Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/61817
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 2,3,4, 1
1Department of Bioengineering, Imperial College London, 2Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Singapore, 4Singapore Eye Research Institute, The Academia
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת ציפוי להגבלת צמיחת תאי אנדותל לאזור מסוים של צלחת 6 בארות ליישום לחץ גזירה באמצעות מודל שייקר מסלולית.

Abstract

לחץ גזירה שנכפה על דופן העורקים על ידי זרימת הדם משפיע על מורפולוגיה ותפקוד של תאי אנדותל. לחצים בדרגה נמוכה, נדנוד ורב-כיווני הונחו כולם כדי לעורר פנוטיפ פרו-אתרוסקלרוטי בתאי אנדותל, בעוד שגודל גבוה וגזירה חד-כיוונית או חד-ערוצית נחשבים לקידום הומאוסטזיס אנדותל. השערות אלה דורשות חקירה נוספת, אך טכניקות במבחנה מסורתיות יש מגבלות, והם עניים במיוחד בהטלת לחצים גזירה רב כיוונית על תאים.

שיטה אחת שצוברת שימוש גובר היא לתרבות תאי אנדותל בלוחות רב-באר סטנדרטיים על הפלטפורמה של שייקר מסלולי; בשיטה פשוטה, זולה, בעלת תפוקה גבוהה וכרונית זו, המדיום המסתחרר מייצר דפוסים ועוצמות שונות של גזירה, כולל גזירה רב-כיוונית, בחלקים שונים של הבאר. עם זאת, יש לו מגבלה משמעותית: תאים באזור אחד, החשופים לסוג אחד של זרימה, עשויים לשחרר מתווכים למדיום המשפיעים על תאים בחלקים אחרים של הבאר, חשופים לזרימות שונות, ומכאן מעוותים את הקשר לכאורה בין זרימה לפנוטיפ.

כאן אנו מציגים שינוי קל ובמחיר סביר של השיטה המאפשרת לתאים להיחשף רק למאפייני מתח גזירה ספציפיים. זריעת תאים מוגבלת לאזור מוגדר של הבאר על ידי ציפוי אזור העניין עם פיברונקטין, ואחריו פסיבציה באמצעות פתרון passivating. לאחר מכן, הצלחות ניתן להסתחרר על שייקר, וכתוצאה מכך חשיפה של תאים פרופילי גזירה מוגדרים היטב כגון גזירה רב כיוונית בעוצמה נמוכה או גזירה חד-כיוונית בעוצמה גבוהה, בהתאם למיקומם. כמו קודם, השימוש בכלי פלסטיק סטנדרטיים לתרבות התאים מאפשר ניתוח נוסף ופשוט של התאים. השינוי כבר איפשר הדגמה של מתווכים מסיסים, ששוחררו מאנדותל תחת מאפייני לחץ גזירה מוגדרים, המשפיעים על תאים הממוקמים במקומות אחרים בבאר.

Introduction

התגובות של תאי כלי הדם לסביבה המכנית שלהם חשובים בתפקוד תקין של כלי הדם ובהתפתחות של מחלה1. Mechanobiology של תאי אנדותל (ECs) כי קו פני השטח הפנימיים של כל כלי הדם כבר מוקד מסוים של מחקר mechanobiological כי ECs לחוות ישירות את הלחץ גזירה שנוצר על ידי זרימת הדם מעליהם. שינויים פנוטיפיים שונים כגון תגובות דלקתיות, נוקשות ומורפולוגיה שהשתנו, שחרור חומרים vasoactive, לוקליזציה וביטוי של חלבונים junctional תלויים בחשיפה EC ללחץ גזירה2,3,4. תכונות אנדותל תלויות גזירה עשויות להסביר גם את ההתפתחות הלא יציבה של מחלות כגון טרשת עורקים5,6,7.

