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Biology

Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen

Published: December 8, 2020 doi: 10.3791/61851
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 1,2, 3, 2,4, 1,2,5
1School of Life Sciences, University of Technology Sydney, 2ARC Research Hub for Integrated Devices for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL), Faculty of Science, University of Technology Sydney, 3School of Mechanical and Manufacturing Engineering, The University of New South Wales, 4Surgical Diagnostics Pty Ltd., 5Institute for Biomedical Materials and Devices, University of Technology Sydney

Summary

Diese Arbeit skizziert ein Protokoll zur dynamischen, nicht-invasiven Überwachung der Wärmeübertragung von laserbestrahlten Goldnanopartikeln auf tBLMs. Das System kombiniert Impedanzspektroskopie zur Echtzeitmessung von Leitfähigkeitsänderungen über die tBLMs hinweg mit einem horizontal fokussierten Laserstrahl, der die Goldnanopartikelbeleuchtung antreibt, zur Wärmeerzeugung.

Abstract

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Untersuchung der Wärmeübertragung zwischen bestrahlten Goldnanopartikeln (GNPs) und Zweischichtlipidmembranen durch Elektrochemie unter Verwendung von gebundenen Doppelschichtlipidmembranen (tBLMs), die auf Goldelektroden montiert sind. Bestrahlte modifizierte BSP, wie Streptavidin-konjugierte BSP, sind in tBLMs eingebettet, die Zielmoleküle wie Biotin enthalten. Mit diesem Ansatz werden die Wärmeübertragungsprozesse zwischen bestrahlten GNPs und der Modelldoppelschichtlipidmembran mit interessierenden Entitäten durch einen horizontal fokussierten Laserstrahl vermittelt. Das thermische Prädiktive Rechenmodell wird verwendet, um die elektrochemisch induzierten Leitfähigkeitsänderungen in den tBLMs zu bestätigen. Unter den verwendeten spezifischen Bedingungen erforderte die Detektion von Wärmeimpulsen eine spezifische Befestigung der Goldnanopartikel an der Membranoberfläche, während ungebundene Goldnanopartikel keine messbare Reaktion hervorrufen konnten. Diese Technik dient als leistungsstarker Detektionsbiosensor, der direkt für das Design und die Entwicklung von Strategien für thermische Therapien verwendet werden kann, die eine Optimierung der Laserparameter, der Partikelgröße, der Partikelbeschichtungen und der Zusammensetzung ermöglichen.

Introduction

Die hyperthermische Leistung bestrahlter Gold-Nanomaterialien bietet eine neue Klasse minimalinvasiver, selektiver und gezielter Behandlung von Infektionen und Tumoren1. Die Verwendung von Nanopartikeln, die mit einem Laser erhitzt werden können, wurde verwendet, um erkrankte Zellen selektiv zu zerstören und ein Mittel zur selektiven Wirkstoffabgabebereitzustellen 2,3. Eine Folge der Photothermolysephänomene erhitzter plasmonischer Nanopartikel ist eine Schädigung der Zellmembranen. Die flüssige Lipiddoppelschichtmembran gilt als besonders anfällige Stelle für Zellen, die sich solchen Behandlungen unterziehen, da die Denaturierung intrinsischer Membranproteine sowie Membranschäden auch zum Zelltod führen können4, da viele Proteine dazu da sind, den Ionenpotentialgradienten über Zellmembranen aufrechtzuerhalten. Während die Fähigkeit, die Wärmeübertragung auf der Nanoskala zu bestimmen und zu überwachen, von zentralem Interesse für die Untersuchung und Anwendung von bestrahlten BSP1,5,6,7, Bewertung und Verständnis der molekularen Wechselwirkungen zwischen BSP und Biomembranen sowie der direkten Folgen der laserinduzierten Erwärmungsphänomene eingebetteter BSP in biologischen Geweben ist, müssen noch vollständig aufgeklärt werden8. Daher bleibt ein gründliches Verständnis des Hyperthermieprozesses von bestrahlten BSP eine Herausforderung. Daher könnte die Entwicklung einer Nanomaterial-Elektroden-Grenzfläche, die die natürliche Umgebung von Zellen nachahmt, ein Mittel sein, um die Wärmeübertragungseigenschaften von bestrahlten Goldnanopartikeln innerhalb biologischer Systeme eingehend zu untersuchen.

