Summary
Dit werk schetst een protocol om dynamische, niet-invasieve monitoring van warmteoverdracht van laserbestraalde gouden nanodeeltjes naar tBLMs te bereiken. Het systeem combineert impedantiespectroscopie voor de real-time meting van geleidingsveranderingen over de tBLMs, met een horizontaal gerichte laserstraal die gouden nanodeeltjesverlichting aandrijft, voor warmteproductie.
Abstract
Hier rapporteren we een protocol om de warmteoverdracht tussen bestraalde gouden nanodeeltjes (BNP's) en dubbellaagse lipidembranen te onderzoeken door elektrochemie met behulp van vastgebonden dubbellaagse lipidembranen (tBLMs) geassembleerd op gouden elektroden. Bestraalde gemodificeerde BNP's, zoals streptavidin-geconjugeerde BNP's, zijn ingebed in tBLMs die doelmoleculen bevatten, zoals biotine. Door deze benadering te gebruiken, worden de warmteoverdrachtsprocessen tussen bestraalde BNP's en model dubbellaags lipidemembraan met entiteiten van belang gemedieerd door een horizontaal gerichte laserstraal. Het thermisch voorspellende rekenmodel wordt gebruikt om de elektrochemisch geïnduceerde geleidingsveranderingen in de tBLMs te bevestigen. Onder de specifieke omstandigheden die werden gebruikt, vereiste het detecteren van warmtepulsen specifieke bevestiging van de gouden nanodeeltjes aan het membraanoppervlak, terwijl ongebonden gouden nanodeeltjes geen meetbare respons konden uitlokken. Deze techniek dient als een krachtige detectiebiosensor die direct kan worden gebruikt voor het ontwerp en de ontwikkeling van strategieën voor thermische therapieën die optimalisatie van de laserparameters, deeltjesgrootte, deeltjescoatings en samenstelling mogelijk maken.
Introduction
De hypertherme prestaties van bestraalde gouden nanomaterialen bieden een nieuwe klasse van minimaal invasieve, selectieve, gerichte behandeling voor infecties en tumoren1. Het gebruik van nanodeeltjes die door een laser kunnen wordenverwarmd,is gebruikt om zieke cellen selectief te vernietigen en een middel te bieden voor selectieve medicijnafgifte2,3. Een gevolg van de fotothermolyseverschijnselen van verwarmde plasmonische nanodeeltjes is schade aan de celmembranen. Het vloeibare lipide dubbellaagse membraan wordt beschouwd als een bijzonder kwetsbare plaats voor cellen die dergelijke behandelingen ondergaan, omdat denaturatie van intrinsieke membraaneiwitten en membraanbeschadiging ook kan leiden tot celdood4, omdat er veel eiwitten zijn om de ionische potentiële gradiënt over celmembranen te behouden. Hoewel het vermogen om de warmteoverdracht op nanoschaal te bepalen en te monitoren van cruciaal belang is voor de studie en toepassing van bestraalde BNP's1,5,6,7,beoordeling en begrip van de moleculaire interacties tussen BNP's en biomembranen, evenals de directe gevolgen van de laser-geïnduceerde verwarmingsverschijnselen van ingebedde BNP's in biologische weefsels, moeten nog volledig worden opgehelderd8. Daarom blijft een grondig begrip van het hyperthermieproces van bestraalde BNP's een uitdaging. Als zodanig zou de ontwikkeling van een nanomateriaal-elektrode-interface die de natuurlijke omgeving van cellen nabootst, een middel kunnen zijn om een diepgaand onderzoek uit te voeren naar de warmteoverdrachtskenmerken van bestraalde gouden nanodeeltjes binnen biologische systemen.
De complexiteit van inheemse celmembranen is een van de belangrijke uitdagingen bij het begrijpen van de bestraalde BNP-interacties in cellen. Er zijn verschillende kunstmatige membraanplatforms ontwikkeld om nauwe eenvoudige bio-mimetische versies van natuurlijke lipidemembraanarchitectuur en -functionaliteit te bieden, waaronder, maar niet beperkt tot, zwarte lipidembranen9,ondersteunde planaire dubbellaagse membranen10,hybride dubbellaagse membranen11,polymeer-gedempte lipide bilayer membranen12 en vastgebonden dubbellaagse lipidembranen13. Elk kunstmatig lipidemembraanmodel heeft duidelijke voordelen en beperkingen met betrekking tot het nabootsen van de natuurlijke lipidemembranen14.
