עבודה זו מתארת פרוטוקול להשגת ניטור דינמי ולא פולשני של העברת חום מננו-חלקיקי זהב מוקרנים בלייזר ל- tBLMs. המערכת משלבת ספקטרוסקופיית עבלה למדידה בזמן אמת של שינויי מוליכות על פני tBLMs, עם קרן לייזר ממוקדת אופקית המניעה תאורת ננו-חלקיקים מזהב, לייצור חום.
כאן אנו מדווחים פרוטוקול כדי לחקור את העברת החום בין חלקיקי זהב מוקרן (GNPs) וקרום שומנים דו שכבתי על ידי אלקטרוכימיה באמצעות ממברנות שומנים דו שכבתיים קשורות (tBLMs) המורכב על אלקטרודות זהב. GNPs שעברו שינוי מוקרן, כגון GNPs מצומדים בסטרפטבידין, מוטבעים ב- tBLMs המכילים מולקולות יעד, כגון ביוטין. באמצעות גישה זו, תהליכי העברת החום בין GNPs מוקרן לבין קרום השומנים דו שכבתי מודל עם ישויות עניין מתווכים על ידי קרן לייזר ממוקד אופקית. המודל החישובי הניבוי התרמי משמש כדי לאשר את שינויי המוליך המושרים אלקטרוכימית ב- tBLMs. בתנאים הספציפיים בהם נעשה שימוש, זיהוי פולסים חום דרש התקשרות ספציפית של חלקיקי הזהב לפני השטח של הממברנה, בעוד חלקיקי זהב לא מאוגדים לא הצליחו לעורר תגובה מדידה. טכניקה זו משמשת biosensor גילוי רב עוצמה אשר ניתן להשתמש ישירות לתכנון ופיתוח של אסטרטגיות לטיפולים תרמיים המאפשר אופטימיזציה של פרמטרי לייזר, גודל החלקיקים, ציפוי החלקיקים והרכב.
הביצועים היפרתרמיים של ננו ננו זהב מוקרן מציע סוג חדש של טיפול זעיר פולשני, סלקטיבי, ממוקד לזיהומים וגידולים1. העסקת חלקיקים שניתן לחמם על ידי לייזר שימשה להרוס תאים חולים באופן סלקטיבי, כמו גם מתן אמצעי לאספקת תרופות סלקטיבית2,3. תוצאה של תופעות פוטותרמיליזה של חלקיקים פלסמוניים מחוממים היא נזק לקרום התא. קרום דו שכבתי שומנים נוזלי נחשב אתר פגיע במיוחד עבור תאים העוברים טיפולים כאלה כי denaturation של חלבונים ממברנה פנימית, כמו גם נזק ממברנה יכול גם להוביל למוות תאים4, כמו חלבונים רבים נמצאים שם כדי לשמור על שיפוע הפוטנציאלי יוני על פני קרום התא. בעוד היכולת לקבוע ולנטר העברת חום בקנה מידה ננומטרי היא עניין מרכזי למחקר ויישום של GNPs מוקרן 1,5,6,7, הערכה והבנה של האינטראקציות המולקולריות בין GNPs ו bio-membranes, כמו גם את ההשלכות הישירות שלתופעותהחימום המושרה בלייזר של GNPs מוטבע ברקמות ביולוגיות, עדיין לא נוהרו במלואם8. לכן, הבנה מעמיקה של תהליך היפרתרמיה של GNPs מוקרן נשאר אתגר. ככזה, פיתוח של ממשק ננו-חומרים-אלקטרודה המחקה את הסביבה הטבעית של תאים יכול לספק אמצעי שבאמצעותו לבצע חקירה מעמיקה של מאפייני העברת החום של חלקיקי זהב מוקרן בתוך מערכות ביולוגיות.
המורכבות של קרום התא המקומי הוא אחד האתגרים המשמעותיים בהבנת אינטראקציות GNPs מוקרן בתאים. היו פלטפורמות ממברנה מלאכותית שונות שפותחו כדי לספק גרסאות ביו-מימטיות פשוטות קרובות של ארכיטקטורה ופונקציונליות של קרום השומנים הטבעי, כולל, אך לא רק, ממברנות שומנים שחורות9, ממברנות דו-שכבתיות פלנאריות נתמכות10, ממברנות דו-שכבתיות היברידיות11, ממברנות דו-שכבתיות מרופדות בשומןפולימר 12 וקרום השומנים הדו-שכבתי קשור13. לכל מודל קרום השומנים המלאכותי יש יתרונות ומגבלות ברורים ביחס לחיקוי ממברנות השומנים הטבעיות14.
מחקר זה מתאר את התעסוקה של אלקטרודות מצופות קרום השומנים כחיישן להערכת ננו-חלקיקי זהב ואינטראקציות קרום השומנים, באמצעות מודל tBLM. ערכת זיהוי הביו-סנסור המבוססת על tBLM מספקת יציבות ורגישות טבועה13 מכיוון שקרומים קשורים יכולים לתקן את עצמם, בניגוד למערכות אחרות (כגון ממברנות שנוצרו על ידי מהדק תיקון או ליפוזומים) שבהן רק כמות קטנה של נזק לממברנה גורמת לקריסתם15,16,17,18. יתר על כן, מכיוון ש- tBLMs הם בממדי מ”מ2, עבלה ברקע היא בסדרי גודל נמוכים יותר מטכניקות הקלטה של מהדק תיקון, המאפשרות הקלטה של שינויים בשטף היוני של הממברנה המבסאלית עקב אינטראקציות ננו-חלקיקים. כתוצאה מכך, הפרוטוקול הנוכחי יכול להשוות שינויים בהווכות הממברנה על ידי GNPs מאוגדים כי הם נרגשים על ידי לייזרים שכוחותיהם נמוכים כמו 135 nW / μm2.
המערכת המוצגת כאן מספקת שיטה רגישה וניתנת לשחזור לקביעת פרמטרי לייזר מדויקים, גודל חלקיקים, ציפוי חלקיקים והרכב הדרושים לתכנון ופיתוח טיפולים תרמיים. זה קריטי לעידון של טיפולים פוטותרמיים מתעוררים, כמו גם מציע מידע בעל ערך עבור מנגנונים מפורטים של העברת חום בתוך מערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מבוסס על עבודה19שפורסמה בעבר . חלוקה לרמות של הפרוטוקול היא כדלקמן: המקטע הראשון מגדיר את היווצרות tBLM; המקטע השני מתאר כיצד לבנות את ההתקנה וליישר את מקור לייזר העירור; החלק האחרון ממחיש כיצד לחלץ מידע מנתוני ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במודל tBLM עם מצע אלקטרודה קופלנאר בשילוב עם יישור לייזר אופקי שהוקם המאפשר הקלטת עבלה חשמלית בזמן אמת בתגובה להקרנת לייזר של חלקיקי זהב. השיטה של הקלטת EIS המוצגת כאן בונה רשימה מינימלית של ניסויים הדרושים כדי לספק הקלטה של שינויים זרם יון על פני ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית הגילוי של מועצת המחקר האוסטרלית (DP150101065) ומרכז המחקר ARC לניתוח משתמש קצה ברמות נמוכות (IDEAL) (IH150100028).
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |