Summary
Denne protokol beskriver en belægning metode til at begrænse endotelcelle vækst til et bestemt område af en 6-brønds plade til forskydning stress ansøgning ved hjælp af orbital shaker model.
Abstract
Shear stress pålagt arteriel væg ved strømmen af blod påvirker endotelcelle morfologi og funktion. Lav størrelse, oscillatory og multidirectional shear understreger alle er blevet postuleret for at stimulere en pro-atherosklerotisk fænotype i endotelceller, mens høj størrelse og ensrettet eller enaksial forskydning menes at fremme endotel homeostase. Disse hypoteser kræver yderligere undersøgelser, men traditionelle in vitro-teknikker har begrænsninger og er særligt dårlige til at pålægge cellerne multidirectional shear-belastninger.
En metode, der vinder stigende brug, er at kultur endotelceller i standard multi-well plader på platformen af en orbital shaker; i denne enkle, billige, høj-gennemløb og kronisk metode, den hvirvlende medium producerer forskellige mønstre og størrelser af shear, herunder multidirectional shear, i forskellige dele af brønden. Det har dog en betydelig begrænsning: celler i en region, der udsættes for en type flow, kan frigive mæglere i mediet, der påvirker celler i andre dele af brønden, udsat for forskellige strømme og dermed forvrænge den tilsyneladende relation mellem flow og fænotype.
Her præsenterer vi en nem og overkommelig ændring af metoden, der gør det muligt for celler kun at blive udsat for specifikke forskydningsstressegenskaber. Cellesåning er begrænset til en bestemt region i brønden ved at belægge interesseregionen med fibronectin efterfulgt af passivering ved hjælp af passiveringsopløsning. Derefter kan pladerne hvirvles på rysteren, hvilket resulterer i eksponering af celler for veldefinerede forskydningsprofiler såsom lav størrelse multidirectional shear eller høj størrelse enaksial forskydning, afhængigt af deres placering. Som før giver brugen af standardcellekultur plastartikler ligetil yderligere analyse af cellerne. Ændringen har allerede gjort det muligt at påvise opløselige mæglere, frigivet fra endothelium under definerede forskydningsstressegenskaber, der påvirker celler placeret andre steder i brønden.
Introduction
Reaktionerne fra vaskulære celler på deres mekaniske miljø er vigtige i blodkarrenes normale funktion og i udviklingen af sygdom1. Mekanobiologien af de endotelceller (ECs), der ligger på den indvendige overflade af alle blodkar, har været et særligt fokus for mekanobiologisk forskning, fordi ECs direkte oplever den forskydningsstress, der genereres af blodgennemstrømningen over dem. Forskellige fænotypiske ændringer såsom inflammatoriske reaktioner, ændret stivhed og morfologi, frigivelse af vasoaktive stoffer og lokalisering og ekspression af junctionalproteiner afhænger af EF-eksponering for forskydningsstress2,3,4. Shear-afhængige endotel egenskaber kan også tegne sig for den ujævne udvikling af sygdomme som åreforkalkning5,6,7.
Det er nyttigt at undersøge effekten af forskydning på ECs i kultur, hvor belastninger kan kontrolleres, og ECs kan isoleres fra andre celletyper. Almindeligt anvendt in vitro-enheder til påføring af forskydningsbelastning på ECs omfatter parallelpladeflowkammeret og kegle- og plade-viscometeret, men kun uniaxial steady, oscillatory og pulsatile flow kan påføres8,9. Selv om modificerede flow kamre med tilspidset eller forgrening geometrier og mikrofluidic chips, der efterligner en stenotisk geometri er blevet udviklet, deres lav-throughput og den relativt korte kultur varighed, der er muligt udgør en udfordring10, 11.
