Summary

Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

Published: September 26, 2020
doi:

Summary

Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de Salmonella typhimurium triptófano sintasa comp este protocolo un sistema rápido para purificar el complejo proteico en un día. Los métodos cubiertos son la mutagénesis dirigida al sitio, la expresión de proteínas en Escherichia coli,la cromatografía de afinidad, la cromatografía de filtración en gel y la cristalización.

Abstract

Se han realizado estudios estructurales con complejo bienzimático triptófano sintasa (TS) (α2β2 TS) de Salmonella typhimurium para comprender mejor su mecanismo catalítico, comportamiento alosterico y detalles de la transformación enzimática de sustrato a producto en enzimas dependientes de PLP. En este trabajo, un novedoso sistema de expresión para producir la subunidad β aislada α y aislada permitió la purificación de altas cantidades de subunidades puras y α complejo StTS2β2de las subunidades aisladas en 2 días. La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad seguida de escisión de la etiqueta de afinidad, precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Para comprender mejor el papel de los residuos clave en el sitio β enzima, se realizó mutagénesis directa en el sitio en estudios estructurales previos. Otro protocolo fue creado para purificar el tipo salvaje y mutante α2β2complejosStTS. Un protocolo simple, rápido y eficiente que utiliza fraccionamiento de sulfato de amonio y SEC permitió la purificación de α complejo2β2StTS en un solo día. Ambos protocolos de purificación descritos en este trabajo tienen ventajas considerables en comparación con los protocolos anteriores para purificar el mismo complejo utilizando PEG 8000 y espermina para cristalizar el complejo α2β2StTS a lo largo del protocolo de purificación. La cristalización de tipo salvaje y algunas formas mutantes ocurre en condiciones ligeramente diferentes, lo que perjudica la purificación de algunos mutantes utilizando PEG 8000 y esperfina. Para preparar cristales adecuados para estudios cristalográficos de rayos X se realizaron varios esfuerzos para optimizar la cristalización, la calidad de los cristales y la crioprotección. Los métodos presentados aquí deben ser generalmente aplicables para la purificación de las subunidades de triptófano sintasa y α de tipo salvaje y mutante2β2StTS complejos.

Introduction

El complejo bienzimático triptófano sintasa (TS) (α2β2)es una enzima alostérica, catalizando los dos últimos pasos en la biosíntesis del aminoácido L-triptófano en bacterias, plantas y hongos1,2,3. La bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa una infección gastrointestinal grave en humanos y otros animales. Dado que los seres humanos y los animales superiores no tienen ST (EC 4.2.1.20), la inhibición de S. typhimurium α2β2 complejo TS (α2β2StTS) se ha explorado como un posible objetivo farmacológico para el tratamiento de la criptosporidiosis y la tuberculosis4,las infecciones genitales y oculares5,y para la posible utilización de herbicidas en la agricultura6. La α-subunidad cataliza la escisión aldolítica de indol-3-glicerol-fosfato (IGP) a gliceraldehído-3-fosfato (GAP) e indol, a través de la formación de un intermedio de tautómero de indolenina y posteriormente la escisión de enlaces carbono-carbono para producir GAP e indol3,6. El sitio β-catalítico contiene una molécula de cofactor piridoxal 5′-fosfato (PLP) unida a β-Lys87 a través de una base de Schiff, que funciona como un sumidero de electrones en el curso de las reacciones en la enzima β-subunidad3,7. El sitio β cataliza el reemplazo del hidroxilo de cadena lateral L-Serina por indol para dar L-triptófano y una molécula de agua en una reacción dependiente de PLP. Calle TS sirve como un modelo de larga data para la investigación de la canalización de sustratos y la comunicación alotérica dentro de complejos multienzimáticos2,3. La comunicación alostérica bidireccional entre las subunidades α y β del ST es necesaria para sincronizar los pasos catalíticos y evitar la liberación de indol durante la síntesis de L-triptófano3. Para extender este esfuerzo, hemos preparado varios mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr y β-Ser377Ala) por mutación de punto único para ser utilizados en exploraciones adicionales de la relación entre la estructura enzimática, el mecanismo y la función en el sitio catalítico de la subunidad β StTS.

La investigación detallada sobre el mecanismo catalítico de α2β2StTS fue iniciada por el grupo de investigación de Edith W. Miles. Los primeros estudios con Escherichia coli nativa αcomplejo 2β2 TS se han centrado en la purificación y caracterización del complejo α-subunidad8,9,aislado β-subunidad10,11 y la reconstitución del complejo TS α2β2 a partir de las subunidades aisladas12. La purificación se llevó a cabo mediante precipitación de sulfato de amonio, diálisis de muestras, cromatografía DEAE-Sephadex, diálisis y una segunda ronda cromatográfica en una columna12de DEAE-Sephadex. En otro protocolo, se mejoró la purificación del mismo complejo cargando el lisato celular clarificado en una columna DEAE-Sephadex seguido de un paso cromatográfico en una columna Sepharose 4B, precipitación de sulfato de amonio y diálisis13. Ambos protocolos de purificación duran de 4 a 5 días. Escherichia coli αcomplejo TS 2β2 cristalizados, pero los cristales no eran adecuados para la difracción de rayos X en ese momento.

