Summary
Denne protokol introducerer en metode til at udvikle et stillads ved hjælp af decellulariserede rotte nyrer. Protokollen indeholder decellulariserings- og recellulariseringsprocesser for at bekræfte biotilgængelighed. Decellularisering udføres ved hjælp af Triton X-100 og natrium dodecyl sulfat.
Abstract
Vævsteknik er en banebrydende disciplin inden for biomedicin. Cellekultur teknikker kan anvendes til regenerering af funktionelle væv og organer til at erstatte syge eller beskadigede organer. Stilladser er nødvendige for at lette produktionen af tredimensionelle organer eller væv ved hjælp af differentierede stamceller in vivo. I denne rapport beskriver vi en ny metode til udvikling af vaskulære stilladser ved hjælp af decellulariserede rotte nyrer. Otte uger gamle Sprague-Dawley rotter blev brugt i denne undersøgelse, og heparin blev injiceret i hjertet for at lette strømmen ind i nyrefartøjerne, så heparin kunne gennemgå nyrefartøjerne. Bukhulen blev åbnet, og den venstre nyre blev indsamlet. De indsamlede nyrer blev perfunderet i 9 timer ved hjælp af rengøringsmidler, såsom Triton X-100 og natrium dodecyl sulfat, for at decellularisere vævet. Decellulariserede nyrestilladser blev derefter forsigtigt vasket med 1% penicillin / streptomycin og heparin for at fjerne cellulært affald og kemiske rester. Transplantation af stamceller med decellulariserede vaskulære stilladser forventes at lette produktionen af nye organer. Således kan de vaskulære stilladser give et fundament for vævsteknik af organtransplantationer i fremtiden.
Introduction
Cellekultur teknikker anvendes til regenerering af funktionelle væv og organer til at erstatte syge eller beskadigede organer. Allogen organtransplantation er i øjeblikket den mest almindelige behandling for uoprettelig organskade; denne fremgangsmåde kræver dog brug af immunosuppression for at forhindre afvisning af det transplanterede organ. På trods af fremskridt inden for transplantationsvaccination kan 20 % af transplantationsmodtagerne desuden opleve akut afvisning inden for 5 år, og inden for 10 år efter transplantationen kan 40 % af modtagerne miste deres transplanterede graft eller dø1.
Fremskridt inden for vævsteknikteknologier har givet efter i et nyt paradigme for transplantation af nye organer uden immunafstødning ved hjælp af differentierede stamceller. Efter stamcelledifferentiering er der brug for et stillads, kaldet en syntetisk ekstracellulær matrix, for at lette produktionen af tredimensionelle organer og gøre det muligt for det nye væv at trives i modtageren. Stilladser fra decellulariserede indfødte organer har fordele, herunder et mere effektivt miljø for etablering af celler og forbedring af stamcellespredning, selv om disse mekanismer ikke er fuldt belyst2. Især nyrerne er et egnet organ til stilladsgeneration, fordi det har rigelig cirkulation og en niche til stamcellevirksomhed. Derudover er det på grund af den komplekse struktur i nyrerne svært at kunstigt regenerere nyrer til organtransplantation.
I denne rapport introducerer vi en metode til udvikling af vaskulære stilladser ved hjælp af decellulariserede organer i en rottemodel for at lette fremtidige dyreforsøg til vævstekniske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af administrationen af Pusan National University of Medicine og blev udført i overensstemmelse med etiske retningslinjer for brug og pleje af dyr. (certifikat nr. 2017-119). Forud for dyreforsøg bør der indhentes institutionel godkendelse.
BEMÆRK: Alle kirurgiske instrumenter og bedøvelsesinstrumenter/-udstyr og reagenser, der anbefales til vellykket kirurgisk præsentation og billeddannelse af abdominalorganer, er beskrevet i tabel 1.
1. Forberedelsesprocedurer for høst af rotte nyrer
- Som forberedelse til operationen skal du placere 8 uger gamle Sprague-Dawley rotter (vejer 200-250 g) på en opvarmningspude. Placer en rektal termometersonde i endetarmen for at overvåge kernetemperaturen.
- Bedøve rotten med en 5% blanding af isoflurane gas (induktion: 5%, vedligeholdelse: 3%).