כדאי לחקור את ההשפעה של גזירה על מחשבים אלקטרוניים בתרבות, שם ניתן לשלוט בלחצים, וניתן לבודד ECs מסוגי תאים אחרים. התקני במבחנה הנפוצים להחלת לחץ גזירה על מחשבים אלקטרוניים כוללים את תא הזרימה של הלוח המקביל ואת viscometer חרוט וצלחת, אבל רק חד-מיני יציב, נדנוד, זרימה pulsatile ניתן להחיל8,9. למרות שפותחו תאי זרימה מותאמים עם גיאומטריות מחודדות או מסתעפות ושבבים מיקרופלואידיים המחקים גיאומטריה סטנוטית, התפוקה הנמוכה שלהם ומשך התרבות הקצר יחסית האפשרי מציבים אתגר10, 11.

שיטת שייקר מסלולית (או מערבולת היטב) לחקר mechanotransduction אנדותל, שבו תאים גדלים בכלי פלסטיק סטנדרטיים של תרבות התא להציב על הפלטפורמה של שייקר מסלולית, הוא צובר תשומת לב גוברת כי הוא מסוגל כרונית הטלת מורכבים, דפוסי מתח גזירה שונים מרחבית על ECs עם תפוקה גבוהה (ראה סקירה על ידי Warboys ואח'12). סימולציות דינמיקת נוזלים חישובית (CFD) הופעלו כדי לאפיין את הווריאציה המרחבית והטמפורלית של לחץ גזירה בבאר מתערבלת. התנועה המסתובבת של מדיום התרבות הנגרמת על ידי התנועה המסלולית של פלטפורמת השייקר שעליה ממוקמת הלוח מובילה לזרימה רב-כיוונית בדרגה נמוכה (LMMF, או זרימה פרו-אתרוגנית) במרכז וזרימה יוניקסיאלית בעוצמה גבוהה (HMUF, או זרימה את'רופקטיבית באופן פוטטיבי) בקצה הבארות של צלחת של 6 בארות. לדוגמה, לחץ גזירה קיר ממוצע זמן (TAWSS) הוא כ 0.3 Pa במרכז ו 0.7 Pa בקצה צלחת 6-באר הסתחרר ב 150 סל"ד עם רדיוס מסלולי 5 מ"מ13. השיטה דורשת רק כלי פלסטיק זמינים מסחרית ואת שייקר מסלולית עצמה.

יש, עם זאת, חיסרון לשיטה (ולשיטות אחרות של הטלת זרימות במבחנה): ECs לשחרר מתווכים מסיסים ומיקרו-חלקיקים באופן תלוי גזירה14,15,16 ו secretome זה עשוי להשפיע על ECs באזורים של הבאר מלבד זה שבו הם שוחררו, בשל ערבוב במדיום מתערבל. זה עשוי להסוות את ההשפעות בפועל של לחץ גזירה על פנוטיפ EC. לדוגמה, Ghim et al. העריכו כי זה מסביר את ההשפעה הזהה לכאורה של פרופילי גזירה שונים על הובלה טרנסצ'לית של חלקיקים גדולים17.

כאן אנו מתארים שיטה לקידום הידבקות תא אנדותל וריד טבור אנושי (HUVEC) באזורים ספציפיים של צלחת 6-באר באמצעות ציפוי פיברונקטין תוך שימוש F-127 פלורוני כדי להעביר את פני השטח ולמנוע צמיחה במקום אחר. השיטה פותרת את המגבלה שתוארה לעיל מכיוון, על ידי פילוח צמיחת תאים, מחשבים אלקטרוניים חווים רק סוג אחד של פרופיל גזירה, ואינם מושפעים מפרחומים ממחשבים אלקטרוניים החשופים לפרופילים אחרים במקומות אחרים בבאר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור מכשירים והכנת ריאגנטים

