Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة لتطوير سقالة باستخدام كليتي الفئران المزيلتين. ويشمل البروتوكول عمليات الازالة وإعادة الخلايا لتأكيد التوافر البيولوجي. يتم تنفيذ إزالة الخلايا باستخدام تريتون X-100 وكبريتات دودسيل الصوديوم.
Abstract
هندسة الأنسجة هي تخصص متطور في الطب الحيوي. يمكن تطبيق تقنيات زراعة الخلايا لتجديد الأنسجة والأعضاء الوظيفية لتحل محل الأعضاء المريضة أو التالفة. هناك حاجة إلى السقالات لتسهيل توليد الأعضاء أو الأنسجة ثلاثية الأبعاد باستخدام الخلايا الجذعية المتمايزة في الجسم الحي. في هذا التقرير، نصف طريقة جديدة لتطوير السقالات الوعائية باستخدام كلى الفئران المزيلة. استخدمت فئران سبراغ دولي البالغة من العمر ثمانية أسابيع في هذه الدراسة، وتم حقن الهيبارين في القلب لتسهيل التدفق إلى الأوعية الكلوية، مما سمح للهابارين بالتغلغل في الأوعية الكلوية. فتح تجويف البطن، وتم جمع الكلى اليسرى. تم تغلغل الكلى التي تم جمعها لمدة 9 ساعة باستخدام المنظفات ، مثل تريتون X-100 وكبريتات دودسيل الصوديوم ، لإزالة الخلايا النسيجية. ثم تم غسل سقالات الكلى منزوعة الخلايا بلطف مع 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والهبارين لإزالة الحطام الخلوي والمخلفات الكيميائية. ومن المتوقع زرع الخلايا الجذعية مع السقالات الأوعية الدموية decellularized لتسهيل توليد أجهزة جديدة. وبالتالي ، قد توفر السقالات الوعائية أساسا لهندسة الأنسجة لترقيع الأعضاء في المستقبل.
Introduction
يتم تطبيق تقنيات زراعة الخلايا لتجديد الأنسجة والأعضاء الوظيفية لتحل محل الأعضاء المريضة أو التالفة. زرع الأعضاء المسببة للألوجين هو حاليا العلاج الأكثر شيوعا لتلف الأعضاء لا رجعة فيه; ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج استخدام كبت المناعة لمنع رفض العضو المزروع. وعلاوة على ذلك، على الرغم من التقدم في علم المناعة زرع، 20٪ من المتلقين زرع قد تواجه رفض حاد في غضون 5 سنوات، وخلال 10 سنوات بعد زرع، 40٪ من المتلقين قد تفقد الكسب غير المشروع المزروعة أو يموت1.
وقد أثمر التقدم في تقنيات هندسة الأنسجة في نموذج جديد لزرع أعضاء جديدة دون رفض المناعة باستخدام الخلايا الجذعية المتمايزة. بعد تمايز الخلايا الجذعية ، هناك حاجة إلى سقالة ، تسمى مصفوفة اصطناعية خارج الخلية ، لتسهيل توليد الأعضاء ثلاثية الأبعاد وتمكين الأنسجة الجديدة من الازدهار داخل المتلقي. السقالات من الأعضاء الأصلية decellularized لها مزايا، بما في ذلك بيئة أكثر فعالية لإنشاء الخلايا وتعزيز انتشار الخلايا الجذعية، على الرغم من أن هذه الآليات لم يتم توضيحها تماما2. على وجه الخصوص ، الكلى هي جهاز مناسب لتوليد السقالات لأنها تحتوي على تداول وفير ومكانة لإنشاء الخلايا الجذعية. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب الهيكل المعقد للكلى ، من الصعب تجديد الكلى بشكل مصطنع لزرع الأعضاء.
في هذا التقرير، نقدم طريقة لتطوير السقالات الوعائية باستخدام الأعضاء المزيلة في نموذج الفئران لتسهيل الدراسات الحيوانية المستقبلية لأغراض هندسة الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل إدارة جامعة بوسان الوطنية للطب وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لاستخدام ورعاية الحيوانات. (الشهادة رقم 2017-119). قبل أي دراسات حيوانية، يجب الحصول على موافقة مؤسسية.
ملاحظة: جميع الأدوات الجراحية والتخديرية / المعدات والكواشف الموصى بها للعرض الجراحي الناجح وتصوير أعضاء البطن مفصلة في الجدول 1.
1. إجراءات التحضير لحصاد كلى الفئران
- استعدادا لعملية جراحية، ضع فئران سبراغ دولي البالغة من العمر 8 أسابيع (وزنها 200-250 غرام) على منصة للتدفئة. ضع مسبار ميزان الحرارة المستقيم في المستقيم لمراقبة درجة الحرارة الأساسية.
- تخدير الفئران مع خليط 5٪ من غاز الأيزوفلوران (التعريفي: 5٪، الصيانة: 3٪).
- لبدء العملية، ضع الجرذ في وضع ية بعد إجراء التخدير. قم بتركيب الأطراف الأربعة للفأر على طاولة العملية بشريط لاصق.
