Summary
该协议描述了一种涂层方法，使用轨道摇床模型将内皮细胞生长限制在 6 井板的特定区域，用于剪切应力应用。
Abstract
血液流动对动脉壁施加的剪切应力影响内皮细胞形态和功能。低震级、振荡和多向剪切应力都被假定用于刺激内皮细胞中的亲动脉粥样硬化表型，而高震级和单向或单轴剪切被认为会促进内皮平衡。这些假设需要进一步研究，但传统的体外技术有局限性，在将多向剪切应力强加于细胞方面尤其差。
一种越来越被使用的方法是在轨道摇床平台上的标准多井板中培养内皮细胞：在这种简单、低成本、高通量和慢性方法中，涡流介质在油井的不同部分产生不同的剪切模式和幅度，包括多向剪切。然而，它有一个显著的限制：一个区域的细胞暴露在一种类型的流动中，可能会将调停器释放到影响井中其他部分的细胞的介质中，暴露在不同的流中，从而扭曲流和表型之间的明显关系。
在这里，我们介绍了一个简单和负担得起的方法修改，允许细胞暴露在特定的剪切应力特性。细胞播种仅限于油井的指定区域，将感兴趣的区域涂上纤维素，然后使用被动溶液进行活化。随后，板可以在摇床上旋转，导致细胞暴露在定义明确的剪切轮廓，如低震级多向剪切或高震级单轴剪切，这取决于其位置。与以往一样，使用标准的细胞培养塑料器皿可以直接进一步分析细胞。修改已经允许在定义的剪切应力特性下从内皮释放的可溶性介质的演示，这些细胞会影响位于井中其他地方的细胞。
Introduction
血管细胞对其机械环境的反应对血管的正常功能和疾病1的发展具有重要意义。排列在所有血管内表面的内皮细胞（ECs）的机械生物学一直是机械生物学研究的一个特别重点，因为ECs直接体验到血流产生的剪切应力。各种表型变化，如炎症反应，改变刚度和形态，血管活性物质的释放，以及结点蛋白的本地化和表达取决于EC暴露在剪切应力2，3，4。依赖剪切的内皮特性也可能是动脉粥样硬化5、6、7等疾病的零星发展的原因。
研究剪切对培养中 CC 的影响是有用的，因为文化可以控制应力，而 EC 可以与其他细胞类型隔离。常用的体外装置用于将剪切应力应用于 UC，包括平行板流室和锥板测速仪，但只能应用单轴稳定、振荡和脉动流8、9。虽然已开发出具有锥形或分支几何形状的改性流室和模仿维持几何形状的微流芯片，但其低通量和相对较短的文化持续时间可能构成挑战10， 11。
用于研究内皮机械转移的轨道摇床（或旋转良好）方法，即细胞生长在放置在轨道摇床平台上的标准细胞培养塑料器皿中，正日益受到关注，因为它能够长期将复杂、空间变化的剪切应力模式强加于吞吐量高的 ES 上（见 Warboys 等人的评论）。已采用计算流体动力学 （CFD） 模拟来描述旋转井中剪切应力的空间和时间变化。放置板的摇床平台的轨道运动引起的培养介质的旋转运动导致中心低震级多向流（LMMF，或假定亲热流）和6井板块井边缘的高震级单轴流（HMUF，或假定动脉保护流）。例如，时间平均壁切变应力 （TAWSS） 在中心约为 0.3 Pa，在 6 井板的边缘为 0.7 Pa，在 150 rpm 旋转，轨道半径为 5 毫米，半径为 13。该方法只需要市售的塑料制品和轨道摇床本身。
然而，这种方法（以及体外施加流动的其他方法）有一个缺点：由于旋转介质中的混合，IC以依赖剪切的方式释放可溶性介质和微粒，这种分泌物可能会影响井下区域的ECs，而不是释放的区域。这可能掩盖剪切应力对EC表型的实际影响。例如，Ghim等人推测，这解释了不同剪切图对大粒子17的跨细胞传输的明显相同影响。
在这里，我们描述了一种方法，促进人类脐带内皮细胞（HUVEC）粘附在6井板的特定区域使用纤维素涂层，同时使用Pluronic F-127传递表面，防止生长其他地方。该方法解决了上述限制，因为通过细分细胞生长，ECs 只体验一种剪切轮廓，并且不受暴露于井中其他配置文件的 EC 的分泌物的影响。
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Protocol
1. 制造设备和制备试剂
- 不锈钢模块的制造
- 根据提供的工程图（图1），使用数控铣床从316级不锈钢中制造不锈钢模块。
- 多晶硅氧烷 （PDMS） 模具的 3D 打印
- 根据提供的工程图（图2），使用固体工程制作 PDMS 模具的 3D 计算机辅助设计 （CAD） 模型。
- 将 CAD 模型导入 STL 文件，并将 STL 文件导入库拉 2.6.2。