Die Komplexität nativer Zellmembranen ist eine der wesentlichen Herausforderungen beim Verständnis der bestrahlten GNPs-Wechselwirkungen in Zellen. Es wurden verschiedene künstliche Membranplattformen entwickelt, um nahe an einfachen biomimetischen Versionen der natürlichen Lipidmembranarchitektur und -funktionalität zu liefern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf schwarze Lipidmembranen9,unterstützte planare Doppelschichtmembranen10,hybride Doppelschichtmembranen11,polymergepolsterte Lipiddoppelschichtmembranen12 und gebundene Doppelschichtlipidmembranen13. Jedes künstliche Lipidmembranmodell hat deutliche Vorteile und Einschränkungen in Bezug auf die Nachahmung der natürlichen Lipidmembranen14.

Diese Studie beschreibt den Einsatz von lipidmembranbeschichteten Elektroden als Sensor zur Beurteilung von Goldnanopartikel- und Lipidmembranwechselwirkungen unter Verwendung des tBLM-Modells. Das tBLM-basierte Biosensor-Detektionsschema bietet inhärente Stabilität undEmpfindlichkeit 13, da angebundene Membranen sich selbst reparieren können, im Gegensatz zu anderen Systemen (wie Membranen, die durch Patch-Clamp oder Liposomen gebildet werden), bei denen nur eine geringe Menge an Membranschäden zu ihrem Kollapsführt 15,16,17,18. Da tBLMs mm2 Abmessungen haben, ist die Hintergrundimpedanz um Größenordnungen niedriger als bei Patch-Clamp-Aufzeichnungstechniken, was eine Aufzeichnung von Veränderungen des Basalmembranionenflusses aufgrund von Nanopartikelwechselwirkungen ermöglicht. Infolgedessen kann das vorliegende Protokoll Änderungen der Membranleitfähigkeit durch gebundene GNPs kontrastieren, die von Lasern angeregt werden, deren Leistung so niedrig wie 135 nW / μm2 ist.

Das hier vorgestellte System bietet eine empfindliche und reproduzierbare Methode zur Bestimmung präziser Laserparameter, Partikelgröße, Partikelbeschichtungen und Zusammensetzung, die für die Entwicklung und Entwicklung thermischer Therapien erforderlich sind. Dies ist entscheidend für die Verfeinerung neuer photothermischer Therapien und bietet wertvolle Informationen für detaillierte Mechanismen der Wärmeübertragung innerhalb biologischer Systeme. Das vorgestellte Protokoll basiert auf bereits veröffentlichten Arbeiten19. Ein Überblick über das Protokoll ist wie folgt: Der erste Abschnitt definiert die tBLM-Formation; Im zweiten Abschnitt wird beschrieben, wie das Setup aufgebaut und die Anregungslaserquelle ausgerichtet wird. Der letzte Abschnitt veranschaulicht, wie Informationen aus den Daten der elektrischen Impedanzspektroskopie extrahiert werden.