Deze studie beschrijft het gebruik van lipidemembraan-gecoate elektroden als een sensor voor het beoordelen van gouden nanodeeltjes en lipidemembraaninteracties, met behulp van het tBLM-model. Het op tBLM gebaseerde biosensordetectieschema biedt inherente stabiliteit en gevoeligheid13 omdat vastgebonden membranen zichzelf kunnen herstellen, in tegenstelling tot andere systemen (zoals membranen gevormd door patchklem of liposomen) waarin slechts een kleine hoeveelheid membraanschade resulteert in hun ineenstorting15,16,17,18. Verder, omdat tBLMs van mm 2-dimensies zijn, is de achtergrondimedantie ordes van grootte lager dan patch-clamp-opnametechnieken, die een registratie van veranderingen in basalemembraan ionische flux als gevolg van nanodeeltjesinteracties mogelijk maken. Als gevolg hiervan kan het huidige protocol veranderingen in membraangeleiding contrasteren met gebonden BNP's die worden geëxciteerd door lasers met een vermogen van slechts 135 nW / μm2.
Het hier gepresenteerde systeem biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor het bepalen van nauwkeurige laserparameters, deeltjesgrootte, deeltjescoatings en samenstelling die nodig zijn om thermische therapieën te ontwerpen en te ontwikkelen. Dit is van cruciaal belang voor de verfijning van opkomende fotothermische therapieën en biedt waardevolle informatie voor gedetailleerde mechanismen van warmteoverdracht binnen biologische systemen. Het gepresenteerde protocol is gebaseerd op eerder gepubliceerd werk19. Een overzicht van het protocol is als volgt: het eerste deel definieert de tBLM-formatie; het tweede deel schetst hoe de opstelling moet worden geconstrueerd en de excitatielaserbron moet worden uitgelijnd; het laatste deel illustreert hoe informatie uit de elektrische impedantiespectroscopiegegevens kan worden geëxtraheerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van tBLMs-elektroden
- Voorbereiding van de eerste monolaagcoating
- Dompel een vers gesputterd elektrodemicroscoopglaasje met goudpatroon onder in een ethanolische oplossing bestaande uit een 3 mM 1: 9-verhouding van benzyl-disulfide-tetra-ethyleenglycol-OH "spacer" -moleculen (benzyldisulfide bestond uit een vier zuurstof-ethyleenglycolafstander, afgesloten met een OH-groep) en benzyldisulfide (tetra-ethyleenglycol) n = 2 C20-fytanyl "vastgebonden" moleculen. Hierdoor ontstaat de eerste laag coating waaraan een dubbellaag kan worden verankerd.
OPMERKING: De gouden elektrode is gemaakt door het verdampen van 100 nm, 99,9995% goud (5n5 goud) film op aangepaste 25 mm x 75 mm polycarbonaat dia's20. - Incubeer elektroden met de eerste laag bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
- Spoel de gouden elektroden door ze onder te dompelen in grote hoeveelheden pure ethanol van meer dan 30 s.
- Gebruik de gouden elektrodeschuif met de eerste monolaag direct voor de volgende stap of bewaar in een pot vol pure ethanol.
- OPMERKING: Om de integriteit van de eerste laag te waarborgen, minimaliseert u elk direct contact met de gouden delen van de dia
- Dompel een vers gesputterd elektrodemicroscoopglaasje met goudpatroon onder in een ethanolische oplossing bestaande uit een 3 mM 1: 9-verhouding van benzyl-disulfide-tetra-ethyleenglycol-OH "spacer" -moleculen (benzyldisulfide bestond uit een vier zuurstof-ethyleenglycolafstander, afgesloten met een OH-groep) en benzyldisulfide (tetra-ethyleenglycol) n = 2 C20-fytanyl "vastgebonden" moleculen. Hierdoor ontstaat de eerste laag coating waaraan een dubbellaag kan worden verankerd.
- Montage van de eerste monolaags gecoate plaat
- Haal voorzichtig een coplanaire gouden elektrodeschuif uit de container met behulp van een pincet, zorg ervoor dat u geen contact maakt met de patroongebieden waar de tBLMs zich zullen vormen.
OPMERKING: Let op de kant van de dia waarop het goud is gedeponeerd. - Aan de lucht drogen schuif gedurende 1 - 2 minuten in om eventuele resterende ethanol te verwijderen.
- Plaats de gouden elektrode over een droog oppervlak, zorg ervoor dat de goudelektrode correct is georiënteerd met een patroon van het gouden oppervlak naar boven gericht.
- Verwijder de transparante lijmlaag van een dun laminaat en plaats over de 6 kanalen om elk goed te definiëren.
- Gebruik een drukrol om lucht tussen de dia en de transparante kleeflaag af te geven, zoals weergegeven in figuur 1A.
OPMERKING: De tijd die nodig is voor deze stap moet door de onderzoeker worden geoptimaliseerd. In dit protocol variëren de tijden van 2-3 minuten. - Breng zo snel mogelijk (binnen 1-2 minuten) de tweede lipide bilayer aan de geassembleerde eerste monolayer gecoate elektrode voor zelfassemblage om beschadiging van de eerste laag te voorkomen.
- Haal voorzichtig een coplanaire gouden elektrodeschuif uit de container met behulp van een pincet, zorg ervoor dat u geen contact maakt met de patroongebieden waar de tBLMs zich zullen vormen.
- Bereiding van tweede lipide bilayer
- Voeg 6 μL van 3 mM lipiden van belang toe aan de eerste put van de zes putjesglijbaan. Laat de rand van de micropipettepunt het gouden oppervlak niet raken, wat de vastgebonden chemicaliën op de elektrode kan beschadigen.
OPMERKING: Het lipidenmengsel dat in dit werk werd gebruikt, bestond uit 3 mM 70% zwitterionic C20 diphytanyl-ether-glycero-phosphatidylcholine (DPEPC) en 30% C20 diphytanyldiglyceride ether lipids (GDPE) gemengd met 3 mM cholesterol-PEG-Biotine in 50:1 molaire verhouding. - Introduceer 6 μL van het lipidenmengsel in de andere putten met een opening van 10 s tussen elke toevoeging.
- Incubeer elke put gedurende precies 2 minuten bij kamertemperatuur voordat u het lipidenmengsel over de elektroden uitwisselt met een buffer zoals PBS. Plaats de tijden voor de toevoeging en bufferuitwisseling 10 s uit elkaar, zodat elke put precies 2 minuten met het lipide wordt geïncubeerd.
- Was nog 3 keer met 50 μL PBS-buffer (pH 7,0). Zorg ervoor dat u te allen tijde 50 μL buffer over de elektroden laat. Laat de elektroden niet drogen.
OPMERKING: Door het ethanoloplosmiddel op deze manier te verdringen met de waterige oplossing (de oplosmiddeluitwisselingsmethode)kan een snelle vorming van een enkele lipide dubbellaag verankerd aan de goudelektrode via de vastgebonden chemicaliën mogelijk worden.
- Voeg 6 μL van 3 mM lipiden van belang toe aan de eerste put van de zes putjesglijbaan. Laat de rand van de micropipettepunt het gouden oppervlak niet raken, wat de vastgebonden chemicaliën op de elektrode kan beschadigen.
- Testen van tBLM-formatie met behulp van elektrische impedantiespectroscopie (EIS) metingen
- Plaats voorbereide elektrodeschuif in een AC-impedantiespectrometer (bijv. Tethapod). Zorg ervoor dat de spectrometer via een USB-poort is aangesloten op een computer waarop de software wordt uitgevoerd.
- Open de software, klik op Setup en open Hardware.
- Stel de hardware-instellingen in op het gebruik van 25 mV piek-naar-piek AC-excitatie.
- Stel frequenties in tussen 0,1 en 10.000 Hz met twee stappen per decennium voor snelle impedantiemaatregelen druk op ok.
