Summary
Denne protokollen beskriver en beleggmetode for å begrense endotelcellevekst til et bestemt område av en 6-brønns plate for skjærspenningsapplikasjon ved hjelp av orbital shaker-modellen.
Abstract
Skjærspenning pålagt arterieveggen ved blodstrømmen påvirker endotelcellemorfologi og funksjon. Lav størrelse, oscillatoriske og flerveis skjærspenninger har alle blitt postulert for å stimulere en pro-aterosklerotisk fenotype i endotelceller, mens høy størrelse og enveis eller enaksial skjær antas å fremme endotelial homeostase. Disse hypotesene krever videre undersøkelser, men tradisjonelle in vitro-teknikker har begrensninger, og er spesielt dårlige til å pålegge flerveis skjærspenninger på celler.
En metode som får økende bruk er å dyrke endotelceller i standard multi-brønnplater på plattformen til en orbital shaker; I denne enkle, rimelige, høye gjennomstrømnings- og kroniske metoden produserer det virvlende mediet forskjellige mønstre og størrelser av skjær, inkludert flerveis skjær, i forskjellige deler av brønnen. Det har imidlertid en betydelig begrensning: celler i en region, utsatt for en type strømning, kan frigjøre mediatorer i mediet som påvirker celler i andre deler av brønnen, utsatt for forskjellige strømmer, og dermed forvrenge den tilsynelatende sammenhengen mellom strømning og fenotype.
Her presenterer vi en enkel og rimelig modifikasjon av metoden som gjør at celler bare kan eksponeres for spesifikke skjærspenningsegenskaper. Cellesåing er begrenset til en definert region av brønnen ved å belegge regionen av interesse med fibronectin, etterfulgt av passivasjon ved hjelp av passiviseringsløsning. Deretter kan platene virvles på shakeren, noe som resulterer i eksponering av celler for veldefinerte skjærprofiler som lav størrelse flerveis skjær eller høy størrelse uniaxial skjær, avhengig av deres plassering. Som før tillater bruk av standard cellekulturplastikkvare enkel videre analyse av cellene. Modifikasjonen har allerede tillatt demonstrasjon av løselige meglere, frigjort fra endotel under definerte skjærspenningsegenskaper, som påvirker celler som ligger andre steder i brønnen.
Introduction
Responser av vaskulære celler til deres mekaniske miljø er viktige i normal funksjon av blodkar og i utviklingen av sykdom1. Mekanobiologien til endotelcellene (ECs) som strekker den indre overflaten av alle blodkar har vært et spesielt fokus på mekanobiologisk forskning fordi ECs direkte opplever skjærspenningen generert av blodstrøm over dem. Ulike fenotypiske endringer som inflammatoriske responser, endret stivhet og morfologi, frigjøring av vasoaktive stoffer og lokalisering og uttrykk for koblingsproteiner avhenger av EC-eksponering for skjærspenning2,3,4. Skjæravhengige endotelegenskaper kan også redegjøre for den klumpete utviklingen av sykdommer som aterosklerose5,6,7.
Det er nyttig å studere effekten av skjær på ECs i kultur, hvor stress kan kontrolleres, og ECs kan isoleres fra andre celletyper. Vanligvis brukte in vitro-enheter for påføring av skjærspenning på ECer inkluderer parallellplatestrømningskammeret og kjegle-og-plate-viscometeret, men bare uniaxial steady, oscillatorisk og pulsatile strømning kan påføres8,9. Selv om modifiserte strømningskamre med koniske eller forgrenende geometrier og mikrofluidiske sjetonger som etterligner en stenotisk geometri er utviklet, er deres lave gjennomstrømning og den relativt korte kulturvarigheten som er mulig utgjøre en utfordring10, 11.