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Protocol

1. tBLMs Elektroden vorbereitung

  1. Vorbereitung der ersten Monolayer-Beschichtung
    1. Tauchen Sie einen frisch gesputterten goldgemusterten Elektrodenmikroskopobjektträger in eine ethanolische Lösung, die aus einem 3 mM 1: 9-Verhältnis von Benzyldisulfid-Tetra-Ethyleneglykol-OH-"Spacer"-Molekülen (Benzyldisulfid bestand aus vier Sauerstoff-Ethylenglykol-Abstandhaltern, die mit einer OH-Gruppe abgeschlossen wurden) und Benzyldisulfid (Tetra-Ethylenglykol) n = 2 C20-Phytanyl "angebundene" Moleküle. Dadurch entsteht die erste Schichtbeschichtung, auf der eine Doppelschicht verankert werden kann.
      HINWEIS: Die Goldelektrode wird durch Verdampfen von 100 nm, 99,9995% Gold (5n5 Gold) Film auf benutzerdefinierte 25 mm x 75 mm Polycarbonat-Dias20hergestellt.
    2. Inkubieren Sie Elektroden mit der ersten Schicht bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.
    3. Spülen Sie die Goldelektroden aus, indem Sie über 30 s in reichlich reines Ethanol eintauchen.
    4. Verwenden Sie den Goldelektrodenschieber mit der ersten Monoschicht direkt für den nächsten Schritt oder lagern Sie ihn in einem Glas voller reinem Ethanol.
    5. HINWEIS: Um die Integrität der ersten Schicht zu gewährleisten, minimieren Sie jeden direkten Kontakt mit den Goldanteilen des Objektträgers.
  2. Montage des ersten monoschichtbeschichteten Schlittens
    1. Nehmen Sie vorsichtig einen koplanaren Goldelektrodenschieber mit einer Pinzette aus seinem Behälter und achten Sie darauf, keinen Kontakt mit den gemusterten Bereichen aufzunehmen, in denen sich die tBLMs bilden.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Seite des Objektträgers zu identifizieren, auf der das Gold abgelagert wird.
    2. Lufttrockener Gleiten für 1 - 2 min, um Restethanol zu entfernen.
    3. Legen Sie die Goldelektrode über eine trockene Oberfläche und stellen Sie sicher, dass die Goldelektrode korrekt ausgerichtet ist und die Gemusterte Goldoberfläche nach oben zeigt.
    4. Ziehen Sie die transparente Klebeschichtabdeckung von einem dünnen Laminat und legen Sie sie über die 6 Kanäle, um jeden Brunnen zu definieren.
    5. Verwenden Sie eine Andruckwalze, um Luft zwischen dem Schlitten und der transparenten Klebeschicht freizugeben, wie in Abbildung 1A dargestellt.
      HINWEIS: Die für diesen Schritt benötigte Zeit muss vom Forscher optimiert werden. In diesem Protokoll liegen die Zeiten zwischen 2-3 Minuten.
    6. Sobald möglich (innerhalb von 1-2 Minuten) die zweite Lipiddoppelschicht zur Selbstmontage in die montierte erste monolayerbeschichtete Elektrode eingeführt wird, um eine Beschädigung der ersten Schicht zu vermeiden.
  3. Herstellung der zweiten Lipiddoppelschicht
