Summary
Bu protokol, hücreden sönmemiş sıçan böbrekleri kullanarak bir iskele geliştirmek için bir yöntem sunar. Protokol, biyoyararlanıcılığı doğrulamak için hücreden arındırma ve yeniden hücreleştirme süreçlerini içerir. Desellülerizasyon Triton X-100 ve sodyum dodecyl sülfat kullanılarak gerçekleştirilir.
Abstract
Doku mühendisliği biyotıpta son teknoloji bir disiplindir. Hastalıklı veya hasarlı organların yerine fonksiyonel doku ve organların yenilenmesi için hücre kültürü teknikleri uygulanabilir. Vivo olarak farklılaştırılmış kök hücreler kullanılarak üç boyutlu organ veya dokuların üretilmesini kolaylaştırmak için iskelelere ihtiyaç vardır. Bu raporda, hücreden sönmemiş sıçan böbrekleri kullanarak damarlı iskeleler geliştirmek için yeni bir yöntem anlatıyoruz. Bu çalışmada sekiz haftalık Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı ve heparin böbrek damarlarına akışı kolaylaştırmak için kalbe enjekte edildi ve heparinin böbrek damarlarına nüfuz etmesini sağladı. Karın boşluğu açıldı ve sol böbrek toplandı. Toplanan böbrekler, dokuyu hücreden çıkarmak için Triton X-100 ve sodyum dodecyl sülfat gibi deterjanlar kullanılarak 9 saat boyunca perfüzyona uğradı. Hücreden çıkarıcı böbrek iskeleleri daha sonra hücresel kalıntıları ve kimyasal kalıntıları gidermek için% 1 penisilin / streptomisinin ve heparin ile nazikçe yıkandı. Kök hücrelerin hücre dışılaştırılmış damar iskeleleri ile naklinin yeni organların üretilmesini kolaylaştırması beklanmaktadır. Böylece, damarlı iskeleler gelecekte organ greftlerinin doku mühendisliği için bir temel sağlayabilir.
Introduction
Hücre kültürü teknikleri, hastalıklı veya hasarlı organların yerini alacak fonksiyonel doku ve organların yenilenmesi için uygulanır. Allojenik organ nakli şu anda geri dönüşü olmayan organ hasarının en yaygın tedavisidir; ancak bu yaklaşım, nakledilen organın reddedilmesini önlemek için immünosupresyon kullanılmasını gerektirir. Ayrıca, transplant immünolojislerindeki gelişmelere rağmen, nakil alıcılarının% 20'si 5 yıl içinde akut ret yaşayabilir ve transplantasyondan sonraki 10 yıl içinde, alıcıların% 40'ı nakledilen greftini kaybedebilir veya1ölebilir.
Doku mühendisliği teknolojilerindeki gelişmeler, farklılaştırılmış kök hücreler kullanılarak bağışıklık reddi olmadan yeni organların nakli için yeni bir paradigma ortaya koymuştur. Kök hücre farklılaşmasından sonra, üç boyutlu organların üretilmesini kolaylaştırmak ve yeni dokunun alıcı içinde gelişmesini sağlamak için sentetik hücre dışı matris adı verilen bir iskeleye ihtiyaç vardır. Hücre dışılaştırılmış yerli organlardan gelen iskeleler, hücrelerin kurulması ve kök hücre çoğalmasının artırılması için daha etkili bir ortam da dahil olmak üzere avantajlara sahiptir, ancak bu mekanizmalar tam olarak aydınlatılmamıştır2. Özellikle böbrek, bol dolaşıma ve kök hücre kuruluşu için bir nişe sahip olduğu için iskele üretimi için uygun bir organdır. Ek olarak, böbreğin karmaşık yapısı nedeniyle, organ nakli için böbrekleri yapay olarak yenilemek zordur.
Bu raporda, doku mühendisliği amacıyla gelecekteki hayvan çalışmalarını kolaylaştırmak için bir sıçan modelinde hücreden sönmemiş organlar kullanarak damarlı iskeleler geliştirme yöntemini tanıtıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Pusan Ulusal Tıp Üniversitesi yönetimi tarafından onaylanmış ve hayvanların kullanımı ve bakımı için etik kurallara uygun olarak yapılmıştır. (sertifika no. 2017-119). Herhangi bir hayvan çalışması öncesinde kurumsal onay alınmalıdır.
NOT: Karın organlarının başarılı cerrahi sunumu ve görüntülenmesi için önerilen tüm cerrahi ve anestezik aletler/ekipmanlar ve reaktifler Tablo 1'deayrıntılı olarak açıklanmıştır.
1. Sıçan böbreklerinin toplanması için hazırlık prosedürleri
- Ameliyata hazırlanırken, 8 haftalık Sprague-Dawley sıçanlarını (200-250 g ağırlığında) bir ısınma yastığına yerleştirin. Çekirdek sıcaklığını izlemek için rektum içine bir rektal termometre probu yerleştirin.
