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Biochemistry

Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

Published: September 26, 2020 doi: 10.3791/61839
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Summary

Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de Salmonella typhimurium triptófano sintasa comp este protocolo un sistema rápido para purificar el complejo proteico en un día. Los métodos cubiertos son la mutagénesis dirigida al sitio, la expresión de proteínas en Escherichia coli,la cromatografía de afinidad, la cromatografía de filtración en gel y la cristalización.

Abstract

Se han realizado estudios estructurales con complejo bienzimático triptófano sintasa (TS) (α2β2 TS) de Salmonella typhimurium para comprender mejor su mecanismo catalítico, comportamiento alosterico y detalles de la transformación enzimática de sustrato a producto en enzimas dependientes de PLP. En este trabajo, un novedoso sistema de expresión para producir la subunidad β aislada α y aislada permitió la purificación de altas cantidades de subunidades puras y α complejo StTS2β2de las subunidades aisladas en 2 días. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad seguida de escisión de la etiqueta de afinidad, precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Para comprender mejor el papel de los residuos clave en el sitio β enzima, se realizó mutagénesis directa en el sitio en estudios estructurales previos. Otro protocolo fue creado para purificar el tipo salvaje y mutante α2β2complejosStTS. Un protocolo simple, rápido y eficiente que utiliza fraccionamiento de sulfato de amonio y SEC permitió la purificación de α complejo2β2StTS en un solo día. Ambos protocolos de purificación descritos en este trabajo tienen ventajas considerables en comparación con los protocolos anteriores para purificar el mismo complejo utilizando PEG 8000 y espermina para cristalizar el complejo α2β2StTS a lo largo del protocolo de purificación. La cristalización de tipo salvaje y algunas formas mutantes ocurre en condiciones ligeramente diferentes, lo que perjudica la purificación de algunos mutantes utilizando PEG 8000 y esperfina. Para preparar cristales adecuados para estudios cristalográficos de rayos X se realizaron varios esfuerzos para optimizar la cristalización, la calidad de los cristales y la crioprotección. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la purificación de las subunidades de triptófano sintasa y α de tipo salvaje y mutante2β2StTS complejos.

Introduction

El complejo bienzimático triptófano sintasa (TS) (α2β2)es una enzima alostérica, catalizando los dos últimos pasos en la biosíntesis del aminoácido L-triptófano en bacterias, plantas y hongos1,2,3. La bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa una infección gastrointestinal grave en humanos y otros animales. Dado que los seres humanos y los animales superiores no tienen ST (EC 4.2.1.20), la inhibición de S. typhimurium α2β2 complejo TS (α2β2StTS) se ha explorado como un posible objetivo farmacológico para el tratamiento de la criptosporidiosis y la tuberculosis4,las infecciones genitales y oculares5,y para la posible utilización de herbicidas en la agricultura6. La α-subunidad cataliza la escisión aldolítica de indol-3-glicerol-fosfato (IGP) a gliceraldehído-3-fosfato (GAP) e indol, a través de la formación de un intermedio de tautómero de indolenina y posteriormente la escisión de enlaces carbono-carbono para producir GAP e indol3,6. El sitio β-catalítico contiene una molécula de cofactor piridoxal 5′-fosfato (PLP) unida a β-Lys87 a través de una base de Schiff, que funciona como un sumidero de electrones en el curso de las reacciones en la enzima β-subunidad3,7. El sitio β cataliza el reemplazo del hidroxilo de cadena lateral L-Serina por indol para dar L-triptófano y una molécula de agua en una reacción dependiente de PLP. Calle TS sirve como un modelo de larga data para la investigación de la canalización de sustratos y la comunicación alotérica dentro de complejos multienzimáticos2,3. La comunicación alostérica bidireccional entre las subunidades α y β del ST es necesaria para sincronizar los pasos catalíticos y evitar la liberación de indol durante la síntesis de L-triptófano3. Para extender este esfuerzo, hemos preparado varios mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr y β-Ser377Ala) por mutación de punto único para ser utilizados en exploraciones adicionales de la relación entre la estructura enzimática, el mecanismo y la función en el sitio catalítico de la subunidad β StTS.

La investigación detallada sobre el mecanismo catalítico de α2β2StTS fue iniciada por el grupo de investigación de Edith W. Miles. Los primeros estudios con Escherichia coli nativa αcomplejo 2β2 TS se han centrado en la purificación y caracterización del complejo α-subunidad8,9,aislado β-subunidad10,11 y la reconstitución del complejo TS α2β2 a partir de las subunidades aisladas12. La purificación se llevó a cabo mediante precipitación de sulfato de amonio, diálisis de muestras, cromatografía DEAE-Sephadex, diálisis y una segunda ronda cromatográfica en una columna12de DEAE-Sephadex. En otro protocolo, se mejoró la purificación del mismo complejo cargando el lisato celular clarificado en una columna DEAE-Sephadex seguido de un paso cromatográfico en una columna Sepharose 4B, precipitación de sulfato de amonio y diálisis13. Ambos protocolos de purificación duran de 4 a 5 días. Escherichia coli αcomplejo TS 2β2 cristalizados, pero los cristales no eran adecuados para la difracción de rayos X en ese momento.

En un estudio novedoso, las formas recombinantes y de tipo salvaje de S. typhimurium αcomplejo 2β2 TS fueron purificadas y cristalizadas14,15. El complejo recombinante α2β2StTS se sobreexpresó en la cepa CB149 de E. coli que lleva el vector de expresión pEBA-10. Se reportó la recolección de datos de cristalización inicial y difracción de rayos X y el análisis del complejo stTSα2 β214. Sin embargo, agujas largas y delgadas como αcristales de 2β2StTS deterioraron los estudios estructurales. En un intento de recopilar mejores datos de difracción de rayos X, se describió otro protocolo de purificación para purificar el tipo salvaje y las formas mutantes del complejo α2β2StTS15. La purificación se llevó a cabo con una precipitación inicial utilizando esperfina y PEG 8.000 en el lisato celular clarificado y se eliminó un gran precipitado voluminoso por centrifugación. La fracción sobrenadante que contenía altas cantidades de α complejo StTSde 2β2se almacenó durante 16-48 h a 4 °C hasta que los cristales amarillos precipitaron. Los cristales fueron lavados y dializado extensamente contra diferentes tampones. El complejo proteico fue recristalizado en tampón que contenía sulfato de amonio y dializado15. Aunque la cristalización de proteínas depende de las concentraciones de proteínas y precipitantes en solución, es difícil monitorear, predecir y reproducir la purificación para otras formas mutantes de αcomplejo 2β2StTS en solución. Este protocolo tiene la ventaja de que no utiliza ningún método cromatográfico; sin embargo, las desventajas son el largo tiempo de purificación necesario para cristalizar, dializar y recristalizar, lo que generalmente requiere de 5 a 7 días. Para obtener cristales adecuados para la recolección de datos de rayos X, se evaluaron más de 600 condiciones de cristalización utilizando una combinación y variación de concentración de proteínas, temperatura, precipitantes (PEG 4,000, 6,000 y 8,000) y aditivos (CaCl2,MnCl2,ZnCl2,cadaverina, putrescina, esperfina o espermidina)15. Los cristales tenían una mejor forma cristalina y crecían más rápido en condiciones que contenían 12% de PEG 8,000 y 2 mM de espermín. La cristalización fue más favorable a 25 ° C en lugar de a 4, 30 o 42 ° C y creció a dimensiones máximas dentro de los 3 días15. Varias α2β2estructuras cristalinasstTS fueron reportadas en ese momento (1996-1999)16,17,18,19,20,21 y muchas otras estructuras se han publicado hasta la fecha.

Aquí, el propósito principal es presentar protocolos alternativos para purificar la triptófano sintasa y optimizar la cristalización de proteínas. El presente trabajo muestra mejoras significativas para purificar el tipo salvaje aislado α-subunidad (αStTS), aislado β-subunidad (βStTS), reconstituido αcomplejo St 2β2StTS de las subunidades aisladas, y formas salvajes tipo y mutantes del complejo α2β2StTS. Las ventajas sobre los protocolos anteriores son considerables, ya que el tiempo de purificación se redujo significativamente y se optimizó la cristalización y la crioprotección. Las formas mutantes de αcomplejo 2β2StTS diseñado en este trabajo han cristalizado cerca de la misma condición utilizada para la forma de tipo salvaje. Sin embargo, la optimización de la cristalización fina fue necesaria para obtener grandes cristales individuales de calidad suficiente para la determinación de la estructura a una resolución casi atómica. Hasta la fecha, hay 134 estructuras cristalinas de triptófano sintasa depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), lo que representa 101, 31 y 2 estructuras cristalinas, respectivamente, para bacterias, arqueas y eucariotas. Muy bien, 73 estructuras pertenecen a S. enterica serovar typhimurium y 5 estructuras cristalinas del complejo α2β2StTS tienen límites de resolución superiores a 1.50 Angstroms. No en vano, 4 de cada 5 fueron preparados en nuestro grupo de investigación (PDB IDs:5CGQ a 1,18 Å, 4HT3 a 1,30 Å, 4HPJ a 1,45 Å, 6DZ4 a 1,45 Å de resolución). Se prevé que las estructuras cristalinas refinadas de la forma mutante del complejo α 2β2StTS proporcionen nuevos conocimientos sobre el mecanismo y las funciones desempeñadas por los residuos de aminoácidos esenciales involucrados en la síntesis de L-triptófano.