- 将模型切成打印速度为 50 mm/s 的层，填充密度为 60%。
- 将文件导出为 G 代码，并将其上传到 Ultimaker2 3D 打印机进行打印。使用聚乳酸 （PLA） 作为印刷材料。
- PDMS 环的铸造
- 将 PDMS 碱基和固化剂（均来自硅胶弹性剂套件）与 90.9% 碱基和 9.1% 固化剂的比例混合。
- 将混合良好的溶液约 2.6 mL 倒入 3D 打印模具中。
- 去除真空脱气室中的气泡。
- 在80°C的炉子里治疗1小时。
- 允许 PDMS 环冷却到室温，然后小心地从模具中取出固化的 PDMS 环。PDMS环的工程图见图3。
- 准备 1% 普鲁罗尼奇 F-127
- 称出5克普鲁罗尼克F-127，倒入玻璃瓶中，然后将100毫升无菌水加入玻璃瓶中。这提供了 5% 的普鲁罗尼奇 F-127 解决方案。
- 确保所有 Pluronic F-127 粉末都浸入水中，关闭盖子，并使用液体灭菌循环程序将其高压灭菌。
- 高压灭菌后，让溶液冷却到室温后再使用。
- 将 10 毫升 5% 的普鲁罗尼克 F-127 溶液添加到 40 mL 的自碎无菌水中，使 1% 的普鲁罗尼克 F-127 解决方案。在生物安全柜 （BSC） 罩中执行稀释。
- 在室温下存放 1% 和 5% 的普鲁罗尼奇 F-127。
- 准备4%甲醛（PFA）
- 将 800 毫升磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 添加到玻璃烧杯中，在搅拌时加热至 60 °C（从步骤 1.5.1 到 1.5.5 继续搅拌）。
- 称 40 克 PFA 粉末，并将其添加到温暖的 PBS 解决方案中。
注意：PFA 是危险的，在烟罩中执行步骤 1.5.2 到 1.5.6。 - 将 1 M 氢氧化钠 （NaOH） 慢慢放入 PFA 解决方案中，直到解决方案变清晰。
- 将 PFA 溶液的 pH 调整到大约 7.4，含 1 M 盐酸 （HCl）。
- 用 1X PBS 充值 1 L 的解决方案。这给出了 1 L 的 4% PFA。
- 用 0.2μm 过滤器过滤 PFA 溶液，以去除任何颗粒、液化物并在 -20 °C 冰柜中冻结。
- 准备 0.1% 特里顿-X
- 将 50 μL 的纯三顿 X 添加到 50 mL 的 PBS 中，使 0.1% 的特里顿-X 解决方案。
- 准备1%牛血清白蛋白（BSA）
- 重量为 0.5 克 BSA，将其倒入 50 mL 离心机管中，然后将 50 mL 的 PBS 添加到管中。
- 让它在滚筒的室温下滚动1小时溶解。
- 在 4 °C 下存储 1% BSA，最长达两周。
2. 涂装 6 井板
- 使用前，自动结块不锈钢模块、PDMS 环和钳子。在 BSC 罩中执行所有后续程序，并观察无菌技术，以确保无菌。
- 使用钳子将 PDMS 环放在 6 井中。使用 PDMS 环的外部边缘将 PDMS 环与井同心对齐。
注意：应仅使用未经组织培养处理良好的板材。 - 使用钳子将不锈钢模块放在 PDMS 环的顶部。
- 将内部保留环钳的尖端插入固定环的抓地力孔中，挤压支架以减少保留环的直径。将其放入 6 井中，将其牢牢压在不锈钢模块上，并释放钳子，以确保井中的 PDMS 环。
- 通过打开 PDMS 环和不锈钢模块，将 1 mL 的 5μg/mL 纤维素添加到井的中心或边缘（取决于感兴趣的区域）。
- 旋转板，以确保纤维素溶液覆盖所有感兴趣的区域。
- 在 95% 空气/5% CO2下的加湿孵化器中，在 37 °C 下孵化 30 分钟。
- 从井中取出纤维素溶液，用PBS洗两次。从井中完全取出PBS。
- 从井中取出固定环、不锈钢模块和 PDMS 环。
- 将 1.5 毫升的 1% 普鲁罗尼克 F-127 添加到井的中心或边缘（未涂层表面），并在室温下孵育 1 小时，以传递未涂层表面。
- 从井中取出普鲁罗尼奇 F-127 溶液，用 PBS 清洗三次。
- 立即使用涂层井或将其存放在 4 °C 处长达两周，涂层井中包含一层 PBS。
3. 胡韦茨的播种
- 在实验中使用第 5 段以下的 HUVEC。
- 去除所有培养介质，用 PBS 清洗一次细胞。
- 在 95% 空气/5% CO 2 下的加湿孵化器中加入 3 mL 的 0.05% trypsin，在 37 °C 下孵育3分钟。轻轻敲击烧瓶以驱散细胞。