- حلق وتنظيف البطن من الفئران المانحة مع الصابون المبيد للجراثيم. تطبيق 2٪ بيتادين لمدة 1-2 دقيقة على الأقل، ومسح مع محلول الإيثانول 70٪. كرر هذا التسلسل ثلاث مرات.
- غطي الحقل الجراحي بغطاء معقم.
- إجراء شق في البطن العمودي وفضح الكلى اليسرى، الحالب، الشريان الأورطي البطني، والكافا الوريد السفلي.
- تصور وتشريح الكلى اليسرى، الحالب، الشريان الأورطي البطني، والكافا الوريد السفلي قبل قطع باديكل.
2. التشوه عبر القلب
- قبل الجراحة، قم بإعداد محلول التشوه.
- جعل 50 مل من محلول التغلغل لكل فأر.
- مزيج 1x برنامج تلفزيوني مع ما يقرب من 10 U / مل الهيبارين (1 25 قنينة وحدة كلورية سيجعل 2.5 لتر من برنامج تلفزيوني + هيب).
- مزيج كميات متساوية من 8٪ paraformaldehyde مع برنامج تلفزيوني 1x لجعل 4٪ PFA/1xPBS الحل.
ملاحظة: يمكن تخزين 8٪ PFA المصنوعة في الماء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين. ومع ذلك، 4٪ PFA المخفف في برنامج تلفزيوني مستقر فقط لمدة أسبوع واحد في 4 درجة مئوية. جعل التخفيف جديدة.
- تمديد شق البطن الرأسي الجمجمة. تأكد من رسم مقص بعيدا عن الأجهزة عند قطع لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية.
- مواصلة شق من خلال القفص الصدري، ومن ثم قطع من خلال الحجاب الحاجز عن طريق رفع القص.
- دبوس رفرف فضفاضة من الجلد للخروج من الطريق، وتحرير القلب عن طريق تمزيق أي النسيج الضام مع ملقط.
تنبيه: لا تستخدم المقص لتحرير القلب وهذا يمكن أن يؤدي إلى نزيف غير مرغوب فيه. - افتح خط الملحي العازل بالفوسفات وتأكد من تدفق الخط قبل وضع الإبرة في البطين الأيسر. عقد القلب بلطف مع ملقط حادة، واستخدام hemostat للسيطرة على الإبرة. يجب إدخال الإبرة لا يزيد عن 1/4 بوصة.
ملاحظة: قد يؤدي الإدراج أكبر من 1/4 بوصة إلى ثقب في الجانب الآخر من الأنسجة. - في حين دعم القلب مع الإبرة و hemostat، حدد موقع الأذين الأيمن وقص من خلال ذلك مع مقص استئصال القزحية. بقية hemostat على جسم الجرذ، وتأكد من الإبرة لا تزال في وضع داخل القلب.
ملاحظة: إذا كان القطع كافيا، يجب أن يكون هناك دم في تجويف الجسم حيث يتم تخفيف الضغط من برنامج تلفزيوني يتدفق إلى الفئران. - فك بعناية القدمين الأمامية ورفرف الجلد.
- استمر في ممارسة التشويش على برنامج تلفزيوني لمدة 4 دقائق أو أكثر إذا كان الدم لا يزال مرئيا في الكلى والكبد.
3. حصاد الكلى وتفكيكها
- حصاد الكلى اليسرى مع الشريان الأورطي البطني والكافا الوريد السفلي.
- Ligate الحالب، الشريان الأورطي الصدري، متفوقة فينا كافا، وفروع الشريان الأورطي البطني.
- الحفاظ على الجهاز رطب في برنامج تلفزيوني دولبيكو (DPBS) في طبق بيتري 10 سم.
- Cannulate الشريان الأورطي البطني والكافا الوريد السفلي مع قسطرة قياس 23. لإزالة الدم المتبقي، قم بتوصيل القنية بمضخة تمعج، واغسلها مع DPBS (500 مل) و16 U/mL heparin لمدة 90 دقيقة بمعدل 5 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
- لdeellularize الكلى، perfuse الكلى مع 1٪ تريتون X-100 (1 لتر) لمدة 3 ساعة ومن ثم مع 0.75٪ الصوديوم دودسيل كبريتات (SDS) حل (2 لتر) لمدة 6 ساعة في ضغط مستمر من 40 ملم زئبق.
ملاحظة: سوف تصبح الكلى شفافة بعد 8 ساعة. - لإزالة SDS المتبقية، قم بثقب العينة بنسبة 1٪ بنسلين في الماء المقطر (6 لتر) لمدة 18 ساعة (بين عشية وضحاها) ثم مع DPBS معقم (500 مل) و16 U/mL heparin لمدة 90 دقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كان مورفولوجيا الإجمالي من الكلى الفئران الأحمر الداكن(الشكل 1A). بعد التفكيك ، أصبحت الكلية شاحبة وشفافة (الشكل 1D). تم تقييم الحمض النووي الجينومي المتبقي مع مجموعة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، في سقالات الكلى المزيلة ومقارنتها مع تلك الموجودة في الكلى الأصلية (التحكم). وأكد التحليل الكمي أن الحمض النووي الجينومي للأنسجة قد تم القضاء عليه تقريبا بعد إزالة الخلايا. ومن بين 14 حالة، كان متوسط محتويات الحمض النووي 115.05 نانوغرام/ميكرولتر للتحكم و1.96 نانوغرام/ميكرولتر للسقالة ذات الخلايا. في المجموع، تمت إزالة 98.3٪ من الحمض النووي(الشكل 2)،على الرغم من الحفاظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد، وتم الحفاظ على gromeruli acellular في parenchyma القشرية (الشكل 3).
