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Biochemistry

प्रोटीन के उच्च क्रम संरचनात्मक विश्लेषण करने के लिए लेजर-मुक्त हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61861
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

Summary

यह प्रोटोकॉल फ्लैश ऑक्सीकरण प्रोटीन पदचिह्निंग करने के लिए इनलाइन कट्टरपंथी डोसिमेट्री और प्लाज्मा प्रकाश स्रोत का उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह विधि प्रोटीन अध्ययन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण की प्रजनन क्षमता को सरल और बेहतर बनाने के लिए खतरनाक यूवी लेजर की जगह ले।

Abstract

हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) एक उभरती हुई और आशाजनक उच्च क्रम संरचनात्मक विश्लेषण तकनीक है जो प्रोटीन संरचना, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, या प्रोटीन-लिगांड इंटरैक्शन में परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान करती है। एचआरपीएफ हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स(▪ओह) का उपयोग करता है ताकि प्रोटीन की विलायक सुलभ सतह को अपरिवर्तनीय रूप से लेबल किया जा सके। एचआरपीएफ प्रदर्शन की अंतर्निहित जटिलता, लागत और खतरनाक प्रकृति ने बायोफार्मा में व्यापक आधारित गोद लेने को काफी हद तक सीमित कर दिया है। इन कारकों में शामिल हैं: 1) जटिल, खतरनाक और महंगे लेजर का उपयोग जो पर्याप्त सुरक्षा सावधानियों की मांग करते हैं; और 2) एचआरपीएफ की अपरिवर्तनीयता ▪ओह की पृष्ठभूमि मैला ढोने के कारण है कि तुलनात्मक अध्ययन सीमा । यह प्रकाशन लेजर-मुक्त एचआरपीएफ सिस्टम के संचालन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यह लेजर-मुक्त एचआरपीएफ सिस्टम इन-लाइन रेडिकल डोसिमेट्री के साथ उच्च ऊर्जा, उच्च दबाव प्लाज्मा प्रकाश स्रोत फ्लैश ऑक्सीकरण तकनीक का उपयोग करता है। प्लाज्मा प्रकाश स्रोत सुरक्षित है, उपयोग करने में आसान है, और लेजर आधारित एचआरपीएफ सिस्टम की तुलना में हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स पैदा करने में अधिक कुशल है, और इन-लाइन कट्टरपंथी डोसिमेटर अध्ययन की पुनरुत्पादन क्षमता को बढ़ाता है। संयुक्त, लेजर मुक्त HRPF प्रणाली पते और उल्लेख कमियों और लेजर आधारित तकनीकों की सीमाओं surmounts ।

Introduction

प्रोटीन संरचना और संबद्ध उच्च क्रम संरचना (एचओएस) उचित जैविक कार्य और गुमराह व्यवहार1के प्रमुख निर्धारक हैं। यही बात बायोफार्मास्युटिकल्स पर भी लागू होती है, जिनकी संरचना और कार्यात्मक गतिविधि उनके उत्पादन और पर्यावरण के विभिन्न पहलुओं पर निर्भर करती है। एचओएएस में बायोफार्मा परिवर्तन को प्रतिकूल दवा प्रतिक्रियाओं (एडीआर) से जोड़ा गया है जो अवांछनीय फार्माकोलॉजी और रोगी इम्यूनोलॉजिकल प्रतिक्रिया2,3के लिए जिम्मेदार है। एडीआर की उपस्थिति ने बायोफार्मा उद्योग को जैव चिकित्सा की सुरक्षा और प्रभावकारिता में प्रोटीन एचओएस की महत्वपूर्ण भूमिका के लिए सतर्क कर दिया है, और उन्होंने नए और बेहतर एचओएस एनालिटिक्स 4 की आवश्यकतास्थापितकी है।

हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) प्रोटीन एचओएएस में बदलाव को ट्रैक करने के लिए एक आशाजनक तकनीक है। एचआरपीएफ में प्रोटीन के बाहरी हिस्से की अपरिवर्तनीय लेबलिंग शामिल है जिसमें ▪ओह के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण के साथप्रोटीन5,6, 7की सॉल्वेंट सुलभ सतह की पहचान करने के लिए पीछा कियाजाताहै । एचआरपीएफ का सफलतापूर्वक उपयोग प्रोटीन एचओएस और इसके कार्य 8,9में दोषों का पता लगाने के लिए किया गया है , जिसमें मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) 10 ,11,12,13के होस की विशेषता है, जो लिगांड 14 के बाध्यकारी केडी और15,16,17,18,19से अधिक का निर्धारण करता है । एचआरपीएफ के लिए ओह ▪उत्पन्न करने के लिए एक आम तरीका फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण ऑफ प्रोटीन (एफओपी) है, जो एच 2ओ2के फोटोलिसिस से ▪ओह का उत्पादन करने के लिए उच्च ऊर्जा, तेज यूवी लेजर को रोजगार देता है। अधिकांश भाग के लिए, FPOP खतरनाक गैस (KrF) को नियोजित करने वाले महंगे एक्सिमर लेजर का उपयोग करता है जो श्वसन और आंख की चोट20से बचने के लिए पर्याप्त सुरक्षा उपायों की मांग करता है। साँस लेने के खतरों से बचने के लिए, दूसरों आवृत्ति चार गुना नियोडिमियम yttrium एल्यूमीनियम गार्नेट (Nd: YAG) लेजर21,जो विषाक्त गैस के उपयोग को समाप्त करता है, लेकिन अभी भी महंगा कर रहे हैं, महत्वपूर्ण परिचालन विशेषज्ञता की आवश्यकता है, और व्यापक आवारा प्रकाश नियंत्रण की मांग करने के लिए आंख की चोट से उपयोगकर्ताओं की रक्षा का इस्तेमाल किया है ।

हालांकि एचआरपीएफ का उपयोग करके पर्याप्त जानकारी प्राप्त की जा सकती है, लेकिन बायोफार्मा में व्यापक दत्तक ग्रहण पूरा नहीं किया गया है। सीमित एचआरपीएफ अपनाने के लिए दो बाधाओं में शामिल हैं: 1) खतरनाक और महंगे लेजर का उपयोग जो पर्याप्त सुरक्षा सावधानियों की मांग करते हैं20; और 2) एचआरपीएफ की अपरिवर्तनीयता ▪ओह की पृष्ठभूमि मैला ढोने के कारण है कि सीमा तुलनात्मक अध्ययन22. लेजर उपयोग को हटाना, एक उच्च गति, उच्च ऊर्जा प्लाज्मा फ्लैश फोटोलिसिस इकाई को सुरक्षित रूप से फेसियल तरीके से एफओपीओपी करने के लिए विकसित किया गया था। एचआरपीएफ प्रयोगों की अपरिवर्तनीयता में सुधार करने के लिए, वास्तविक समय कट्टरपंथी दोसिमेत्री को लागू किया जाता है।

एचआरपीएफ का अभ्यास ओएच22 ▪की पृष्ठभूमि में मैला ढोने के लिए जिम्मेदार अप्रतिदक्षिणता से सीमित रहा है । जबकि ▪ओह प्रोटीन स्थलाकृति के उत्कृष्ट जांच कर रहे हैं, वे भी कई तैयारी में पाया घटकों के साथ प्रतिक्रिया, यह आवश्यक एक लक्ष्य प्रोटीन ऑक्सीकरण के लिए उपलब्ध कट्टरपंथी की प्रभावी एकाग्रता को मापने के लिए कर रही है । बफर तैयारी, हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता, लिगांड गुण, या फोटोलिसिस में भिन्नता के परिणामस्वरूप नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों के बीच ऑक्सीकरण मतभेद हो सकते हैं जो एचओएस अंतर अध्ययनों में अस्पष्टता पैदा करते हैं। वास्तविक समय कट्टरपंथी डोसिमेट्री के अलावा ओह लोड ▪ प्रभाव के समायोजन में सक्षम बनाता हैऔर इसलिए एक HRPF प्रयोग के दौरान आत्मविश्वास और प्रजनन क्षमता बढ़ जाती है । एफओपी में कट्टरपंथी दोसिमेट्री के उपयोग का वर्णन23 , 24,25अन्य जगहों पर किया गया है और हाल ही में26के एक प्रकाशन में इस पर विस्तार से चर्चा की गई है । यहां, हम एक उपन्यास फ्लैश फोटोलिसिस सिस्टम और रीयल-टाइम डोसिमेट्री के उपयोग का वर्णन करते हैं ताकि घोड़े-मायोग्लोबिन (एंब) को लेबल किया जा सके, एक एक्सीमर लेजर का उपयोग करते समय प्राप्त एफओपी प्रयोग में पेप्टाइड ऑक्सीकरण के स्तर की तुलना करें।