- Sıçanı% 5 izofluran gazı karışımı ile uyuşturun (indüksiyon: % 5, bakım: % 3).
- Operasyona başlamak için, anestezinin verilmesinden sonra sıçanı bir supine pozisyonuna yerleştirin. Sıçanın dört uzuvlarını bantla ameliyat masasına monte edin.
- Donör sıçanın karnını mikrop öldürücü sabunla tıraş edin ve temizleyin. En az 1-2 dakika boyunca% 2 betadin uygulayın ve% 70 etanol çözeltisi ile silin. Bu sırayı üç kez tekrarlayın.
- Ameliyat alanını steril bir fenestratlı örtü ile örtün.
- Dikey bir karın kesiği yapın ve sol böbreği, üretteri, abdominal aortu ve alt vena kavayı ortaya çıkarın.
- Pedileyi kesmeden hemen önce sol böbreği, üretteri, abdominal aortu ve alt vena kavayı görselleştirin ve parçalara ayırın.
2. Transkardiyal perfüzyon
- Ameliyattan önce perfüzyon çözeltisini hazırlayın.
- Sıçan başına 50 mL perfüzyon çözeltisi yapın.
- 1x PBS'i yaklaşık 10 U/mL heparin ile karıştırın (1 25 kU şişe 2,5 L PBS +Hep yapacaktır).
- %4 PFA/1xPBS çözümünü yapmak için 1x PBS ile %8'lik eşit hacimlerde paraformaldehit karıştırın.
NOT: Suda yapılan %8 PFA 2 aya kadar 4 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, PBS'de seyreltilmiş% 4 PFA sadece 4 ° C'de 1 hafta boyunca stabildir. Seyreltme taze olsun.
- Dikey karın kesisini kranially olarak uzatın. İç organlara zarar vermemek için keserken makası organlardan çektiğinizden emin olun.
- Kesiği göğüs kafesinden devam ettirin ve ardından sternumu kaldırarak diyaframı kesin.
- Derinin gevşek kapağını yoldan çekin ve herhangi bir bağ dokusunups ile yırtarak kalbi serbest bırakın.
DİkKAT: Kalbi serbest bırakmamak için makası kullanmayın ve bu istenmeyen kanamalara neden olabilir. - Fosfat tamponlu salin (PBS) hattını açın ve iğneyi sol ventriküle yerleştirmeden önce hattın aktığından emin olun. Kalbi künt tokmaklarla hafifçe tutun ve iğneyi kontrol etmek için bir hemostat kullanın. İğne en fazla 1/4 inç sokulmalıdır.
NOT: 1/4 inçten büyük ekleme, dokunun diğer tarafına delik açabilir. - İğne ve hemostat ile kalbi desteklerken, sağ kulakçığı bulun ve iridektomi makası ile içinden kesin. Hemostat farenin vücuduna yaslanın ve iğnenin hala kalbin içine yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
NOT: Kesik yeterliyse, PBS'den sıçana akan basınç hafiflemiş olduğu için vücut boşluğunda kan olmalıdır. - Ön ayakları ve cilt kapağını dikkatlice sabitle.
- Böbrek ve karaciğerde hala kan görünüyorsa PBS'ye 4 dakika veya daha uzun süre perfüzyona devam edin.
3. Böbrek hasadı ve hücreden arındırma
- Sol böbreği abdominal aort ve inferior vena kava ile hasat edin.
- Üretter, torasik aort, üstün vena kava ve abdominal aortu dallarını ligat.
- Dulbecco'nun PBS'sinde (DPBS) 10 cm'lik petri kabında organı nemli tutun.
- Abdominal aort ve inferior vena kavayı 23 Gauge kateter ile yalıtın. Artık kanı çıkarmak için kanülleri peristaltik bir pompaya bağlayın ve DPBS (500 mL) ve 16 U/mL heparin ile 37 °C'de 5 rpm hızında 90 dakika yıkayın.
- Böbreği desellülerize etmek için, böbreği 3 saat boyunca% 1 Triton X-100 (1 L) ve daha sonra 40 mmHg sabit basınçta 6 saat boyunca% 0.75 sodyum dodecyl sülfat (SDS) çözeltisi (2 L) ile perfuse edin.