    1. Fügen Sie 6 μL mit 3 mM Lipiden von Interesse zur ersten Bohrung der sechs Bohrer hinzu. Lassen Sie den Rand der Mikropipettenspitze nicht die Goldoberfläche berühren, wodurch die angebundenen Chemikalien an der Elektrode beschädigt werden können.
      HINWEIS: Die in dieser Arbeit verwendete Lipidmischung bestand aus 3 mM 70% zwitterionischen C20-Diphytanyl-Ether-Glycero-Phosphatidylcholin (DPEPC) und 30% C20-Diphytanyldiglycetherlipiden (GDPE), gemischt mit 3 mM Cholesterin-PEG-Biotin im Molarverhältnis 50:1.
    2. 6 μL der Lipidmischung in die anderen Vertiefungen mit einem Abstand von 10 s zwischen jeder Zugabe geben.
    3. Inkubieren Sie jede Vertiefung für genau 2 min bei Raumtemperatur, bevor Sie das Lipidgemisch über die Elektroden mit einem Puffer wie PBS austauschen. Die Zeiten für die Addition und den Pufferaustausch liegen 10 s auseinander, so dass jede Vertiefung jeweils genau 2 Minuten mit dem Lipid inkubiert wird.
    4. 3 weitere Male mit 50 μL PBS-Puffer (pH 7,0) waschen. Achten Sie darauf, jederzeit 50 μL Puffer über den Elektroden zu lassen. Lassen Sie die Elektroden nicht trocknen.
      HINWEIS: Die Verdrängung des Ethanollösungsmittels mit der wässrigen Lösung auf diese Weise (Lösungsmittelaustauschmethode)ermöglicht die schnelle Bildung einer einzigen Lipiddoppelschicht, die über die angebundenen Chemikalien an der Goldelektrode verankert ist.
  4. Prüfung der tBLM-Bildung mittels messungen der elektrischen Impedanzspektroskopie (EIS)
    1. Setzen Sie den vorbereiteten Elektrodenschieber in ein AC-Impedanzspektrometer (z. B. Tethapod) ein. Stellen Sie sicher, dass das Spektrometer über einen USB-Anschluss an einen Computer angeschlossen ist, auf dem die Software ausgeführt wird.
    2. Öffnen Sie die Software, klicken Sie auf Setup und öffnen Sie Hardware.
    3. Stellen Sie die Hardwareeinstellungen so ein, dass 25 mV Peak-to-Peak AC-Anregung verwendet wird.
    4. Stellen Sie Frequenzen zwischen 0,1 und 10.000 Hz mit zwei Schritten pro Jahrzehnt für schnelle Impedanzmessungen ein.
    5. Klicken Sie auf das Menü Setup und öffnen Sie Modell.
    6. Verwenden Sie ein äquivalentes Schaltungsmodell, das die Anbinde-Goldelektrode als konstantes Phasenelement in Reihe mit einem Widerstand beschreibt, der den Elektrolytpuffer beschreibt, und einem parallelen Widerstands-Kondensator-Netzwerk, um die Lipiddoppelschicht zu beschreiben, und drücken Sie OK.
    7. Drücken Sie die Starttaste, um eine Echtzeitmessung der Membrankapazität (Cm)und der Membranleitung (Gm)zu starten. Cm-Werte typischer tBLMs sollten im Bereich von 12,5 nF bis 15,5 nF für 10% gebundene Chemikalienliegen 21,22.
    8. Nachdem Sie das Protokoll ausgeführt und das Experiment abgeschlossen haben, speichern Sie die Daten.
    9. Wiederholen Sie die Messung mit der nächsten Vertiefung.