- Klik op het menu Setup en open Model.
- Gebruik een equivalent circuitmodel dat de tethering goudelektrode beschrijft als een constant fase-element in serie met een weerstand die de elektrolytbuffer beschrijft en een parallel weerstand-condensatornetwerk om de lipide bilayer te beschrijven, en druk op OK.
- Druk op de Start-knop om een real-time meting van de membraancapaciteit (Cm)en de membraangeleiding (Gm)te starten. Cm-waarden van typische tBLMs moeten in het bereik van 12,5 nF tot 15,5 nF liggen voor 10% vastgebonden chemicaliën21,22.
- Nadat u het protocol hebt uitgevoerd en het experiment hebt voltooid, slaat u de gegevens op.
- Herhaal de meting met het volgende putje.
2. Laserbestraling
- Experimentele opstelling
OPMERKING: Het op maat gemaakte systeem wordt voor elke tBLM-put afzonderlijk ingesteld.- Voer experimenten uit in een lichtdichte doos om lasergevaarlijk te minimaliseren.
- Gebruik een optiektabel om het experiment in te stellen om ongewenste trillingen te verminderen.
- Plaats de impedantielezer, waar de gouden dia is aangesloten, op een XYZ-podium en til deze zodanig op dat deze zich in het pad van de laserbron bevindt.
- Gebruik grof-fijne scherpstellen microscopische tandwielen om de hoogte van de laserbron te regelen om de juiste precisie te bereiken.
- Richt het laserpad langs de lengteas van de elektrodeschuif.
LET OP: Draag altijd een geschikte laserveiligheidsbril en handhaaf goede laserveiligheidsprotocollen. - Laat de geselecteerde afgestemde laser stabiliseren voordat u het experiment start.
OPMERKING: Een schema van de experimentele opstelling wordt geïllustreerd in figuur 2A.
- Uitlijning van laser- en goudelektroden
OPMERKING: Beoordeel voordat u begint altijd het laservermogen met behulp van een vermogensmeter om ervoor te zorgen dat alleen zeer lage wattages aan de tBLMs worden geleverd.- Pas het laserpad of de hoek van de elektrode zodanig aan dat de laser door de vloeistof gaat die de elektrode bedekt en net zichtbaar is, gelijkmatig, aan het gouden oppervlak.
- Pas de positie van het laserstraallicht voor elk experiment aan door de laserstraalbron te verhogen of te verlagen met behulp van de fijnafstelling terwijl veranderingen in de membraangeleiding worden waargenomen.
- Vergrendel de knop om de positie van het laserpad vast te zetten wanneer er geen geleidingsveranderingen worden waargenomen.
OPMERKING: Verhoogde membraangeleidingswaarden worden gegenereerd wanneer de laser interageert met de onderliggende goudelektrode. Het is daarom belangrijk om het laserpad zo aan te passen dat dergelijke interacties niet mogelijk zijn.
- Monstervoorbereiding
- Bereid de uitlijning van het laserstraallicht voor (wanneer er geen verandering in de membraangeleiding is), zoals weergegeven in figuur 2,positie 3.
- Voeg GNPs of interest (gefunctionaliseerd of kaal) toe aan de PBS-buffer waarin de tBLMs worden ondergedompeld terwijl de laser is uitgeschakeld.
- Meng de PBS-buffer rond de tBLMs drie keer voorzichtig, waarbij u voorzichtig moet zijn dat u de elektrode niet aanraakt.
- Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
- Zet de laser aan om het monster te bestralen, met behulp van de juiste uitgelijnde laserstraallichtpositie zoals te zien in figuur 2,positie 3.
- Gebruik de juiste combinatie van GNPs grootte, vorm en concentratie met laserlichtgolflengte.
OPMERKING: De laserstraal van de ingestelde golflengte moet worden koppeld aan de overeenkomstige GNP plasmon resonantiefrequentie. - Registreer continu gemeten stroom (real-time metingen).
- Voer stappen 2.2.1 - 2.3.7 uit, waarbij de BNP-toevoeging voor de controle-experimenten wordt weggelaat.
3. Statistische gegevensanalyse en presentatie
- Exporteer de gegevens naar een spreadsheet.
- Extraheer de membraangeleidingsparameter versus tijd.
- Gebruik de opgenomen gegevens na het instellen van een laserstraallicht met de juiste positie en voorafgaand aan de introductie van GNPs.
- Normaliseer gegevens door de gemeten membraangeleiding te verdelen over de basislijnmembraangeleiding.
OPMERKING: Dit bevestigt dat relatieve veranderingen in membraangeleidingswaarden worden opgewekt door geïntroduceerde bestraalde BNP's. - Presenteer gegevens als tijdsdiagrammen (x-as) versus genormaliseerde membraangeleiding (y-as).
4. Voorspel de hoeveelheid gelokaliseerde warmte die in de tBLMs wordt gegenereerd door bestraalde nanodeeltjes (thermisch voorspellend model)
- Los het probleem van stralingsoverdracht op volgens Dombrovsky23, om het geabsorbeerde stralingsvermogen in bestraalde nanodeeltjesoplossingen te berekenen.
- Bereken de warmteontwikkeling door de warmtebron als gevolg van geabsorbeerde straling in de energievergelijking op te nemen.
OPMERKING: Voor een gedetailleerde uitleg van de numerieke analyse van warmteontwikkeling in de tBLMs van bestraalde nanodeeltjes en de nanomateriaal-elektrode-interface, zie 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gouden substraat waarop tBLMs kunnen worden gemaakt, is weergegeven in figuur 1. Een schema van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 2.
Coplanaire gouden elektroden, zoals weergegeven in figuur 1A, zijn gemaakt van 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonaat basissubstraat met patroongouden arrays. Een transparante lijmlaag definieert de zes afzonderlijke meetkamers. De coplanaire goudelektrode maakt de directe blootstelling van het laserlicht aan het tBLMs-membraan mogelijk. Elke put van de elektrode-array bevat een cirkelvormige werkelektrode (gebied: 0,707 cm2) en een halve cirkelvormige tegenelektrode of coplanaire elektrode (gebied: ~ 0,725 cm2), die worden gescheiden door een opening van ~ 2 mm. De transparante lijmlaag isoleert de rest van het gedeponeerde goud uit de bulkelektrolyt. De onderliggende gouden lay-out verbindt de werkelektroden daarentegen met contactgebieden buiten de meetkamers om de elektrische verbinding met de EIS-lezer te leveren zonder dat een referentie-elektrode nodig is.
Het laserpad is uitgelijnd op een manier waarop het interageert met de tBLMs en wordt verspreid door de vloeistofbuffer eromheen, maar niet zodanig dat het kan interageren met het onderliggende gouden substraat. Dit is eenvoudig te bepalen door horizontaal op- en neer te gaan van de laser totdat de juiste positie is vastgesteld. Deze positie is net op het punt waar geen veranderingen in membraangeleiding kunnen worden waargenomen. Gezien het feit dat tBLMs worden gevormd door bevestiging aan een substraatlaag van bulkgoud, lijkt het waarschijnlijk dat de veranderingen in membraangeleiding op positie 1 en 2 in figuur 2 het gevolg zijn van warmte van interacties van de laser met nanostructuren in de gesputterde bulkgoudlaag. Dus, met behulp van de nauwkeurige positie van horizontale lichtstraaluitlijning gericht op het elimineren van interactie tussen het laserlicht en het bulk gouden substraat onder de tBLMs.
Het richten van het horizontale laserlicht direct op de goudelektrode veroorzaakt een toename van de membraangeleiding, zoals weergegeven in figuur 2,positie 1 en 2. De precieze laserpositie onthulde een verwaarloosbare variatie in de membraangeleidingsregistraties tijdens beide perioden van laser ON en laser OFF(figuur 2B,positie 3). De GNP-steekproef werd toegevoegd na het vaststellen van basismetingen, zoals weergegeven in figuur 2,positie 3. De toevoeging van streptavidin-geconjugeerde 30 nm gouden nanodeeltjes aan tBLMs die gebiotinyleerd cholesterol bevatten, toonde een duidelijk verschil tussen de laser AAN- en UIT-perioden, evenals in vergelijking met positie 3, met duidelijke toenames in geleidingsamplitude tijdens de laser ON-fase(Figuur 2B, positie 4).
