Summary
O procedimento descreve o isolamento do villi do epitélio intestinal do camundongo submetido à desdiferente para determinar seu potencial de formação organoide.
Abstract
A clonogenicidade dos organoides do epitélio intestinal é atribuída à presença de células-tronco. O pequeno epitélio intestinal do camundongo é compartimentalizado em criptas e villi: o caule e as células proliferadoras estão confinados às criptas, enquanto o epitélio villi contém apenas células diferenciadas. Assim, as criptas intestinais normais, mas não as villi, podem dar origem a organoides em culturas 3D. O procedimento aqui descrito é aplicável apenas ao epitélio villus submetido à desdiferenteidade que leva à haste. O método descrito usa o smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4KO:β-cateninGOF) rato mutante condicional. A mutação faz com que o villi intestinal desdifera e gere células-tronco no villi. Villi intestinal submetido à desdiferenteização são raspados do intestino usando lâminas de vidro, colocados em um coador de 70 μm e lavados várias vezes para filtrar quaisquer células soltas ou criptas antes do revestimento na matriz BME-R1 para determinar seu potencial de formação organoide. Dois critérios principais foram utilizados para garantir que os organoides resultantes fossem desenvolvidos a partir do compartimento villus dediferente e não das criptas: 1) avaliando microscopicamente o villi isolado para garantir a ausência de quaisquer criptas amarradas, antes e depois do revestimento na matriz 3D, e 2) monitorando o curso temporal do desenvolvimento organoide do villi. A iniciação organoide do villi ocorre apenas dois a cinco dias após o revestimento e parece irregularmente moldada, enquanto os organoides derivados da cripta do mesmo epitélio intestinal são aparentes dentro de dezesseis horas de revestimento e parecem esféricos. A limitação do método, no entanto, é que o número de organoides se formou, e o tempo necessário para a iniciação organoide a partir do villi variam dependendo do grau de desdiferenciação. Portanto, dependendo da especificidade da mutação ou do insulto que causa a desdiferente, o estágio ideal em que villi pode ser colhido para avaliar seu potencial organoide formando, deve ser determinado empiricamente.
Introduction
As criptas intestinais, mas não villi, formam organoides quando cultivadas na matriz Matrigel ou BME-R1. Esses organoides são estruturas auto-organizadas, muitas vezes referidas como o "mini-intestino" devido à presença das várias linhagens diferenciadas, progenitora e células-tronco presentes no epitélio intestinal in vivo. O potencial de formar organoides a partir de criptas é atribuído à presença de células-tronco1. Os villi intestinais, por outro lado, consistem apenas em células diferenciadas e, portanto, não podem formar organoides. No entanto, mutações2 ou condições que permitam a desdiferenteação do epitélio villus podem levar a células-tronco no villi2,3. Esta mudança de destino que resulta em caule no epitélio de villi pode ser confirmada pelo chapeamento do epitélio villus dediferente na matriz 3D para determinar seu potencial de formação organoide como um indicador de de-novo caule no epitélio villus. Portanto, o aspecto crítico deste procedimento é garantir a ausência de contaminação por cripta.
A mutação condicional Smad4KO:β-cateninGOF causa dediferente no epitélio intestinal marcado pela expressão de proliferação e marcadores de células-tronco no villi, e eventualmente a formação de estruturas anptóricas nos villi referidas como criptas ectópicas A presença de células-tronco essas villidiferentes foi determinada pela expressão de marcadores de células-tronco nas criptas ectópicas(in vivo)e pela capacidade da villi mutante de formar organoides wh en matrigelbanhado 3. O procedimento abaixo mencionado elabora a metodologia utilizada para confirmar a haste do epitélio intestinal dediferente no Smad4KO:β-cateninGOF mutantes. Uma característica fundamental dessa metodologia para isolar villi foi o uso de raspagem do lúmen intestinal, em oposição ao método de quelação EDTA4. Ao contrário do método de quelação EDTA, o isolamento de Villi, raspando, retém a maioria do mesenquima subjacente e permite ajustar a pressão de raspagem para produzir villi sem criptas amarradas. A pressão da raspagem é subjetiva ao operador, portanto, a pressão ideal para produzir villi sem criptas amarradas deve ser determinada empiricamente pelo operador. O aspecto crítico deste procedimento é garantir a ausência de contaminação por cripta por exame microscópico do villi antes e depois do revestimento na matriz BME-R1.
Villi intestinal são raspados do lúmen intestinal com lâminas de vidro e colocados em um filtro de 70 μm e lavados com PBS para se livrar de células soltas ou criptas, se houver, antes de chapeamento na matriz BME-R1. O método enfatiza os seguintes critérios para evitar a contaminação da cripta: a) confinar a colheita de villi a metade proximal do duodeno onde os villi são os mais longos, b) minimizando o número de arranhões que produzem villi, c) lavar o filtro contendo o villi através de uma série de PBS em um prato de seis poços, e d) confirmando a ausência de contaminação cripta por exame microscópico antes e depois do revestimento na matriz BME-R1. O isolamento de Villi raspando, e não pela quelação edta, evita a perda completa do mesenquima subjacente que pode fornecer os sinais de nicho5,6,7,8, se necessário, para iniciação organoide a partir do epitélio villus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com camundongos realizados, incluindo o uso de tamoxifen e eutanásia por deslocamento cervical, tiveram a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais no Instituto Stevens de ecnologia.
1. Ratos
NOTA: A geração de Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Os camundongos Villin-CreERT2 foram descritos anteriormente3. Camundongos adultos entre oito e doze semanas de idade foram usados.
- Induzir a mutação Smad4KO:β-cateninGOF no Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 com injeção intraperitoneal de Tamoxifen em óleo de milho por quatro dias consecutivos.
- Sacrifique a luxação cervical 10 dias após a primeira injeção de tamoxifen.
- Pulverize o abdômen com 70% de etanol para evitar que o pelo do rato entre na cavidade peritoneal.
- Abra a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecção para expor o intestino. Isole o intestino com o auxílio da tesoura e fórceps.
NOTA: A perda concomitante de Smad4 juntamente com o ganho de mutação de função de β-catenin (Smad4KO;β-cateninGOF) no epitélio intestinal foi atingida pela injeção deSmad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 camundongos todos os dias por quatro dias consecutivos com 0,05 g de peso corporal tamoxifen/kg em óleo de milho. Estes camundongos são colhidos dez dias após a primeira injeção de tamoxifen para garantir a presença de células expressando marcadores associados a células-tronco no villi dediferente.
2. Isolamento e preparação do duodeno
- Disseca a metade proximal do duodeno.
- Lave o duodeno com 5 mL de PBS gelado em uma seringa de 10 mL para limpar o conteúdo luminal.
- Abra o duodeno longitudinalmente com uma tesoura angular e coloque o duodeno plano em uma placa de Petri de 15 cm no gelo com o lúmen do duodeno de frente para o operador.
3. Isolamento de Villi raspando
- Antes de começar a raspagem, coloque um coador de malha de 70 μm em um dos poços de uma placa de cultura tecidual de 6 poços. Encha todos os poços com 4 mL de PBS 1x e coloque a placa de cultura tecidual de 6 poços no gelo(Figura 1).
- Raspe o villi da seguinte forma usando dois slides de vidro microscópicos: um para segurar o duodeno para baixo e o outro para raspar(Figura 1B1).
- Raspe o lado luminal do duodeno superficialmente para lá e para cá duas vezes para remover o muco. Aplique pressão de tal forma que este passo remova a camada de muco, mas não o villi.
- Raspe o duodeno novamente, para lá e para cá duas vezes aplicando a mesma pressão que em 3..1, durante o qual villi pode ser visto coletando nos slides(Figura 1B2). Esta é a pressão ideal (que deve ser determinada empiricamente pelo operador) para produzir o villi sem as criptas amarradas.