2. Laserbestrahlung

  1. Versuchsaufbau
    HINWEIS: Das maßgeschneiderte System wird für jeden tBLM gut individuell eingerichtet.
    1. Führen Sie Experimente in einer lichtdichten Box durch, um den Laser gefährlich zu minimieren.
    2. Verwenden Sie eine Optiktabelle, um das Experiment einzurichten, um unerwünschte Vibrationen zu reduzieren.
    3. Platzieren Sie den Impedanzleser, an dem der Goldschlitten angeschlossen ist, auf einer XYZ-Bühne und heben Sie ihn so an, dass er im Weg der Laserquelle sitzt.
    4. Verwenden Sie grob-feinfokussierendes mikroskopisches Getriebe, um die Höhe der Laserquelle zu steuern, um die entsprechende Präzision zu erreichen.
    5. Richten Sie den Laserpfad entlang der Längsachse des Elektrodenträgers aus.
      ACHTUNG: Tragen Sie immer eine geeignete Laserschutzbrille und pflegen Sie gute Lasersicherheitsprotokolle.
    6. Lassen Sie den ausgewählten abgestimmten Laser stabilisieren, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
      HINWEIS: Ein Schema des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 2Adargestellt.
  2. Ausrichtung von Laser- und Goldelektroden
    HINWEIS: Bevor Sie beginnen, bewerten Sie immer die Laserleistung mit einem Leistungsmesser, um sicherzustellen, dass nur sehr geringe Wattagen an die tBLMs geliefert werden.
    1. Stellen Sie entweder den Laserweg oder den Winkel der Elektrode so ein, dass der Laser durch die Flüssigkeit geht, die die Elektrode bedeckt, und nur gleichmäßig an der Goldoberfläche sichtbar ist.
    2. Passen Sie die Laserstrahllichtposition für jedes Experiment an, indem Sie die Laserstrahlquelle mithilfe der Feineinstellung anheben oder senken, während Sie Änderungen der Membranleitfähigkeit beobachten.
    3. Verriegeln Sie den Knopf, um die Position des Laserpfads zu sichern, wenn keine Leitfähigkeitsänderungen beobachtet werden.
      HINWEIS: Erhöhte Membranleitwertwerte werden erzeugt, wenn der Laser mit der darunter liegenden Goldelektrode interagiert. Es ist daher wichtig, den Laserweg so einzustellen, dass solche Wechselwirkungen nicht möglich sind.
  3. Probenvorbereitung
    1. Bereiten Sie die Ausrichtung des Laserstrahllichts vor (bei der sich der Membranleitwert nicht ändert), wie in Abbildung 2, Position 3 dargestellt.
    2. Fügen Sie dem PBS-Puffer, in den die tBLMs eingetaucht sind, während der Laser ausgeschaltet ist, interessante GNPs (funktionalisiert oder nackt) hinzu.
    3. Mischen Sie den PBS-Puffer, der die tBLMs umgibt, dreimal vorsichtig und achten Sie darauf, die Elektrode nicht zu berühren.
    4. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Schalten Sie den Laser ein, um die Probe zu bestrahlen, wobei Sie die korrekt ausgerichtete Laserstrahllichtposition verwenden, wie in Abbildung 2, Position 3 dargestellt.
    6. Verwenden Sie die geeignete Kombination aus GNPs Größe, Form und Konzentration mit Laserlichtwellenlänge.
      HINWEIS: Der Laserstrahl der eingestellten Wellenlänge sollte an die entsprechende BSP-Plasmon-Resonanzfrequenz gekoppelt werden.
    7. Erfassen Sie den gemessenen Strom kontinuierlich (Echtzeitmessungen).
    8. Führen Sie die Schritte 2.2.1 - 2.3.7 aus, wobei die BSP-Zugabe für die Kontrollexperimente weggelassen wird.

3. Statistische Datenanalyse und Darstellung

  1. Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle.
  2. Extrahieren Sie den Membranleitwertparameter im Vergleich zur Zeit.
  3. Verwenden Sie die aufgezeichneten Daten nach dem Einstellen eines Laserstrahllichts mit der richtigen Position und vor der Einführung von GNPs.
  4. Normalisieren Sie die Daten, indem Sie den gemessenen Membranleitwert über den Basismembranleitwert aufteilen.
    HINWEIS: Dies bestätigt, dass relative Veränderungen der Membranleitungswerte durch eingeführte bestrahlte BSP hervorgerufen werden.
  5. Präsentieren Sie Daten als Zeitdiagramme (x-Achse) im Vergleich zur normalisierten Membranleitung (y-Achse).

4. Vorhersage der Menge an lokalisierter Wärme, die in den tBLMs aus bestrahlten Nanopartikeln erzeugt wird (thermisches Vorhersagemodell)

  1. Lösen Sie das Strahlungsübertragungsproblem nach Dombrovsky23, um die absorbierte Strahlungsleistung in bestrahlten Nanopartikellösungen zu berechnen.
  2. Berechnen Sie die Wärmeentwicklung, indem Sie die Wärmequelle aufgrund der absorbierten Strahlung in die Energiegleichung einbeziehen.
    HINWEIS: Eine detaillierte Erläuterung der numerischen Analyse der Wärmeentwicklung in den tBLMs aus bestrahlten Nanopartikeln und der Nanomaterial-Elektroden-Grenzfläche finden Sie in 19.

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Representative Results

Das Goldsubstrat, auf dem tBLMs erzeugt werden können, ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Schema des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 2 dargestellt.

Koplanare Goldelektroden, wie in Abbildung 1Agezeigt, bestehen aus 25 mm x 75 mm x 1 mm Polycarbonat-Basissubstrat mit gemusterten Goldarrays. Eine transparente Klebeschicht definiert die sechs einzelnen Messkammern. Die koplanare Goldelektrode ermöglicht die direkte Exposition des Laserlichts gegenüber der tBLMs-Membran. Jede Vertiefung des Elektrodenarrays enthält eine kreisförmige Arbeitselektrode (Fläche: 0,707cm2)und eine halbkreisförmige Gegenelektrode oder koplanare Elektrode (Fläche: ~ 0,725cm2),die durch einen Spalt von ~2 mm getrennt sind. Die transparente Klebeschicht isoliert den Rest des abgelagerten Goldes vom Massenelektrolyten. Im Gegensatz dazu verbindet das darunter liegende Goldlayout die Arbeitselektroden mit Kontaktflächen außerhalb der Messkammern, um die elektrische Verbindung zum EIS-Leser herzustellen, ohne dass eine Referenzelektrode erforderlich ist.

Der Laserpfad ist so ausgerichtet, dass er mit den tBLMs interagiert und durch den ihn umgebenden Flüssigkeitspuffer gestreut wird, aber nicht so, dass er mit dem darunter liegenden Goldsubstrat interagieren kann. Dies lässt sich leicht durch horizontales Anheben und Absenken des Lasers bestimmen, bis die richtige Position festgelegt ist. Diese Position befindet sich genau an dem Punkt, an dem keine Veränderungen der Membranleitfähigkeit beobachtet werden können. Da tBLMs durch Anheftung an eine Substratschicht aus Bulk-Gold gebildet werden, scheint es wahrscheinlich, dass die Änderungen der Membranleitfähigkeit an position 1 und 2 in Abbildung 2 auf Wärme aus Wechselwirkungen des Lasers mit Nanostrukturen innerhalb der gesputterten Bulk-Goldschicht zurückzuführen sind. Daher wird die genaue Position der horizontalen Lichtstrahlausrichtung verwendet, wobei der Schwerpunkt auf der Eliminierung der Wechselwirkung zwischen dem Laserlicht und dem Unterhalb der tBLMs gefundenen Goldsubstrat liegt.

Die Fokussierung des horizontalen Laserlichts direkt auf die Goldelektrode führt zu einer Erhöhung der Membranleitfähigkeit, wie in Abbildung 2, Position 1 und 2 dargestellt. Die genaue Laserposition zeigte vernachlässigbare Abweichungen der Membranleitfähigkeitsaufzeichnungen während der beiden Perioden von Laser ON und Laser OFF(Abbildung 2B,Position 3). Die BSP-Stichprobe wurde nach der Erstellung von Basisaufzeichnungen hinzugefügt, wie in Abbildung 2, Position 3 dargestellt. Die Zugabe von Streptavidin-konjugierten 30-nm-Goldnanopartikeln zu tBLMs, die biotinyliertes Cholesterin enthielten, zeigte einen deutlichen Unterschied zwischen der Laser-ON- und OFF-Periode sowie im Vergleich zu Position 3 mit deutlichen Erhöhungen der Leitfähigkeitsamplitude während der Laser-ON-Phase(Abbildung 2B,Position 4).