  1. ייצור מודול נירוסטה
    1. פברק את מודול הנירוסטה מפלדת אל-חלד בדרגה 316 באמצעות מכונת כרסום CNC בהתאם לציור ההנדסי שסופק (איור 1).
  2. הדפסה תלת-ממדית של תבנית פוליאדימיאתילסילוקסן (PDMS)
    1. הכינו דגם תכנון תלת מימדי בעזרת מחשב (CAD) של תבנית ה-PDMS באמצעות SolidWorks בהתאם לציור ההנדסי שסופק (איור 2).
    2. יצא את מודל CAD לקובץ STL וייבא את קובץ ה- STL ל- Cura 2.6.2.
    3. פורסים את הדגם לשכבות במהירות הדפסה של 50 מ"מ/ים וצפיפות מילוי של 60%.
    4. יצא את הקובץ כקוד G והעלה אותו למדפסת Ultimakerדו-ממדית להדפסה. השתמש בחומצה פולילקטית (PLA) כחומר ההדפסה.
  3. ליהוק טבעת PDMS
    1. מערבבים את בסיס PDMS ואת סוכן הריפוי (שניהם מערכת אלסטומר סיליקון) עם יחס של 90.9% בסיס ו 9.1% ריפוי סוכן.
    2. יוצקים כ 2.6 מ"ל של הפתרון מעורב היטב לתוך עובש מודפס 3D.
    3. הסר בועות בתא גמילה ואקום.
    4. לרפא אותו במשך 1 שעות בתנור 80 מעלות צלזיוס.
    5. אפשרו לטבעת PDMS להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסירו בזהירות את טבעת ה-PDMS שנרפאה מהתבנית. הציור ההנדסי של טבעת PDMS מוצג באיור 3.
  4. הכנת 1% F-127 פלרוני
    1. שוקלים 5 גרם של F-127 פלורוני, יוצקים אותו לתוך בקבוק זכוכית, ולאחר מכן מוסיפים 100 מ"ל של מים סטריליים לתוך בקבוק הזכוכית. זה נותן 5% פתרון F-127 פלורוני.
    2. ודא כי כל אבקת Pluronic F-127 שקוע במים, לסגור את הכובע autoclave אותו באמצעות תוכנית מחזור עיקור נוזלי.
    3. לאחר אוטוקלאב, תן לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
    4. הוסף 10 מ"ל של 5% פתרון F-127 פלורוני ל 40 מ"ל של מים סטריליים autoclaved לעשות 1% Pluronic F-127 פתרון. בצע את הדילול בארון biosafety (BSC) מכסה המנוע.
    5. יש לאחסן הן 1% והן 5% F-127 פלורוניק בטמפרטורת החדר.
  5. הכנת 4% פארפורמלדהיד (PFA)
    1. מוסיפים 800 מ"ל של מלוחים עם אגירה פוספטית (PBS) לזכוכית ומחממים אותה ל-60 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב (ממשיכים לבחוש משלב 1.5.1 עד 1.5.5).
    2. שוקלים 40 גרם של אבקת PFA ומוסיפים אותה לפתרון PBS החם.
      התראה: PFA הוא מסוכן, לבצע את השלבים 1.5.2 כדי 1.5.6 במכסה המנוע אדים.
    3. הוסף 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH) לאט dropwise לתוך פתרון PFA עד הפתרונות הופכים ברורים.
    4. להתאים את ה- pH של פתרון PFA כ 7.4 עם 1 מ 'של חומצה הידרוכלורית (HCl).
    5. התמלא את הפתרון ל- 1 L עם PBS 1X. זה נותן 1 L של 4% PFA.
    6. סנן את פתרון PFA עם מסנני 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים, aliquot ולהקפיא במקפיא -20 מעלות צלזיוס.
  6. הכנה של 0.1% טריטון-X
    1. הוסף 50 μL של Triton-X טהור לתוך 50 מ"ל של PBS כדי להפוך 0.1% טריטון-X פתרון.
  7. הכנת 1% אלבומין סרום שור (BSA)
    1. שוקלים 0.5 גרם של BSA, יוצקים אותו לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל של PBS לתוך הצינור.
    2. תן לו להתגלגל במשך שעה בטמפרטורת החדר על רולר להתמוסס.
    3. חנות 1% BSA ב 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.