- Use um tubo de transferência de 1 mL contendo PBS para transferir o villi (que são coletados no slide da etapa 3.2.2.) para um coador de malha de 70 μm colocado em um prato de 6 poços. Os villi são recolhidos assim, após cada arranhão(Figura 1B2).
- Lave o villi coletado no coador de 70 μm (a partir da etapa 3.3) transferindo o coador (com o villi) através de uma série de poços em um prato de 6 poços contendo PBS frio (~ 4 mL/well). Isto é para remover criptas soltas, se houver.
- Usando um tubo p1000, transfira a suspensão villi em PBS (~ 3 mL) do coador de 70 μm para um novo tubo de 15 mL no gelo.
- Use uma ponta de tubulação p200 revestida com 0,1% BSA para aspirar 50 μL de volume da suspensão villi em um slide de vidro. Conte o número de villi na gotícula de 50 μL sob ampliação de 4x para determinar a concentração de villi na suspensão pbs. Por exemplo, se houver 10 villi na suspensão de 50 μL examinada, então a concentração de villi é de 0,2 villi/μL. Este também é o momento para confirmar a ausência de criptas amarradas.
- Calcule o volume de suspensão de villi necessário para a placa em uma concentração de 0,5 villi/μL da matriz BME-R1. Adicione 100 μL extras para explicar o erro de pipetação e o volume necessário para o exame microscópico necessário para garantir a pureza do villi.
ATENÇÃO: A pressão utilizada nos dois primeiros arranhões, que remove o muco, mas não o villi, deve ser usada nos arranhões subsequentes durante os quais villi será liberado. Limitar o número de raspagens para lá e para cá para dois após a liberação de villi é observado pela primeira vez. Esta medida evita a liberação de villi com as criptas amarradas. É essencial avaliar microscopicamente o villi para garantir a ausência das criptas amarradas.
4. Chapeamento de villi na matriz BME-R1
- Utilizando uma ponta de tubulação revestida de 0,1% BSA p200, transfira para um tubo de microcentrifusagem o volume de villi (a partir da etapa 3.6) necessário para a placa a uma densidade de ~ 6 villi por poço em 12,5 μL de matriz BME-R1. O uso de ponta sem corte revestida com BSA neste ponto garante que os villi, que são muito grandes para uma ponta pontiaguda, sejam aspirados sem serem bloqueados ou perdidos por ficarem presos às laterais da ponta.
- Gire o villi por 2 min a 200 x g em uma centrífuga refrigerada (4 °C) e remova o supernatante.
- Repita o passo 4.2 para remover qualquer PBS residual e proceda para o próximo passo sob um capô de fluxo laminar.
- Resuspenque a pelota de villi suavemente na quantidade necessária de BME-R1 frio descongelado no gelo.
- Utilizando um tubo p20, placa 12,5 μL/bem do villi na matriz BME-R1 em 3D em uma placa de fundo U pré-armada de 96 poços.
- Incubar a placa em uma incubadora de cultura tecidual a 37 °C por 15 minutos para permitir a solidificação da matriz BME-R1.
- Adicionar 125 μL/bem de ENR pré-aquecido (fator de crescimento epidérmico/Noggin/R-spondin1) mídia: mídia DMEM F-12 avançada, suplementada com 1x Penicilina: Estreptomicina, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% de mídia condicionada de células HEK293-T expressando R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine e 0,05 mg/mL Primocin.
- Incubar o villi banhado em uma incubadora de cultura de tecidos mantida a 37 °C com 5% de CO2, e mudar a mídia a cada dois dias.
- Descarte qualquer poço em que organoides apareçam antes de dois dias de chapeamento, já que o ponto de tempo mais antigo em que os organoides derivados de Villi são esperados é depois de dois dias.