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des tBLM-Modells (Tethered Bilayer Lipid Membrane) auf einem Goldsubstrat. (A) Koplanarer Goldelektrodenschieber mit sechs Vertiefungen, der letztendlich durch Zugabe einer dünnen transparenten Klebeschicht definiert wird. (B) Das tBLM-Modell besteht aus Abstandhaltern (Ethylenglykolketten, die mit einer Hydroxylgruppe enden) und angebundenen Molekülen (Ethylenglykolgruppen, die mit einer hydrophoben Phytanylkette enden) die Anbindeleien an die Goldsubstratoberfläche, um die erste Schicht zu bilden. Die zweite Schicht umfasst die nicht angebundenen Lipide. Die modifizierte Zahl basierte auf Cornell et al.24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Darstellung des Assay-Aufbaus für die Ausrichtung und der entsprechenden Änderungen des Messmembranleitwerts über tBLMs, die sich aus der Laserbeleuchtung ergeben ( λ = 530 nm). (A) Schematisch repräsentativ für die verschiedenen Positionen der horizontalen Laserausrichtung; wobei Position 1: Laserlichtstrahl, der mit dem Goldsubstrat ausgerichtet ist (wenn der Laser eingeschaltet wurde, ist rot gekennzeichnet); Position 2 das horizontale Laserlicht gemischt mit Membran und Goldsubstrat; Position 3 Laserlicht fokussiert in die Schüttflüssigkeit, die tBLMs umgibt; Position 4 Laserstrahllicht fokussiert in die Flüssigkeit, die die tBLMs in Gegenwart von Streptavidin-konjugierten 30 nm sphärischen GNPs umgibt. (B) Normalisierte Leitfähigkeitsaufzeichnungen über die Zeit entsprechen den verschiedenen Ausrichtungspositionen. Position 1, 2 und 3 Messungen der tBLM-Leitfähigkeit in Abwesenheit von BSP, während Position 4 eine Messung der tBLM-Leitfähigkeit in Gegenwart von Streptavidin-konjugierten 30 nm sphärischen BSP ist. Die Membranleitungswerte wurden auf den Ausgangswert der Membranleitung bei tBLMs Bildung normalisiert. Die Ergebnisse sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung des tBLM-Modells mit einem koplanaren Elektrodensubstrat in Verbindung mit einer horizontalen Laserausrichtung, die die Aufzeichnung der elektrischen Impedanz in Echtzeit als Reaktion auf die Laserbestrahlung von Goldnanopartikeln ermöglicht. Die hier vorgestellte Methode der EIS-Aufzeichnung erstellt eine minimale Liste von Experimenten, die notwendig sind, um Ionenstromänderungen über die Membran aufzuzeichnen, die der Wärme entsprechen, die durch die gekoppelte Laser- und Gold-Nanopartikel-Wechselwirkung erzeugt wird. Es gibt einen kritischen Schritt in diesem Protokoll, nämlich die sorgfältige und präzise Ausrichtung des Laserpfads auf den Puffer, der die Doppelschichtlipidmembran umgibt.

Die Verwendung des tBLM-Modells bietet ausgeprägte elektrische Dichtungseigenschaften, die die Eigenschaften natürlicher Lipidmembranen nachahmen24. tBLMs bieten auch eine wässrige ionische Reservoirregion zwischen dem Goldsubstrat und der anschließend gebildeten Membran, wobei die angebundenen Moleküle und das Abstandhaltermolekül eine Dicke von 11 Å25hatten und die Dicke der Doppelschichtlipidmembran etwa 6,5 nm19 betrug. Dies kann Raum bieten, um Membranproteine, Ionenkanäle oder andere spezifisch funktionalisierteMoleküle 13,22einzuarbeiten. Die Auswahl von 70% DPEPC- und 30% GDPE-Lipiden bietet eine optimale Abdichtung der Zweischichtlipidmembran, um die elektrischen Eigenschaften von tBLMs mit dem EIS-System24zu untersuchen. Ebenso ahmt die Einführung von Cholesterin in die zweischichtigen Lipidmembranen native biomimetische Modellmembranen eng nach. Cholesterin-Anteile verbessern die Stabilität der Doppelschicht-Lipidmembran und minimieren die Membranpermeabilität für Ionen, indem sie eine hohe Packung der Phospholipid-Doppelschicht26,27bieten. Die Kombination von tBLMs mit dem EIS-System ermöglicht die indirekte Messung der Wärmeübertragung zwischen bestrahlten GNPs und Doppelschichtlipidmembranen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von koplanaren Goldelektroden in diesem Protokoll die Echtzeit-EIS-Messungen ohne Interferenzen durch Referenz- oder Gegenelektroden.