Orbital shaker (eller virvlende godt) metoden for studiet av endotel mechanotransduction, der celler dyrkes i standard cellekultur plasticware plassert på plattformen til en orbital shaker, får økende oppmerksomhet fordi den er i stand til kronisk imponerende komplekse, romlig varierende skjær stress mønstre på ECs med høy gjennomstrømning (se gjennomgang av Warboys et al.12). Beregningsvæskedynamikk (CFD) simuleringer har blitt brukt for å karakterisere den romlige og tidsmessige variasjonen av skjærspenning i en virvlende brønn. Den virvlende bevegelsen til kulturmediet forårsaket av shakerplattformens orbitale bevegelse der platen er plassert, fører til lav størrelses flerveis strømning (LMMF, eller putativt pro-aterogen strømning) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF, eller putativt atheroprotective strømning) på kanten av brønnene til en 6-brønns plate. For eksempel er tidsgjennomsnittet veggskjærspenning (TAWSS) omtrent 0,3 Pa i midten og 0,7 Pa på kanten av en 6-brønns plate virvlet ved 150 rpm med en 5 mm orbital radius13. Metoden krever bare kommersielt tilgjengelig plasttøy og selve orbital shakeren.
Det er imidlertid en ulempe med metoden (og til andre metoder for å pålegge strømmer in vitro): ECs frigjør løselige mediatorer og mikropartikler på en skjæravhengig måte14,15,16 og dette sekretomet kan påvirke ECs i regioner i brønnen annet enn den de ble utgitt i, på grunn av blandingen i det virvlende mediet. Dette kan maskere de faktiske effektene av skjærspenning på EC fenotype. For eksempel har Ghim et al. spekulert i at dette står for den tilsynelatende identiske påvirkningen av forskjellige skjærprofiler på transcellulær transport av store partikler17.
Her beskriver vi en metode for å fremme humant navlestrengs vene endotelcelle (HUVEC) vedheft i bestemte områder av en 6-brønns plate ved hjelp av fibronektinbelegg mens du bruker Pluronic F-127 for å passivisere overflaten og forhindre vekst andre steder. Metoden løser begrensningen beskrevet ovenfor fordi EC-er ved å segmentere cellevekst bare opplever én type skjærprofil, og påvirkes ikke av sekreter fra ECer som er eksponert for andre profiler andre steder i brønnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av enheter og tilberedning av reagenser
- Fabrikasjon av rustfritt stål modul
- Fremstille modulen i rustfritt stål fra en klasse 316 rustfritt stål ved hjelp av en CNC-fresemaskin i henhold til den tekniske tegningen som følger med (figur 1).
- 3D-utskrift av en polydimetylsiloksanform (PDMS)
- Klargjør en CAD-modell (3D Computer Aided Design) av PDMS-formen ved hjelp av SolidWorks i henhold til den tekniske tegningen som følger med (Figur 2).
- Eksporter CAD-modellen til en STL-fil, og importer STL-filen til Cura 2.6.2.
- Del modellen i lag med en utskriftshastighet på 50 mm/s og fyllingstetthet på 60 %.
- Eksporter filen som en G-kode og last den opp til en Ultimaker2 3D-skriver for utskrift. Bruk polylaktisk syre (PLA) som utskriftsmateriale.
- Støping av PDMS-ring
- Bland PDMS-basen og herdemiddelet (begge fra et silikonelastomersett) med forholdet mellom 90,9 % base og 9,1 % herdemiddel.
- Hell ca. 2,6 ml av den godt blandede oppløsningen i den 3D-trykte formen.
- Fjern bobler i et vakuumavgassingskammer.
- Herd den i 1 time i en ovn på 80 °C.
- La PDMS-ringen avkjøles til romtemperatur, og fjern deretter den herdede PDMS-ringen forsiktig fra formen. Den tekniske tegningen av PDMS-ring vises i figur 3.
- Fremstilling av 1% Pluronic F-127
- Vei ut 5 g Pluronic F-127, hell det i en glassflaske, og tilsett deretter 100 ml sterilt vann i glassflasken. Dette gir en 5% Pluronic F-127 løsning.
- Forsikre deg om at alt Pluronic F-127 pulver er nedsenket i vannet, lukk hetten og autoklaver den ved hjelp av et flytende steriliseringssyklusprogram.
- Etter autoklaven, la oppløsningen avkjøles til romtemperatur før bruk.
- Tilsett 10 ml 5% Pluronic F-127-oppløsning til 40 ml autoklavert sterilt vann for å lage 1% Pluronic F-127-løsning. Utfør fortynning i en biosikkerhetsskap (BSC) hette.
- Oppbevar både 1% og 5% Pluronic F-127 ved romtemperatur.
- Fremstilling av 4% paraformaldehyd (PFA)
- Tilsett 800 ml fosfatbufret saltvann (PBS) til et glassbeger og varm det til 60 °C under omrøring (fortsett å røre fra trinn 1,5,1 til 1,5,5).
- Vei 40 g PFA pulver og tilsett det til den varme PBS-løsningen.
FORSIKTIG: PFA er farlig, utfør trinn 1.5.2 til 1.5.6 i en avtrekkshette. - Tilsett 1 M natriumhydroksid (NaOH) langsomt i PFA-oppløsningen til løsningene blir klare.
- Juster pH i PFA-oppløsningen til ca. 7,4 med 1 M saltsyre (HCl).
- Fyll opp løsningen til 1 L med 1X PBS. Dette gir 1 L av 4% PFA.
- Filtrer PFA-oppløsningen med 0,2 μm-filtre for å fjerne partikler, alisiter og frys i en -20 °C fryser.
- Forberedelse av 0,1% Triton-X
- Tilsett 50 μL ren Triton-X i 50 ml PBS for å lage 0,1 % Triton-X-løsning.
- Tilberedning av 1% bovint serumalbumin (BSA)
- Vei 0,5 g BSA, hell den i et 50 ml sentrifugerør, og tilsett deretter 50 ml PBS i røret.
- La den rulle i 1 time ved romtemperatur på en rulle for å oppløses.
- Oppbevar 1 % BSA ved 4 °C i opptil to uker.
2. Belegg av en 6-brønns plate
- Autoklaver modul i rustfritt stål, PDMS-ring og pinsett før bruk. Utfør alle etterfølgende prosedyrer i en BSC hette og observere aseptiske teknikker for å sikre sterilitet.
- Plasser PDMS-ringen i en 6-brønn ved hjelp av pinsett. Bruk den ytre kanten på PDMS-ringen til å justere PDMS-ringen konsentrisk etter brønnen.
MERK: Kun ikke-vevskulturbehandlede brønnplater skal brukes. - Plasser modulen i rustfritt stål på toppen av PDMS-ringen ved hjelp av pinsett.
- Sett spissene på den interne holderingens tang inn i gripehullene på holderringen, klem holderen for å redusere diameteren på holderringen. Sett den inn i 6-brønnen, trykk den godt på modulen i rustfritt stål og slipp tangene for å feste PDMS-ringen i brønnen.
- Tilsett 1 ml 5 μg/ml fibronectin i midten eller kanten av brønnen (avhengig av interesseområdet) gjennom åpningen av PDMS-ring og modul i rustfritt stål.
- Virvle platen for å sikre at fibronectin-løsningen dekker hele interesseområdet.
- Inkuber i 30 min ved 37 °C i en fuktet inkubator under 95 % luft/5 % CO2.
- Fjern fibronektinoppløsningen fra brønnen og vask to ganger med PBS. Fjern PBS helt fra brønnen.
- Fjern holderingen, modulen i rustfritt stål og PDMS-ringen fra brønnen.
- Tilsett 1,5 ml 1% Pluronic F-127 i midten eller kanten av brønnen (ubestrøket overflate) og inkuber i 1 time ved romtemperatur for å passivisere den ubestrøket overflaten.
- Fjern Pluronic F-127-oppløsningen fra brønnen og vask tre ganger med PBS.
- Bruk den belagte brønnen umiddelbart eller oppbevar den ved 4 °C i opptil to uker med et lag PBS i den belagte brønnen.
3. Såing av HUVEC
- Bruk HUVEC under avsnitt 5 i eksperimentet.
- Fjern alle kulturmedier og vask celler én gang med PBS.
- Tilsett 3 ml 0,05% trypsin og inkuber i 3 min ved 37 °C i en fuktet inkubator under 95 % luft/5 % CO2. Trykk forsiktig på kolben for å løsne cellene.
MERK: Denne protokollen er testet ved hjelp av HUVECer, og konsentrasjonen av trypsin og inkubasjonstiden kan være forskjellig for andre typer ECer. - Overfør oppløsningen til et 15 ml sentrifugerør og nøytraliser trypsin ved hjelp av 6 ml kulturmedium (f.eks. Lonza EGM-2) forhåndsvarslet til 37 °C.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min. Fjern den nøytraliserte trypsinoppløsningen og resuspendcellene med 1 ml forhåndsvarslet kulturmedium.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og frø 180k celler i en belagt 6-brønns plate i 1,5 ml prewarmed kultur medium.
- Rist brønnplaten sidelengs for å sikre at cellene fordeler seg jevnt i brønnen.
- La den ligge i en 37 °C fuktig inkubator under 95 % luft/5 % CO2 over natten.
- Fjern de uattrerte cellene og kulturmediet og erstatt med 2 ml forhåndsvarslet kulturmedium.
MERK: Mange ikke-tilknyttede celler som flyter i mediet forventes.
4. Skjær stress påføring ved hjelp av en orbital shaker
- HUVEC-er bør nå samløp etter 3 dager med vekst. Bytt ut mediet med 1,9 ml forvarselt kulturmedium (for å oppnå en høyde på 2 mm).
- Plasser platen på plattformen til en orbital shaker i en fuktet inkubator under 95% luft / 5% CO2 og virvle den ved 150 rpm i 3 dager.
MERK: Tørk av den utvendige overflaten på orbital shakeren med 70 % etanol før du plasserer den i inkubatoren. - (Valgfritt) Etter 2 dager med skjær kan cytokiner legges til kulturmediet for å undersøke samspillet mellom cytokiner og skjærstress. Etter behandling skjærer du cellene for en annen dag. I denne studien ble TNF-α brukt til å aktivere cellene.
- Utfør analyser etter 3 dagers skjærstressapplikasjon.
5. Farging og avbildning av celler
- Etter 3 dager med skjær, fjern platen fra inkubatoren og vask cellene to ganger med PBS.
- Fest cellene ved å legge til 1,5 ml 4% PFA i brønnen og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur.
- Fjern 4% PFA fra brønnen og vask to ganger med PBS.
- Permeabiliser cellene ved å legge 0,1% Triton-X inn i brønnen og inkubere i 5 min ved romtemperatur.
- Fjern 0,1% Triton-X-løsningen fra brønnen og tilsett 1,5 ml 1% BSA i brønnen for blokkering. Inkuber cellene med 1% BSA i 1 time ved romtemperatur.
- Fortynn kanin anti-menneskelig ZO-1 antistoff ved en 1:200 fortynning i 1% BSA. Tilsett 1,5 ml fortynnet antistoff i brønnen og inkuber det med cellene over natten ved 4 °C.
- Etter inkubering over natten, fjern det fortynnede antistoffet og vask cellene tre ganger med PBS.
- Fortynn Alexa Fluor 488-merket geit anti-kanin IgG sekundært antistoff ved en 1:300 fortynning i PBS. Tilsett 1,5 ml fortynnet sekundært antistoff i brønnen og inkuber det med cellene i 1 time ved romtemperatur.
- Fjern det fortynnede sekundære antistoffet og vask cellene to ganger med PBS.
- Fortynn DRAQ5 ved en fortynning på 1:1000 i PBS. Tilsett 1,5 ml fortynnet DRAQ5 i brønnen og inkuber den med cellene i 15 min ved romtemperatur for å farge cellekjernene.
- Fjern den fortynnede DRAQ5 og vask tre ganger med PBS.
- Utfør en flisskanning fra kanten til midten av brønnen med et konfokalt mikroskop.
6. Kvantifisering av formindeks og cellenummer
- Etter behandling av bildene ved hjelp av MATLAB R2016a.
- Les LIF-filen fra konfokalt mikroskop til MATLAB og konverter den sammenslåtte flisskanningen til et binært bilde, og terskel deretter bildet etter område og intensitet for å skille kjerner fra bakgrunnen.
- Del opp den binære flisskanningen i 1 mm radialsegmenter.
- Monter en ellipse til hver enkelt kjerne.
- Tell antall ellipser i hvert radialsegment for å gi et cellenummer.
- Definer figurindeksen = som SI = 4π x Område / Perimeter2. Beregn figurindeksen for hver ellipse18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vedheft av HUVECs til regioner av brønnplaten som ikke er belagt med fibronectin ble abrogated av Pluronic F-127 passivasjon; veksten var begrenset til regionen belagt med fibronectin selv etter 72 h kultur, med og uten skjær stress søknad (Figur 4A, Figur 4C). Uten Pluronic F-127 passivasjon festet HUVECene seg til overflaten uten fibronectin og hadde spredt seg ytterligere med 72 timers kultur (Figur 4B, Figur 4D).
Justering og forlengelse av HUVEC er tydelig på kanten av en virvlende brønn, som har HMUF, mens cellene i midten av brønnen, som har LMMF, viste en brosteinsmorfologi og ingen justering (Figur 5A, Figur 5B). Forlengelse av HUVEC ble kvantifisert som formindeks: 4π x Område/Perimeter2. En figurindeks på 1 angir en sirkel, mens verdien 0 angir en linje. Figurindeksen gikk ned med radial avstand fra midten, og det var ingen signifikant forskjell mellom segmenterte og fulle brønner. TNF-α behandling økte forlengelsen av HUVEC sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 5C). HMUF økte også antall HUVECer per mm2 sammenlignet med LMMF under begge forhold. Antall HUVECer økte gradvis med avstand langs radiusen. Det ble ikke observert signifikant forskjell i antall HUVECer som vokste i segmenterte og fulle brønner (figur 6).
Figur 1 Ingeniørtegning av modul i rustfritt stål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Dimensjonene er i mm.
Figur 2 Ingeniørtegning av PDMS mold. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Dimensjonene er i mm.
Figur 3 Ingeniørtegning av PDMS-ring som brukes til å segmentere brønnene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Dimensjonene er i mm. Fra Ghim et al.13.
Figur 4 Mikroskopbilder som viser at Pluronic F-127 forhindret humant navlestrengsvene endotelceller (HUVEC) vedheft til regionen uten fibronectinbelegg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ingen HUVECer var festet til den delen av brønnoverflaten som ikke hadde blitt forbehandlet med fibronectin før passivasjon med Pluronic F-127, etter 24 timer (A) og 72 timer (C) vekst. Uten Pluronic F-127 passivasjon ble HUVEC-er festet til overflaten uten fibronectin 24 timer etter sådd (B) og hadde spredt seg ytterligere med 72 timer (D). (Skalastang = 500 μm). Fra Ghim et al.13.
Figur 5 Morfologien til skjærede HUVECer i en segmentert eller fullstendig brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kjernefysisk (rød) flekk viser morfologien til skjærede HUVECer (A) i midten og (B) på kanten av en full brønn (skalastang = 100 μm). A og B viser også celleomriss, avgrenset ved immunstaining av ZO-1 (grønn). Legg merke til justering og forlengelse av celler på kanten, men ikke i midten (C) Ingen signifikant forskjell i kjerneformindeks, noe som indikerer rundhet, mellom HUVEC dyrket i fulle brønner og segmenterte brønner ble sett for ubehandlet eller TNF-α behandlet HUVEC. Cellene var lengre nær kanten av brønnen. En tendens til større forlengelse i TNF-α-behandlede HUVECer var ikke konsekvent signifikant på tvers av steder. (Toveis ANOVA og Bonferronis post hoc-test; n = 3). Denne figuren er endret fra Ghim et al.13
Figur 6 Antall HUVECer per mm2 økte med radial avstand i en virvlende brønnplate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det ble ikke observert signifikant forskjell mellom fulle og segmenterte brønner i tettheten av (A) ubehandlet og (B) TNF-α behandlet HUVEC på ulike radiale steder. I begge tilfeller var det flere celler per enhetsområde på kanten enn midten av brønnen. (Toveis ANOVA og Bonferronis post hoc-test; n = 3). Denne figuren er endret fra Ghim et al13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den virvlende brønnmetoden er i stand til å generere komplekse strømningsprofiler i en enkelt brønn - Low Magnitude Multidirectional Flow (LMMF) i midten og High Magnitude Uniaxial Flow (HMUF) på kanten av brønnen. Skjærstressmediert sekreter av løselig mediator vil imidlertid bli blandet i det virvlende mediet og påvirke celler i hele brønnen, og potensielt maskere den sanne effekten av en bestemt skjærstressprofil på cellene.
Beleggmetoden som er demonstrert her, overvinner dette problemet ved å begrense veksten av celler til en bestemt region av brønnen. Celler festes vanligvis til hydrofile overflater i stedet for hydrofobe. Av denne grunn er polystyrenkulturvare forhåndsbehandlet med plasmaoksidasjon. Alternativt kan hydrofobe overflater belegges med ekstracellulære matriseproteiner som fibronectin, som vist i denne protokollen; ikke-fibronectin belagte regioner ble passivert med Pluronic F-127 for å forhindre gjenværende vedheft til den hydrofobe overflaten.
Denne protokollen er avhengig av nøyaktigheten til den trykte formen. Avhengig av 3D-skriveren kan det være variasjon i de nøyaktige dimensjonene på formen. Dette vil påvirke den endelige PDMS-konstruksjonen, noe som igjen vil føre til at cellene holder seg på feil sted i brønnen. Cellene vil derfor oppleve en annen skjærstressprofil enn den som er modellert av CFD. En annen ulempe med å bruke en 3D-skriver er at formen kanskje ikke er flat, på grunn av fordreining under utskriften. Dette vil resultere i den endelige PDMS-konstruksjonen slik at Pluronic F-127 kan lekke under, og forhindre at celler holder seg på de ønskede stedene. Derfor er det avgjørende å se etter lekkasjer og måle dimensjonen på PDMS-konstruksjonen før bruk.
Denne metoden er enkel, men effektiv i å tillate anvendelsen av en bestemt type skjærspenning (HMUF eller LMMF) til celler. Det er også praktisk å sette opp da de fleste forbruksvarer, reagenser og utstyr er kommersielt tilgjengelige. Ved hjelp av denne metoden tillater ikke bare undersøkelse eller høsting av celler utsatt for veldefinerte strømmer, men tillater innsamling av medium betinget av disse cellene. Metoden gir en ny aveny som undersøker endotel mekanobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner takknemlig et British Heart Foundation-prosjektstipend (til PDW), et National Medical Research Council Singapore TAAP og DYNAMO Grant (til XW, NMRC / OFLCG/004/2018, NMRC / OFLCG/001/2017), et A * STAR Graduate Scholarship (til KTP) og et British Heart Foundation Center of Research Excellence studentship (til MA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Media | |||
| Endothelial Growth Medium (EGM-2) | Lonza | cc-3162 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells | NA | NA | Isolated from cords obtained from donors with uncomplicated labour at the Hammersmith Hospital |
| Reagents and Materials | |||
| Alexa Fuor 488-labelled goat anti-rabbit IgG | Thermofisher Scientific | A11008 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Not Treated | Scientific Laboratory Supplies Ltd | 351146 | |
| Fibronectin from Bovine Plasma | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Phosphate-Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537-6X500ML | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Recombinant Human TNF-a | Peprotech | 300-01A | |
| RS PRO 2.85 mm Black PLA 3D Printer Filament, 1 kg | RS | 832-0264 | |
| Stainless Steel 316 | Metal Supermarket | NA | |
| Sylgard184 Silicone Elastomer kit | Farnell | 101697 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
| Zonula Occludens-1 (ZO-1) antibody | Cell Signaling Technology | 13663 | |
| DRAQ5 (5mM) | Bio Status | DR50200 | |
| Equipments | |||
| Grant Orbital Shaker PSU-10i | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SHA7930 | |
| Leica TCS SP5 Confocal Microscope | Leica | NA | |
| Retaining Ring Pliers | Misumi | RTWP32-58 | |
| Retaining Rings/Internal/C-Type | Misumi | RTWS35 | |
| Ultimaker 2+3-D printer | Ultimaker | NA | |
| Softwares | |||
| Cura 2.6.2 | Ultimaker | NA | |
| MATLAB | The MathWorks | NA | |
| Solidworks 2016 | Dassault Systemes | NA |
References
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 53-62 (2009).
- Wang, C., Baker, B. M., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Endothelial Cell Sensing of Flow Direction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (9), 2130-2136 (2013).
- Tzima, E., et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cell response to fluid shear stress. Nature. 437, 426-431 (2005).
- Potter, C. M. F., Schobesberger, S., Lundberg, M. H., Weinberg, P. D., Mitchell, J. A., Gorelik, J. Shape and compliance of endothelial cells after shear stress in vitro or from different aortic regions: Scanning ion conductance microscopy study. PLoS ONE. 7 (2), 1-5 (2012).
- Asakura, T., Karino, T. Flow Patterns and Spatial Distribution of Atherosclerotic Lesions in Human. Circulation Research. 66 (4), 1045-1067 (1990).
- Bond, A. R., Iftikhar, S., Bharath, A. A., Weinberg, P. D. Morphological evidence for a change in the pattern of aortic wall shear stress with age. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 543-550 (2011).
- Giddens, D. P., Zarins, C. K., Glagov, S. The role of fluid mechanics in the localization and detection of atherosclerosis. Journal of biomechanical engineering. 115, 588-594 (1993).
- Schnittler, H. J., Franke, R. P., Akbay, U., Mrowietz, C., Drenckhahn, D. Improved in vitro rheological system for studying the effect of fluid shear stress on cultured cells. The American journal of physiology. 265, 289-298 (1993).
- Levesque, M. J., Nerem, R. M. The elongation and orientation of cultured endothelial cells in response to shear stress. Journal of biomechanical engineering. 107 (4), 341-347 (1985).
- Chiu, J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Venugopal Menon, N., et al. A tunable microfluidic 3D stenosis model to study leukocyte-endothelial interactions in atherosclerosis. APL Bioengineering. 2 (1), 016103 (2018).
- Warboys, C. M., Ghim, M., Weinberg, P. D. Understanding mechanobiology in cultured endothelium: A review of the orbital shaker method. Atherosclerosis. 285, 170-177 (2019).
- Ghim, M., Pang, K. T., Arshad, M., Wang, X., Weinberg, P. D. A novel method for segmenting growth of cells in sheared endothelial culture reveals the secretion of an anti-inflammatory mediator. Journal of Biological Engineering. 12 (1), 15 (2018).
- Sage, H., Pritzl, P., Bornstein, P. Secretory phenotypes of endothelial cells in culture: comparison of aortic, venous, capillary, and corneal endothelium. Arteriosclerosis. 1 (6), 427-442 (1981).
- Tunica, D. G., et al. Proteomic analysis of the secretome of human umbilical vein endothelial cells using a combination of free-flow electrophoresis and nanoflow LC-MS/MS. Proteomics. 9, 4991-4996 (2009).
- Griffoni, C., et al. Modification of proteins secreted by endothelial cells during modeled low gravity exposure. Journal of Cellular Biochemistry. 112, 265-272 (2011).
- Ghim, M., et al. Visualization of three pathways for macromolecule transport across cultured endothelium and their modification by flow. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (5), 959-973 (2017).
- Levesque, M. J., Liepsch, D., Moravec, S., Nerem, R. M. Correlation of endothelial cell shape and wall shear stress in a stenosed dog aorta. Arteriosclerosis: An Official Journal of the American Heart Association, Inc. 6 (2), 220-229 (1986).