Figuur 1: Schematische weergave van het tethered bilayer lipid membrane (tBLM) model op een gouden substraat. (A) Coplanaire goudelektrodeschuif met zes putten, uiteindelijk gedefinieerd door de toevoeging van een dunne transparante kleeflaag. (B) Het tBLM-model omvat spacer (ethyleenglycolketens eindigend met een hydroxylgroep) en vastgebonden moleculen (ethyleenglycolgroepen geëindigd met hydrofobe fytanylketen) die aan het oppervlak van het gouden substraat worden vastgebonden om de eerste laag te vormen. De tweede laag omvat de niet-vastgebonden lipiden. Het gewijzigde cijfer was gebaseerd op Cornell et al.24. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van de testopstelling voor uitlijning en overeenkomstige veranderingen in de meetmembraangeleiding over tBLMs als gevolg van laserverlichting ( λ = 530 nm). (A) Schematische representativiteit van de verschillende posities van horizontale laseruitlijning; waarbij positie 1: laserlichtstraal uitgelijnd met het gouden substraat (wanneer de laser is ingeschakeld, wordt rood aangegeven); positie 2 het horizontale laserlicht gemengd met membraan en gouden substraat; positie 3 laserlicht gericht op de bulkvloeistof rondom tBLMs; Positie 4 laserstraallicht gericht op de vloeistof rond de tBLMs in de aanwezigheid van streptavidin-geconjugeerde 30 nm bolvormige BNP's. (B) Genormaliseerde geleidingsregistraties in de loop van de tijd komen overeen met de verschillende uitlijnposities. Posities 1, 2 en 3 metingen van tBLMs geleiding in afwezigheid van BNP's, terwijl positie 4 een meting is van tBLMs geleiding in de aanwezigheid van streptavidin-geconjugeerde 30 nm bolvormige BNP's. De membraangeleidingswaarden werden genormaliseerd tot de beginwaarde van de membraangeleiding bij tBLMs-vorming. De resultaten zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft het gebruik van het tBLM-model met een coplanair elektrodesubstraat in combinatie met een horizontale laseruitlijning die de real-time elektrische impedantieregistratie mogelijk maakt als reactie op laserbestraling van gouden nanodeeltjes. De hier gepresenteerde methode van EIS-registratie construeert een minimale lijst van experimenten die nodig zijn om ionenstroomveranderingen over het membraan te registreren, wat overeenkomt met de warmte die wordt gegenereerd door de interactie tussen gekoppelde laser en gouden nanodeeltjes. Er is een cruciale stap in dit protocol, namelijk de zorgvuldige en nauwkeurige uitlijning van het laserpad naar de buffer rond het dubbellaagse lipidemembraan.
Het gebruik van het tBLM-model biedt verschillende elektrische afdichtingseigenschappen die natuurlijke lipidemem kenmerken nabootsen24. tBLMs bieden ook een waterig ionische reservoirgebied tussen het gouden substraat en het vervolgens gevormde membraan, waar de vastgebonden moleculen en het spacermolecuul een dikte hadden van 11 Å25, en de dubbellaagse lipidemembraandikte was ongeveer 6,5 nm19. Dit kan ruimte bieden om membraaneiwitten, ionkanalen of andere specifieke gefunctionaliseerde moleculen op te nemen13,22. De selectie van 70% DPEPC en 30% GDPE lipiden zorgt voor een optimale afdichting van dubbellaags lipidemembraan om de elektrische eigenschappen van tBLMs te onderzoeken met behulp van EIS-systeem24. Evenzo bootst de introductie van cholesterol in de dubbellaagse lipidemembranen de inheemse biomimetische modelmembranen na. Cholesterolmoieties verbeteren de bilayer lipide membraanstabiliteit, evenals het minimaliseren van de membraandoorlaatbaarheid voor ionen door een hoge verpakking van de fosfolipide bilayer26,27te bieden. De combinatie van tBLMs met het EIS-systeem zorgt voor een indirecte meting van de warmteoverdracht tussen bestraalde BNP's en dubbellaagse lipidembranen. Verder maakt het gebruik van coplanaire goudelektroden in dit protocol de real-time EIS-metingen mogelijk zonder enige interferentie van referentie- of tegenelektroden.