注意：此协议已使用 HUVEC 进行了测试，对于其他类型的 EC，trypsin 的浓度及其潜伏时间可能有所不同。 - 将溶液转移到 15 mL 离心机管中，使用 6 mL 的培养介质（例如，Lonza EGM-2）将试管预热至 37 °C 中和。
- 离心机在200 x g 5分钟。取出中和的肌氨脂溶液，用1mL预热培养介质重新加热细胞。
- 使用血细胞仪和种子 180k 细胞将细胞计数，在 1.5 mL 预热培养介质中涂层 6 井板。
- 横向摇动井板，确保细胞均匀地分布在井中。
- 将其留在 37 °C 加湿孵化器中，低于 95% 空气/5% CO2 过夜。
- 取出未连接的细胞和培养介质，代之以 2mL 预热培养介质。
注意：预计许多未连接的细胞会漂浮在介质中。
4. 使用轨道摇床剪切应力应用
- 经过3天的生长，HUVEC应该会达到汇合。将介质替换为 1.9 mL 预热培养介质（达到 2 mm 的高度）。
- 将板放在湿润的孵化器平台上，在 95% 空气/5% CO2 下，以 150 rpm 旋转 3 天。
注意：在将乙醇放入孵化器之前，使用 70% 乙醇擦拭轨道摇床的外部表面。 - （可选）经过2天的剪切，细胞因子可以添加到培养基，以研究细胞因子和剪切应力之间的相互作用。治疗后，再切细胞一天。在这项研究中，TNF-α被用来激活细胞。
- 在剪切应力应用 3 天后进行分析。
5. 细胞的染色和成像
- 剪完 3 天后，从孵化器中取出板，用 PBS 洗两次细胞。
- 将 1.5 mL 的 4% PFA 添加到井中，并在室温下孵育 10 分钟，从而修复细胞。
- 从井中取出 4% 的 PFA，用 PBS 洗两次。
- 通过将 0.1% 的 Triton-X 添加到井中并在室温下孵育 5 分钟，使细胞渗透。
- 从井中取出 0.1% 的 Triton-X 溶液，并将 1.5 mL 的 1% BSA 添加到井中进行阻塞。在室温下用 1% BSA 孵化细胞 1 小时。
- 稀释兔子抗人类ZO-1抗体在1：200稀释在1%BSA。将 1.5 mL 的稀释抗体加入井中，并在 4 °C 的夜间用细胞孵育。
- 隔夜孵育后，取出稀释后的抗体，用PBS清洗细胞三次。
- 稀释亚历克萨氟 488 标签山羊抗兔 Igg 次要抗体在 Pbs 的 1：300 稀释。将 1.5 mL 的稀释二次抗体加入井中，并在室温下与细胞一起孵育 1 小时。
- 去除稀释的二次抗体，用PBS洗两次细胞。
- 在 PBS 中稀释 1：1000 时稀释 DRAQ5。将 1.5 mL 的稀释 DRAQ5 添加到井中，并在室温下用细胞孵育 15 分钟，以染色细胞核。
- 取出稀释后的 DRAQ5，用 PBS 洗三次。
- 使用共焦显微镜执行从边缘到井中央的瓷砖扫描。
6. 形状指数和细胞编号的量化
- 使用 MATLAB R2016a 处理图像后。
- 从共焦显微镜中读取 LIF 文件到 MATLAB，将合并后的磁贴扫描转换为二进制图像，然后按区域和强度对图像进行阈值，以区分核与背景。
- 将二进制磁贴扫描细分为 1 mm 径向段。
- 将椭圆贴在每个内部。
- 计算每个径向段内的椭圆数，以给出一个单元格编号。
- 将形状索引定义为 SI = 4× x 区域 / 周边2。计算每个椭圆18的形状索引。
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Representative Results
HUVEC粘附到未涂有纤维素的井板区域，被普鲁罗尼奇F-127的通活性所废除：生长仅限于涂有纤维素的区域，即使在72小时的文化之后，有和没有剪切应力应用（图4A，图4C）。没有普鲁罗尼奇F-127的通电，HUVEC连接到表面没有纤维素，并进一步扩散了72小时的文化（图4B，图4D）。
HUVEC 的对齐和拉长在有 HMUF 的旋转井的边缘很明显，而具有 LMMF 的井中央的细胞则表现出鹅卵石形态，没有对齐（图 5A，图 5B）。HUVEC 的伸长被量化为形状索引： 4 × x 区域/周边2。形状指数为 1 表示一个圆，而值为 0 表示一行。形状指数随着距离中心径向距离而下降，分段井和全井之间没有显著差异。与未经治疗的对照组（图5C）相比，TNF-α治疗增加了HUVEC的拉长。与这两种条件下的LMMF相比，HMUF还增加了每毫米2的HUVEC数量。随着半径的距离，HUVEC 的数量逐渐增加。在分段和全井中生长的HUVEC数量没有显著差异（图6）。
图 1不锈钢模块的工程图。请点击这里查看此图的更大版本。
尺寸在毫米。
图 2 Pdms 模具的工程图。请点击这里查看此图的更大版本。
尺寸在毫米。
图 3 用于分段油井的 Pdms 环的工程图。请单击此处查看此图的较大版本。
尺寸在毫米。从吉姆等人13。
图4显微镜图像显示，普鲁罗尼奇F-127阻止人类脐带内皮细胞（HUVECs）粘附到该地区，没有纤维素涂层。请点击这里查看此图的更大版本。
在24小时（A）和72小时（C）的生长后，在普鲁罗尼奇F-127的通过之前，没有HUVEC连接到井面未预处理过纤维素的部分。没有普鲁罗尼奇F-127的通电，HUVEC在播种后24小时没有纤维素，并且进一步扩散到72h（D）。（比例杆 =500μm）。从吉姆等人13。
图 5分割或完全井中剪切的 HUVEC 的形态。请单击此处查看此图的较大版本。
核（红色）污渍显示中间剪切的 HUVEC （A）和（B）在全井边缘（比例杆 = 100μm）的形态。A和B还显示细胞轮廓，通过 ZO-1（绿色）的免疫维护来描述。请注意，在边缘而不是中心（C）的细胞的排列和拉长在核形状指数（表示圆形）上没有显著差异，在全井中生长的 HUVEC 和细分井之间，未处理或 TNF-α处理的 HUVEC。细胞在井边拉长得更长。TNF-α处理的HUVEC中，更延长的倾向在各地并不一贯显著。（双向 ANOVA 和邦费罗尼的临时测试后; n = 3）。这一数字已从吉姆等人13人修改
图6每毫米2 的 HUVEC 数量随着旋转井板的径向距离而增加。 请单击此处查看此图的较大版本。
在不同径向位置，未处理 的 （A） 和 （B） TNF-α处理的 HUVEC 密度中未发现全井和分段井之间的显著差异。在这两种情况下，每个单位区域在边缘的细胞都比井中心多。（双向 ANOVA 和邦费罗尼的临时测试后; n = 3）。这个数字已经从吉姆等人13日修改。
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Discussion
旋转井方法能够在单口井中生成复杂的流剖面 - 中心低震级多向流 （LMMF） 和井边缘的高震级单轴流 （HMUF）。然而，可溶性介质的剪切应激介分泌物将混合在漩涡介质中，影响整个井中的细胞，从而可能掩盖特定剪切应力特征对细胞的真正影响。
这里演示的涂层方法通过将细胞的生长限制在井的特定区域来克服这个问题。细胞通常附着在亲水表面，而不是疏水表面。因此，聚苯乙烯培养洁具是用等离子氧化预处理的。或者，疏水表面可以涂上细胞外基质蛋白，如纤维素，如本协议所示：非纤维素涂层区域与普鲁罗尼克F-127一起通电，以防止任何残留粘附在疏水表面。
此协议取决于打印模具的准确性。根据 3D 打印机的不同，模具的确切尺寸可能会有变化。这将影响最终的 PDMS 构造，这反过来又会导致细胞粘附在井内不正确的位置。因此，这些细胞将经历除差价合约模拟的剪切应力特征外的其他情况。使用 3D 打印机的另一个缺点是，由于打印过程中的扭曲，模具可能不平整。这将导致最终的 PDMS 构造允许 Pluronic F-127 在下面泄漏，防止细胞粘附在所需的位置。因此，在使用前检查泄漏并测量 PDMS 构造的尺寸至关重要。
这种方法简单而有效，允许将特定类型的剪切应力（HMUF或LMMF）应用于细胞。由于大多数耗材、试剂和设备均市售，因此设置也很方便。使用这种方法不仅允许检查或收获暴露在明确定义流动中的细胞，而且还允许收集由这些细胞调节的中等条件的细胞。该方法为研究内皮机械生物学提供了一条新途径。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢英国心脏基金会项目赠款（PDW）、新加坡国家医学研究理事会TAAP和DYNAMO赠款（XW、NMRC/OFLCG/004/2018、NMRC/OFLCG/001/2017）、A*STAR研究生奖学金（致KTP）和英国心脏基金会卓越研究中心（MA）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
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