В этой работе описывается протокол для достижения динамического, неинвазивного мониторинга теплопередачи от облученных лазером наночастиц золота к tBLM. Система сочетает в себе импедансную спектроскопию для измерения изменений проводимости в реальном времени в tBLM с горизонтально сфокусированной лазерной лучом, которая управляет освещением наночастиц золота, для производства тепла.
Здесь мы сообщаем о протоколе исследования теплопередачи между облученными наночастицами золота (GGNP) и двухслойными липидными мембранами с помощью электрохимии с использованием привязанных двухслойных липидных мембран (tBLM), собранных на золотых электродах. Облученные модифицированные ГПН, такие как стрептавидин-конъюгированные ГПН, встроены в tBLM, содержащие молекулы-мишени, такие как биотин. Используя этот подход, процессы теплопередачи между облученными ГНН и модельной двухслойной липидной мембраной с объектами, представляющими интерес, опосредованы горизонтально сфокусированным лазерным лучом. Тепловая прогностическая вычислительная модель используется для подтверждения электрохимически индуцированных изменений проводимости в tBLM. В определенных условиях обнаружения тепловых импульсов требовалось специфическое прикрепление наночастиц золота к поверхности мембраны, в то время как несвязанные наночастицы золота не смогли вызвать измеримый ответ. Этот метод служит мощным биосенсором обнаружения, который может быть непосредственно использован для проектирования и разработки стратегий тепловой терапии, которая позволяет оптимизировать параметры лазера, размер частиц, покрытия частиц и состав.
Гипертермические характеристики облученных наноматериалов золота предлагают новый класс минимально инвазивного, селективного, целенаправленного лечения инфекций иопухолей1. Применение наночастиц, которые могут быть нагреты лазером, было использовано для избирательного уничтожения больных клеток, а также для обеспечения средства для селективной доставки лекарств2,3. Следствием явлений фототермолиза нагретых плазмонных наночастиц является повреждение клеточных мембран. Жидко-липидная двухслойная мембрана считается особенно уязвимым местом для клеток, проходящих такое лечение, поскольку денатурация внутренних мембранных белков, а также повреждение мембраны также могут привести к гибели клеток4,поскольку многие белки существуют для поддержания градиента ионного потенциала через клеточные мембраны. В то время как способность определять и контролировать теплопередачу на наноуровне представляет ключевой интерес для изучения и применения облученных ГПН1,5,6,7,оценки и понимания молекулярных взаимодействий между ГПН и биомембранами, а также прямых последствий лазерно-индуцированных явлений нагрева встроенных ГПН в биологических тканях, еще предстоит полностью прояснить8. Поэтому глубокое понимание процесса гипертермии облученных ГПН остается проблемой. Таким образом, разработка интерфейса наноматериал-электрод, который имитирует естественную среду клеток, может обеспечить средство для проведения углубленного исследования характеристик теплопередачи облученных наночастиц золота в биологических системах.
Сложность нативных клеточных мембран является одной из значительных проблем в понимании взаимодействий облученных ГПН в клетках. Были разработаны различные искусственные мембранные платформы для обеспечения близких простых биомиметических версий архитектуры и функциональности естественной липидной мембраны, включая, но не ограничиваясь ими, черные липидные мембраны9,поддерживаемые планарные бислойные мембраны10,гибридные двухслойные мембраны11,полимерные амортизированные липидные двухслойные мембраны12 и привязанные двухслойные липидные мембраны13. Каждая модель искусственной липидной мембраны имеет явные преимущества и ограничения в отношении имитации естественных липидных мембран14.
Это исследование описывает использование электродов с липидным мембранным покрытием в качестве датчика для оценки взаимодействия наночастиц золота и липидной мембраны с использованием модели tBLM. Схема обнаружения биосенсоров на основе tBLM обеспечивает присущую им стабильность ичувствительность 13, поскольку привязанные мембраны могут самовоспроизводиться, в отличие от других систем (таких как мембраны, образованные патч-зажимом или липосомами), в которых только небольшое количество повреждений мембран приводит к их коллапсу15,16,17,18. Кроме того, поскольку tBLM имеют размерымм 2, фоновое сопротивление на порядки ниже, чем методы записи патч-зажима, что позволяет регистрировать изменения в ионном потоке базальной мембраны из-за взаимодействий наночастиц. В результате этого настоящий протокол может противопоставлять изменения в проводимости мембраны связанными GNP, которые возбуждаются лазерами, мощность которых равна 135 нВт/мкм2.
Система, представленная здесь, обеспечивает чувствительный и воспроизводимый метод определения точных параметров лазера, размера частиц, покрытий частиц и состава, необходимых для проектирования и разработки тепловой терапии. Это имеет решающее значение для уточнения новых фототермических методов лечения, а также предлагает ценную информацию для подробных механизмов теплопередачи в биологических системах. Представленный протокол основан на ранее опубликованной работе19. Схема протокола выглядит следующим образом: первый раздел определяет формирование tBLM; во втором разделе описывается, как построить установку и выровнять источник лазера возбуждения; в заключительном разделе показано, как извлечь информацию из данных электроимпедантной спектроскопии.
Этот протокол описывает использование модели tBLM с копланарной электродной подложкой в сочетании с установкой горизонтального лазерного выравнивания, которое позволяет регистрировать электрическое сопротивление в режиме реального времени в ответ на лазерное облуч…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Австралийского исследовательского совета (ARC) Discovery Program (DP150101065) и Исследовательским центром ARC для интегрированного устройства для анализа конечных пользователей на низких уровнях (IDEAL) (IH150100028).
30 nm diameter streptavidin-conjugated gold nanoparticles | Cytodiagnostics | AC-30-04-05 | This is a streptavidin-conjugated GNPs product ready for use |
30 nm diameter bare gold nanoparticles | Sigma-Aldrich | 753629 | This is a bare GNPs product ready for use |
Cholesterol-PEG-Biotin (MW1000) | NANOCS | PG2-BNCS-10k | Dissolved in highly pure ethanol |
C20 Diphytanyl-Glycero-Phosphatidylcholine lipids | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S1 | 1 ml glass vial containing 70% C16 diphytanyl phosphatidylcholine (DPEPC) and 30% C16 diphytanyl glycerol (GDPE) in 99.9% ethanol |
Benzyl-disulfide-tetra-ethyleneglycol-OH | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Spacer molecules |
Benzyl-disulfide (tetra-ethyleneglycol) n=2 C20-phytanyl | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-S2 | Tethered molecules |
532 nm green laser continuous light | OBIS LS/OBIS CORE LS, China | ND-1000 | The power of this laser was ~135 mW |
tethaPod EIS reader | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-R1 | A reader of conductance and capacitance on six channels simultaneously |
tethaPlate cartridge assembly | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-BG | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
Clamp and slide assembly jig | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-A1 | Materials to attach the slide with electrodes to the flow cell cartridge |
Lipid coated coplanar gold electrodes | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-T10 | Coplanar gold electrodes are made from 25 mm x 75 mm x 1 mm polycarbonate base substrate with patterned gold arrays layout, then coated with benzyldisulphide, bis-tetraethylene glycol C16 phytanyl half membrane spanning tethers in a tether ratio of 10% |
tethaQuick software | SDx Tethered Membranes Pty. Ltd. | SDx-B1 | Software for use with tethaPod to process data and display conductance, impedance and capacitance measurements from the tethaPlate electrodes |
99.9% Pure ethanol | Sigma-Aldrich | 34963 | Absolute, 99.9% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | pH 7 |