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Protocol

1. Protocolo rápido para purificar la subunidad α y β y el complejo recombinado α2β2StTS

  1. Subclonización de ADN en vector de expresión pETSUMO
    1. Obtener el gen de acoplamiento traslacional (trpA y trpB) que codifica las α- y β- subunidades de la triptófano sintasa de la bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium clonada en el vector de expresión pEBA-1022. Utilice el vector pEBA-10 como plantilla de ADN.
      NOTA: Alternativamente, los cebadores enumerados a continuación se pueden usar para amplificar ambos genes del genoma de Salmonella enterica serovar typhimurium. Se siguieron todos los pasos de la biología molecular como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual23.
    2. Utilice la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar individualmente la secuencia de polinucleótidos de longitud completa de la α-subunidad(αStTS) con cebadores αStTS-FW-Bam y αStTS-Rev-Eco y la secuencia completa de β-subunidad (βStTS) con cebadores βStTS-FW-Bam y βStTS-Rev-Hind. Utilice una temperatura de fusión de aproximadamente 55 °C y un tiempo de extensión de la polimerasa de 2 min.
      1. Utilice ADN polimerasa de alta fidelidad (por ejemplo, Phusion) y el protocolo del fabricante para amplificar las secuencias de ADN. Para una reacción de PCR de 50 μL, agregue 34 μL de agua libre de nucleasa, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL de imprimación delantera de 10 μM, 1 μL de imprimación inversa de 10 μM, 1 μL de ADN de plantilla (200 ng), 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL de ADN polimerasa de fusión.
      2. Para el programa de PCR, utilice un arranque en caliente (180 segundos a 98 °C) seguido de 30 ciclos de amplificación (30 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 120 segundos a 72 °C), y una extensión final (300 segundos a 72 °C).
        NOTA: Las secuencias en cursiva corresponden a los sitios de restricción BamHI, EcoRI, BamHI y HindIII, respectivamente. La eficiencia de escisión enzimática cercana al termini de los fragmentos de PCR se mejoró mediante la adición de bases adicionales (secuencias en minúsculas).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Cargue el producto de PCR en gel de agarosa al 0,8% en 1x tampón TAE (40 mM Tris, 20 mM de ácido acético y 1 mM de EDTA) a 6 V / cm, extraiga en gel la banda de ADN de interés y purifique en gel el fragmento de PCR utilizando un kit de perlas de sílice siguiendo las instrucciones del fabricante.
      1. Digiera al menos 200 ng de cada fragmento de ADN con las enzimas de restricción y las condiciones adecuadas recomendadas por el fabricante durante 2 horas a 37 °C.
      2. Para establecer una reacción de digestión de restricción de 50 μL, agregue 34 μL de agua libre de nucleasa, 10 μL de ADN (200 ng), 5 μL de tampón de reacción 10x, 0.5 μL de enzima de restricción 1 y 0.5 μL de enzima de restricción 2.
      3. Cargue el producto de digestión en gel de agarosa al 0,8% en 1x TAE a 6 V / cm, extracto de gel y gel purifique el fragmento digerido utilizando un kit comercial.
    4. Subclón individualmente cada fragmento en el vector de expresión de E. coli pET SUMO, previamente digerido con enzimas apropiadas y gel purificado.
      NOTA: Este vector es una versión modificada del pET SUMO comercial. Este vector ha sido optimizado para la clonación de enzimas de restricción. El sitio de clonación múltiple (MCS) del vector pET28b(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI y XhoI) se insertó en el sitio de clonación de pET SUMO. Este vector contiene una etiqueta N-terminal 6x-Histidina en el marco con la proteína modificadora pequeña similar a la ubiquitina (SUMO) y múltiples sitios de clonación.
    5. Ligar 100 ng de pET SUMO modificado y 50 ng de fragmento de PCR con ADN ligasa T4 durante 2 horas a 25 °C.
    6. Transformar el plásmido construido en células competentes de células de α de la cepa DH10B de E. coli. Células de placa en placas de agar LB que contienen 35 μg/ml de kanamicina. Incubar la placa invertida durante la noche a 37 °C.
    7. Seleccione una sola colonia de cada transformación, prepare ADN plásmido ultra puro y realice la secuenciación del ADN para verificar que αStTS o βStTS fueron clonados en marco con la etiqueta His6-SUMO N-terminal.
      NOTA: Preparar existencias de glicerol de cultivo celular (convertir la suspensión celular en una concentración final del 16% de glicerol estéril) y almacenarlas a largo plazo a -80 °C.
    8. Transformar el plásmido de expresión SUMO-αStTS o SUMO-βStTS individualmente en células competentes de la cepa de expresión de E. coli Rosetta (DE3) pLysS con un sistema basado en promotores T7. Placa las células recombinantes en placas de agar Luria Bertani (LB) que contienen 35 μg/ml de kanamicina y cloranfenicol. Incubar la placa invertida durante la noche a 37 °C.
    9. Después de la formación exitosa de colonias, elija una sola colonia (sin colonias satélites) y disperse en 5 ml de LB medio con ambos antibióticos. Células de cultivo durante la noche con agitación a 200 rpm a 37 °C.
      NOTA: Preparar existencias de glicerol de cultivo celular, almacenar a largo plazo a -80 °C o utilizar inmediatamente para la expresión de proteínas recombinantes.
  2. Expresión de las subunidadesSUMO- αStTS y SUMO-βStTS
    1. Inocular células pLysS frescas de la cepa de E. coli Rosetta (DE3) que albergan SUMO-αStTS o SUMO-βStTS construye o raspa parte del stock de glicerol congelado en un cultivo de 50 ml de LB que contiene 35 μg / ml de kanamicina y cloranfenicol. Cultive las células durante la noche con agitación a 200 rpm a 37 °C.
    2. A la mañana siguiente, inocular 5 ml del cultivo celular nocturno en un fresco y estéril 2x 1000 ml de LB que contenga glicerol al 2% más kanamicina y cloranfenicol (matraz de Fernbach de 2,8 L). Cultivo celular con agitación a 200 rpm a 37 °C.
      NOTA: La expresión de SUMO-αStTS o SUMO-βStTS en caldo LB produce 125-150 mg de proteína etiquetada por litro. Considere la posibilidad de escalar el protocolo hacia arriba o hacia abajo para satisfacer demandas específicas.
    3. Inducir la expresión de proteínas recombinantes cuando el OD600 alcanza 0.6-0.8 mediante la adición de isopropil β-D-1 tiogalactopyranoside (IPTG) a una concentración final de 0.4 mM seguido de incubación a 30 °C durante la noche con agitación a 200 rpm.
    4. Cosechar las células centrifugando a 4.000 x g a 4 °C durante 20 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares con tampón de lisis en frío 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, que contiene 500 mM de NaCl, 5% de glicerol, 10 mM de 2-mercaptoetanol y 40 mM de imidazol-Cl) hasta un volumen final de 60 ml.
      NOTA: Las células pueden almacenarse a largo plazo a -80 °C o utilizarse inmediatamente para la purificación de proteínas. Para almacenar las células, divida la suspensión celular en tubos cónicos de centrífuga desechables de 2 x 50 ml y mantenga los gránulos celulares a -80 ° C hasta el paso de purificación de proteínas.
  3. Purificación de la α- y β-subunidades de triptófano sintasa
    NOTA: Todos los procedimientos deben llevarse a cabo a 4 °C, a menos que se indique lo contrario. Para reducir el tiempo de purificación, equilibre las columnas de afinidad cargadas con níquel de agarosa Ni-NTA y la columna de exclusión de tamaño en tampón antes de la purificación de proteínas o durante la expresión de proteínas recombinantes.
    1. Interrumpa el pellet celular por sonicación utilizando un sonificador digital con sonda Horn de 1/2" (o un equipo similar). Realice 20 ciclos al 80% de amplitud en un baño de agua helada utilizando 10 s de pulso y 20 s de reposo o hasta la interrupción completa de la célula.
    2. Centrifugar el lisado celular a 30.000 x g durante 30 min. Sobrenadante aspirante, asegurando que el pellet no se desprenda del tubo. Filtre el sobrenadante con una unidad de filtro de 0,45 μm sobre hielo y fluya a través de una columna de afinidad cargada con níquel de agarosa Ni-NTA de 15 ml preequilibrada en tampón de lisis 1.
      NOTA: Cada columna de agarosa de Ni-NTA se utilizará para purificar la proteína recombinante SUMO-αStTS o SUMO-βStTS. La purificación se puede realizar en una columna de Ni-NiTA de 2x 5 ml unida a un sistema de cromatografía líquida de proteínas rápidas. Purificar una proteína a la vez.
    3. Lavar la columna de agarosa De-NTA en 100 ml de tampón de lisis 1.
    4. Proceda con una elución de un paso de 80 ml con tampón E1 (tampón Tris-Cl de 25 mM, pH 7.8, que contiene 200 mM de NaCl, 5% de glicerol y 400 mM de imidazol-Cl).
      NOTA: La SUMO-proteasa tolera hasta 300 mM de imidazol y la membrana de los dispositivos de filtro centrífugo tolera hasta 100 mM de imidazol. Recomendamos realizar una precipitación de sulfato de amonio para eliminar altas cantidades de imidazol y disminuir el tiempo de purificación en lugar de diluir la muestra de proteína y perder el tiempo con la concentración de proteínas.
    5. Evaluar el volumen inicial de la fracción sobrenadante. Agregue lentamente pequeñas cantidades de sulfato de amonio a la vez, hasta que se alcance una saturación del 60% (39.48 g / 100 mL) a 25 ° C. Revuelva suavemente la solución durante 30 minutos y evite las burbujas. Centrifugadora a 10.000 x g durante 15 min.
    6. Aspire y deseche la fracción sobrenadante con cuidado. Resuspend la fracción de pellets en 20 mL de tampón de muestra (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl y 5% de glicerol).
    7. Para la escisión his-SUMO-tag con SUMO-proteasa, añadir el fragmento recombinante de proteasa 1 específica de Ubl de Saccharomyces cerevisiae en una proporción de 1:1000 e incubar la mezcla durante 2 horas a 4 °C.
    8. Centrifugar el producto de digestión a 10.000 x g en 25 °C durante 20 min para eliminar los agregados de proteínas antes de cargar la muestra a través de una columna de cromatografía de afinidad.
    9. Elimine los rastros de la etiqueta His6-SUMO que pasan por la muestra resuspendida de 20 ml en una columna de agarosa de Ni-NTA de 15 ml, previamente equilibrada en el tampón de lisis 1.
    10. Recoja la muestra de paso que contiene el αStTS o βStTS no etiquetado.
    11. Lave la columna Ni-NTA en 20 ml del tampón 1 para recoger las sobras de αStTS o β stTSno etiquetadas.
    12. Concentre cada subunidad por separado con una unidad de filtro centrífugo de corte de 15 ml y 10 kDa girando a 3.000 x g a 4 °C. Transfiera la proteína concentrada a un tubo fresco de 2,0 ml y una microcentrífuga (10.000 x g, 10 min, 4 °C) para eliminar los agregados. Determine la concentraciónde proteínas 24, prepare 1 ml de alícuotas a 20-25 mg ml-1, etiquete, congele en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 ° C.
      NOTA: Las muestras de proteínas prepurpurizadas pueden almacenarse a largo plazo a -80 °C o utilizarse inmediatamente para la purificación de proteínas en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC).
    13. Tome una alícuota de proteína (20 mg) y una microcentrífuga a 10,000 x g durante 10 minutos para eliminar los agregados antes de sec.
    14. Muestra de carga en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (por ejemplo, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) unida a una cromatografía líquida de proteína rápida a un caudal de 0,5 mL min-1,previamente equilibrada en tampón SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% de glicerol, fosfato de piridoxal al 0,1 mM).
      NOTA: Para purificar mayores cantidades de α aisladoStTS o β subunidadStTS y disminuir el número de rondas SEC, cargue una muestra de 5 ml a 20-25 mg ml-1 en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño a un caudal de 1,5 ml min-1.
    15. Evaluar la calidad de αStTS o βStTS en la fracción pico utilizando una electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio al 12% o al 15% (SDS-PAGE), respectivamente, teñida con tinción azul brillante de Coomassie25.
    16. Concentrar la proteína con unidades de filtro centrífugo de corte frescas de 15 ml 10 kDa, determinar la concentración de proteína24,preparar alícuotas de 0,5 ml a 20-25 mg mlde -1,etiquetar, congelar en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 °C.
  4. Purificación del complejo α2β2StTS de las subunidades α y β
    NOTA: Equilibrar la columna de cromatografía de exclusión de tamaño (Sephadex S-200 HR o Superdex 200 pg) en tampón SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, 5% glicerol, 0.1 mM piridoxal fosfato).
    1. Para purificar el complejo α2stTSde tipo salvajeβ 2de las subunidades α y β, descongele muestras de concentrado de αsubunidadesStTS y βStTS a 4 °C.
    2. Combinar alícuotas (1,2 αStTS: 1,0 β relación molarStTS) e incubar a 4 °C durante 1 h.
      NOTA: El exceso de αStTS es necesario para garantizar que la mayoría de βStTS se incorporen al complejo α2β2StTS.
    3. Eliminar los agregados proteicos por microcentrifugación (10.000 x g, 10 min, 4 °C).
    4. Cargue el sobrenadante clarificado en la columna de exclusión de tamaño.
    5. Evaluar la calidad de αStTS o βStTS en la fracción pico utilizando una electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio al 12% o al 15% (SDS-PAGE), respectivamente, teñida con tinción azul brillante de Coomassie25.
    6. Determine la concentración de proteína24, prepare alícuotas de 250-1000 μL a 15-20 mg mL-1, congele en nitrógeno líquido y almacene a -80 ° C.

