Summary
Detta protokoll introducerar en metod för att utveckla en byggnadsställning med hjälp av decellulära råtta njurar. Protokollet omfattar avcellulerings- och omcelluleringsprocesser för att bekräfta biotillgängligheten. Avcellularisering utförs med triton X-100 och natrium dodecylsulfat.
Abstract
Vävnadsteknik är en spjutspetsdisciplin inom biomedicin. Cellkulturtekniker kan tillämpas för regenerering av funktionella vävnader och organ för att ersätta sjuka eller skadade organ. Byggnadsställningar behövs för att underlätta genereringen av tredimensionella organ eller vävnader med hjälp av differentierade stamceller in vivo. I denna rapport beskriver vi en ny metod för att utveckla vascularized byggnadsställningar med hjälp av decellularized råtta njurar. Åtta veckor gamla Sprague-Dawley råttor användes i denna studie, och heparin injicerades i hjärtat för att underlätta flödet i njurkärlen, så att heparin kan läsa in i njurkärlen. Bukhålan öppnades, och den vänstra njuren samlades in. De insamlade njurarna perfused för 9 h med hjälp av tvättmedel, såsom Triton X-100 och natrium dodecyl sulfat, att avcellularisera vävnaden. Decellulariserade njurställningar tvättades sedan försiktigt med 1% penicillin/streptomycin och heparin för att ta bort cellulära skräp och kemiska rester. Transplantation av stamceller med decellulerade kärlställningar förväntas underlätta genereringen av nya organ. Således kan de vascularized byggnadsställningarna ge en grund för vävnadsteknik av organtransplantat i framtiden.
Introduction
Cellkulturtekniker tillämpas för regenerering av funktionella vävnader och organ för att ersätta sjuka eller skadade organ. Allergiframkallande organtransplantation är för närvarande den vanligaste behandlingen för irreversibel organskada. Detta tillvägagångssätt kräver dock användning av immunsuppression för att förhindra avstötning av det transplanterade organet. Dessutom, trots framsteg inom transplantationsimmunologi, 20% av transplantation mottagare kan uppleva akut avstötning inom 5 år, och inom 10 år efter transplantation, 40% av mottagarna kan förlora sin transplanterade transplantat eller dö1.
Framsteg inom vävnadsteknik har gett vika i ett nytt paradigm för transplantation av nya organ utan immunavstötning med hjälp av differentierade stamceller. Efter stamcellsdiversitet behövs en byggnadsställning, kallad en syntetisk extracellulär matris, för att underlätta genereringen av tredimensionella organ och göra det möjligt för den nya vävnaden att trivas inom mottagaren. Byggnadsställningar från decellulära inhemska organ har fördelar, inklusive en effektivare miljö för etablering av celler och förbättring av stamcellsproliferation, även om dessa mekanismer inte har blivit helt klarlagda2. I synnerhet är njuren ett lämpligt organ för byggnadsställningsgenerering eftersom den har riklig cirkulation och en nisch för stamcellsinrättning. Dessutom, på grund av njurens komplexa struktur, är det svårt att artificiellt regenerera njurar för organtransplantation.
I denna rapport introducerar vi en metod för att utveckla vascularized byggnadsställningar med hjälp av decellulariserade organ i en råtta modell för att underlätta framtida djurstudier för vävnadstekniska ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av administrering av Pusan National University of Medicine och genomfördes i enlighet med etiska riktlinjer för användning och vård av djur. (intyg nr 2017-119). Före djurstudier bör institutionellt godkännande erhållas.
OBS: Alla kirurgiska och bedövningsmedel/utrustning och reagenser som rekommenderas för framgångsrik kirurgisk presentation och avbildning av bukorganen beskrivs i tabell 1.
1. Förberedelseförfaranden för skörd av råtta njurar
- Inför operationen placerar du 8 veckor gamla Sprague-Dawley råttor (väger 200-250 g) på en värmande kudde. Placera en rektal termometersond i ändtarmen för att övervaka kärntemperaturen.
- Söv råttan med en 5% blandning av isoflurangas (induktion: 5%, underhåll: 3%).