- For at starte operationen skal du placere rotten i en liggende stilling efter administration af anæstesi. Monter rottens fire lemmer på operationsbordet med tape.
- Barber og rengør donorrottens underliv med germicidal sæbe. Påfør 2% betadin i mindst 1-2 min, og tør med en 70% ethanolopløsning. Gentag denne sekvens tre gange.
- Dæk det operative felt med en steril fenestrated drapering.
- Lav en lodret abdominal snit og udsætte venstre nyre, ureter, abdominal aorta, og ringere vena cava.
- Visualiser og dissekere venstre nyre, ureter, abdominal aorta, og ringere vena cava lige før skære pedicle.
2. Transcardial perfusion
- Før operationen skal du forberede perfusionsopløsningen.
- Lav 50 ml perfusionsopløsning pr. rotte.
- Bland 1x PBS med ca. 10 U/mL heparin (1 25 kU hætteglas vil gøre 2,5 L PBS +Hep).
- Bland lige store mængder paraformaldehyd med 1x PBS for at fremstille 4% PFA/1xPBS-opløsningen.
BEMÆRK: 8% PFA fremstillet i vand kan opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder. 4 % PFA fortyndet i PBS er dog kun stabilt i 1 uge ved 4 °C. Gør fortyndingen frisk.
- Udvid det lodrette abdominale snit kranialt. Sørg for at trække saksen væk fra organerne, når du skærer for at undgå at beskadige de indre organer.
- Fortsæt snittet gennem brystkassen, og skær derefter gennem mellemgulvet ved at løfte brystbenet.
- Pin den løse flap af huden ud af vejen, og befri hjertet ved at rive enhver bindevæv med pincet.
ADVARSEL: Brug ikke saksen til at frigøre hjertet, og dette kan resultere i uønsket blødning. - Åbn fosfat-bufferlinjen (PBS) og sørg for, at linjen flyder, før du placerer nålen i venstre hjertekammer. Hold hjertet forsigtigt med stumpe pincet, og brug en hæmostat til at styre nålen. Nålen bør ikke indsættes mere end 1/4 tommer.
BEMÆRK: Indsættelse større end 1/4 tommer kan resultere i perforering til den anden side af vævet. - Mens du støtter hjertet med nålen og hæmostaten, skal du finde det rigtige atrium og klippe gennem det med iridektomi saks. Hvil hæmostaten på rottens krop, og sørg for, at nålen stadig er placeret inde i hjertet.
BEMÆRK: Hvis snittet er tilstrækkeligt, skal der være blod i kropshulen, da trykket fra PBS, der strømmer ind i rotten, lettes. - Forsigtigt frigøre de forreste fødder og hud flap.
- Fortsæt perfusing PBS i 4 min eller længere, hvis der stadig er blod synlig i nyrerne og leveren.
3. Høst og decellularisering af nyrer
- Høst venstre nyre med abdominal aorta og ringere vena cava.
- Ligate ureter, thoracic aorta, overlegen vena cava, og grene af abdominal aorta.
- Hold orgelet hydreret i Dulbeccos PBS (DPBS) i en 10 cm petriskål.
- Cannulate abdominal aorta og ringere vena cava med en 23 Gauge kateter. For at fjerne restblod skal du forbinde kanylen med en peristaltisk pumpe og vaske med DPBS (500 mL) og 16 U/mL heparin i 90 minutter med en hastighed på 5 omdrejninger ved 37 °C.
- For at decellularisere nyrerne skal du gennemgå nyrerne med 1% Triton X-100 (1 L) i 3 timer og derefter med 0,75% natrium dodecyl sulfat (SDS) opløsning (2 L) i 6 timer ved et konstant tryk på 40 mmHg.