2. Purificación del tipo salvaje o forma mutante del complejo α2β2StTS

  1. Mutagénesis dirigida al sitio para preparar mutantes βStTS
    1. Utilice el vector de expresión de constructo pEBA-1022 como plantilla de ADN durante dos pasos de la reacción en cadena de la polimerasa para introducir mutaciones puntuales específicas en la secuencia de polinucleótidos TS de cadena β.
      NOTA: Este protocolo se puede utilizar para introducir una mutación puntual única en α o β subunidad de Salmonella typhimurium triptófano sintasa. Para los cebadores de oligonucleótidos nuevos adicionales que contengan la mutación deseable deben diseñarse adecuadamente. En este trabajo, se enumeran las mutaciones βQ114A, βK167T, βS377A.
    2. Realizar reacciones de PCR utilizando pares de cebadores de nucleótidos TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev y TS-FW-NcoI/S377A-Rev para generar fragmentos A1, B1 y C1, respectivamente.
      NOTA: El oligonucleótido TS-NcoI-FW y TS-SacI-Rev, respectivamente, anneals aguas arriba y aguas abajo de la secuencia de polinucleótidos αβ StTS clonada en el vector pEBA-10.
      1. Utilice ADN polimerasa de alta fidelidad (por ejemplo, Phusion) y el protocolo del fabricante para amplificar las secuencias de ADN. Para una reacción de PCR de 50 μL, agregue 34 μL de agua libre de nucleasa, 10 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de dNTP de 10 mM, 1 μL de imprimación hacia adelante de 10 μM, 1 μL de imprimación inversa de 10 μM, 1 μL de ADN de plantilla (200 ng), 1,5 μL de DMSO, 0,5 μL de ADN polimerasa.
      2. Para el programa de PCR, utilice un arranque en caliente (180 segundos a 98 °C) seguido de 30 ciclos de amplificación (30 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 120 segundos a 72 °C), y una extensión final (300 segundos a 72 °C).
        NOTA: Se siguieron todos los pasos de la biología molecular como se describe en Clonación molecular: Un manual de laboratorio23. Mientras que una secuencia minúscula corresponde a un sitio de restricción, una secuencia en negrita y cursiva corresponde a una mutación.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Realice reacciones de PCR utilizando pares de cebadores de nucleótidos TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF y TS-Rev-SacI/S377A-FF para generar fragmentos A2, B2 y C2, respectivamente.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Utilice la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar individualmente los fragmentos parciales. Utilice una temperatura de fusión de 55 °C y un tiempo de extensión de la polimerasa de 2 min.
    5. Para realizar la segunda ronda de reacciones de PCR, cargue el producto de PCR anterior en gel de agarosa al 0,8% sobre 1x TAE a 6 V / cm y el extracto de gel y el gel purifican los fragmentos de interés.
      1. Mezcle los fragmentos A1/A2, B1/B2 y C1/C2 por separado en cantidades equimolares, desnaturale al calor la mezcla durante 10 min a 96 °C y anneal a 25 °C. Extender las hebras recombinantes con una polimerasa de alta fidelidad y desoxirribonucleótidos según el protocolo del fabricante.
    6. Para generar un alto número de copias del fragmento de ADN mutante de longitud completa, agregue oligo cebadores TS-FW-NcoI y TS-Rev-SacI para realizar una segunda PCR.
    7. Cargue el producto de PCR sobre agarosa al 0,8% en 1x tampón TAE a 6 V/cm, extraiga en gel la banda de ADN de interés, purifique en gel el fragmento de PCR y proceda con la digestión de restricción adecuada durante 2 horas a 37 °C siguiendo el tampón apropiado y las condiciones recomendadas por el fabricante.
      1. Digiera al menos 200 ng de cada fragmento de ADN con las enzimas de restricción y las condiciones adecuadas recomendadas por el fabricante durante 2 horas a 37 °C. Para establecer una reacción de digestión de restricción de 50 μL, agregue 34 μL de agua libre de nucleasa, 10 μL de ADN (200 ng), 5 μL de tampón de reacción 10x, 0.5 μL de enzima de restricción 1 y 0.5 μL de enzima de restricción 2. Cargue el producto de digestión sobre agarosa al 0,8% en 1x tampón TAE a 6 V/cm y purifique el fragmento de PCR digerido.
    8. Digest 200 ng de construcción pEBA-10 con enzimas de restricción NcoI y SacI siguiendo la recomendación del fabricante. Cargue el producto de digestión en gel de agarosa al 0,8% en 1x tampón TAE a 6 V / cm, elimine la banda correspondiente al vector y purifique el gel del vector digerido.
    9. Ligar 100 ng de vector con 50 ng de fragmento de PCR, previamente digerido y purificado, con ADN ligasa T4 durante 2 horas a 25 °C. Transformar el plásmido construido en células competentes células de la cepa E. coli DH10B. Células de placa en placas de agar LB que contienen 50 μg/ml deampicilina. Incubar la placa invertida durante la noche a 37 °C.
    10. Escoja una sola colonia (sin colonias satélite) de cada transformación celular y disperse en 5 ml de medio LB que contenga ampicilina. Cultive las células durante la noche con agitación a 200 rpm a 37 °C. Prepare 10 μg de ADN plásmido ultrapura de cada construcción diseñada. Preparar las existencias de glicerol de cultivo celular (girar la suspensión celular en una concentración final del 16% de glicerol estéril) y almacenar a largo plazo a -80 °C.
    11. Realice la secuenciación del ADN para confirmar la secuencia de longitud completa que codifica las α y β subunidades de triptófano sintasa. Confirme cada mutación individual y descarte cualquier construcción de plásmido que contenga una mutación aleatoria indeseable. Los cebadores de oligonucleótidos utilizados en este estudio se enumeran a continuación.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-GATGCAAACAGC-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCTCATTG-3'
      NOTA: Cebadores de oligonucleótidos TS-1F, TS-1R, TS-2F y TS-3F recocidos en la secuencia de polinucleótidos de la subunidad β (código de acceso genBank: CP051286.1). Cebadores TS-4F y TS-5F anneal en la secuencia de polinucleótidos de la subunidad α (código de acceso GenBank: CP053865.1).
    12. Utilice 200 ng de cada construcción de plásmido (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T y pEBA-10-βS377A) para transformar células competentes de la cepa de expresión de E. coli CB149, que carece del operón trp 26. Después de la formación exitosa de colonias, elija una sola colonia y cultive las células en 5 ml de medio LB que contenga 50 μg / ml de ampicilina. Cultivo en la incubadora bacteriana a 37 °C durante la noche. Preparar existencias de glicerol de cultivo celular, almacenar a largo plazo a -80 °C o utilizar inmediatamente para la expresión de proteínas recombinantes.