Gold in der Nanopartikelskala hat andere physikalische und optische Eigenschaften als größere Goldaggregate. Die Größe und Form von Nanopartikeln greifen auf ihre Bioverteilung, Zirkulationslebensdauer und Zellaufnahme zu, wobei Nanopartikel mittlerer Größe (20-60 nm) eine maximale Zellaufnahme aufweisen und ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen bieten, was eine anschließende Funktionalisierung ermöglicht28,29. Die in dieser Studie implementierte BSP-Größe von 30 nm stellte mittlere BSP-Größen dar, während die Laserwellenlängenauswahl entsprechend der Absorptionsspitze der BSP erfolgte, um die effizienteste Anregung zu erzielen, was folglich zu einer Erwärmung führt. Die Laserbeleuchtung von tBLMs Goldoberflächen erhöht die Membranleitungsspitzen in der Laser-ON-Phase. Dies soll auf Massen-Goldoberflächen-Nanostrukturen zurückzuführen sein, die mit dem Laser interagieren, was Wärmeproduktionsphänomene nach der Zugabe der BSP30maskieren würde. Um dies zu überwinden, werden die hier entwickelten GNPs durch horizontale Laserausrichtung über die Lipid-Puffer-Schnittstelle beleuchtet, wie in Abbildung 2, Position 3 und 4 dargestellt.

Die hier beschriebenen Protokolle können leicht modifiziert werden, indem die Lipidzusammensetzung der Membran verändert wird, um verschiedene natürliche Zelltypen nachzuahmen, oder indem die eingeführte BSP-Größe und -Form wie 100 nm Gold-Nanourchinen mit dem entsprechenden Laserstrahllicht19verändert werden. Dies kann dann verwendet werden, um den Einfluss lokalisierter GNPs-induzierter Strahlung auf bestimmte Zelltypen zu bestimmen.

Zusammenfassend dient dieses Protokoll als robuster Detektionsbiosensor, um Wechselwirkungen von in situ bestrahlten GNPs mit Modell-Doppelschicht-Lipidmembranentitäten von Interesse zu untersuchen, um Fragen zu Wärmeübertragungsphänomenen zu beantworten. Dies wird dazu beitragen, effizientere photothermische Therapien zu entwickeln und wertvolle Informationen für detaillierte Mechanismen der Wärmeübertragung innerhalb biologischer Systeme zu liefern. Dieser Ansatz kann als Werkzeug für die Vorhersage des Ausmaßes der Zellmembranzerstörung verwendet werden, das von diesen erhitzten Nanopartikeln erlebt werden kann.

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Disclosures

Die Autoren erklären die folgenden finanziellen Interessen/persönlichen Beziehungen, die als potenzielle konkurrierende Interessen angesehen werden können: Prof. Bruce Cornell ist Direktor - Wissenschaft und Technologie bei Surgical Diagnostics SDx tethered membranes Pty. Ltd.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council (ARC) Discovery Program (DP150101065) und dem ARC Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles Cytodiagnostics AC-30-04-05 This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use
30 nm diameter bare gold nanoparticles Sigma-Aldrich 753629 This is a bare GNPs product ready for use
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) NANOCS PG2-BNCS-10k Dissolved in highly pure ethanol
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S1 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Spacer molecules
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl  SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-S2 Tethered molecules
532 nm green laser continuous light OBIS LS/OBIS CORE LS, China ND-1000 The power of this laser was ~135 mW 
tethaPod EIS reader SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-R1 A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously
tethaPlate cartridge assembly SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-BG Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Clamp and slide assembly jig SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-A1 Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge
Lipid coated coplanar gold electrodes SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-T10 Coplanar  gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% 
tethaQuick software SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. SDx-B1 Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes
 99.9% Pure ethanol Sigma-Aldrich  34963 Absolute,  99.9%
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 pH 7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biology Tethered Bilayer Lipid Membranes (tBLMs) Biosensor Gold nanopartikel Laser Wärmeübertragung Membrandynamik
Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen zur Überwachung der Wärmeübertragung zwischen Goldnanopartikeln und Lipidmembranen
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Alghalayini, A., Jiang, L., Gu, X., Yeoh, G. H., Cranfield, C. G., Timchenko, V., Cornell, B. A., Valenzuela, S. M. Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (166), e61851, doi:10.3791/61851 (2020).

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