2. ציפוי צלחת של 6 באר

  1. מובלעת אוטומטית של מודול נירוסטה, טבעת PDMS ופינצ'רים לפני השימוש. בצע את כל ההליכים הבאים במכסה המנוע BSC ולבחון טכניקות אספטיות כדי להבטיח סטריליות.
  2. הנח את טבעת ה- PDMS במרחק של 6 בארות באמצעות פינצטה. השתמש בקצה החיצוני של טבעת PDMS כדי ליישר את טבעת PDMS באופן מרוכז עם הבאר.
    הערה: יש להשתמש רק בתרבית שאינה רקמה המטופלת היטב.
  3. הנח את מודול נירוסטה על גבי טבעת PDMS באמצעות פינצטה.
  4. הכנס את קצות צבת טבעת ההחזקה הפנימית לתוך חורי האחיזה של הטבעת השומרת, לסחוט את המחזיק כדי להפחית את קוטר הטבעת השומרת. להתאים אותו לתוך 6-טוב, לחץ אותו בחוזקה על מודול נירוסטה ולשחרר את הצבת כדי לאבטח את טבעת PDMS בבאר.
  5. הוסף 1 מ"ל של 5 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין למרכז או לקצה הבאר (בהתאם לאזור העניין) דרך פתיחת טבעת PDMS ומודול נירוסטה.
  6. מערבולת הצלחת כדי להבטיח כי פתרון fibronectin מכסה את כל האזור של עניין.
  7. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח תחת 95% אוויר / 5% CO2.
  8. הסר את הפתרון fibronectin מן הבאר ולשטוף פעמיים עם PBS. הסר לחלוטין את ה- PBS מהבאר.
  9. הסר את טבעת ההחזקה, מודול נירוסטה וטבעת PDMS מהבאר.
  10. מוסיפים 1.5 מ"ל של 1% פלורוני F-127 למרכז או לקצה הבאר (משטח לא צבוע) ומדגרת במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי להעביר את המשטח הלא צלוי.
  11. הסר את פתרון ה-F-127 הפלורוני מהבאר ושטף שלוש פעמים עם PBS.
  12. השתמש היטב מצופה מיד או לאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים עם שכבה של PBS בבאר מצופה.

3. זריעת HUVECs

  1. השתמש HUVECs מתחת לקטע 5 בניסוי.
  2. הסר את כל מדיום התרבות ולשטוף תאים פעם אחת עם PBS.
  3. הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין ודגרת במשך 3 דקות ב 37 °C (69 °F) באינקובטור לח תחת 95% אוויר / 5% CO2. הקש בעדינות על הבקבוק כדי לעקור את התאים.
    הערה: פרוטוקול זה נבדק באמצעות HUVECs ואת הריכוז של טריפסין וזמן הדגירה שלה עשוי להיות שונה עבור סוג אחר של ECs.
  4. להעביר את הפתרון צינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולנטרל את טריפסין באמצעות 6 מ"ל של מדיום תרבות (למשל, Lonza EGM-2) מראש ל 37 °C (60 °F).
  5. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות. הסר את פתרון טריפסין מנוטרל resuspend תאים עם 1 מ"ל של מדיום תרבות מראש.
  6. לספור את התאים באמצעות המוציטרומטר וזרע 180k תאים לתוך צלחת מצופה 6-באר ב 1.5 מ"ל של מדיום תרבות מראש.
  7. לנער את צלחת היטב לרוחב כדי להבטיח כי התאים להפיץ באופן שווה בבאר.
  8. השאירו אותו באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-95% אוויר/5% CO2 למשך הלילה.
  9. הסר את התאים הלא מחוברים ואת מדיום התרבות והחלף ב- 2 מ"ל של מדיום תרבות טרום-מלחמתי.
    הערה: צפויים תאים רבים שאינם מחוברים לצוף באמצעי.

4. יישום מתח גזירה באמצעות שייקר מסלולית

  1. HUVECs צריך להגיע להתכנסות לאחר 3 ימים של צמיחה. החלף את המדיום עם 1.9 מ"ל של מדיום תרבות מראש (כדי להשיג גובה של 2 מ"מ).
  2. מניחים את הצלחת על הפלטפורמה של שייקר מסלולית באינקובטור לח תחת 95% אוויר / 5% CO2 ומסחררים אותו ב 150 סל"ד במשך 3 ימים.
    הערה: לנגב את המשטח החיצוני של שייקר מסלולית באמצעות 70% אתנול לפני הצבת אותו לתוך החממה.
  3. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' לאחר יומיים של גזירה, ציטוקינים ניתן להוסיף למדיום התרבות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ציטוקינים ומתח גזירה. לאחר הטיפול, לגזירה התאים ליום אחר. במחקר זה, TNF-α שימש להפעלת התאים.
  4. בצע ניתוחים לאחר 3 ימים של יישום מתח גזירה.

