Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen

Summary

Diese Arbeit skizziert ein Protokoll zur dynamischen, nicht-invasiven Überwachung der Wärmeübertragung von laserbestrahlten Goldnanopartikeln auf tBLMs. Das System kombiniert Impedanzspektroskopie zur Echtzeitmessung von Leitfähigkeitsänderungen über die tBLMs hinweg mit einem horizontal fokussierten Laserstrahl, der die Goldnanopartikelbeleuchtung antreibt, zur Wärmeerzeugung.

Abstract

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Untersuchung der Wärmeübertragung zwischen bestrahlten Goldnanopartikeln (GNPs) und Zweischichtlipidmembranen durch Elektrochemie unter Verwendung von gebundenen Doppelschichtlipidmembranen (tBLMs), die auf Goldelektroden montiert sind. Bestrahlte modifizierte BSP, wie Streptavidin-konjugierte BSP, sind in tBLMs eingebettet, die Zielmoleküle wie Biotin enthalten. Mit diesem Ansatz werden die Wärmeübertragungsprozesse zwischen bestrahlten GNPs und der Modelldoppelschichtlipidmembran mit interessierenden Entitäten durch einen horizontal fokussierten Laserstrahl vermittelt. Das thermische Prädiktive Rechenmodell wird verwendet, um die elektrochemisch induzierten Leitfähigkeitsänderungen in den tBLMs zu bestätigen. Unter den verwendeten spezifischen Bedingungen erforderte die Detektion von Wärmeimpulsen eine spezifische Befestigung der Goldnanopartikel an der Membranoberfläche, während ungebundene Goldnanopartikel keine messbare Reaktion hervorrufen konnten. Diese Technik dient als leistungsstarker Detektionsbiosensor, der direkt für das Design und die Entwicklung von Strategien für thermische Therapien verwendet werden kann, die eine Optimierung der Laserparameter, der Partikelgröße, der Partikelbeschichtungen und der Zusammensetzung ermöglichen.

Introduction

Die hyperthermische Leistung bestrahlter Gold-Nanomaterialien bietet eine neue Klasse minimalinvasiver, selektiver und gezielter Behandlung von Infektionen und Tumoren¹. Die Verwendung von Nanopartikeln, die mit einem Laser erhitzt werden können, wurde verwendet, um erkrankte Zellen selektiv zu zerstören und ein Mittel zur selektiven Wirkstoffabgabe^{bereitzustellen 2,3}. Eine Folge der Photothermolysephänomene erhitzter plasmonischer Nanopartikel ist eine Schädigung der Zellmembranen. Die flüssige Lipiddoppelschichtmembran gilt als besonders anfällige Stelle für Zellen, die sich solchen Behandlungen unterziehen, da die Denaturierung intrinsischer Membranproteine sowie Membranschäden auch zum Zelltod führen können⁴, da viele Proteine dazu da sind, den Ionenpotentialgradienten über Zellmembranen aufrechtzuerhalten. Während die Fähigkeit, die Wärmeübertragung auf der Nanoskala zu bestimmen und zu überwachen, von zentralem Interesse für die Untersuchung und Anwendung von bestrahlten BSP^1,5,6,7, Bewertung und Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zwischen BSP und Biomembranen sowie der direkten Folgen der laserinduzierten Erwärmungsphänomene eingebetteter BSP in biologischen Geweben ist, müssen noch vollständig aufgeklärt werden⁸. Daher bleibt ein gründliches Verständnis des Hyperthermieprozesses von bestrahlten BSP eine Herausforderung. Daher könnte die Entwicklung einer Nanomaterial-Elektroden-Grenzfläche, die die natürliche Umgebung von Zellen nachahmt, ein Mittel sein, um die Wärmeübertragungseigenschaften von bestrahlten Goldnanopartikeln innerhalb biologischer Systeme eingehend zu untersuchen.

Die Komplexität nativer Zellmembranen ist eine der wesentlichen Herausforderungen beim Verständnis der bestrahlten GNPs-Wechselwirkungen in Zellen. Es wurden verschiedene künstliche Membranplattformen entwickelt, um nahe an einfachen biomimetischen Versionen der natürlichen Lipidmembranarchitektur und -funktionalität zu liefern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf schwarze Lipidmembranen^9,unterstützte planare Doppelschichtmembranen^10,hybride Doppelschichtmembranen^11,polymergepolsterte Lipiddoppelschichtmembranen¹² und gebundene Doppelschichtlipidmembranen¹³. Jedes künstliche Lipidmembranmodell hat deutliche Vorteile und Einschränkungen in Bezug auf die Nachahmung der natürlichen Lipidmembranen¹⁴.