NOT: Böbrek 8 saat sonra şeffaf hale gelecektir. - Artık SDS'yi çıkarmak için, numuneyi damıtılmış suda (6 L) %1 penisilin ile 18 saat (geceleme) ve ardından steril DPBS (500 mL) ve 16 U/mL heparin ile 90 dakika boyunca perfuse edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sıçan böbreklerinin brüt morfolojisi koyu kırmızıydı (Şekil 1A). Hücreden arındırma sonrası böbrek soluk ve yarı saydam hale geldi(Şekil 1D). Kalıntı genomik DNA, üreticinin talimatlarına göre, hücreden sönmemiş böbrek iskelelerinde ve yerli böbreklerdeki (kontrol) ile karşılaştırıldığında ticari bir kit ile değerlendirildi. Kantitatif analiz, doku genomik DNA'sının hücreden arındırıldıktan sonra neredeyse ortadan kaldırıldığını doğruladı. 14 olgudan ortalama DNA içeriği kontrol için 115.05 ng/μL ve desellülerize iskele için 1.96 ng/μL olarak belirlendi. Toplamda DNA'nın %98,3'ü çıkarılmıştır (Şekil 2), üç boyutlu yapı korunmuş olmasına rağmen kortikal tozşimde hücresel gromeruli korunmuştur (Şekil 3).
Şekil 1: Böbrek arteriyel perfüzyon desellülarizasyonuna maruz kalan sıçan böbrekleri. (A) Decellularizasyonun başlamasından hemen sonra. (B) Triton X-100 tedavisinden sonra. (C) SDS tampon tedavisinden sonra. (D) Gece iskele yıkamadan sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kontroldeki DNA konsantrasyonları ve hücreden arındırılmış sıçan böbrekleri, hücreden arındırma sonrası DNA içeriğinin azaldığını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kontrol ve hücre dışı böbrek örneklerinin hematoksilin ve eozin lekesi. (A) kontrol korteksi (A') desellülerize korteks (B) kontrol medulla (B ') hücre dışı medulla (C) kontrol damarı (C') hücre dışı damar. Ölçek çubuğu, 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organların ve diğer dokuların hücreden arındırılması için çeşitli protokoller kullanılmıştır. En uygun hücre dışılaştırma protokolü, hücre dışı matrisin (ECM) üç boyutlu mimarisini korumalıdır. Genel olarak, bu tür protokoller hücre zarının fiziksel işleme veya iyonik çözeltilerle lizin edilmesi, sitoplazma ve çekirdeğin enzimatik işleme veya deterjanlarla ECM'den ayrıştırması ve daha sonra hücresel kalıntıların dokudan çıkarılmasından oluşur3. Fiziksel süreçler arasında kazıma, çözelti ajitasyonu, basınç gradyanları, çıtçıt dondurma, nontermal kalıcı elektroporasyon ve süper kritik sıvılar2bulunur. Cilt veya ince bağırsak gibi bir doku veya organın dış yüzeyindeki hücreler, enzimlerle birlikte mekanik süreçlerle verimli bir şekilde çıkarılabilir4. İyonik veya noyonik deterjanlar DNA/protein etkileşimlerini, lipitleri ve lipoproteinleri çözür, ancak ECM yapısına zarar verebilir5. Enzimler ayrışmış sitoplazma ve nükleer maddeyi çıkarır, ancak bu malzemeleri ECM'de bırakır, bu da bağışıklık tepkisine neden olabilir6. Desellülerizasyon için en uygun ajanlar doku kalınlığı ve yoğunluğu veya desellülerize dokunun klinik kullanımı ile belirlenir.
Hücreden arındırma için, noniyonik ve iyonik deterjanların bir kombinasyonunu kullandık: Triton X-100 ve SDS. Triton X-100, noniyonik bir deterjan olarak lipid/lipid ve lipid/protein etkileşimlerini etkili bir şekilde bozar. Bununla birlikte, Triton X-100, glikozaminogllikan (GAG), laminin ve fibronektin içeriği kaybı nedeniyle ECM ultrayapısını da yok edebilir. SDS, iyonik bir deterjan olarak, nükleer kalıntıları ve sitoplazmik proteinleri etkili bir şekilde temizler, aynı zamanda GAG ve kollajen kaybı ile ECM ultrayapısını bozar3. Bu ajanlar ECM'nin mikro yapısını tahrip etse de, SDS ve Triton X-100 tüm DNA içeriğini başarıyla çıkarır7,8. Bu önemlidir, çünkü bir iskelede kalan DNA içeriği bağışıklık reddine neden olabilir. Düzgün bir şekilde desellülerize edilmiş dokuda, DNA içeriği 50 ng / mg9,10'dan az olmalıdır.
Yöntemde, desellülerizasyon perfüzyonunun basıncı 40 mmHg idi. Desellülerizasyon perfüzyonu için basınç kontrolü gereklidir. Optimal perfüzyon basıncı organdan organa değişir ve 60 mmHg insan ve porcine böbrek veya kalp desellülerizasyonu için en uygun basınçtır11. Sıçanlarda, 40 mmHg hücreselleştirme perfüzyonu için yeterli kabul edilir12.
Allograft naklinin değiştirilmesi için umut verici bir tedavi, damarlı bir iskele kullanılarak kök hücrelerin naklidir. Organ desellülerizasyonu için bu protokolün gelecekteki doku mühendisliği çalışmaları için bir temel sağlayabileceğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Pusan Ulusal Üniversite Hastanesi'nden Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Hibesi ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