5. כתמים והדמיה של תאים

  1. לאחר 3 ימים של גזירה, להסיר את הצלחת מן האינקובטור ולשטוף תאים פעמיים עם PBS.
  2. לתקן את התאים על ידי הוספת 1.5 מ"ל של 4% PFA לתוך הבאר דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר את 4% PFA מהבאר ולשטוף פעמיים עם PBS.
  4. לחלחל את התאים על ידי הוספת 0.1% טריטון-X לתוך הבאר דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את פתרון טריטון-X של 0.1% מהבאר והוסף 1.5 מ"ל של 1% BSA לבאר לחסימה. דגירה התאים עם 1% BSA עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  6. לדלל ארנב אנטי אנושי ZO-1 נוגדן בדילול 1:200 ב 1% BSA. מוסיפים 1.5 מ"ל של נוגדן מדולל לתוך הבאר ומדגירה אותו עם התאים לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. לאחר הדגירה לילה, להסיר את הנוגדן מדולל לשטוף תאים שלוש פעמים עם PBS.
  8. לדלל אלקסה פלואור 488 שכותרתו עז נגד ארנב IgG נוגדן משני ב 1:300 דילול PBS. מוסיפים 1.5 מ"ל של נוגדן משני מדולל לבאר ומדגירה אותו עם התאים במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  9. הסר את הנוגדן המשני מדולל לשטוף תאים פעמיים עם PBS.
  10. לדלל DRAQ5 בדילול של 1:1000 ב PBS. מוסיפים 1.5 מ"ל של DRAQ5 מדולל לתוך הבאר ולהדגיר אותו עם התאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את גרעיני התא.
  11. הסר את DRAQ5 מדולל לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  12. בצע סריקת אריחים מהקצה למרכז הבאר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

6. כימות אינדקס הצורות ומספר התאים

  1. פרסם את התמונות באמצעות MATLAB R2016a.
  2. קרא את קובץ ה- LIF ממיקרוסקופ קונפוקאלי ל- MATLAB והמר את סריקת האריחים הממוזגת לתמונה בינארית, ולאחר מכן הוסף את התמונה לפי אזור ועוצמה כדי להבדיל בין גרעינים לרקע.
  3. לחלק את סריקת האריחים הבינאריים למקטעים רדיאליים של 1 מ"מ.
  4. התאם אליפסה לכל גרעין בנפרד.
  5. ספור את מספר האליפסות בתוך כל מקטע מוקדי כדי לתת מספר תא.
  6. הגדר את אינדקס הצורות = כ- SI = 4π x שטח / היקף2. חשב את אינדקס הצורות עבור כל אליפסה18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הידבקות של HUVECs לאזורים של צלחת היטב לא מצופה פיברונקטין בוטלה על ידי פסיבציה Pluronic F-127; הצמיחה הוגבלה לאזור מצופה פיברונקטין גם לאחר 72 שעות של תרבות, עם וללא יישום מתח גזירה (איור 4A, איור 4C). ללא פסיבציה Pluronic F-127, HUVECs מחובר אל פני השטח ללא fibronectin והתפשט עוד יותר על ידי 72 שעות של תרבות (איור 4B, איור 4D).

יישור והתארכות של HUVECs ניכרים בקצה באר מתערבלת, שבה יש HMUF, בעוד התאים במרכז הבאר, אשר יש LMMF, הציגו מורפולוגיה מרוצפת אבן וללא יישור (איור 5A, איור 5B). התארכות של HUVECs כמתה כמדד צורה: 4π x שטח / היקף2. אינדקס צורה של 1 מציין עיגול, בעוד שערך של 0 מציין קו. מדד הצורות ירד עם מרחק רדיאלי מהמרכז, ולא היה הבדל משמעותי בין בארות מפולחים ומלאות. טיפול TNF-α התארכות מוגברת של HUVECs בהשוואה לבקרות לא מטופלות (איור 5C). HMUF גם הגדיל את מספר HUVECs למ"מ2 לעומת LMMF בשני התנאים. מספר HUVECs גדל בהדרגה עם המרחק לאורך הרדיוס. לא נצפה הבדל משמעותי במספר ה-HUVECs הגדלים בבארות מקוטעות ומלאות (איור 6).

Figure 1
איור 1ציור הנדסי של מודול נירוסטה.  

הממדים במ"מ.

Figure 2
איור 2 ציור הנדסי של תבנית PDMS.

הממדים במ"מ.

Figure 3
איור 3 ציור הנדסי של טבעת PDMS המשמש לפלח את הבארות.

הממדים במ"מ. מ- Ghim ואח '13.

Figure 4
איור 4תמונות מיקרוסקופ המראות כי Pluronic F-127 מנע הידבקות תאי אנדותל וריד טבור אנושי (HUVECs) לאזור ללא ציפוי פיברונקטין.  

לא חוברו HUVECs לחלק של פני השטח היטב שלא טופלו מראש עם פיברונקטין לפני פסיבציה עם F-127 פלורוני, לאחר 24 שעות (A) ו 72 שעות (C) של צמיחה. ללא פסיבציה Pluronic F-127, HUVECs היו מחוברים אל פני השטח ללא fibronectin 24 שעות לאחר זריעה(B)והתרבה עוד יותר על ידי 72 שעות(D). (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). מ- Ghim ואח '13.

Figure 5
איור 5המורפולוגיה של HUVECs גזירה בבאר מקוטעת או מלאה.  

כתם גרעיני (אדום) מראה את המורפולוגיה של HUVECs גזירה (A) במרכז ו -(B) בקצה באר מלאה (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). A ו- B מציגים גם קווי מתאר של תאים, המסומלים על ידי immunostaining של ZO-1 (ירוק). שים לב היישור וההתארכות של תאים בקצה אבל לא במרכז (C) אין הבדל משמעותי במדד הצורה הגרעינית, המציין מעוגנות, בין HUVECs גדל בארות מלאות בארות מקוטעות נראתה עבור מטופלים או TNF-α מטופלים HUVEC. התאים היו מוארכים יותר ליד קצה הבאר. נטייה להארכה גדולה יותר ב- HUVECs שטופלו ב- TNF-α לא הייתה משמעותית באופן עקבי בין מיקומים. (מבחן פוסט הוק דו כיווני של ANOVA ובונפרוני; n = 3). נתון זה שונה מ- Ghim ואח '13

Figure 6
איור 6 מספר HUVECs לכל מ"מ2 גדל עם מרחק רדיאלי בצלחת באר מתערבלת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

לא נצפה הבדל משמעותי בין בארות מלאות ומפולגות בצפיפות של (A) לא מטופל ו-(B) HUVECs שטופלו ב- TNF-α במקומות רדיאליים שונים. בשני המקרים, היו יותר תאים ליחידת שטח בקצה מאשר במרכז הבאר. (מבחן פוסט הוק דו כיווני של ANOVA ובונפרוני; n = 3). נתון זה שונה מ- Ghim ואח '13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת ה-swirling-well מסוגלת ליצור פרופילי זרימה מורכבים בבאר אחת - זרימה רב-כיוונית בעוצמה נמוכה (LMMF) במרכז וזרימה חד-ערוצית בעוצמה גבוהה (HMUF) בקצה הבאר. עם זאת, הפרשות גזירה בתיווך מתח של מתווך מסיס יהיה מעורב במדיום מתערבל להשפיע על התאים בבאר כולה, פוטנציאל מיסוך ההשפעה האמיתית של פרופיל מתח גזירה מסוים על התאים.

שיטת הציפוי המודגמת כאן מתגברת על בעיה זו על ידי הגבלת צמיחת התאים לאזור מסוים של הבאר. תאים בדרך כלל לצרף משטחים הידרופיליים ולא אלה הידרופובי. מסיבה זו, כלי תרבות פוליסטירן מטופל מראש עם חמצון פלזמה. לחלופין, משטחים הידרופוביים יכולים להיות מצופים בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים כגון פיברונקטין, כפי שמודגם בפרוטוקול זה; אזורים מצופים שאינם פיברונקטין הועברו עם F-127 פלורוניק כדי למנוע כל הידבקות שיורית על פני השטח הידרופובי.