En un estudio novedoso, las formas recombinantes y de tipo salvaje de S. typhimurium αcomplejo 2β2 TS fueron purificadas y cristalizadas14,15. El complejo recombinante α2β2StTS se sobreexpresó en la cepa CB149 de E. coli que lleva el vector de expresión pEBA-10. Se reportó la recolección de datos de cristalización inicial y difracción de rayos X y el análisis del complejo stTSα2 β214. Sin embargo, agujas largas y delgadas como αcristales de 2β2StTS deterioraron los estudios estructurales. En un intento de recopilar mejores datos de difracción de rayos X, se describió otro protocolo de purificación para purificar el tipo salvaje y las formas mutantes del complejo α2β2StTS15. La purificación se llevó a cabo con una precipitación inicial utilizando esperfina y PEG 8.000 en el lisato celular clarificado y se eliminó un gran precipitado voluminoso por centrifugación. La fracción sobrenadante que contenía altas cantidades de α complejo StTSde 2β2se almacenó durante 16-48 h a 4 °C hasta que los cristales amarillos precipitaron. Los cristales fueron lavados y dializado extensamente contra diferentes tampones. El complejo proteico fue recristalizado en tampón que contenía sulfato de amonio y dializado15. Aunque la cristalización de proteínas depende de las concentraciones de proteínas y precipitantes en solución, es difícil monitorear, predecir y reproducir la purificación para otras formas mutantes de αcomplejo 2β2StTS en solución. Este protocolo tiene la ventaja de que no utiliza ningún método cromatográfico; sin embargo, las desventajas son el largo tiempo de purificación necesario para cristalizar, dializar y recristalizar, lo que generalmente requiere de 5 a 7 días. Para obtener cristales adecuados para la recolección de datos de rayos X, se evaluaron más de 600 condiciones de cristalización utilizando una combinación y variación de concentración de proteínas, temperatura, precipitantes (PEG 4,000, 6,000 y 8,000) y aditivos (CaCl2,MnCl2,ZnCl2,cadaverina, putrescina, esperfina o espermidina)15. Los cristales tenían una mejor forma cristalina y crecían más rápido en condiciones que contenían 12% de PEG 8,000 y 2 mM de espermín. La cristalización fue más favorable a 25 ° C en lugar de a 4, 30 o 42 ° C y creció a dimensiones máximas dentro de los 3 días15. Varias α2β2estructuras cristalinasstTS fueron reportadas en ese momento (1996-1999)16,17,18,19,20,21 y muchas otras estructuras se han publicado hasta la fecha.

Aquí, el propósito principal es presentar protocolos alternativos para purificar la triptófano sintasa y optimizar la cristalización de proteínas. El presente trabajo muestra mejoras significativas para purificar el tipo salvaje aislado α-subunidad (αStTS), aislado β-subunidad (βStTS), reconstituido αcomplejo St 2β2StTS de las subunidades aisladas, y formas salvajes tipo y mutantes del complejo α2β2StTS. Las ventajas sobre los protocolos anteriores son considerables, ya que el tiempo de purificación se redujo significativamente y se optimizó la cristalización y la crioprotección. Las formas mutantes de αcomplejo 2β2StTS diseñado en este trabajo han cristalizado cerca de la misma condición utilizada para la forma de tipo salvaje. Sin embargo, la optimización de la cristalización fina fue necesaria para obtener grandes cristales individuales de calidad suficiente para la determinación de la estructura a una resolución casi atómica. Hasta la fecha, hay 134 estructuras cristalinas de triptófano sintasa depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), lo que representa 101, 31 y 2 estructuras cristalinas, respectivamente, para bacterias, arqueas y eucariotas. Muy bien, 73 estructuras pertenecen a S. enterica serovar typhimurium y 5 estructuras cristalinas del complejo α2β2StTS tienen límites de resolución superiores a 1.50 Angstroms. No en vano, 4 de cada 5 fueron preparados en nuestro grupo de investigación (PDB IDs:5CGQ a 1,18 Å, 4HT3 a 1,30 Å, 4HPJ a 1,45 Å, 6DZ4 a 1,45 Å de resolución). Se prevé que las estructuras cristalinas refinadas de la forma mutante del complejo α 2β2StTS proporcionen nuevos conocimientos sobre el mecanismo y las funciones desempeñadas por los residuos de aminoácidos esenciales involucrados en la síntesis de L-triptófano.