BEMÆRK: Nyrerne bliver gennemsigtige efter 8 timer. - For at fjerne rest-SDS skal prøven gennemgås med 1% penicillin i destilleret vand (6 L) i 18 timer (natten over) og derefter med steril DPBS (500 mL) og 16 U/mL heparin i 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den grove morfologi af rotte nyrer var mørkerød (Figur 1A). Efter afcellularisering blev nyrerne blege og gennemskinnelige (Figur 1D). Resterende genomisk DNA blev vurderet med et kommercielt kit i henhold til producentens anvisninger, i decellulariserede nyrestilladser og sammenlignet med det i indfødte nyrer (kontrol). Kvantitativ analyse bekræftede, at vævsgenomisk DNA næsten blev elimineret efter afcellularisering. Fra 14 tilfælde var det gennemsnitlige DNA-indhold 115,05 ng/μL for kontrol og 1,96 ng/μL for det decellulerede stillads. I alt blev 98,3% af DNA fjernet (Figur 2), selv om den tredimensionelle struktur blev opretholdt, og acellulære gromeruli blev bevaret i kortikale parenchyma (Figur 3).
Figur 1: Rotte nyrer udsat for nyrearteriel perfusion decellularisering. (A)Umiddelbart efter afcellulariseringens start. (b)Efter Triton X-100 behandling. (c)Efter SDS buffer behandling. (D) Efter nattevask. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: DNA-koncentrationer i kontrol og decellulariserede rotte nyrer, der viser reduceret DNA-indhold efter decellularisering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hematoxylin og eosin farvning af kontrol og decellulariserede nyreprøver. (A) kontrolbark (A ') decellulariseret cortex (B) kontrol medulla ( B') decellulariseret medulla (C) kontrol vene (C ') decellulariseret vene. Skalalinje, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskellige protokoller er blevet brugt til decellularisering af organer og andet væv. Den optimale decellulariseringsprotokol skal bevare den tredimensionale arkitektur i den ekstracellulære matrix (ECM). Generelt består sådanne protokoller i at lyse cellemembranen ved fysisk behandling eller ioniske opløsninger, adskille cytoplasmaet og kernen fra ECM ved enzymatisk behandling eller rengøringsmidler og derefter fjerne celleaffald fra vævet3. Fysiske processer omfatter skrabning, opløsning agitation, trykgradienter, snap-frysning, nonthermal permanent elektroporation og superkritiske væsker2. Celler på den ydre overflade af et væv eller organ, såsom huden eller tyndtarmen, kan effektivt fjernes ved mekaniske processer kombineret med enzymer4. Ioniske eller nonioniske rengøringsmidler opløser DNA/proteininteraktioner, lipider og lipoproteiner, men kan beskadige ECM-strukturen5. Enzymer fjerner det dissociated cytoplasma og nukleare materiale, men efterlader disse materialer i ECM, som kan forårsage immunrespons6. De optimale midler til decellularisering bestemmes af vævstykkelse og -tæthed eller den kliniske anvendelse af det decellulariserede væv.
Til decellularisering brugte vi en kombination af nonioniske og ioniske rengøringsmidler: Triton X-100 og SDS. Triton X-100, som et nonionisk vaskemiddel, forstyrrer effektivt lipid / lipid og lipid / protein interaktioner. Triton X-100 kan dog også ødelægge ECM ultrastruktur på grund af tab af glycosaminoglycan (GAG), laminin og fibronectinindhold. SDS, som et ionisk vaskemiddel, fjerner effektivt nukleare rester og cytoplasmiske proteiner, men forstyrrer også ECM-ultrastruktur ved tab af GAG og kollagen3. Selv om disse stoffer ødelægge mikrostruktur af ECM, SDS og Triton X-100 held fjerne alle DNA-indhold7,8. Dette er vigtigt, fordi resterende DNA-indhold i et stillads kan forårsage immunafvisning. I væv, der er blevet korrekt decellulariseret, skal DNA-indholdet være mindre end 50 ng/mg9,10.
I metoden var trykket af decellulariseringstransfusionen 40 mmHg. Trykkontrol er påkrævet for decellularisering perfusion. Det optimale perfusionstryk varierer fra organ til organ, og 60 mmHg er det optimale tryk for menneske- og svine nyre- eller hjertedecellularisering11. Hos rotter anses 40 mmHg for tilstrækkelig til decellularisering perfusion12.
En lovende behandling for udskiftning af allografttransplantation er transplantation af stamceller ved hjælp af et vaskulært stillads. Vi håber, at denne protokol for organdecellularisering kan danne grundlag for fremtidige vævstekniske undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af en Biomedical Research Institute Grant fra Pusan National University Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