פרוטוקול זה תלוי בדיוק התבנית המודפסת. בהתאם למדפסת תלת-ממד, ייתכנו שינויים בממדים המדויקים של התבנית. פעולה זו תשפיע על מבנה PDMS הסופי, אשר בתורו יגרום לתאים דבקים במיקום שגוי בתוך הבאר. התאים יחוו אפוא פרופיל מתח גזירה שונה מזה שעוצב על ידי CFD. חיסרון נוסף בשימוש במדפסת תלת-ממד הוא שייתכן שהתבנית אינה שטוחה, עקב עיוות במהלך ההדפסה. זה יגרום למבנה PDMS הסופי המאפשר F-127 פלורוני לדלוף מתחת, מניעת תאים לדבוק במקומות הרצויים. לכן חשוב לבדוק דליפות ולמדוד את הממד של מבנה PDMS לפני השימוש.

שיטה זו היא פשוטה אך יעילה המאפשרת יישום של סוג מסוים של מתח גזירה (HMUF או LMMF) לתאים. זה גם נוח להגדיר כמו רוב מתכלים, ריאגנטים, וציוד זמינים מסחרית. שימוש בשיטה זו לא רק מאפשר בדיקה או קצירה של תאים החשופים לזרימות מוגדרות היטב, אלא מאפשר איסוף של תאים בינוניים המותנים על ידי תאים אלה. השיטה מספקת שדרה חדשה החוקרת מכנוביולוגיה אנדותל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים בהכרת תודה על מענק פרויקט קרן הלב הבריטית (ל-PDW), המועצה הלאומית למחקר רפואי סינגפור TAAP ודינמו גרנט (ל-XW, NMRC/OFLCG/004/2018, NMRC/OFLCG/001/2017), מלגת בוגרי A*STAR (ל-KTP) ומרכז קרן הלב הבריטית למצוינות במחקר (לתואר שני).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell and Media
Endothelial Growth Medium (EGM-2) Lonza cc-3162
Human Umbilical Vein Endothelial Cells NA NA Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital
Reagents and Materials
Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG Thermofisher Scientific A11008
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-50G
Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated  Scientific Laboratory Supplies Ltd  351146
Fibronectin from Bovine Plasma Sigma-Aldrich F1141-5MG
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Phosphate-Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537-6X500ML
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Recombinant Human TNF-a Peprotech 300-01A
RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg RS 832-0264
Stainless Steel 316 Metal Supermarket NA
Sylgard184 Silicone Elastomer kit Farnell 101697
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4049-100ML
Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody Cell Signaling Technology 13663
DRAQ5 (5mM) Bio Status DR50200
Equipments
Grant Orbital Shaker PSU-10i Scientific Laboratory Supplies Ltd  SHA7930
Leica TCS SP5 Confocal Microscope Leica NA
Retaining Ring Pliers Misumi RTWP32-58
Retaining Rings/Internal/C-Type Misumi RTWS35
Ultimaker 2+3-D printer Ultimaker NA
Softwares
Cura 2.6.2 Ultimaker NA
MATLAB The MathWorks NA
Solidworks 2016 Dassault Systemes NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
  2. Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
  3. Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
  4. Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
  5. Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
  6. Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
  7. Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
  8. Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
  9. Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
  10. Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
  11. Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
  12. Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
  13. Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
  14. Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
  15. Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
  16. Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
  17. Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
  18. Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).

Tags

נסיגה גיליון 172 פילוח צמיחה אנדותל מתח גזירה שייקר מסלולית Mechanobiology זרימה רב כיוונית בעוצמה נמוכה זרימה חד-כיוונית בעוצמה גבוהה PDMS F-127 פלרוני לחץ גזירה רוחבי בקיר
פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pang, K. T., Ghim, M., Arshad, M.,… More

Pang, K. T., Ghim, M., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies. J. Vis. Exp. (172), e61817, doi:10.3791/61817 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter