Summary
この研究は、レーザー照射金ナノ粒子からtBLMへの熱伝達の動的で非侵襲的なモニタリングを達成するためのプロトコルを概説する。このシステムは、インピーダンス分光法を組み合わせて、tBLM全体の伝導変化をリアルタイムで測定し、金ナノ粒子照明を駆動する水平に焦点を当てたレーザービームを熱製造に使用します。
Abstract
ここでは、金電極に組み立てられたテザリング二重層脂質膜(tBLM)を用いた電気化学による、照射された金ナノ粒子(GNP)と二層脂質膜の間の熱伝達を調べるプロトコルを報告する。ストレプトアビジン共役GNPなどの照射された修飾GNPは、ビオチンなどの標的分子を含むtBLMに埋め込まれています。このアプローチを用いることで、照射されたGNPと目的のエンティティを持つモデル二重層脂質膜との間の熱伝達プロセスは、水平に焦点を合わせるレーザービームによって媒介される。熱予測計算モデルは、tBLMにおける電気化学的に誘導された伝導度の変化を確認するために使用されます。使用される特定の条件下では、熱パルスを検出するには金ナノ粒子を膜表面に特定の付着させる必要がありますが、結合されていない金ナノ粒子は測定可能な応答を引き出すことができませんでした。この技術は、レーザーパラメータ、粒子サイズ、粒子コーティングおよび組成物の最適化を可能にする熱療法の戦略の設計と開発に直接利用することができる強力な検出バイオセンサーとして機能します。
Introduction
照射された金ナノ材料の高熱性能は、感染症および腫瘍に対する低侵襲、選択的、標的治療の新しいクラスを提供する。レーザーで加熱できるナノ粒子の雇用は、疾患細胞を選択的に破壊するとともに、選択的薬物送達2,3の手段を提供するために用いられてきた。熱いプラズモニックナノ粒子の光熱による現象の結果は、細胞膜への損傷である。この流体脂質二重層膜は、細胞膜全体のイオンポテンシャル勾配を維持するために多くのタンパク質が存在するため、固有の膜タンパク質の変性および膜損傷も細胞死に至る可能性があるため、このような治療を受けている細胞にとって特に脆弱な部位と考えられている。ナノスケールでの熱伝達を決定および監視する能力は、照射されたGnP1、5、6、7、GnPsとバイオ膜間の分子相互作用の評価と理解、ならびに生物学的組織における組み込みGnMPのレーザー誘発加熱現象の直接的な結果の研究と応用に重要な関心事であるが、 まだ完全に解明されていない8.したがって、照射されたGNPの温熱法プロセスを十分に理解することは依然として課題である。このように、細胞の自然環境を模倣するナノ材料電極界面の開発は、生物学的システム内で照射された金ナノ粒子の熱伝達特性の詳細な調査を行う手段を提供することができる。
ネイティブ細胞膜の複雑さは、細胞内の照射されたGNP相互作用を理解する上で重要な課題の1つです。天然脂質膜アーキテクチャおよび機能性の近接的なバイオ模倣バージョンを提供するために開発された様々な人工膜プラットフォームが存在するが、これらに限定されないが、黒色脂質膜9、支持された平坦二重層膜10、ハイブリッド二層膜11、ポリマークッション脂質二層膜12およびテザリング二層脂質膜13。各人工脂質膜モデルは、天然脂質膜14を模倣することに関して明確な利点および限界を有する。
本研究では、tBLMモデルを用いて、金ナノ粒子と脂質膜相互作用を評価するためのセンサーとしての脂質膜被覆電極の採用について説明する。tBLMベースのバイオセンサ検出スキームは、わずか量の膜損傷が15、16、17、18に至る他のシステム(パッチクランプまたはリポソームによって形成された膜など)とは異なり、テザード膜が自己修復できる固有の安定性と感度13を提供する。また、tBLMはmm2次元であるため、背景インピーダンスはパッチクランプ記録技術よりも桁違いに低く、ナノ粒子相互作用による基底膜イオン束の変化を記録することができます。この結果、本プロトコルは、135 nW/μm2と低いパワーを持つレーザーによって励起される結合されたGnMPによる膜伝導度の変化を対比することができる。
ここで提示されるシステムは、正確なレーザーパラメータ、粒子サイズ、粒子コーティング、および熱療法の設計と開発に必要な組成を決定するための敏感で再現可能な方法を提供します。これは、新たな光熱療法の改良に不可欠であり、生物学的システム内の熱伝達の詳細なメカニズムに関する貴重な情報を提供する。提示されたプロトコルは、以前に公開された作品19に基づいています。プロトコルの概要は次のとおりです: 最初のセクションは、tBLM の形成を定義します。2 番目のセクションでは、セットアップを構築し、励振レーザー ソースを位置合わせする方法について説明します。最後のセクションでは、電気インピーダンス分光法データから情報を抽出する方法を示しています。
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Protocol
1. tBLMS電極の準備
- 初の単層コーティングの準備
- ベンジルジスルフィド-テトラ-エチレングリコール-OH「スペーサー」分子の3 mM 1:9比で構成されるエタノール溶液に、スパッタ付きの金パターン電極顕微鏡スライドを浸す(ベンジルジスルフィドは4つの酸素エチレングリコールスペーサーを含み、 OH基)およびベンジルジスルフィド(テトラエチレングリコール)n=2C20-フィタニル「つながれた」分子で終了する。これにより、二重層を固定できる最初の層コーティングが作成されます。
注:金の電極はカスタム25 mm x 75 mmポリカーボネートスライド20に100 nm、99.9995%の金(5n5ゴールド)フィルムを蒸発させることによって作られる。 - 室温で第1層を用いて電極を少なくとも1時間インキュベートする。
- 30s以上の純エタノールを大量に浸漬して金電極をすすいだ。
- 次のステップに直接最初の単層と金電極スライドを使用するか、純粋なエタノールの完全な瓶に保存します。
- 注:最初のレイヤーの整合性を確保するには、スライドの金色部分への直接接触を最小限に抑えます。
- ベンジルジスルフィド-テトラ-エチレングリコール-OH「スペーサー」分子の3 mM 1:9比で構成されるエタノール溶液に、スパッタ付きの金パターン電極顕微鏡スライドを浸す(ベンジルジスルフィドは4つの酸素エチレングリコールスペーサーを含み、 OH基)およびベンジルジスルフィド(テトラエチレングリコール)n=2C20-フィタニル「つながれた」分子で終了する。これにより、二重層を固定できる最初の層コーティングが作成されます。
- 最初の単層コーティングスライドを組み立てる
- ピンセットを使用して容器から1つのコプラナー金電極スライドを慎重に取り外し、tBLMが形成されるパターン化された領域と接触しないようにしてください。
注:金が堆積しているスライドの側面を識別することに注意してください。 - 空気乾燥スライドは1〜2分間、残留エタノールを除去する。
- 乾燥した表面の上に金の電極を置き、金の電極が正しく上向きのパターン化された金の表面と向きであることを確認します。
- 薄いラミネートから透明な接着剤層カバーを剥がし、6つのチャネルの上に置き、各ウェルを定義します。
- 図1Aに示すように、圧力ローラを使用してスライドと透明接着層の間の空気を放出します。
注: このステップに必要な時間は、研究者が最適化する必要があります。このプロトコルでは、時間は2〜3分の範囲です。 - 第1層を損傷しないように、第2の脂質二重層を組み立てられた第1単層被覆電極に早急に導入する。
- ピンセットを使用して容器から1つのコプラナー金電極スライドを慎重に取り外し、tBLMが形成されるパターン化された領域と接触しないようにしてください。
- 第2脂質二重層の調製
- 6つのウェルスライドの最初のウェルに関心のある3 mM脂質の6 μLを加えます。マイクロピペットの先端の端が金の表面に触れないようにしてください。
注:この研究で使用される脂質混合物は、3 mM 70% ジウテリリアニック C20 ジフィタニル-エテル-グリセロホスファチジルコリン (DPEPC) と 30% C20 ジフィタニルジグリセリド エーテル脂質 (GDPE) 3 mM コレステロール-PEG-ビオチンと混合した 50:1 モル比で構成されています。 - 脂質混合物の6 μLを各添加の間に10 sギャップを持つ他のウェルに導入する。
- PBSなどのバッファーで電極上で脂質混合物を交換する前に、室温で正確に2分間、各ウェルをインキュベートします。各ウェルが各々2分間脂質でインキュベートされるように、10s離れた添加及び緩衝交換のための時間を空間化する。
- PBSバッファー(pH 7.0)を50 μLで3回洗浄します。電極の上に50 μLのバッファを常に残してください。電極を乾燥させないでください。
注:このように水溶液とエタノール溶媒を置き換える(溶媒交換法)は、つながれた化学を介して金電極に固定された単一の脂質二重層の迅速な形成を可能にする。
- 6つのウェルスライドの最初のウェルに関心のある3 mM脂質の6 μLを加えます。マイクロピペットの先端の端が金の表面に触れないようにしてください。
- 電気インピーダンス分光法(EIS)測定を用いたtBLM形成試験
- 準備した電極スライドをACインピーダンス分光計(例えばテタポッド)に挿入します。分光計がUSBポートを介してソフトウェアを実行しているコンピュータに接続されていることを確認します。
- ソフトウェアを開き、[セットアップ] をクリックして、[ハードウェア] を開きます。
- 25 mV のピークからピークへの交流励起を使用するようにハードウェア設定を設定します。
- 0.1~10,000 Hzの周波数を設定し、10年あたり2ステップで高速インピーダンス対策を行いOKを押します。
- [設定] メニューをクリックし、[モデル]を開きます。
- テザリング金電極を直列の定相素子として記述する等価回路モデルを用いて、電解質バッファーを記述する抵抗と、脂質二重層を記述する並列抵抗キャパシタネットワークを有する、OKを押す。
- [開始]ボタンを押して、膜容量(Cm)と膜伝導(Gm)のリアルタイム測定を開始します。典型的なtBLMsのCm値は、10%のテザーケリー21,22に対して12.5 nF~15.5 nFの範囲内にあるべきである。
- プロトコルを実行して実験を終えた後、データを保存します。
- 次のウェルで測定を繰り返します。
2.レーザー照射
- 実験用セットアップ
メモ: カスタムメイドのシステムは、各tBLMに対して個別に設定されています。- レーザーを危険にさらすように防光ボックスで実験を行います。
- 光学表を使用して、不要な振動を減らすために実験を設定します。
- 金のスライドが接続されているインピーダンスリーダーをXYZステージに置き、レーザー光源の経路に座るような高さを上げます。
- レーザー光源の高さを制御して適切な精度を達成するために、粗い細かい焦点を合わせる顕微鏡ギアリングを使用します。
- 電極スライドの縦軸に沿ってレーザーパスをターゲットにします。
注意:常に適切なレーザー安全メガネを着用し、良好なレーザー安全プロトコルを維持します。 - 実験を開始する前に、選択した調整されたレーザーを安定させます。
注: 実験用セットアップの概略を図2Aに示します。
- レーザー電極と金電極のアライメント
注: 始める前に、パワーメーターを使用してレーザー出力を評価し、非常に低いワット数のみがtBLに送られるようにしてください。- レーザーパスまたは電極の角度を調整して、レーザーが電極を覆う液体を通過し、金の表面で均等に見えるようにします。
- 膜伝導の変化を観察しながら、微調整を使用してレーザービーム光源を上げ下げすることにより、実験ごとにレーザー光の位置を調整します。
- 導通変化が見られない場合は、ノブをロックしてレーザーパスの位置を固定します。
注: レーザーが下層の金電極と相互作用すると、膜コンダクタンス値が増加します。したがって、そのような相互作用が不可能になるようにレーザー経路を調整することが重要である。
- サンプル準備
- 図2、位置3に示すように、レーザー光の位置合わせ(膜伝導に変化がない場合)を準備します。
- レーザーがOFFの間に tBL が浸漬される PBS バッファに目的の GNP(機能化または裸)を追加します。
- 電極に触れないように、tBLMを取り巻くPBSバッファーを3回そっと混ぜます。
- 室温で5〜10分間インキュベートします。
- レーザーをオンにしてサンプルを照射し、図2、位置3に見られるように正しい位置のレーザー光の位置を使用します。
- レーザー光波長を使用して、GnMPのサイズ、形状、濃度の適切な組み合わせを使用してください。
注: 設定された波長のレーザービームは、対応するGNPプラズモン共鳴周波数に結合する必要があります。 - 連続的に測定された電流を記録する(リアルタイム測定)。
- ステップ 2.2.1 ~ 2.3.7 を実行し、制御実験用の GNP の追加を省略します。
3.統計データ分析と表示
- データをスプレッドシートにエクスポートします。
- 膜伝導パラメータ対時間を抽出します。
- 正しい位置でレーザー光を設定した後、およびGnPS導入前に記録されたデータを使用してください。
- 基準膜コンダクタンス上で測定された膜伝導率を分割してデータを正規化します。
注:これは導入された照射されたGNPによって引き出される膜伝導値の相対的な変化を確認する。 - 時間のプロット(x軸)と正規化された膜伝導(y軸)のデータを提示します。
4.照射されたナノ粒子からtBLMで発生する局所熱量を予測する(熱予測モデル)
- 照射されたナノ粒子溶液中の吸収放射線パワーを計算するために、ドンブロフスキー23に従って放射線移動の問題を解決する。
- 吸収された放射による熱源をエネルギー方程式に組み込むことにより、発熱を計算します。
注: 照射されたナノ粒子とナノ材料電極界面からのtBLMにおける発熱の数値解析の詳細については、19を参照してください。
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Representative Results
tBLM を作成できるゴールド基板を図 1に示します。実験用セットアップの概略を図2に示します。
