Summary
Detta protokoll beskriver en beläggningsmetod för att begränsa endotel cell tillväxt till en viss region i en 6-brunns platta för shear stress ansökan med hjälp av orbital shaker modell.
Abstract
Shear stress påtvingas på artärväggen genom blodflödet påverkar endotelcellsmorfologi och funktion. Låg magnitud, oscillaterande och multidirectional shear påfrestningar har alla postulerats för att stimulera en pro-atherosclerotic fenotyp i endotelceller, medan hög magnitud och enkelriktad eller enaxial sax tros främja endotelial homeostas. Dessa hypoteser kräver ytterligare undersökning, men traditionella in vitro-tekniker har begränsningar och är särskilt dåliga på att införa multidirectional shear stress på celler.
En metod som får allt större användning är att odla endotelceller i vanliga multibrunnsplattor på plattformen för en orbital shaker; I denna enkla, billiga, hög genomströmning och kroniska metod producerar det virvlande mediet olika mönster och magnitud på sajuvning, inklusive multidirectional sav, i olika delar av brunnen. Det har dock en betydande begränsning: celler i en region, utsatta för en typ av flöde, kan frigöra medlare i mediet som påverkar celler i andra delar av brunnen, utsatta för olika flöden, vilket förvränger det uppenbara förhållandet mellan flöde och fenotyp.
Här presenterar vi en enkel och prisvärd modifiering av metoden som gör det möjligt för celler att exponeras endast för specifika savspänningsegenskaper. Cellfröning är begränsad till en definierad region i brunnen genom att täcka den region som är av intresse med fibronectin, följt av passivering med passiveringslösning. Därefter kan plattorna virvlas på skakapparaten, vilket resulterar i exponering av celler för väldefinierade saxprofiler som multidirektionell sax med låg magnitud eller enaxialsaxialsax med hög magnitud, beroende på deras placering. Som tidigare möjliggör användningen av standard cellkulturartiklar enkel ytterligare analys av cellerna. Ändringen har redan gjort det möjligt att demonstrera lösliga medlare, som frigörs från endotel under definierade savspänningsegenskaper, som påverkar celler som finns någon annanstans i brunnen.
Introduction
Svar från kärlceller på deras mekaniska miljö är viktiga i blodkärlens normala funktion och i utvecklingen av sjukdom1. Mekanobiologin hos de endotelceller (ECs) som kanterar den inre ytan av alla blodkärl har varit ett särskilt fokus för mekanobiologisk forskning eftersom ECs direkt upplever den saxstress som genereras av blodflödet över dem. Olika fenotypiska förändringar såsom inflammatoriska svar, förändrad styvhet och morfologi, frisättning av vasoaktiva ämnen och lokalisering och uttryck av junctional proteiner beror på EG exponering för sax stress2,3,4. Shear-beroende endotel egenskaper kan också förklara ojämn utveckling av sjukdomar såsom åderförkalkning5,6,7.
Det är användbart att studera effekten av sav på ECs i kultur, där påfrestningar kan kontrolleras, och ECs kan isoleras från andra celltyper. Vanliga in vitro-anordningar för applicering av saxspänning på ECs inkluderar parallellplåtens flödeskammare och kon- och plåtviscometern, men endast enaxialt stadigt, svängbart och pulsatilt flöde kanappliceras 8,9. Även om modifierade flödeskammare med avsmalnande eller förgrenande geometrier och mikrofluidiska chips som efterliknar en stenotisk geometri har utvecklats, utgör deras låga genomströmning och den relativt korta kulturtid som är möjlig en utmaning10, 11.
Orbital shaker (eller virvlande väl) metoden för studier av endotel mekanotransduktion, där celler odlas i standard cellkultur plastartiklar placerade på plattformen för en orbital shaker, får allt större uppmärksamhet eftersom den kan kroniskt införa komplexa, rumsligt varierande sax stressmönster på ECs med hög genomströmning (se granskning av Warboys et al.12). Beräkningsvätska dynamik (CFD) simuleringar har använts för att karakterisera rumsliga och tidsmässiga variationen av shear stress i en virvlande brunn. Den virvlande rörelsen hos odlingsmediet som orsakas av omloppsrörelsen hos den shakerplattform på vilken plattan placeras leder till multidirektionellt flöde med låg magnitud (LMMF, eller förföriskt pro-aterogent flöde) i mitten och Uniaxial Flow med hög magnitud (HMUF, eller putativt ateroprotektivt flöde) vid kanten av brunnarna på en 6-brunnsplatta. Till exempel är tidsgenomsnittad väggsjuvspänning (TAWSS) cirka 0,3 Pa i mitten och 0,7 Pa vid kanten av en 6-brunnsplatta virvlad vid 150 varv/min med en 5 mm omloppsradie13. Metoden kräver endast kommersiellt tillgängliga plastartiklar och själva orbital shakern.
Det finns dock en nackdel med metoden (och andra metoder för att införa flöden in vitro): ECs släpper lösliga medlare och mikropartiklar på ett savberoende sätt14,15,16 och denna secretome kan påverka ECs i andra regioner än den där de släpptes, på grund av blandningen i det virvlande mediet. Detta kan dölja de faktiska effekterna av sax stress på EG fenotyp. Till exempel har Ghim et al. spekulerat i att detta står för det till synes identiska inflytandet av olika savprofiler på transcellulär transport av stora partiklar17.
Här beskriver vi en metod för att främja mänsklig navelsträngsmörjningscell (HUVEC) vidhäftning i specifika regioner av en 6-brunnsplatta med fibronectinbeläggning medan du använder Pluronic F-127 för att passivera ytan och förhindra tillväxt någon annanstans. Metoden löser den begränsning som beskrivs ovan eftersom ECs, genom att segmentera celltillväxt, endast upplever en typ av savprofil och inte påverkas av secretomes från ECs som exponeras för andra profiler någon annanstans i brunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av anordningar och beredning av reagenser
- Tillverkning av rostfri modul
- Tillverka den rostfria modulen av rostfritt stål av rostfritt stål av klass 316 med hjälp av en CNC-fräsmaskin enligt den medföljande konstruktionsritningen (figur 1).
- 3D-utskrift av en pdms-form (polydimethylsiloxane)
- Förbered en 3D-datorstödd designmodell (CAD) av PDMS-formen med SolidWorks enligt den medföljande tekniska ritningen (Figur 2).
- Exportera CAD-modellen till en STL-fil och importera STL-filen till Cura 2.6.2.
- Skär modellen i lager med en utskriftshastighet på 50 mm/s och fyllnadstätheten på 60 %.
- Exportera filen som en G-kod och ladda upp den till en Ultimaker2 3D-skrivare för utskrift. Använd polylaktisk syra (PLA) som tryckmaterial.
- Gjutning av PDMS-ring
- Blanda PDMS-bas- och härdningsmedel (båda från ett silikon elastomer kit) med förhållandet 90,9% bas och 9,1% härdningsmedel.
- Häll cirka 2,6 ml av den välblandade lösningen i den 3D-printade formen.
- Ta bort bubblor i en vakuumavgasningskammare.
- Härda den i 1 timme i en 80 °C ugn.
- Låt PDMS-ringen svalna till rumstemperatur och ta sedan bort den härdade PDMS-ringen försiktigt från formen. Den tekniska ritningen av PDMS-ringen visas i figur 3.
- Beredning av 1% Pluronic F-127
- Väg ut 5 g Pluronic F-127, häll den i en glasflaska och tillsätt sedan 100 ml sterilt vatten i glasflaskan. Detta ger en 5% Pluronic F-127 lösning.
- Se till att allt pluronic F-127 pulver är nedsänkt i vattnet, stäng locket och autoklavera det med hjälp av ett flytande steriliseringsprogram.
- Efter autoklav, låt lösningen svalna till rumstemperatur före användning.
- Tillsätt 10 ml pluronic F-127-lösning till 40 ml autoklaverat sterilt vatten för att göra 1% Pluronic F-127-lösning. Utför utspädningen i en BSC-huva (Biosafety Cabinet).
- Förvara både 1% och 5% Pluronic F-127 vid rumstemperatur.
- Beredning av 4% paraformaldehyd (PFA)
- Tillsätt 800 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en glasbägare och värm den till 60 °C under omrörning (fortsätt omröra från steg 1.5.1 till 1.5.5).
- Väg 40 g PFA-pulver och tillsätt det till den varma PBS-lösningen.
VARNING: PFA är farligt, utför steg 1.5.2 till 1.5.6 i en rökhuv. - Tillsätt 1 M natriumhydroxid (NaOH) långsamt droppe i PFA-lösningen tills lösningarna blir klara.
- Justera PFA-lösningens pH-vatten till cirka 7,4 med 1 M saltsyra (HCl).
- Toppa lösningen till 1 L med 1X PBS. Detta ger 1 L av 4% PFA.
- Filtrera PFA-lösningen med 0,2 μm filter för att avlägsna partiklar, alikvot och frysa i en -20 °C frys.
- Beredning av 0,1% Triton-X
- Tillsätt 50 μL ren Triton-X i 50 ml PBS för att göra 0,1% Triton-X-lösning.
- Beredning av 1% bovint serumalbumin (BSA)
- Väg 0,5 g BSA, häll det i ett 50 ml centrifugeringsrör och tillsätt sedan 50 ml PBS i röret.
- Låt den rulla i 1 timme vid rumstemperatur på en rulle för att lösa upp.
- Förvara 1% BSA vid 4 °C i upp till två veckor.
2. Beläggning av en 6-brunnsplatta
- Autoklav rostfritt stål modul, PDMS ring och pincett före användning. Utför alla efterföljande procedurer i en BSC-huva och observera aseptiska tekniker för att säkerställa sterilitet.
- Placera PDMS-ringen i en 6-brunns med pincett. Använd PDMS-ringens yttre kant för att rikta in PDMS-ringen koncentriskt mot brunnen.
OBS: Endast icke-vävnadskulturbehandlade brunnsplattor ska användas. - Placera den rostfria modulen ovanpå PDMS-ringen med pincett.
- Sätt in spetsarna på den inre låsringens tång i griphålen på låsringen, pressa hållaren för att minska diametern på låsringen. Montera den i 6-brunnen, tryck den ordentligt på rostfria modulen och släpp tången för att säkra PDMS-ringen i brunnen.
- Tillsätt 1 ml 5 μg/ml fibronektin i mitten eller kanten av brunnen (beroende på intresseområde) genom att öppna PDMS-ringen och rostfria modulen.
- Snurra plattan för att säkerställa att fibronectinlösningen täcker hela intresseområdet.
- Inkubera i 30 min vid 37 °C i en fuktad inkubator under 95 % luft/5 % CO2.
- Ta bort fibronectinlösningen från brunnen och tvätta två gånger med PBS. Ta helt bort PBS från brunnen.
- Ta bort låsringen, rostfria modulen och PDMS-ringen från brunnen.
- Tillsätt 1,5 ml 1% Pluronic F-127 i mitten eller kanten på brunnen (obestruken yta) och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur för att passivera den obelagda ytan.
- Ta bort Pluronic F-127-lösningen från brunnen och tvätta tre gånger med PBS.
- Använd den belagda brunnen omedelbart eller förvara den vid 4 °C i upp till två veckor med ett lager PBS i den belagda brunnen.
3. Sådd av HUVEC
- Använd HUVECs under passage 5 i experimentet.
- Ta bort allt odlingsmedium och tvätta cellerna en gång med PBS.
- Tillsätt 3 ml 0,05% trypsin och inkubera i 3 min vid 37 °C i en fuktad inkubator under 95% luft/5% CO2. Knacka försiktigt på kolven för att lossa cellerna.
OBS: Detta protokoll har testats med HUVECs och koncentrationen av trypsin och dess inkubationstid kan vara annorlunda för andra typer av ECs. - Överför lösningen till ett 15 ml centrifugeringsrör och neutralisera trypsinet med 6 ml odlingsmedium (t.ex. Lonza EGM-2) som är förvärmt till 37 °C.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min. Ta bort den neutraliserade trypsinlösningen och återanvända celler med 1 ml förvärmt odlingsmedium.
- Räkna cellerna med hjälp av en haemocytometer och frö 180k celler i en belagd 6-brunnsplatta i 1,5 ml förvärmt odlingsmedium.
- Skaka brunnsplattan i lydnad för att säkerställa att cellerna fördelas jämnt i brunnen.
- Låt den vara i en fuktad inkubator på 37 °C under 95 % luft/5 % CO2 över natten.
- Ta bort de obundna cellerna och odlingsmediet och ersätt med 2 mL förvärmt odlingsmedium.
OBS: många obundna celler som flyter i mediet förväntas.
4. Shear stressapplikation med hjälp av en orbital shaker
- HUVECs bör nå sammanflöde efter 3 dagars tillväxt. Ersätt mediet med 1,9 ml förvärmt odlingsmedium (för att uppnå en höjd av 2 mm).
- Placera plattan på plattformen för en orbital shaker i en fuktad inkubator under 95% luft/5% CO2 och snurra den vid 150 varv/min i 3 dagar.
OBS: Torka av den yttre ytan på orbital shakern med 70% etanol innan du placerar den i inkubatorn. - (Valfritt) Efter 2 dagars savning kan cytokiner läggas till odlingsmediet för att undersöka samspelet mellan cytokiner och savstress. Efter behandlingen, sav cellerna i en annan dag. I denna studie användes TNF-α för att aktivera cellerna.
- Utför analyser efter 3 dagars shear stress ansökan.
5. Färgning och avbildning av celler
- Efter 3 dagars sax, ta bort plattan från inkubatorn och tvätta cellerna två gånger med PBS.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 1,5 ml 4% PFA i brunnen och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort 4% PFA från brunnen och tvätta två gånger med PBS.
- Permeabilisera cellerna genom att lägga till 0,1% Triton-X i brunnen och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort 0,1% Triton-X-lösningen från brunnen och tillsätt 1,5 ml 1% BSA i brunnen för blockering. Inkubera cellerna med 1% BSA i 1 timme vid rumstemperatur.
- Späd kanin anti-human ZO-1 antikropp vid en utspädning på 1:200 i 1% BSA. Tillsätt 1,5 ml utspädd antikropp i brunnen och inkubera den med cellerna över natten vid 4 °C.
- Efter inkubation över natten, ta bort den utspädda antikroppen och tvätta cellerna tre gånger med PBS.
- Späd Alexa Fluor 488-märkt get antikanin IgG sekundär antikropp vid en 1:300 utspädning i PBS. Tillsätt 1,5 ml utspädd sekundär antikropp i brunnen och inkubera den med cellerna i 1 timme vid rumstemperatur.
- Ta bort den utspädda sekundära antikroppen och tvätta cellerna två gånger med PBS.
- Späd DRAQ5 vid en utspädning på 1:1000 i PBS. Tillsätt 1,5 ml utspädd DRAQ5 i brunnen och inkubera den med cellerna i 15 minuter vid rumstemperatur för att färga cellkärnorna.
- Ta bort den utspädda DRAQ5 och tvätta tre gånger med PBS.
- Utför en panelskanning från kanten till mitten av brunnen med ett konfokalt mikroskop.
6. Kvantifiering av formindex och cellnummer
- Posta bilderna med MATLAB R2016a.
- Läs LIF-filen från konfokalt mikroskop till MATLAB och konvertera den sammanslagna panelsökningen till en binär bild och tröska sedan bilden efter område och intensitet för att skilja atomkärnor från bakgrunden.
- Dela upp den binära kakelskanningen i 1 mm radiella segment.
- Montera en ellips på varje enskild kärna.
- Räkna antalet ellipser inom varje radiellt segment för att ge ett cellnummer.
- Definiera formindex = som SI = 4π x Område / Omkrets2. Beräkna formindexet för varje ellips18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vidhäftning av HUVECs till regioner av brunnen plattan inte belagda med fibronectin var upphävas av Pluronic F-127 passivation; Tillväxten begränsades till regionen belagd med fibronectin även efter 72 h kultur, med och utan shear stress tillämpning(figur 4A, figur 4C). Utan den pluroniska F-127 passiveringen hade HUVECs fäst vid ytan utan fibronectin och hade spridit sig ytterligare med 72 h kultur (Figur 4B, Figur 4D).
Justering och förlängning av HUVECs är uppenbara vid kanten av en virvlande brunn, som har HMUF, medan cellerna i mitten av brunnen, som har LMMF, uppvisade en kullerstensmorfologi och ingen justering (Figur 5A, Figur 5B). Förlängning av HUVECs kvantifierades som formindex: 4π x Område/Omkrets2. Ett formindex på 1 anger en cirkel, medan värdet 0 anger en linje. Formindexet minskade med radiellt avstånd från mitten och det fanns ingen signifikant skillnad mellan segmenterade och fulla brunnar. TNF-α ökade förlängningen av HUVECs jämfört med obehandlade kontroller(figur 5C). HMUF ökade också antalet HUVECs per mm2 jämfört med LMMF under båda villkoren. Antalet HUVECs ökade gradvis med avstånd längs radien. Ingen signifikant skillnad observerades i antalet HUVEC som odlades i segmenterade och fulla brunnar (figur 6).
Bild 1 Teknisk ritning av rostfri modul. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Måtten är i mm.
Bild 2 Teknisk ritning av PDMS mögel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Måtten är i mm.
Bild 3 Teknisk ritning av PDMS-ring som används för att segmentera brunnarna.
Måtten är i mm. Från Ghim et al.13.
Bild 4Mikroskopbilder som visar att Pluronic F-127 förhindrade människans navelsträngsven endotelceller (HUVECs) vidhäftning till regionen utan fibronectinbeläggning.
Inga HUVECs var fäst vid den del av brunnen ytan som inte hade förbehandlats med fibronectin före passivering med Pluronic F-127, efter 24 h(A) och 72 h (C) tillväxt. Utan Pluronic F-127 passivation var HUVECs fästa på ytan utan fibronectin 24 h efter sådd (B) och hade proliferated ytterligare med 72 h (D). (Skalstång = 500 μm). Från Ghim et al.13.
Bild 5 Morfologin hos saxade HUVECs i en segmenterad eller full brunn.
Nukleär (röd) fläck visar morfologin hos saxade HUVECs (A) i mitten och (B) vid kanten av en full brunn (skalstång = 100 μm). A och B visar också cellkonturer, avgränsade genom immunostaining av ZO-1 (grön). Observera justering och förlängning av celler vid kanten men inte i mitten (C) Ingen signifikant skillnad i kärnformsindex, vilket indikerar rundhet, mellan HUVECs som odlas i fulla brunnar och segmenterade brunnar sågs för obehandlade eller TNF-α behandlade HUVEC. Cellerna var mer långsträckta nära brunnens kant. En tendens till större förlängning i TNF-α behandlade HUVECs var inte konsekvent betydande på olika platser. (Tvåvägs ANOVA och Bonferronis post hoc-test; n = 3). Denna siffra har ändrats från Ghim et al.13
Figur 6 Antalet HUVECs per mm2 ökade med radiellt avstånd i en virvlande brunnsplatta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Ingen signifikant skillnad observerades mellan fulla och segmenterade brunnar i densiteten hos (A) obehandlade och (B) TNF- α-behandlade HUVECs på olika radiella platser. I båda fallen fanns det fler celler per enhetsområde vid kanten än brunnens centrum. (Tvåvägs ANOVA och Bonferronis post hoc-test; n = 3). Denna siffra har ändrats från Ghim et al13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden med virvlande brunn kan generera komplexa flödesprofiler i en enda brunn - LMMF (Low Magnitude Multidirectional Flow) i mitten och High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) vid brunnens kant. Skevning stressmedlade sekret av löslig medlare kommer dock att blandas i det virvlande mediet och påverka celler i hela brunnen, vilket potentiellt döljer den sanna effekten av en viss savspänningsprofil på cellerna.
Den beläggningsmetod som demonstreras här övervinner denna fråga genom att begränsa cellernas tillväxt till en viss region av brunnen. Celler fäster vanligtvis på hydrofila ytor snarare än hydrofoba. Av denna anledning är polystyrenkulturvaror förbehandlade med plasmaoxidation. Alternativt kan hydrofoba ytor beläggas med extracellulära matrisproteiner som fibronektin, vilket visas i detta protokoll. icke-fibronectin belagda regioner var passiverade med Pluronic F-127 för att förhindra någon kvarvarande vidhäftning till den hydrofobiska ytan.
Detta protokoll är beroende av noggrannheten hos den tryckta formen. Beroende på 3D-skrivaren kan det finnas variation i formens exakta dimensioner. Detta påverkar den slutliga PDMS-konstruktionen, vilket i sin tur resulterar i att cellerna följer på en felaktig plats i brunnen. Cellerna skulle därför uppleva en annan savspänningsprofil än den som modelleras av CFD. En annan nackdel med att använda en 3D-skrivare är att formen kanske inte är platt, på grund av warping under utskriften. Detta kommer att resultera i den slutliga PDMS-konstruktionen som gör det möjligt för Pluronic F-127 att läcka under, vilket förhindrar att celler fastnar på önskade platser. Därför är det viktigt att kontrollera läckor och mäta dimensionen av PDMS-konstruktionen före användning.
Denna metod är enkel men effektiv för att tillåta tillämpning av en viss typ av savspänning (HMUF eller LMMF) på celler. Det är också bekvämt att ställa in eftersom de flesta förbrukningsvaror, reagenser och utrustning är kommersiellt tillgängliga. Med denna metod tillåter inte bara undersökning eller skörd av celler som utsätts för väldefinierade flöden utan möjliggör insamling av medium som konditioneras av dessa celler. Metoden ger en ny väg som undersöker endotelmekanobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt ett british heart foundation-projektbidrag (till PDW), ett nationellt medicinskt forskningsråd Singapore TAAP och DYNAMO Grant (till XW, NMRC / OFLCG / 004 / 2018, NMRC / OFLCG / 001 / 2017), ett A * STAR Graduate Scholarship (till KTP) och ett British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (till MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