      NOTA: Una sola mutación puntual en α o β subunidad de Salmonella typhimurium triptófano sintasa puede afectar la función enzimática o disminuir la síntesis de L-triptófano en la cepa CB149 de E. coli. Considere la posibilidad de utilizar la cepa bl21(DE)pLys-S de E. coli o Rosetta (DE3)pLys-S si no se detecta expresión o cantidades más bajas de complejo recombinante α2β2StTS en un gel SDS-PAGE.
  2. Expresión de tipo salvaje y forma mutante del complejo α2β2StTS en E. coli
    1. Cultivar cepa de expresión de E. coli que albergue la construcción deseable en un medio lb fresco y estéril de 50 ml que contenga 50 μg/ml de ampicilina. Cultive las células durante la noche con agitación a 200 rpm a 37 °C.
    2. Añadir 5 ml del cultivo celular durante la noche en un fresco y estéril 2x 1000 ml de LB que contenga 2% de glicerol más ampicilina (matraz de Fernbach de 2,8 L). Cultivo celular con agitación a 200 rpm a 37 °C.
    3. Inducir la expresión de proteínas recombinantes cuando el OD600 alcanza 0.6-0.8 mediante la adición de IPTG a una concentración final de 0.4 mM seguida de incubación a 30 °C durante la noche con agitación a 200 rpm.
    4. Cosechar las células centrifugando a 4.000 x g en 4 °C durante 20 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares con tampón de lisis en frío 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, que contiene 100 mM NaCl, 5 mM de ditiotereitol, 1 mM de EDTA y 1 mM de PMSF) hasta un volumen final de 50 ml de tampón.
      NOTA: Las células pueden almacenarse a largo plazo a -80 °C o utilizarse inmediatamente para la purificación de proteínas. Para almacenar las células, divida la suspensión celular en tubos cónicos de centrífuga desechables de 2 x 50 ml y mantenga los gránulos celulares a -80 ° C hasta el paso de purificación de proteínas. La expresión de la forma mutante y de tipo silvestre de αcomplejo 2stTSde 2 β2en caldo LB produce 125-150 mg de proteína por litro. Considere la posibilidad de escalar el protocolo hacia arriba o hacia abajo para satisfacer demandas específicas.
  3. Purificación de tipo salvaje o forma mutante del complejo α2β2StTS
    NOTA: El siguiente protocolo está destinado a purificar el tipo salvaje recombinante no etiquetado o la forma mutante del α2β2StComplejo TS dentro de 1 día, dependiendo del conjunto de habilidades y esfuerzos. Para reducir el tiempo de purificación, equilibre la columna de exclusión de tamaño en el tampón previo a la purificación/expresión de proteínas. Purificación de α de tipo salvaje o mutante2β2StEl complejo TS se lleva a cabo mediante una purificación de dos pasos que comprende fraccionamiento de sulfato de amonio y una cromatografía de exclusión de tamaño. Este protocolo produce 60-100 mg de complejo puro de 1 L de LB medio.
    1. Interrumpa el pellet celular por sonicación utilizando un sonificador digital con sonda Horn de 1/2" (o un equipo similar). Realice 20 ciclos al 80% de amplitud en un baño de agua helada utilizando 10 s de pulso y 20 s de reposo o hasta la interrupción completa de la célula.
    2. Centrifugar el lisado celular a 30.000 x g durante 30 min a 25 °C. Sobrenadante aspirante, asegurando que el pellet no se desprenda del tubo. Filtre la fracción sobrenadante clarificada con un filtro de 0,45 μm a temperatura ambiente.
    3. Evaluar el volumen inicial de la fracción sobrenadante clarificada. Agregue lentamente pequeñas cantidades de sulfato de amonio a la vez, hasta que se alcance una saturación del 20% (11.51 g / 100 mL). Realizar fraccionamiento de sulfato de amonio a 25 °C. Revuelva suavemente la solución durante 10 minutos y evite las burbujas.
    4. Centrifugadora a 30.000 x g durante 10 min a 25 °C. Transfiera la fracción sobrenadante al 20% a un matraz limpio. Resuspenda suavemente el 20% de la fracción de pellets en 20 ml del tampón de muestra 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, que contiene 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA y 2 mM de ditiotereitol) y prepare una muestra para ejecutar el gel SDS-PAGE. Deseche la fracción de pellets al 20%.
    5. Evaluar el volumen inicial de la fracción sobrenadante al 20%. Agregue sulfato de amonio para que se alcance una saturación del 30% (5.94 g / 100 ml), revuelva la solución, evite las burbujas y centrífuga como antes. Transfiera la fracción sobrenadante al 30% a un matraz limpio. Resuspenda suavemente el 30% de la fracción de pellets en 20 ml del tampón de muestra 2 y prepare una muestra para ejecutar el gel SDS-PAGE. Deseche la fracción de pellets al 30%.
    6. Evaluar el volumen inicial de la fracción sobrenadante del 30%. Agregue sulfato de amonio a una saturación del 40% que se alcanza (6.14 g / 100 ml), revuelva la solución, evite las burbujas y centrífuga como antes. Transfiera la fracción sobrenadante al 40% a un matraz limpio. Resuspenda suavemente el 40% de la fracción de pellets en 10 ml de tampón de muestra 2 y prepare una muestra para ejecutar el gel SDS-PAGE. Deseche la fracción sobrenadante al 40%.
      NOTA: Evaluar la calidad del complejo αβStTS utilizando muestras de las fracciones de sobrenadante y pellets al 30% y 40% en un gel SDS-PAGE al 12%25. Si verifica que cualquier otro complejo mutante αβStTS está en la fracción sobrenadante al 40%, proceda a una saturación del 60% de sulfato de amonio (13.0 g / 100 mL). Las alícuotas proteicas prepurpuradas del complejo StTS α2β2 prepurpuradas pueden almacenarse a largo plazo a -80 °C o utilizarse inmediatamente para la purificación de proteínas en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC).
    7. Microcentrífugo la muestra de proteína a 10.000 x g,20 min, 4 °C y carga la fracción sobrenadante sobre una columna HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR unida a una cromatografía líquida de proteína rápida a un caudal de 0,5 mL min-1,previamente equilibrada en tampón SEC (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, 5% glicerol, 0,1 mM de fosfato de piridoxal).
      NOTA: Para purificar grandes cantidades de complejo, cargue una muestra de 5 ml a 20-25 mg ml-1 en una columna HiLoad 26/600 Superdex 200 pg a un caudal de 1,5 ml min-1.
    8. Evaluar las muestras recogidas a lo largo del fraccionamiento de sulfato de amonio y las fracciones máximas de la columna SEC en un gel SDS-PAGE al 12% teñido con tinción azul brillante de Coomassie25.
    9. Concentre el tipo salvaje o mutante αcomplejo 2β2StTS con una unidad de filtro centrífugo de corte de 15 mL 100 kDa girando a 3.000 x g a 4 °C. Transfiera la proteína concentrada a un tubo fresco de 2,0 ml y una microcentrífuga (10.000 x g, 10 min, 4 °C) para eliminar los agregados.
    10. Determine la concentraciónde proteínas 24, prepare 0.5 ml de alícuotas a 20-25 mg ml-1, etiquete, congele en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 ° C.

3. Cristalización optimizada para el tipo salvaje y la forma mutante del complejo α2β2StTS

NOTA: La condición de cristalización inicial para el complejo stTSα2β2se informó previamente en condiciones que contenían 12% de PEG 8,000 y 2 mM de espermín22.

  1. Preparar soluciones de stock antes de los ensayos de cristalización para lograr una mejor reproducibilidad de cristalización. Para realizar estudios estructurales con TS, cristalizar proteína conNa+ oCs+ ion en el sitio de coordinación metálica del complejo bienzima.
    1. Preparar 5 ml de solución de caldo de 200 ml de esperfina en agua y mantener las alícuotas de 500 μL a -20 °C.
    2. Preparar una solución de caldo de 50 ml de PEG 8000 al 30% (p/v) en agua y mantener 25 ml de alícuotas en un matraz cónico centrífugo desechable de 50 ml a 25 °C.
    3. Preparar una solución de 25 ml de 1 M de CsCl en agua y mantener a 25 °C.
    4. Preparar una solución de caldo de 25 ml de 1 M de NaCl en agua y conservar a 25 °C.
    5. Preparar 3x 50 ml de solución stock de 1 M de bicina y valorar con CsOH o NaOH para obtener soluciones tamponadas a pH 7.6, 7.8 y 8.0. Mantener 25 ml de alícuotas a 4 °C.
  2. Descongele una muestra de αcomplejo 2β2StTS (20-25 mg ml-1)en un baño de hielo.
  3. Muestra de microcentrífuga a 10.000 x g durante 10 min a 25 °C para eliminar agregados de proteínas.
  4. Transfiera la fracción sobrenadante despejada a un tubo de microcentrífuga limpio.
  5. Concentración estimadade proteínas 24 y alícuotas de proteínas diluidas (150-200 μL) a 15 mg mL-1 con 50 mM bicine-CsOH o -NaOH, pH 7.8 que contiene 50 mM CsCl o NaCl. Mantenga la muestra de proteína a 25 °C.
  6. Prepare las soluciones de depósito de 500 μL para 3 placas de gota sentadas de 24 pozos en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml etiquetados. La solución del reservorio contiene 50 mM bicine-CsOH o -NaOH, 50 mM CsCl o NaCl, y PEG 8000. Variar la concentración de PEG 8000 (6-11%) en las columnas de la placa y la concentración de esperfina (2-8 mM) en las filas de la placa. Cambie el pH del tampón (pH 7.6, 7.8 y 8.0) para cada conjunto.
  7. Tapa los tubos y el vórtice vigorosamente al menos 10 segundos. Tubos de centrífuga a 10.000 x g durante 10 min a 25 °C para eliminarburbujas. Dispensar una solución tamponada de 500 μL en cada depósito etiquetado.
  8. Use una micropipeta P-10 y dispense 5 μL de solución de proteína a 15 mg ml-1 por cada gota sentada bien. Evita las burbujas. Añadir 5 μL de cada solución de reservorio correspondiente a la gota de proteína. Evite las burbujas durante la mezcla y no pipetee hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la mezcla.
  9. Pega la placa con una cinta adhesiva transparente y guárdala a 25 °C. Los cristales aparecen en 2-5 días y crecen a sus dimensiones completas en dos semanas.

4. Recopilación de datos de difracción de rayos X y solución de estructura compleja α 2β2StTS

NOTA: Antes de la recopilación de datos de difracción de rayos X, prepare la solución crioprotectora para cada cristal con anticipación. Utilice la solución de reservorio específico para preparar 3 alícuotas que contengan concentraciones crecientes de sulfóxido de dmetilo en solución (10, 20 y 30% v/v) y ligando (s) específico(s). Se encontró que el dimetilsulfóxido es un mejor crioprotector que el glicerol, el etilenglicol y el PEG 200-300.

  1. Cosecha un solo cristal grande usando un cryoloop bajo el microscopio estereoscópico.
  2. Pipetear 2 μL de cada solución crioprotectora que contenga la solución de precipitación más concentraciones más concentraciones más altas de dmetilsulfóxido y ligando (s) en un nuevo portaobjetos de cubierta.
  3. Secuencialmente, remoje crystal en cada gota y deje que el cristal se equilibre durante 30 s en la solución crioprotectora.
  4. Enfriamiento por flash del cristal crioprotegido utilizando una corriente de nitrógeno gaseoso a -173 °C (100 K) o sumergirlo en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo en discos.
    NOTA: Llene una espuma Dewar con nitrógeno líquido, enfríe previamente un disco de cristal, almacene cristales en el almacenamiento criogénico Dewar y envíe cristales al sincrotrón utilizando un cargador seco.
  5. Proceda con la recopilación de datos de difracción de rayos X a -173°C. Registre datos de difracción de rayos X utilizando un tiempo de exposición de 0.5-4.0 s y oscilaciones de 0.5°. Gire el cristal 180-360°.
  6. Procese las imágenes de difracción de rayos X con iMosflm27 para generar un archivo de reflexión en el grupo espacial apropiado. Generalmente, α2β2cristalesStTS pertenecen al grupo espacial C 121 (C2).
  7. Escalar conjuntamente múltiples observaciones de reflexiones con Scala28,implementadas en el paquete CCP429.
  8. Resuelva la estructura del complejo α2stTSde alta resoluciónβ 2 mediantereemplazo molecular utilizando MolRep30 y un modelo de búsqueda apropiado. Inspeccione el modelo y el mapa de densidad de electrones en Coot31 después de una solución de estructura exitosa.
    NOTA: Hay muchas estructuras de cristales de TS depositadas en el Banco de Datos de Proteínas con diferentes ligandos. Para un mejor paso de reemplazo molecular y una disminución del tiempo de ajuste de la estructura cristalina más nueva, use el mejor modelo de búsqueda que contenga ligando (s) de interés. Proceda con el refinamiento de la estructura cristalina enCCP4 29,30 o Phenix31.
  9. Realice ajustes manuales al modelo utilizando Coot32,seguido de refinamiento automático con Refmac29,33 o phenix.refine31,34. Cree y refine el modelo final ejecutando rondas iterativas de construcción de modelos en Coot32 y refinamiento automatizado.
  10. Proceda con la deposición de factores de coordenadas y estructura en el sitio web del Banco de Datos de Proteínas.

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Representative Results

Purificación de las αy βsubunidades de la triptófano sintasa
La α-subunidad(αStTS) y la β-subunidad (βStTS) de la Salmonella typhimurium triptófano sintasa fueron subclaonadas en el vector pET SUMO modificado. La Figura 1A muestra resultados representativos de SDS-PAGE de dos bandas fuertes correspondientes a la proteína de fusión His6-SUMO-αStTS (lane αON) e His6-SUMO-βStTS (lane βON). El protocolo de purificación descrito en este trabajo permitió la purificación de ambas subunidades individualmente dentro de los 2 días. El primer día se utilizó para purificar cada proteína mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA, precipitación de sulfato de amonio seguida de escisión his-SUMO-tag, eliminación de trazas de his-sumo-tag y concentración de proteínas. Las figuras 1B y 1C muestran resultados representativos de SDS-PAGE de la α-subunidad y la purificación de β-subunidad, respectivamente. En el segundo día, el concentrado α-subunidad, β-subunidad y el complejo α2β2StTS de las subunidades α y β se cargaron en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño. La Figura 1D muestra un perfil de elución típico de αStTS, βStTS y αcomplejos 2β2StTS en una columna de exclusión de tamaño S-200 HR. La Figura 1E muestra un resultado representativo de SDS-PAGE de las fracciones máximas recogidas. Las fracciones máximas más puras se agruparon, concentraron y el complejo StTSα2β2se utilizó para estudios de cristalización de proteínas.

Purificación del tipo salvaje y mutante αcomplejo 2β2StTS
Otro protocolo rápido y eficiente para purificar el tipo salvaje y la forma mutante del complejo α2β2S. typhimurium triptófano sintasa se describe en este trabajo. La Figura 2 muestra una representación del constructo pEBA-10 que contiene el gen de acoplamiento traslacional de tipo salvaje (trpA y trpB) que codifica para las α- y β- subunidades22. El protocolo de mutagénesis PCR de dos pasos para generar formas mutantes del complejo stTSα 2β2se representa en la Figura 3.

Las regiones codificantes del mutante αcomplejo 2β2StTS en pEBA10 fueron confirmadas por secuenciación de ADN y utilizadas para transformar las células CB149 de la cepa CB149 de E. coli 26. El tipo salvaje y la forma mutante del complejo α2β2StTS se sobreexpresaron y las proteínas recombinantes se purificaron con éxito en 1-2 días. El fraccionamiento de sulfato de amonio a temperatura ambiente eliminó fácilmente la mayoría de las proteínas contaminantes del sistema de expresión heteróloga(Figura 4A,carriles 20P, 30P y 40S). En la Figura 4Bse muestra un perfil de elución representativo con posición de elución relativa deαcomplejo de exclusión de tamaño 2 β2StTS (143,06 kDa) en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. La pureza de las fracciones máximas excluidas fue analizada SDS-PAGE antes de la agrupación(Figura 4C).

Optimización de lacristalización del complejo de α de tipo salvaje y mutante2 β 2triptófano sintasa
Se utilizaron alícuotas de tipo salvaje y mutantes α2β2StTScomplex a 15 mg ml-1 para configurar placas de gota sentadas de 24 pozos. Típicamente, las gotas que consisten en una solución de proteína de 5 μL y el volumen equivalente de solución de reservorio se equilibraron contra 500 μL de solución de reservorio (Figura 5). Se requiere esperfina para cristalizar el tipo salvaje y mutante α2β2StTS complejo22. Mientras que la concentración final de espermina para cristalizar el tipo salvaje es de 2 mM, la concentración de espermina para cristalizar el complejo mutante en este trabajo mostró ser ligeramente mayor (4-8 mM).

Se obtuvieron grandes cristales individuales a través de una optimización de cristalización fina, variando PEG 8000 (6-11%) y pH tampón bicino. Los cristales con diferentes morfologías aparecieron en 2-5 días y los cristales crecieron a tamaño completo en dos semanas(Figura 6). Antes de la recopilación de datos de difracción de rayos X, los cristales se empaparon en una solución crioprotectora (tampón de reservorio que contenía hasta un 30% de dimetilsulfóxido). El proceso optimizado dio como resultado cristales de calidad adecuados para mediciones de difracción de rayos X a una resolución casi atómica.

Análisis de datos de difracción de rayos X
Se preparó una estructura cristalina del tipo salvaje αcomplejo 2β2StTS con los métodos descritos en este artículo y se recopilaron datos de difracción de rayos X a una resolución casi atómica. El cristal se empapó en una solución crioprotectora que contenía inhibidor de F9 (2- ({[4- (Trifluoromethoxy)Phenyl]Sulfonyl}Amino)Ethyl Dihydrogen Phosphate) y L-Triptófano.

Se recopiló un conjunto completo de datos de difracción de rayos X en la línea de haz de sincrotrón SIBYLS 12.3.1 en la Fuente de Luz Avanzada (Berkeley-CA) girando el cristal 360 ° en incrementos de 0.5 °. Se procesaron las intensidades de difracción de rayos X y las estadísticas de recolección de datos se resumen en la Tabla 1. El análisis de simetría indica que el cristal pertenecía al grupo espacial monoclínico C2. Los parámetros de celda unitaria son a = 182.55, b = 59.30, c = 67.37Å, α = 90.00, β = 94.82, γ = 90.00°. El valor calculado del coeficiente de Matthews (Vm = 2,57 Å3 Da-1)sugiere la presencia de una molécula heterodímero TS (αβ StTS) en la unidad asimétrica del cristal con un contenido de disolvente del 52,08%35,36. Todos los datos de rayos X se recopilaron a bajas temperaturas (100 K) para mejorar la calidad de la difracción y disminuir la desintegración de la radiación. La α2β2StTS estructura cristalina en complejo se resolvió mediante el método de reemplazo molecular utilizando el modelo wild type αβ StTS en complejo con el inhibidor F9 en el sitio α y el ion cesio en el sitio de coordinación del metal (código PDB ID: 4HT3). El archivo de coordenadas final y los factores de estructura se depositaron en el AP con el código de acceso 5CGQ(Figura 7A). La estructura cristalina del tipo salvaje αcomplejo 2β2StTS con inhibidor F9 en el sitio α enzima ( Figura7B), ion cesio en el sitio de coordinación del metal (Figura 7C), el cofactor piridoxal 5'-fosfato unido covalentemente a βLys87 (Figura 7D), y el producto L-triptófano en el sitio β enzima ( Figura7E) se resolvió a una resolución de Angstrom de 1.18. El modelo 5CGQ es la estructura cristalina de 2 β2StTS de mayor resolución αdepositadaen el PDB hasta la fecha.

Figure 1
Figura 1: Purificación de las subunidades α y β y delcomplejo st TS α2β2. (A) Expresión de proteínas recombinantes. Gel SDS-PAGE al 12% del perfil de expresión durante la noche de SUMO-αStTS (αON) y SUMO-βStTS (βON) después de la inducción de IPTG a 30 °C (α/β0 antes de la inducción de IPTG). (B, C) Cromatografía de afinidad de Ni-NTA seguida de precipitación de sulfato de amonio (saturación del 60%), (S) extracto crudo clarificado (FT1) Columna de Ni-NTA pasar a través de la muestra (W) Muestra de lavado de columna (E) Muestra de eluido (60S) y (60P) sobrenadante y fracciones precipitadas después de la centrifugación de alta velocidad, respectivamente (D) Producto de digestión sumoproteasa (FT2) Columna de Ni-NTA pasar a través de la muestra que contiene la subunidad αStTS o βStTS sin etiquetas. (D) perfil de elución de α subunidadStTS (28,67 kDa), β subunidadStTS (42,86 kDa) y αcomplejo 2β2StTS (143,06 kDa) con una columna de cromatografía de exclusión de tamaño HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. Cada carrera se realizó por separado. (E) Geles SDS-PAGE de las fracciones máximas excluidas de cada cromatografía individual. Mientras que el 15% de los geles SDS-PAGE se prepararon para analizar αcomplejo 2β2StTS y α subunidadStTS, se preparó un gel SDS-PAGE al 12% para analizar la subunidad stTSβ. MW de carril, marcadores de peso molecular en kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación del constructo pEBA-10. (A) Representación del gen de acoplamiento traslacional de tipo salvaje (trpA y trpB) que codifica las α- y β- subunidades de la triptófano sintasa de la bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium (Yang, Ahmed et al. 1996). (B) El vector contiene un gen de resistencia a la ampicilina (amp), un origen de replicación (ori), un gen lacIq para apagar mejor un promotor lac en ausencia de inductor IPTG, y el promotor reprimido por LacI. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Representación general del protocolo de mutagénesis PCR de dos pasos. El vector pEBA-10 se utilizó como plantilla de ADN. La primera ronda de PCR se preparó con cebadores TS-FW-NcoI y MUT-REV (un cebador inverso que contiene una mutación) para generar el primer fragmento y cebadores TS-Rev-SacI y MUT-FW (un cebador delantero que contiene una mutación) para generar el segundo fragmento). Los fragmentos fueron purificados en gel y combinados equimolarmente, desnaturalados por calor y recocidos. Las hebras recombinantes se extendieron con polimerasa y desoxirribonucleótidos. La segunda ronda de PCR se preparó con cebadores TS-FW-NcoI y TS-Rev-SacI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Purificación del tipo salvaje y forma mutante delcomplejo α2β2StTS. (A) Gel SDS-PAGE al 12% de muestras recogidas a lo largo de la precipitación de sulfato de amonio utilizando 20, 30, 40 y 50% de saturación de sulfato de amonio a temperatura ambiente: (CE) extracto crudo (S) y (P) sobrenadante y fracciones precipitadas después de la centrifugación a alta velocidad. (B) Perfil de elución del complejo α2β2StTS (143,06 kDa) con una columna de cromatografía de exclusión de tamaño HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR. (C) Imagen en gel SDS-PAGE al 12% de las fracciones máximas excluidas. Lane MW, marcadores de peso molecular en kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, Bio-Rad). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Optimización de la cristalización para el tipo salvaje y la forma mutante delcomplejo α2β2StTS. Los cristales se cultivaron en un tampón Bicine-CsOH de 50 mM que contenía 50 mM CsCl2. La concentración de polietilenglicol 8000 (6-11%) y espermina (2-8 mM) se varió para obtener formas de cristales grandes individuales para realizar estudios estructurales por cristalografía de proteínas de rayos X. (A) Bicine-CsOH, pH 7.6. (B) Bicine-CsOH, pH 7.8. (C) Bicine-CsOH, pH 8.0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Fotomicrografía de cristales de tipo salvaje y forma mutante delcomplejo α2β2StTS. Los cristales difieren en morfología, pero pertenecen al grupo espacial C2. Los cristales crecieron a sus dimensiones completas en las condiciones finales después de dos semanas. Cristales de aproximadamente 0,20 x 0,15 x 0,10 mm de tamaño. (A-D) Holocristales PLP en complejo con ion cesio en el sitio de coordinación metálica de la forma de tipo salvaje (columna A), forma mutante α2β2 βQ114A (columna B), α2β2 βK167T (columna C) y α2β2 βS377A (columna D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Visualización general de la estructura cristalina y validación de los mapas de densidad de electrones obtenidos después del refinamiento de la estructura cristalina. (A) estructura cristalina del tipo salvaje αcomplejo 2β2StTS con inhibidor F9 en el sitio α enzima (color amarillo), ion cesio en el sitio de coordinación del metal (color azul), el cofactor piridoxal 5'-fosfato covalente unido a βLys87 (color verde), y el producto L-triptófano en el sitio β enzima (color cian) a una resolución de 1.18 Angstrom. Mientras que la subunidad α está coloreada en azul claro, la subunidad β está coloreada en salmón. (B-E) Mapas de densidad de electrones contorneados a nivel de 1.0 r.m.s. alrededor de (B) inhibidor F9 (C) ion cesio (D) piridoxal-5′-fosfato, y (E) L-triptófano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Recopilación y procesamiento de datos
Fuente de rayos X / Línea de haz Línea de haz ALS 12.3.1
Longitud de onda (Å) 10,000
Resolución (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
Número total de reflexiones 2151280 (252941)
Número total de reflexiones únicas 231646 (32187)
Grupo espacial para indexación, escalado y fusión C 1 2 1
Dimensiones de la celda
a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
Mosaicidad 0.61
Matthews volumen VM (Å3 Da-1) 2.57
Rmeas (%) 8.6 (93.0)
14.7 (3.0)
CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
Integridad (%) 98.6 (94.2)
Multiplicidad 9.3 (7.9)
Estadísticas de refinamiento
Rwork/Rfree (%) 14.04 / 16.05
Longitud de enlace RMSD (Å) 0.0120
Ángulo de enlace RMSD (°) 14,059
Ramachandran favorecido 515 (96.44%)
Ramachandran permitido 16 (3.00%)
Ramachandran no permitido 3 (0.56%)

Tabla 1: Recopilación y procesamiento de datos. Los valores entre paréntesis son para la cubierta exterior.

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Discussion

Hemos diseñado con éxito la forma mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T y α2β2 complejos βS377A StTS para estudios de correlación estructura-función. Inicialmente, hemos intentado purificar los mutantes utilizando un protocolo de purificación previo22,que requiere α cristalización del complejo2β2StTS con PEG 8000 y esperfina durante la purificación. Aunque la tasa de cristalización depende de la forma mutante y de la concentración del complejo en solución, siendo difícil predecir cuándo aparecen cristales en un gran volumen de solución. La cristalización podría lograrse después de largos períodos (48-96 h) o siendo necesaria la adición de cantidades adicionales de PEG 8000 después de la iniciación de la cristalización15.

Desafortunadamente, las formas mutantes de α complejo StTS2β2presentado en este trabajo no se purificaron con éxito utilizando este protocolo ya que no lograron cristalizar durante los pasos iniciales del protocolo, lo que perjudicó los estudios cristalográficos. Por lo tanto, hemos creado un protocolo de purificación simple y eficiente que comprende el fraccionamiento de sulfato de amonio y la cromatografía de exclusión de tamaño, que dan altos rendimientos de tipo silvestre y forma mutante de α2β2StTS complejo. Este protocolo es más rápido (1-2 días) y reproducible en comparación con el protocolo anterior (5-7 días)15,22, ya que no hay requisitos de cristalización y solución de problemas del protocolo a lo largo de la purificación. Además, hemos creado nuevos constructos de expresión y protocolo para purificar altas cantidades de la α-subunidad, β-subunidad y la reconstitución αcomplejo 2β2StTS de los aislados.

La aplicación futura incluye la recombinación de subúyidades de tipo salvaje y mutantes para realizar estudios funcionales y estructurales. Mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T y α2β2 complejo βS377A cristalizado en condiciones que contienen concentraciones más altas de espermina (4-8 mM) en comparación con la forma de tipo salvaje (2 mM). Por lo tanto, vale la pena dedicar tiempo a mejorar la calidad de los cristales de proteínas variando la concentración de precipitantes y el pH tampón. Las formas de cristal grande único crecieron aleatoriamente en solución tamponada de bicina (pH 7.6-8.0) que contenía 6-11% PEG 8,000. Los métodos descritos en este trabajo se utilizarán para preparar estructuras cristalinas del tipo salvaje y formas mutantes del complejo α2β2 con diferentes ligandos dentro de los sitios α y β activos, imitando diferentes estados intermedios y de transición involucrados en la conversión de indol y serina en triptófano. Se prevé que las estructuras cristalinas de estos mutantes proporcionen nuevos conocimientos sobre el mecanismo y las funciones que desempeñan los residuos clave en la síntesis de L-triptófano.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar y no declaran intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (GM097569).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

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