Diese Studie beschreibt den Einsatz von lipidmembranbeschichteten Elektroden als Sensor zur Beurteilung von Goldnanopartikel- und Lipidmembranwechselwirkungen unter Verwendung des tBLM-Modells. Das tBLM-basierte Biosensor-Detektionsschema bietet inhärente Stabilität und^{Empfindlichkeit 13,} da angebundene Membranen sich selbst reparieren können, im Gegensatz zu anderen Systemen (wie Membranen, die durch Patch-Clamp oder Liposomen gebildet werden), bei denen nur eine geringe Menge an Membranschäden zu ihrem Kollaps^{führt 15,16,17,18}. Da tBLMs mm² Abmessungen haben, ist die Hintergrundimpedanz um Größenordnungen niedriger als bei Patch-Clamp-Aufzeichnungstechniken, was eine Aufzeichnung von Veränderungen des Basalmembranionenflusses aufgrund von Nanopartikelwechselwirkungen ermöglicht. Infolgedessen kann das vorliegende Protokoll Änderungen der Membranleitfähigkeit durch gebundene GNPs kontrastieren, die von Lasern angeregt werden, deren Leistung so niedrig wie 135 nW / μm^{2 ist.}

Das hier vorgestellte System bietet eine empfindliche und reproduzierbare Methode zur Bestimmung präziser Laserparameter, Partikelgröße, Partikelbeschichtungen und Zusammensetzung, die für die Entwicklung und Entwicklung thermischer Therapien erforderlich sind. Dies ist entscheidend für die Verfeinerung neuer photothermischer Therapien und bietet wertvolle Informationen für detaillierte Mechanismen der Wärmeübertragung innerhalb biologischer Systeme. Das vorgestellte Protokoll basiert auf bereits veröffentlichten Arbeiten¹⁹. Ein Überblick über das Protokoll ist wie folgt: Der erste Abschnitt definiert die tBLM-Formation; Im zweiten Abschnitt wird beschrieben, wie das Setup aufgebaut und die Anregungslaserquelle ausgerichtet wird. Der letzte Abschnitt veranschaulicht, wie Informationen aus den Daten der elektrischen Impedanzspektroskopie extrahiert werden.

Protocol

1. tBLMs Elektroden vorbereitung Vorbereitung der ersten Monolayer-Beschichtung Tauchen Sie einen frisch gesputterten goldgemusterten Elektrodenmikroskopobjektträger in eine ethanolische Lösung, die aus einem 3 mM 1: 9-Verhältnis von Benzyldisulfid-Tetra-Ethyleneglykol-OH-“Spacer”-Molekülen (Benzyldisulfid bestand aus vier Sauerstoff-Ethylenglykol-Abstandhaltern, die mit einer OH-Gruppe abgeschlossen wurden) und Benzyldisulfid (Tetra-Ethylenglykol) n = 2 C20-Phytanyl “angebundene” M…

Representative Results

Das Goldsubstrat, auf dem tBLMs erzeugt werden können, ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Schema des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 2 dargestellt. Koplanare Goldelektroden, wie in Abbildung 1Agezeigt, bestehen aus 25 mm x 75 mm x 1 mm Polycarbonat-Basissubstrat mit gemusterten Goldarrays. Eine transparente Klebeschicht definiert die sechs einzelnen Messkammern. Die koplanare Goldelektrode ermöglicht …

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des tBLM-Modells mit einem koplanaren Elektrodensubstrat in Verbindung mit einer horizontalen Laserausrichtung, die die Aufzeichnung der elektrischen Impedanz in Echtzeit als Reaktion auf die Laserbestrahlung von Goldnanopartikeln ermöglicht. Die hier vorgestellte Methode der EIS-Aufzeichnung erstellt eine minimale Liste von Experimenten, die notwendig sind, um Ionenstromänderungen über die Membran aufzuzeichnen, die der Wärme entsprechen, di…

Materials

30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles	Cytodiagnostics	AC-30-04-05	This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles	Sigma-Aldrich	753629	This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000)	NANOCS	PG2-BNCS-10k	Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S1	1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-S2	Tethered molecules
532 nm green laser continuous light	OBIS LS/OBIS CORE LS, China	ND-1000	The power of this laser was ~135 mW
tethaPod EIS reader	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-R1	A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-BG	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-A1	Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-T10	Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10%
tethaQuick software	SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.	SDx-B1	Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
99.9% Pure ethanol	Sigma-Aldrich	34963	Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	pH 7