- För att starta operationen, placera råttan i ett supin läge efter administrering av anestesi. Montera råttans fyra lemmar på operationsbordet med tejp.
- Raka och rengör donatorråttans buk med bakteriedrisk tvål. Applicera 2% betadin i minst 1-2 min och torka med en 70% etanollösning. Upprepa den här sekvensen tre gånger.
- Täck det operativa fältet med ett sterilt fenestrated draperi.
- Gör ett vertikalt buksnitt och exponera vänster njure, urinrör, bukaormi och sämre vena cava.
- Visualisera och dissekera den vänstra njuren, urinröret, buken storast och sämre vena cava strax innan du skär pedicle.
2. Transkardiell perfusion
- Före operationen, förbered perfusionslösningen.
- Gör 50 ml perfusionslösning per råtta.
- Blanda 1x PBS med ca 10 U/ml heparin (1 25 kU injektionsflaska kommer att göra 2,5 L PBS+Hep).
- Blanda lika stora volymer av 8% paraformaldehyd med 1x PBS för att göra 4% PFA/1xPBS-lösningen.
OBS: 8% PFA tillverkad i vatten kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 månader. 4% PFA utspädd i PBS är dock endast stabil i 1 vecka vid 4 °C. Gör utspädningen fräsch.
- Förläng det vertikala buksnittet kranialt. Var noga med att dra saxen bort från organen när du skär för att undvika att skada de inre organen.
- Fortsätt snittet genom revbenskorgen och skär sedan genom membranet genom att lyfta bröstbenet.
- Fäst den lösa hudluckan ur vägen och befria hjärtat genom att riva någon bindväv med tången.
VARNING: Använd inte saxen för att frigöra hjärtat och detta kan leda till oönskad blödning. - Öppna den fosfatbuffrade saltlösningslinjen (PBS) och se till att linjen flyter innan nålen placeras i den vänstra ventrikeln. Håll hjärtat försiktigt med trubbiga tång och använd en hemostat för att kontrollera nålen. Nålen ska inte sättas in mer än 1/4 tum.
OBS: Införing större än 1/4 tum kan resultera i perforering på andra sidan vävnaden. - Medan du stöder hjärtat med nålen och hemostaten, hitta rätt atrium och snip genom det med iridectomy sax. Vila hemostaten på råttans kropp och se till att nålen fortfarande är placerad inuti hjärtat.
OBS: Om snittet är tillräckligt ska det finnas blod i kroppshålan när trycket från PBS som strömmar in i råttan lättas. - Ta försiktigt bort framfötterna och hudluckan.
- Fortsätt att genomsyra PBS i 4 minuter eller längre om det fortfarande finns blod synligt i njure och lever.
3. Njurskörd och avcellulering
- Skörda den vänstra njuren med bukaortan och sämre vena cava.
- Ligate urinrör, bröst aorta, överlägsen vena cava och grenar av buken stora kroppspulsådern.
- Förvara organet hydratiserat i Dulbeccos PBS (DPBS) i en 10 cm Petri-skål.
- Kannulera buken aorta och sämre vena cava med en 23 Gauge kateter. För att avlägsna kvarvarande blod, anslut kanylen med en peristaltisk pump och tvätta med DPBS (500 ml) och 16 U/ml heparin i 90 min med en hastighet av 5 varv/min vid 37 °C.
- För att avcellularisera njuren, granska njuren med 1% Triton X-100 (1 L) i 3 h och sedan med 0,75% natriumddecylsulfatlösning (SDS) (2 L) i 6 h vid ett konstant tryck på 40 mmHg.
OBS: Njuren blir genomskinlig efter 8 timmar. - För att avlägsna kvarvarande SDS, granska provet med 1% penicillin i destillerat vatten (6 L) i 18 timmar (över natten) och sedan med steril DPBS (500 mL) och 16 U/mL heparin i 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rått njurarnas grova morfologi var mörkröd (Figur 1A). Efter decellulariseringen blev njuren blek och genomskinlig (Figur 1D). Restgenomiskt DNA bedömdes med ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner, i decellulära njurställningar och jämfört med det i inhemska njurar (kontroll). Kvantitativ analys bekräftade att vävnad genomisk DNA nästan eliminerades efter decellularisering. Från 14 fall var det genomsnittliga DNA-innehållet 115,05 ng/μL för kontrollen och 1,96 ng/μL för den decellulerade ställningen. Totalt avlägsnades 98,3% av DNA (figur 2), även om den tredimensionella strukturen bibehölls, och acellulära gromeruli bevarades i när parenkym (Figur 3).
Figur 1: Råttor njurar utsätts för njurmedicinska kranskärlens perfusion decellularization. A)Omedelbart efter avcelluleringens början. b)Efter Triton X-100 behandling. C)Efter SDS-buffertbehandling. (D)Efter natttvätt av byggnadsställningar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: DNA-koncentrationer i kontroll och avcellulerade råtta njurar, visar minskat DNA-innehåll efter decellularisering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Hematoxylin och eosinfärgning av kontroll och decellulära njurprover. a)kontrollbarken(A') decellulär cortex(B)kontroll medulla (B ') decelluläriserad medulla (C) kontrollven (C ') decellulär vein. Skalbar, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika protokoll har använts för avcellularisering av organ och andra vävnader. Det optimala avcelluleringsprotokollet bör bevara den tredimensionella arkitekturen hos den extracellulära matrisen (ECM). I allmänhet består sådana protokoll av att lysa cellmembranet genom fysisk bearbetning eller joniska lösningar, ta bort cytoplasman och kärnan från ECM genom enzymatisk bearbetning eller tvättmedel och sedan ta bort cellulärt skräp frånvävnaden 3. Fysiska processer inkluderar skrapning, lösningsröritation, tryckgradienter, snäppfrysning, icke-mal permanent elektroporering och superkritiskavätskor 2. Celler på den yttre ytan av en vävnad eller ett organ, såsom huden eller tunntarmen, kan effektivt avlägsnas genom mekaniska processer i kombination medenzymer 4. Joniska eller icke-joniska rengöringsmedel löser upp DNA/proteininteraktioner, lipider och lipoproteiner, men kan skada ECM-strukturen5. Enzymer tar bort den dissocierade cytoplasman och kärnämnet, men lämnar dessa material i ECM, vilket kan orsaka ett immunsvar6. De optimala medlen för avcellularisering bestäms av vävnadens tjocklek och densitet eller den kliniska användningen av den decellulära vävnaden.
För decellularisering använde vi en kombination av icke-joniska och joniska tvättmedel: Triton X-100 och SDS. Triton X-100, som ett icke-joniskt rengöringsmedel, stör effektivt lipid/lipid och lipid/proteininteraktioner. Triton X-100 kan dock också förstöra ECM ultrastruktur på grund av förlust av glykosaminoglykan (GAG), laminin och fibronectin innehåll. SDS, som ett joniskt tvättmedel, tar effektivt bort nukleära rester och cytoplasmaproteiner, men stör också ECM ultrastrukturen genom förlust av GAG och kollagen3. Även om dessa medel förstör mikrostrukturen hos ECM, SDS och Triton X-100 framgångsrikt ta bort alltDNA-innehåll 7,8. Detta är viktigt eftersom återstående DNA-innehåll i en byggnadsställning kan orsaka immunavstötning. I vävnad som har decellulerats ordentligt bör DNA-halten vara mindre än 50 ng/mg9,10.
I metoden var trycket på decellularization perfusion 40 mmHg. Tryckkontroll krävs för avcellularisering perfusion. Det optimala perfusionstrycket varierar från organ till organ, och 60 mmHg är det optimala trycket för mänsklig och svin njure eller hjärtdecellulering11. Hos råttor anses 40 mmHg vara tillräckligt för decellularisering perfusion12.
En lovande behandling för att ersätta allograft transplantation är transplantation av stamceller med hjälp av en vascularized byggnadsställning. Vi hoppas att detta protokoll för organdecellulering kan utgöra en grund för framtida vävnadstekniska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av ett biomedicinskt forskningsinstituts anslag från Pusan National University Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