Goud op nanodeeltjesschaal heeft andere fysieke en optische kenmerken dan grotere goudaggregaten. De grootte en vorm van nanodeeltjes hebben toegang tot hun biodistributie, circulatielevensduur en celopname, waarbij nanodeeltjes van gemiddelde grootte (20-60 nm) maximale celopname vertonen en een hoge oppervlakte-volumeverhouding bieden, waardoor latere functionalisatie28,29. De geïmplementeerde 30 nm GNP-grootte in deze studie vertegenwoordigde tussenliggende BNP-groottes, terwijl de lasergolflengteselectie volgens de absorptiepiek van GNPs de meest efficiënte excitatie opleverde, wat bijgevolg tot verwarming leidt. De laserverlichting van tBLMs gouden oppervlakken verhoogt membraangeleidingspieken bij de laser ON-fase. Dit wordt voorgesteld als gevolg van bulk gouden oppervlakte nanostructuren die interageren met de laser, die warmteproductieverschijnselen zouden maskeren na de toevoeging van de BNP's30. Om dit te ondervangen, wordt de ontwikkelde benadering hier B BNP's verlicht door horizontale laseruitlijning over de lipide-bufferinterface te gebruiken, zoals geïllustreerd in figuur 2, positie 3 en 4.
De hier beschreven protocollen kunnen gemakkelijk worden gewijzigd door de lipidesamenstelling van het membraan te wijzigen om verschillende natuurlijke celtypen na te bootsen, of door de geïntroduceerde GNPs-grootte en -vorm te wijzigen, zoals 100 nm gouden nanourchinen met het bijbehorende laserstraallicht19. Dit kan vervolgens worden gebruikt om de impact van gelokaliseerde BNP-geïnduceerde straling op specifieke celtypen te bepalen.
Samenvattend dient dit protocol als een robuuste detectiebiosensor om interacties van in situ bestraalde GNPs te bestuderen met model dubbellaagse lipidemembraanentiteiten van belang om vragen over warmteoverdrachtsverschijnselen te beantwoorden. Dit zal helpen bij het ontwikkelen van efficiëntere fotothermische therapieën en waardevolle informatie opleveren voor gedetailleerde mechanismen van warmteoverdracht binnen biologische systemen. Deze benadering kan worden gebruikt als een hulpmiddel voor de voorspelling van het niveau van celmembraanvernietiging dat kan worden ervaren door deze verwarmde nanodeeltjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren de volgende financiële belangen / persoonlijke relaties, die kunnen worden beschouwd als potentiële concurrerende belangen: Prof Bruce Cornell is Director - Science and Technology bij Surgical Diagnostics SDx tethered membranes Pty. Ltd.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Australian Research Council (ARC) Discovery Program (DP150101065) en de ARC Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
| 30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
| Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
| C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
| Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
| Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
| 532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
| tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
| tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
| Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
| tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
| 99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |
References
- Her, S., Jaffray, D. A., Allen, C. Gold nanoparticles for applications in cancer radiotherapy: Mechanisms and recent advancements. Advanced Drug Delivery Reviews. 109, 84-101 (2017).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Killingsworth, M. C., Xu, X., Cortie, M. B. Targeted destruction of murine macrophage cells with bioconjugated gold nanorods. Journal of Nanoparticle Research. 9 (6), 1109-1124 (2007).
- Pissuwan, D., Valenzuela, S. M., Miller, C. M., Cortie, M. B. A golden bullet? Selective targeting of Toxoplasma gondii tachyzoites using antibody-functionalized gold nanorods. Nano Letters. 7 (12), 3808-3812 (2007).
- Zhang, H. -G., Mehta, K., Cohen, P., Guha, C. Hyperthermia on immune regulation: a temperature's story. Cancer Letters. 271 (2), 191-204 (2008).