Protocol

1. Protocolo rápido para purificar la subunidad α y β y el complejo recombinado α2β2StTS Subclonización de ADN en vector de expresión pETSUMOObtener el gen de acoplamiento traslacional (trpA y trpB) que codifica las α- y β- subunidades de la triptófano sintasa de la bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium clonada en el vector de expresión pEBA-1022. Utilice el vector pEBA-10 como plantilla de A…

Representative Results

Purificación de las αy βsubunidades de la triptófano sintasaLa α-subunidad(αStTS) y la β-subunidad (βStTS) de la Salmonella typhimurium triptófano sintasa fueron subclaonadas en el vector pET SUMO modificado. La Figura 1A muestra resultados representativos de SDS-PAGE de dos bandas fuertes correspondientes a la proteína de fusión His6-SUMO-…

Discussion

Hemos diseñado con éxito la forma mutante α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T y α2β2 complejos βS377A StTS para estudios de correlación estructura-función. Inicialmente, hemos intentado purificar los mutantes utilizando un protocolo de purificación previo22,que requiere α cristalización del complejo2β2StTS con PEG 8000 y esperfina durante la purificación. Aunque la tasa de cristalizaci?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (GM097569).

Materials

15 mL 10 kDa filter MilliporeSigma UFC901024 centrifugal filter unit
15 mL 100 kDa filter MilliporeSigma UFC910024 centrifugal filter unit
2 mL cryogenic vials Corning CLS430489 Cryogenic vials
2 mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-141 microcentrifuge tubes
24-well Cryschem Plate Hampton Research HR3-158 24-well sitting drop plates
2-mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100 Chemical
50 mL centrifuge conical tubes Thermo Scientific 12-565-270 centrifuge conical tubes
AB15 ACCUMET Basic Fisher Scientific 13-636-AB15 pH meter
Agarose Fisher Scientific BP1356-100 Agarose gel
ammonium sulfate Fisher Scientific A702-500 Chemical
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5 Antibiotic
Bacterial incubator Fisher Scientific S35836 incubator.
BamHI New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
bicine Fisher Scientific BP2646100 Chemical
Branson 450 Digital Sonifier Brason B450 Cell disruptor
Cesium chloride Fisher Scientific BP210-100 Chemical
Cesium hydroxide Acros Organics AC213601000 Chemical
Chloramphenicol Fisher Scientific BP904-100 Antibiotic
dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D1391 Chemical
dithiothreitol Fisher Scientific BP172-5 Chemical
DNA Polymerase Thermo Scientific F530S HF polymerase
dNTP Set Invitrogen 10-297-018 dNTPs set
EcoRI New England Biolabs R0101S Restriction enzyme
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chemical
Excella E25R Orbital Shaker Eppendorf New Brunswick M1353-0004 Orbital incubator
GE AKTA Prime Plus GE Healthcare 8149-30-0004 FPLC
Gel Extraction Kit Invitrogen K210012 DNA purification kit
Glycerol Fisher Scientific G33-500 Chemical
HindIII New England Biolabs R0104S Restriction enzyme
His-Trap columns GE Healthcare GE17-5255-01 5 mL Histrap column
imidazole Fisher Scientific O3196-500 Chemical
IPTG Thermo Fisher Scientific R0392 Inducer
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Antibiotic
Kelvinator Series-100 Kelvinator discontinued Ultra low freezer
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Liquid broth
Luria Bertani agar Fisher Scientific BP1425-2 Solid broth
NaCl Fisher Scientific S271-500 Chemical
NcoI New England Biolabs R0193S Restriction enzyme
Ni-NTA affinity beads Thermo Fisher Scientific R90115 Ni-NTA agarose beads
PEG 8000 Fisher Scientific BP233-100 Chemical
phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific 44-865-0 Chemical
pyridoxal phosphate Acros Organics AC228170010 Chemical
S-200 HR Cytiva 45-000-196 Size exclusion column
SacI New England Biolabs R0156S Restriction enzyme
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100 Chemical
Sorvall RC-5B centrifuge Sorvall 8327-30-1004 Floor cetrifuge
Spermine Acros Organics AC132750010 Chemical
Superdex 200 prep grade Cytiva 45-002-491 Size exclusion column
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S DNA liagse
Tris Fisher Scientific BP152-500 Chemical
Ubl-specific protease 1 Thermo Scientific 12588018 SUMO Protease

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Hilario, E., Fan, L., Mueller, L. J., Dunn, M. F. PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase. J. Vis. Exp. (163), e61839, doi:10.3791/61839 (2020).

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