Orbital shaker (eller hvirvlende godt) metode til undersøgelse af endotel mekanotransduktion, hvor celler dyrkes i standard cellekultur plasticware placeret på platformen af en orbital shaker, får stigende opmærksomhed, fordi det er i stand til kronisk imponerende komplekse, rumligt varierende forskydning stress mønstre på ECs med høj gennemløb (se gennemgang af Warboys et al.12). Cfd-simuleringer (Computational Fluid Dynamics) er blevet anvendt til at karakterisere den rumlige og tidsmæssige variation af forskydningsstress i en hvirvlende brønd. Den hvirvlende bevægelse af kultur medium forårsaget af orbital bevægelse af shaker platform, hvor pladen er placeret fører til Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF, eller putatively pro-aterogen flow) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, eller putativt atheroprotective flow) på kanten af brøndene i en 6-brønd plade. For eksempel er tidsgennemsnit vægforskydningsbelastning (TAWSS) ca. 0,3 Pa i midten og 0,7 Pa på kanten af en 6-brønds plade hvirvlede ved 150 omdrejninger i minuttet med en 5 mm orbital radius13. Metoden kræver kun kommercielt tilgængelige plasticware og orbital shaker selv.
Der er dog en ulempe ved metoden (og andre metoder til at pålægge strømme in vitro): ECs frigive opløselige mæglere og mikropartikler på en forskydningsafhængig måde14,15,16 og denne sekrenom kan påvirke ECs i andre regioner end den, hvor de blev frigivet, på grund af blandingen i det hvirvlende medium. Dette kan maskere de faktiske virkninger af forskydningsstress på EF-fænotypen. For eksempel har Ghim et al. spekuleret i, at dette tegner sig for den tilsyneladende identiske indflydelse af forskellige forskydningsprofiler på transcellulær transport af store partikler17.
Her beskriver vi en metode til fremme af menneskelig navlestrengsåre endotelcelle (HUVEC) vedhæftning i bestemte områder af en 6-brønds plade ved hjælp af fibronectinbelægning, mens du bruger Pluronic F-127 til at passivere overfladen og forhindre vækst andre steder. Metoden løser den ovenfor beskrevne begrænsning, fordi ECs ved at segmentere cellevækst kun oplever én slags forskydningsprofil og ikke påvirkes af sekreter fra ECs, der udsættes for andre profiler andre steder i brønden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af anordninger og fremstilling af reagenser
- Fremstilling af modulet rustfrit stål
- Fremstille modulet rustfrit stål fra en klasse 316 rustfrit stål ved hjælp af en CNC-fræsemaskine i henhold til den leverede tekniske tegning (Figur 1).
- 3D-udskrivning af en polydimethylsiloxan (PDMS) skimmelsvamp
- Forbered en 3D-computerstøttet designmodel (CAD) af PDMS-formen ved hjælp af SolidWorks i henhold til den leverede tekniske tegning (Figur 2).
- Eksporter CAD-modellen til en STL-fil, og importer STL-filen til Cura 2.6.2.
- Skær modellen i lag med en udskrivningshastighed på 50 mm/s og infilltæthed på 60%.
- Eksporter filen som en G-kode, og overfør den til en Ultimaker2 3D-printer til udskrivning. Brug polylaktisk syre (PLA) som trykmateriale.
- Støbning af PDMS-ring
- Bland PDMS-basen og hærdningsmidlet (begge fra et silikoneelastomersæt) med forholdet 90,9% base og 9,1% hærdningsmiddel.
- Hæld ca. 2,6 ml af den velblandet opløsning i den 3D-printede form.
- Fjern bobler i et vakuum afgasning kammer.
- Hærde det i 1 time i en 80 °C ovn.
- Lad PDMS-ringen køle af til stuetemperatur, og fjern derefter den hærdede PDMS-ring forsigtigt fra formen. Den tekniske tegning af PDMS-ringen er vist i figur 3.
- Forberedelse af 1% Pluronic F-127
- Afvejes 5 g pluronic F-127, hæld det i en glasflaske, og tilsæt derefter 100 mL sterilt vand i glasflasken. Dette giver en 5% Pluronic F-127 løsning.