図1Aに示すように、コプラナー金電極は、パターン化された金アレイを備えた25 mm x 75 mm x 1 mm ポリカーボネートベース基板から作られています。透明な接着剤層は6つの個々の測定室を定義する。同一平面の金の電極は、tBLMs膜にレーザー光の直接露出を可能にする。電極アレイの各ウェルには、円状の作業電極(面積:0.707cm2)と半円状の対極または同一平面電極(面積:〜0.725cm2)が含まれており、これは〜2mmの隙間で分離されています。透明な接着剤層は、バルク電解質から堆積した金の残りの部分を絶縁します。これに対し、下層の金のレイアウトは、参照電極を必要とせずにEISリーダーに電気的接続を提供するために、作業電極を測定室外の接触領域に接続します。
レーザー経路は、tBLMと相互作用する方法で整列し、それを取り巻く液体バッファーを介して散乱されますが、基礎となる金基板と相互作用することはできません。正しい位置が確立されるまで、レーザーの水平昇動と下げによって容易に決定されます。この位置は、膜伝導度の変化が見られない点にあります。tBLMがバルク金の基質層に付着して形成されることを考えると、図2の位置1と2における膜伝導度の変化は、スパッタリングバルク金層内のナノ構造とのレーザーの相互作用による熱の結果である可能性が高いと思われる。このように、レーザー光とtBLMの下に見られるバルク金基板との相互作用を排除することに焦点を当てた水平光ビームアライメントの正確な位置を使用する。
水平レーザー光を金電極に直接焦点を合わせると、図2、位置1、2に示すように膜伝導度が増加します。正確なレーザー位置は、レーザーONとレーザーOFFの両方の期間の間に膜伝導記録にわずかな変動を明らかにした(図2B、位置3)。GNP サンプルは、ベースライン記録を確立した後に追加されました (図 2、位置 3 を参照)。ビオチン化コレステロールを含むtBLMsにストレプトアビジン共役30nm金ナノ粒子を添加した場合、レーザーONとOFF期間の間に明確な差が見られ、3位と比較して、レーザーオン相(図2B、位置4)の間に導電振幅が明確に増加した。
図1:金基質上の接結二重層脂質膜(tBLM)モデルの模式的表現(A) 6つのウェルを備えたコプラナー金電極スライド、最終的には薄い透明接着層の添加によって定義される。 (B)tBLM モデルは、スペーサー(エチレングリコール鎖はヒドロキシル基で終わった)およびテザー化された分子(疎水性フィタニル鎖で終わったエチレングリコール基)を金基質表面にテザーを含み、第1層を形成する。第2の層は、非につながれた脂質を含む。修正された図は、コーネルら24.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:レーザー照明から生じるtBLM全体のアライメントおよび対応する測定膜伝導度変化のためのアッセイセットアップの図(λ= 530 nm)。(A) 水平レーザーアライメントの異なる位置を代表する模式図。位置1:レーザー光は金の基材に合わせて(レーザーがオンになったときは赤で示される)。位置2は、膜と金の基質と混合水平レーザー光;位置 3 レーザー光は、tBLM を取り巻くバルク流体に焦点を当てた;位置4レーザー光は、ストレプトアビジン結合30 nm球形GnPsの存在下でtBLMを取り巻く流体に焦点を合わせた 。(B) 経時の正規化伝導記録は、異なるアライメント位置に対応する。位置1、2および3の位置は、GNPがない場合のtBLM伝導率の測定であり、位置4は、30nm球形GNPの存在下でのtBLM伝導率の測定値である。膜伝導値を、tBLM形成時の膜伝導の初期値に正規化した。結果は、少なくとも3つの独立した実験を代表するものである。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、金ナノ粒子のレーザー照射に応答してリアルタイムの電気インピーダンス記録を可能にする水平レーザーアライメントセットアップと組み合わせて、同一平面電極基板を備えたtBLMモデルの使用を記述する。ここで提示されるEIS記録の方法は、膜全体のイオン電流変化の記録を提供するために必要な実験の最小限のリストを構築し、これは、結合レーザーと金ナノ粒子相互作用によって発生する熱に対応する。このプロトコルには重要なステップがあり、これは二重層脂質膜を取り囲むバッファに向かってレーザー経路を慎重かつ正確に整列させる。