الشكل 1: كلى الفئران التي تتعرض لتشويش الشرايين الكلوية. (أ)مباشرة بعد بدء إزالة الخلايا. (ب) بعد علاج تريتون X-100. (ج) بعد SDS العلاج العازلة. (د) بعد غسل السقالات بين عشية وضحاها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تركيزات الحمض النووي في السيطرة والكلى الفئران decellularized، تظهر انخفاض محتويات الحمض النووي بعد الاحتقان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: هيماتوكسيلين و تلطيخ اليوسين للسيطرة وعينات الكلى المزيلة. (أ) قشرة التحكم (A ') قشرة منزوعة الخلايا (B) التحكم في النخاع (B ') النخاع الديسولار(C)الوريد التحكمي (C ') الوريد منزوع الخلايا. شريط المقياس، 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت بروتوكولات مختلفة لdeellularization من الأعضاء والأنسجة الأخرى. يجب أن يحافظ بروتوكول التفكيك الأمثل على البنية ثلاثية الأبعاد للمصفوفة خارج الخلية (ECM). بشكل عام ، تتكون هذه البروتوكولات من ليسينج غشاء الخلية عن طريق المعالجة الفيزيائية أو الحلول الأيونية ، وتفكيك السيتوبلازم والنواة عن ECM عن طريق المعالجة الأنزيمية أو المنظفات ، ثم إزالة الحطام الخلوي من الأنسجة3. وتشمل العمليات الفيزيائية كشط، والهياج الحل، وتدرجات الضغط، المفاجئة تجميد، والكهرومporation دائم غير الحرارية، والسوائل فوق الحرجة2. يمكن إزالة الخلايا الموجودة على السطح الخارجي للأنسجة أو الأعضاء، مثل الجلد أو الأمعاء الدقيقة، بكفاءة من خلال العمليات الميكانيكية جنبا إلى جنب مع الإنزيمات4. المنظفات الأيونية أو غير الأيونية تذوب الحمض النووي / التفاعلات البروتينية والدهون والبروتينات الدهنية ، ولكن يمكن أن تلحق الضرر ببنية ECM5. تقوم الإنزيمات بإزالة السيتوبلازم والمواد النووية المفككة ، ولكنها تترك هذه المواد في ECM ، والتي يمكن أن تسبب استجابة مناعية6. يتم تحديد العوامل المثلى للتكبيل عن طريق سمك الأنسجة وكثافتها أو الاستخدام السريري للأنسجة التفكيكية.
لإزالة التشظي، استخدمنا مزيجا من المنظفات غير الأيونية والأيونية: تريتون X-100 و SDS. تريتون X-100، كمنظفات غير أيونية، يعطل بشكل فعال الدهون / الدهون والدهون / البروتين التفاعلات. ومع ذلك، قد يدمر تريتون X-100 أيضا البنية الفوقية ECM بسبب فقدان الجليكوسامينوغليكان (GAG) واللامين ومحتويات فيبروكتين. SDS، والمنظفات الأيونية، يزيل بشكل فعال البقايا النووية والبروتينات السيتوبلازمية، ولكن أيضا يعطل البنية الفوقية ECM عن طريق فقدان GAG والكولاجين3. على الرغم من أن هذه العوامل تدمير البنية المجهرية للECM، SDS وتريتون X-100 بنجاح إزالة جميع محتويات الحمض النووي7،8. وهذا أمر ضروري لأن محتوى الحمض النووي المتبقي داخل سقالة يمكن أن يسبب الرفض المناعي. في الأنسجة التي تم decellularized بشكل صحيح، وينبغي أن يكون محتوى الحمض النووي أقل من 50 نانوغرام / ملغ9،10.
في الطريقة ، كان ضغط التشوه 40 ملم زئبق. مطلوب السيطرة على الضغط لتشويش التفكيك. ضغط التشوه الأمثل يختلف من عضو إلى آخر، و 60 ملم زئبق هو الضغط الأمثل للكلى البشرية والبورسينية أو تداعي القلب11. في الفئران، ويعتبر 40 ملم زئبق كافية لتشويش الديسيلولار12.
أحد العلاجات الواعدة لاستبدال زرع اللوغرافت هو زرع الخلايا الجذعية باستخدام سقالة وعائية. ونأمل أن يوفر هذا البروتوكول لتكبيل الأعضاء أساسا لدراسات هندسة الأنسجة في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة معهد البحوث الطبية الحيوية من مستشفى جامعة بوسان الوطنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