- Sørg for, at alt Pluronic F-127 pulver er nedsænket i vandet, luk hætten og autoklave det ved hjælp af en flydende sterilisering cyklus program.
- Efter autoklave skal opløsningen afkøles til stuetemperatur før brug.
- Tilsæt 10 ml pluronic F-127 opløsning til 40 ml autoklaveret sterilt vand for at fremstille 1% pluronic F-127 opløsning. Udformning i et biosikkerhedsskab (BSC) hætte.
- Opbevar både 1% og 5% Pluronic F-127 ved stuetemperatur.
- Fremstilling af paraformaldehyd (PFA) på 4%
- Der tilsættes 800 mL fosfatstødpudesal (PBS) til et glasbægerglas, og det opvarmes til 60 °C under omrøring (under omrøring fra trin 1.5.1 til 1.5.5).
- Der vejes 40 g PFA-pulver, og det tilsættes til den varme PBS-opløsning.
ADVARSEL: PFA er farlig, udfør trin 1.5.2 til 1.5.6 i en røghætte. - Der tilsættes langsomt 1 M natriumhydroxid (NaOH) i PFA-opløsningen, indtil opløsningerne bliver tydelige.
- PFA-opløsningens pH-opløsning justeres til ca. 7,4 med 1 M saltsyre (HCl).
- Fyld opløsningen op til 1 L med 1X PBS. Dette giver 1 L af 4% PFA.
- PFA-opløsningen filtreres med 0,2 μm filtre for at fjerne partikler, aliquot og fryse i en fryser på -20 °C.
- Forberedelse af 0,1% Triton-X
- Der tilsættes 50 μL ren Triton-X til 50 ml PBS for at fremstille 0,1% Triton-X opløsning.
- Forberedelse af 1% bovin serum albumin (BSA)
- Afvejes 0,5 g BSA, hældes det i en 50 mL centrifuge rør, og derefter tilføje 50 mL PBS i røret.
- Lad det rulle i 1 time ved stuetemperatur på en rulle for at opløse.
- Opbevar 1% BSA ved 4 °C i op til to uger.
2. Belægning af en 6-brønds plade
- Autoklave rustfrit stål modul, PDMS ring, og pincet før brug. Udfør alle efterfølgende procedurer i en BSC-hætte og overhold aseptiske teknikker for at sikre sterilitet.
- Placer PDMS-ringen i en 6-brønd ved hjælp af pincet. Brug PDMS-ringens udvendige kant til at justere PDMS-ringen koncentrisk med brønden.
BEMÆRK: Der bør kun anvendes ikke-vævskulturbehandlede brøndplader. - Placer modulet i rustfrit stål oven på PDMS-ringen med pincet.
- Sæt spidserne af den indvendige fastholdelse ring tænger i greb hullerne i fastholdelsesringen, klemme holderen for at reducere diameteren af fastholdelsesringen. Sæt den ind i 6-brønden, tryk den fast på modulet i rustfrit stål, og slip tangen for at sikre PDMS-ringen i brønden.
- Der tilsættes 1 mL på 5 μg/mL fibronectin i midten eller kanten af brønden (afhængigt af interesseområdet) gennem åbning af PDMS-ring og rustfrit stålmodul.
- Slyng pladen for at sikre, at fibronectinopløsningen dækker hele interesseområdet.
- Inkuber i 30 minutter ved 37 °C i en befugtet inkubator under 95% luft/5% CO2.
- Fibernectinopløsningen fjernes fra brønden og vaskes to gange med PBS. Fjern PBS helt fra brønden.
- Fjern støtteringen, modulet i rustfrit stål og PDMS-ringen fra brønden.
- Tilsæt 1,5 mL på 1% Pluronic F-127 ind i midten eller kanten af brønden (ubestrøget overflade) og inkuber i 1 time ved stuetemperatur for at passivere den ubestrøget overflade.
- Fjern Pluronic F-127 opløsningen fra brønden og vask tre gange med PBS.
- Brug den belagte brønd med det samme, eller opbevar den ved 4 °C i op til to uger med et lag PBS i den belagte brønd.
3. Såning af HUVEC'er
- Brug HUVEC'er under passage 5 i eksperimentet.
- Fjern alle kultur medium og vaske celler én gang med PBS.
- Der tilsættes 3 mL på 0,05% trypsin og inkuberes i 3 min ved 37 °C i en befugtet inkubator under 95% luft/5% CO2. Bank forsigtigt på kolben for at løsne cellerne.
BEMÆRK: Denne protokol er blevet testet ved hjælp af HUVEC'er, og koncentrationen af trypsin og dens inkubationstid kan være forskellig for andre typer EC'er. - Opløsningen overføres til et centrifugerør på 15 mL, og trypsin neutraliseres ved hjælp af 6 ml dyrkningsmedium (f.eks. Lonza EGM-2) på forhånd til 37 °C.
- Centrifuge ved 200 x g i 5 min. Fjern den neutraliserede trypsinopløsning og genbrugte celler med 1 ml forvarmet kulturmedium.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og frø 180k celler i en belagt 6-brønds plade i 1,5 mL af forvarmet kultur medium.
- Ryst brøndpladen sideværts for at sikre, at cellerne fordeler jævnt i brønden.
- Lad det stå i en 37 °C befugtet inkubator under 95% luft/5% CO2 natten over.
- Fjern de ubundne celler og kulturmediet og erstat med 2mL af prævarmet kulturmedium.
BEMÆRK: Der forventes mange ikke-vedhæftede celler, der flyder i mediet.
4. Shear stress ansøgning ved hjælp af en orbital shaker
- HUVEC'er bør opnå sammenløb efter 3 dages vækst. Mediet udskiftes med 1,9 mL forvarmet dyrkningsmedium (for at opnå en højde på 2 mm).
- Placer pladen på platformen af en orbital shaker i en befugtet inkubator under 95% luft / 5% CO2 og hvirvel det ved 150 omdrejninger i minuttet i 3 dage.
BEMÆRK: Tør orbital shakerens udvendige overflade af ved hjælp af 70% ethanol, før den placeres i inkubatoren. - (Valgfrit) Efter 2 dages forskydning kan cytokiner tilsættes til kulturmediet for at undersøge samspillet mellem cytokiner og forskydningsstress. Efter behandling forskydes cellerne til en anden dag. I denne undersøgelse blev TNF-α brugt til at aktivere cellerne.
- Udfør analyser efter 3 dages forskydningsstress.
5. Farvning og billeddannelse af celler
- Efter 3 dages forskydning skal pladen fjernes fra inkubatoren og vaskes celler to gange med PBS.
- Fix cellerne ved at tilføje 1,5 mL af 4% PFA i brønden og inkubere i 10 min ved stuetemperatur.
- Fjern 4% PFA fra brønden og vask to gange med PBS.
- Gennemtræng cellerne ved at tilføje 0,1% Triton-X i brønden og inkubere i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern 0,1% Triton-X-opløsningen fra brønden og tilsæt 1,5 ml 1% BSA i brønden til blokering. Inkuber cellerne med 1% BSA i 1 time ved stuetemperatur.
- Fortyndet kanin anti-human ZO-1 antistof ved en 1:200 fortynding i 1% BSA. Der tilsættes 1,5 mL fortyndet antistof i brønden og inkuberes med cellerne natten over ved 4 °C.
- Efter inkubation natten over skal du fjerne det fortyndede antistof og vaske celler tre gange med PBS.