tBLMモデルの使用は、天然の脂質膜特性24を模倣する明確な電気シール特性を提供する。tBLMはまた、金基質と後に形成された膜との間に水性イオンリザーバー領域を提供し、そこでテザー分子とスペーサー分子は11Å25の厚さを有し、二層脂質膜の厚さは約6.5nm19であった。これは、膜タンパク質、イオンチャネルまたは他の特定の機能化された分子13、22を組み込むためのスペースを提供することができる。70%DPEPCおよび30%GDPE脂質の選択はEISシステム24を使用してtBLの電気的特徴を調べるために二層脂質膜の最適な密封を提供する。同様に、二重層脂質膜内にコレステロールを導入すると、天然のバイオミメティックモデル膜を密接に模倣する。コレステロール部分は二重層脂質膜安定性を向上させるとともに、リン脂質二重層26,27の高いパッキングを提供することによりイオンに対する膜透過性を最小限に抑えるとともになる。TBLをEISシステムと組み合わせることで、照射されたGNPと二層脂質膜間の熱伝達の間接的な測定が可能になります。さらに、このプロトコルでの同一平面金電極の使用は、参照または対電極からの干渉なしにリアルタイムのEIS測定を可能にする。
ナノ粒子スケールの金は、より大きな金の凝集体に対して異なる物理的および光学的特性を有する。ナノ粒子の大きさと形状は、その生体分布、循環寿命および細胞取り込みにアクセスし、中間サイズ(20〜60nm)のナノ粒子が最大の細胞取り込みを示すとともに、高い表面積対体積比を提供し、その後の機能化28、29を可能にする。この研究で実装された30nm GNPサイズは中間GnMPサイズを表し、レーザー波長選択はGNPの吸収ピークに従って最も効率的な励起を生み出し、その結果、加熱につながる。tBLMsゴールド表面のレーザー照明は、レーザーオン相で膜伝導ピークを上昇させます。これは、GnPs30の添加に続く熱産生現象を隠すレーザーと相互作用するバルク金表面ナノ構造の結果として提案される。これを克服するために、ここで開発されたアプローチのGnMPは、図2、位置3および4に示すように、脂質バッファ界全体で水平レーザーアライメントを使用して照らされます。
ここで説明するプロトコルは、膜の脂質組成を様々な天然細胞タイプを模倣するように改変するか、または、100nm金ナン酸等の導入されたGnMpのサイズおよび形状を、対応するレーザー光光19で変更することによって容易に変更することができる。この機能を使用して、局在するGNPによる放射線が特定の細胞タイプに与える影響を判断することができます。
要約すると、このプロトコルは、熱伝達現象に関する質問に答えるために、対象となるモデル二層脂質膜エンティティとの現場照射されたGNPの相互作用を研究するための堅牢な検出バイオセンサーとして機能する。これは、より効率的な光熱療法の開発に役立つだけでなく、生物学的システム内の熱伝達の詳細なメカニズムのための貴重な情報を提供します。この手法は、これらの加熱ナノ粒子で経験できる細胞膜破壊のレベルを予測するためのツールとして使用することができる。
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Disclosures
著者らは、潜在的な競合する利益とみなされる可能性のある次の財政的利益/個人的な関係を宣言する:ブルース・コーネル教授は、外科診断SDxテザリングメンブレンPty株式会社の科学技術ディレクターである。
Acknowledgments
この研究は、オーストラリア研究評議会(ARC)ディスカバリープログラム(DP150101065)と、低レベル(IDEAL)(IH150100028)でのエンドユーザ分析のための統合デバイスのためのARC研究ハブによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
| 30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
| Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
| C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
| Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
| Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
| 532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
| tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
| tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
| tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
| 99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |
References
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