NOTA: Qualquer villi que tenha metade ou mais da metade do comprimento de villi são contados como um villus. Ao contrário dos organoides derivados da cripta, os organoides derivados de villi não são esperados dentro de 24 horas após o revestimento. As villis que iniciam organoides parecem estar escurecendo e encolhendo antes da formação de organoides. Assim, quaisquer poços com organoides em desenvolvimento dentro de um dia de revestimento devem ser descartados para evitar a plausibilidade de ter derivado da contaminação plausmática cripta. A metodologia utilizada para produzir os meios condicionados está disponível mediante solicitação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O fator determinante para o sucesso do procedimento é prevenir a contaminação por cripta. O desenvolvimento organoide a partir do villi (e não de qualquer criptas contaminantes) é assegurado confirmando quatro critérios principais: 1) assegurando a pureza do villi colhido por exame microscópico antes e depois de emplacar o villi em BME-R1, 2) emplacando o número limitado de villi por poço para permitir a visualização de todos os villi banhados individualmente, 3) onitoring o desenvolvimento de organoide diariamente; imagens do curso temporal mostram o desenvolvimento de organoide a partir de villi (Figura 3), e 4) onitorando a cinética e aparência morfológica dos organoides iniciados a partir de villi; os organoides iniciados a partir de villi aparecem irregularmente moldados no início e levam de dois a cinco dias antes de serem vistos sob a ampliação 4x em oposição aos organoides derivados da cripta (cultivados por criptas isolantes usando o método de quelação EDTA/PBS1,4) que aparecem durante a noite como estruturas esféricas com bordas bem definidas(Figura 2).
O momento ideal para sacrificar os camundongos para testar o potencial formador organoide do villi é após a dediferente villi-epitélio express marcadores de células-tronco e iniciar o desenvolvimento de criptas ectópicas no villi in vivo (cerca de 10 dias após a injeção de Tamoxifen do Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 ratos). Estes camundongos têm um tamoxifen indutível cre-recombinase que causa perda de Smad4 concomitante com ativação de β-catenin com tamoxifen. As criptas ectópicas desenvolvem-se totalmente dentro de duas semanas após a indução da mutação, enquanto as células-tronco no epitélio villus aparecem dentro de uma semana após a indução da mutação in vivo. O número de villi que formam organoides quando banhados em Matrigel foi relatado variando entre 2% e 12%3. A colheita do camundongo mutante para chapeamento do villi na época em que as células-tronco estão presentes (cerca de uma semana após a indução de cre-recombinase) prolongará o tempo necessário para que os organoides derivados de villi apareçam, enquanto o adiamento da colheita para mais de dez dias após a indução de cre-recombinase aumentará o risco de contaminação.
Figura 1: Configuração experimental e raspagem de villi do epitélio intestinal. A) seringa recheada de PBS (syrg) com tubos e filtro (Fltr) em PBS. B) Isolamento de Villi raspando(B1) e transferindo para um filtro(B2). A seta aponta o villi coletado no slide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Distinção na aparência dos organoides emergindo das criptas versus o epitélio villi dediferenciado do mesmo intestino do rato: A) Desenho animado mostrando villus e criptas. B) Montagem inteira (em PBS) de villi preparada por raspagem (painel superior) e criptas preparadas por EDTA-chelation (painel inferior). C) Organoides derivados de Villi (painel superior) e cripto-derivados (painel inferior) do mesmo epitélio intestinal do mesmo rato em BME-R1 (barras de escala, 500 hum). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Curso temporal de formação organoide a partir do villi dediferente dediferente. A iniciação organoide de dois villis diferentes é mostrada (as regiões encaixotadas são ampliadas nos painéis médio e inferior). O villi com potencial de formação organoide parece denso, possivelmente devido à retenção do mesenquime subjacente. A iniciação organoide do villus é aparente no segundo dia (flecha sólida) de um dos villi (caixa com limite quebrado), enquanto no outro villus (caixa com limite sólido) o organoide aparece no quarto dia (seta). A caixa superior no painel do dia 6 mostra um organoide desenvolvido derivado de villi. Barra de escala, 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método pode confirmar a capacidade de auto-renovação de dediferente villi epitélio que adquire marcadores de células-tronco in vivo. O epitélio intestinal normal pode dar origem a organoides da cripta, mas não do compartimento villi, quando cultivado em 3D por causa da presença de células-tronco nas criptas1. Assim, a formação organoide a partir do epitélio villi dediferenciado cultivado em culturas 3D confirma a formação de células-tronco a partir da reversão do destino celular. Os relatos sobre a reversão do destino celular no epitélio intestinal decorrente de mutações e/ou lesões estão aumentando2,3,9,10,11,12. Assim, este método é aplicável em cenários semelhantes em que os marcadores de células-tronco villi epitélio expressos dediferentes in vivo.