- Fortynd Alexa Fluor 488-mærket ged anti-kanin IgG sekundære antistof på en 1:300 fortynding i PBS. Tilsæt 1,5 mL fortyndet sekundært antistof i brønden og inkuber det med cellerne i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern det fortyndede sekundære antistof og vask celler to gange med PBS.
- Draq5 fortyndes ved en fortynding på 1:1000 i PBS. Tilsæt 1,5 mL fortyndet DRAQ5 i brønden og inkuber den med cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur for at plette cellekernerne.
- Fjern den fortyndede DRAQ5 og vask tre gange med PBS.
- Udfør en flisescanning fra kanten til midten af brønden med et konfokalt mikroskop.
6. Kvantificering af figurindeks og cellenummer
- Post behandle billederne ved hjælp af MATLAB R2016a.
- Læs LIF-filen fra konfokalt mikroskop til MATLAB, og konverter den flettede flisescanning til et binært billede, og tærskel derefter billedet efter område og intensitet for at skelne kerner fra baggrund.
- Underopdel den binære flisescanning i 1 mm radiale segmenter.
- Sæt en ellipse på hver enkelt kerne.
- Tæl antallet af ellipser i hvert radialsegment for at give et cellenummer.
- Definer figurindekset = som SI = 4π x Område / Omkreds2. Beregn figurindekset for hver ellipse18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vedhæftning af HUVEC'er til regioner i brøndpladen, der ikke er belagt med fibronectin, blev ophævet af pluronic F-127 passivation; væksten var begrænset til den region, der var belagt med fibronectin, selv efter 72 timers kultur, med og uden forskydningsstressanvendelse(figur 4A, figur 4C). Uden den pluroniske F-127 passivering, HUVECs fastgjort til overfladen uden fibronectin og havde spredt sig yderligere med 72 h kultur (Figur 4B, Figur 4D).
Tilpasning og forlængelse af HUVECs er tydelige på kanten af en hvirvlende brønd, som har HMUF, mens cellerne i midten af brønden, som har LMMF, udstillet en brosten morfologi og ingen tilpasning (Figur 5A, Figur 5B). Forlængelse af HUVEC'er blev kvantificeret som formindeks: 4π x Område/Omkreds2. Et figurindeks på 1 angiver en cirkel, mens en værdi på 0 angiver en streg. Formindekset faldt med radial afstand fra midten, og der var ingen signifikant forskel mellem segmenterede og fulde brønde. TNF-α behandling øgede forlængelsen af HUVEC'er sammenlignet med ubehandlede kontroller (Figur 5C). HMUF øgede også antallet af HUVEC'er pr. mm2 sammenlignet med LMMF under begge forhold. Antallet af HUVEC'er steg gradvist med afstanden langs radius. Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i antallet af HUVEC'er, der dyrkes i segmenterede og fulde brønde (figur 6).
Figur 1 Teknisk tegning af modulet rustfrit stål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Dimensionerne er i mm.
Figur 2 Teknisk tegning af PDMS-form. Klik her for at se en større version af dette tal.
Dimensionerne er i mm.
Figur 3 Teknisk tegning af PDMS-ring, der bruges til at segmentere brøndene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Dimensionerne er i mm. Fra Ghim et al.13.
Figur 4 Mikroskopbilleder, der viser, at pluronic F-127 forhindrede menneskelig navlestrengsåre endotelceller (HUVECs) vedhæftning til regionen uden fibronectin belægning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ingen HUVECs var knyttet til den del af brønden overflade, der ikke var blevet forbehandlet med fibronectin før passivering med Pluronic F-127, efter 24 timer (A) og 72 h (C) af vækst. Uden pluronic F-127 passivering blev HUVEC'er fastgjort til overfladen uden fibronectin 24 timer efter såning (B) og var vokset yderligere med 72 timer (D). (Skalastang = 500 μm). Fra Ghim et al.13.
Figur 5 Morfologien af klippede HUVEC'er i en segmenteret eller fyldige brønd. Klik her for at se en større version af dette tal.