- Gobin, A. M., et al. Near-infrared resonant nanoshells for combined optical imaging and photothermal cancer therapy. Nano Letters. 7 (7), 1929-1934 (2007).
- Jackson, J. B., Halas, N. J. Surface-enhanced Raman scattering on tunable plasmonic nanoparticle substrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (52), 17930-17935 (2004).
- Emelianov, S. Y., Li, P. -C., O'Donnell, M. Photoacoustics for molecular imaging and therapy. Physics Today. 62 (8), 34 (2009).
- Dimitriou, N. M., et al. Gold nanoparticles, radiations and the immune system: Current insights into the physical mechanisms and the biological interactions of this new alliance towards cancer therapy. Pharmacology & Therapeutics. 178, 1-17 (2017).
- Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979 (1962).
- Tamm, L. K., McConnell, H. M.
- Plant, A. L. Supported hybrid bilayer membranes as rugged cell membrane mimics. Langmuir. 15 (15), 5128-5135 (1999).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
- Alghalayini, A., Garcia, A., Berry, T., Cranfield, C. G. The Use of Tethered Bilayer Lipid Membranes to Identify the Mechanisms of Antimicrobial Peptide Interactions with Lipid Bilayers. Antibiotics. 8 (1), 12 (2019).
- Khan, M. S., Dosoky, N. S., Williams, J. D. Engineering lipid bilayer membranes for protein studies. International Journal of Molecular Sciences. 14 (11), 21561-21597 (2013).
- Urban, P., Kirchner, S. R., Mühlbauer, C., Lohmüller, T., Feldmann, J. Reversible control of current across lipid membranes by local heating. Scientific Reports. 6, 22686 (2016).
- Palankar, R., et al. Nanoplasmonically-induced defects in lipid membrane monitored by ion current: transient nanopores versus membrane rupture. Nano Letters. 14 (8), 4273-4279 (2014).
- Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
- Plaksin, M., Shapira, E., Kimmel, E., Shoham, S. Thermal transients excite neurons through universal intramembrane mechanoelectrical effects. Physical Review X. 8 (1), 011043 (2018).
- Alghalayini, A., et al. Real-time monitoring of heat transfer between gold nanoparticles and tethered bilayer lipid membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. , 183334 (2020).
- Moradi-Monfared, S., Krishnamurthy, V., Cornell, B. A molecular machine biosensor: construction, predictive models and experimental studies. Biosensors and Bioelectronics. 34 (1), 261-266 (2012).
- Hoiles, W., Gupta, R., Cornell, B., Cranfield, C., Krishnamurthy, V. The effect of tethers on artificial cell membranes: A coarse-grained molecular dynamics study. PloS One. 11 (10), 0162790 (2016).
- Cranfield, C. G., et al. Transient potential gradients and impedance measures of tethered bilayer lipid membranes: pore-forming peptide insertion and the effect of electroporation. Biophysical Journal. 106 (1), 182-189 (2014).
- Dombrovsky, L. A. Radiation heat transfer in disperse systems. , Begell House. (1996).
- Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V., King, L., Osman, P. A biosensor that uses ion-channel switches. Nature. 387 (6633), 580 (1997).
- Maccarini, M., et al. Nanostructural determination of a lipid bilayer tethered to a gold substrate. The European Physical Journal E. 39 (12), 123 (2016).
- Beugin-Deroo, S., Ollivon, M., Lesieur, S. Bilayer stability and impermeability of nonionic surfactant vesicles sterically stabilized by PEG-cholesterol conjugates. Journal of Colloid and Interface Science. 202 (2), 324-333 (1998).
- Kendall, J. K., et al. Effect of the Structure of Cholesterol-Based Tethered Bilayer Lipid Membranes on Ionophore Activity. ChemPhysChem. 11 (10), 2191-2198 (2010).
- Jiang, W., Kim, B. Y., Rutka, J. T., Chan, W. C. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent. Nature Nanotechnology. 3 (3), 145 (2008).
- He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles. Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).
- Wang, F. X., et al. Surface and bulk contributions to the second-order nonlinear optical response of a gold film. Physical Review B. 80 (23), 233402 (2009).