Confirmamos o desenvolvimento dos organoides a partir do villi do Smad4KO:β-cateninGOF mutante através do curso de tempo mostrando desenvolvimento de organoide a partir do villi (Figura 3). O aspecto mais crítico é tomar medidas de precaução contra a contaminação por cripta, o que levaria a falsos positivos. As seguintes medidas foram tomadas para garantir a pureza da preparação de villi antes e depois do revestimento: a) isolamento de villi da metade proximal do duodeno onde os villi são os mais longos, b) minimizar o número de arranhões e ajustar a pressão de raspar para produzir villi sem criptas amarradas, c) lavar o villi com PBS depois de colocá-los em um filtro de malha de 70 μm para excluir quaisquer criptas ou células soltas d) exame microscópico do villi colhido antes e depois do revestimento, e e) minimizando o número de villi banhados por poço para que possam ser visualizados individualmente na matriz banhada.
Várias considerações foram feitas para otimizar o procedimento. Em primeiro lugar, colhemos o villi do duodeno proximal onde os villi são os mais longos. O delineamento físico entre a diferenciação e os compartimentos proliferativos no intestino delgado nos permite adotar raspagem para separar mecanicamente o villi das criptas. Esse método só pode ser adotado nos casos em que a compartimentação entre a diferenciação e o compartimento proliferativo é estritamente delineada - como é o caso do intestino delgado, mas não no cólon. Em segundo lugar, otimizamos o tempo de isolamento de Villi após a indução da mutação com base no grau de desdiferente observado in vivo. A dediferenteação no mutante Smad4KOcondicional :β-cateninGOF é marcada pelo aparecimento in vivo de marcadores de células-tronco e criptas ectópicas no epitélio villus dentro de sete e dezdias, respectivamente 3. Assim, o tempo necessário para iniciar organoides do villi mutante diminui à medida que o tempo decorrido após a indução da mutação aumenta. Portanto, ao adaptar este método a outros modelos de dediferentes do intestino, o momento ideal para sacrificar os camundongos para o isolamento de Villi deve ser determinado empiricamente dependendo do tipo de mutação ou lesão e do grau de desdiferente in vivo. Em terceiro lugar, optamos por isolar o villi raspando e não pelo método de quelação EDTA, a fim de manter o mesenquime subjacente, uma vez que as conversações cruzadas epitelial-mesenquimais foram implicadas na função de células-tronco intestinais no intestino5,6,7,8,13. Villi que iniciam os organoides aparecem principalmente escuros possivelmente devido à presença do mesenquime subjacente(Figura 2B e 3). Verificamos a expressão do marcador cd4414, 15, e do fator de transcrição específico do intestino Cdx216,17,18,19,20 confirmando a origem epitelial dos organoides derivados de villi(Figura S1).
Em comparação com abordagens in vivo, os organoides são mais favoráveis à manipulação genética e ao rastreamento. Uma vez que observamos diferenças fenotípicas entre os organoides emergindo das criptas e os villi do mesmo Smad4KO:β-cateninGOF epitélio intestinal(Figura 2B), especulamos diferenças moleculares entre os dois, que atualmente está sendo investigado. Assim, este método é útil na investigação das implicações das mutações causadoras de dediferentes e seus efeitos diferenciais no progenitor versus compartimento de diferenciação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta publicação foi apoiada pelo Prêmio Número K22 CA218462-03 do NiH National Cancer Institute. As células HEK293-T expressando R-Spondin1 foi um presente generoso do Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