Nuklear (rød) plet viser morfologien af klippede HUVECs (A) i midten og (B) på kanten af en fuld brønd (skala bar = 100 μm). A og B viser også celle konturer, afgrænset af immunostaining af ZO-1 (grøn). Bemærk tilpasning og forlængelse af celler ved kanten, men ikke i midten (C) Ingen signifikant forskel i nuklear form indeks, der angiver rundhed, mellem HUVECs dyrket i fuld brønde og segmenterede brønde blev set for ubehandlet eller TNF-α behandlet HUVEC. Cellerne var mere aflange nær kanten af brønden. En tendens til større forlængelse i TNF-α-behandlede HUVEC'er var ikke konsekvent signifikant på tværs af steder. (Tovejs ANOVA og Bonferronis post hoc-test; n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Ghim et al.13
Figur 6 Antallet af HUVEC'er pr. mm2 steg med radial afstand i en hvirvlende brøndplade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel mellem fuldstændige og segmenterede brønde i tætheden af (A) ubehandlede og (B) TNF-α-behandlede HUVEC'er på forskellige radiale steder. I begge tilfælde var der flere celler pr. enhedsområde ved kanten end brøndens centrum. (Tovejs ANOVA og Bonferronis post hoc-test; n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Ghim etal. 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den hvirvlende-godt metode er i stand til at generere komplekse flow profiler i en enkelt brønd - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) på kanten af brønden. Imidlertid vil forskydningsstressmedierede sekreter af opløselig mægler blive blandet i det hvirvlende medium og påvirke celler i hele brønden, hvilket potentielt maskerer den sande effekt af en bestemt forskydningsstressprofil på cellerne.
Den belægningsmetode, der demonstreres her, overvinder dette problem ved at begrænse væksten af celler til en bestemt region i brønden. Celler typisk tillægger hydrofile overflader i stedet for hydrofobe dem. Af denne grund er polystyrenkultur ware forbehandlet med plasmaoxidation. Alternativt kan hydrofobe overflader belægges med ekstracellulære matrixproteiner som fibronectin, som det fremgår af denne protokol; ikke-fibronectinbelagte områder blev passiveret med pluronic F-127 for at forhindre resterende vedhæftning til den hydrofobe overflade.
Denne protokol er afhængig af nøjagtigheden af den trykte form. Afhængigt af 3D-printeren kan der være variation i formens nøjagtige dimensioner. Dette vil påvirke den endelige PDMS-konstruktion, hvilket igen vil resultere i, at cellerne klæber på et forkert sted i brønden. Cellerne vil derfor opleve en anden forskydningsstressprofil end den, der er modelleret af CFD. En anden ulempe ved at bruge en 3D-printer er, at formen muligvis ikke er flad på grund af vridning under udskrivningen. Dette vil resultere i den endelige PDMS-konstruktion, der gør det muligt for Pluronic F-127 at lække nedenunder, hvilket forhindrer celler i at klæbe på de ønskede steder. Derfor er det vigtigt at kontrollere for lækager og måle dimensionen af PDMS-konstruktionen før brug.
Denne metode er enkel, men effektiv til at tillade anvendelse af en bestemt type forskydningsbelastning (HMUF eller LMMF) på celler. Det er også praktisk at oprette, da de fleste af forbrugsstofferne, reagenser og udstyr er kommercielt tilgængelige. Ved hjælp af denne metode ikke kun tillader undersøgelse eller høst af celler udsat for veldefinerede strømme, men gør det muligt at indsamle medium konditioneret af disse celler. Metoden giver en ny vej undersøge endotel mekanobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender taknemmeligt et British Heart Foundation-projekttilskud (til PDW), et National Medical Research Council Singapore TAAP og DYNAMO Grant (til XW, NMRC / OFLCG/004/2018, NMRC / OFLCG/001/2017), et A * STAR Graduate Scholarship (til KTP) og et British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (til MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