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Protocol

1. केशिका ट्यूब स्थापित करना

  1. सिलिका क्लीविंग स्टोन का उपयोग करके, 250 माइक्रोन इनर व्यास (आईडी) सिलिका केशिका को 27 इंच तक क्लीव करें। एक साफ, सीधे कटौती के लिए केशिका सिरों की जांच करें।
  2. पॉलीमाइड कोटिंग को जलाकर लंबाई में लगभग 15 मिमी दो खिड़कियां बनाएं। "निचले अंत" से शुरू पहली फोटोलिसिस खिड़की 90 मिमी दूर "निचले अंत" और दूसरी डॉसिमीटर खिड़की 225 मिमी "निचले अंत" से दूर बनाते हैं।
    नोट: एक बार कोटिंग दूर जला दिया है केशिका बहुत नाजुक है ।
  3. बंदरगाह 5 पर अखरोट और फेरू को अनस्क्रू करें और फेरूल(चित्रा 1A)के शंकुआतक से परे केशिका के "निचले छोर" डालें।
  4. फोटोलिसिस मॉड्यूल पर, फोटोलिसिस सेल कैप को सीधे बाहर खींचकर हटा दें और फिर चुंबकीय रूप से घुड़सवार धातु मास्क को हटा दें जो जगह में केशिका को पकड़ लेगा।
    सावधानी: फोटोलिसिस सेल कैप के अंदर एक घुमावदार दर्पण है, दर्पण को छूने के लिए कुछ भी अनुमति न दें।
  5. डोसिमेटर मॉड्यूल पर, बाईं ओर टैब पर धक्का देकर डोसिमेटर सेल खोलें और डोसिमेटर सेल को दाईं ओर खोलें। चुंबकीय रूप से घुड़सवार क्लिप निकालें जो जगह में केशिका पकड़ लेंगे।
  6. फोटोलिसिस सेल के आधार में ग्रूव चैनल में केशिका रखें। फोटोलिसिस सेल विंडो के साथ केशिका खिड़की को केंद्र करें। एक हाथ से स्थिति में केशिका को पकड़ते समय, जगह में केशिका को पकड़ने के लिए चुंबकीय मुखौटा जोड़ें। फोटोलिसिस कैप को वापस स्थिति में रखें।
  7. डोसिमेटर सेल के आधार में ग्रूव चैनल में केशिका रखें। केंद्र डोसिमेटर सेल बेस के केंद्र में छोटे एपर्चर पर दूसरी केशिका खिड़की। एक हाथ से स्थिति में केशिका धारण करते समय, दो चुंबकीय क्लिप को स्थान पर केशिका रखने की स्थिति में रखें। डोसिमेटर सेल को तब तक बंद करें जब तक कि यह क्लिक बंद न हो जाए।
  8. उत्पाद कलेक्टर(चित्रा 1B)के केशिका लिफ्ट के ऊपर knurled अखरोट के माध्यम से केशिका डालें। केशिका को शीशी के नीचे तक बढ़ाएं।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि केशिका शमन समाधान में डूबे हुए है, जबकि एक प्रयोग चलाने के लिए शीशी के नीचे तक पहुंचने के लिए केशिका के लिए महत्वपूर्ण है ।

2. एक इंजेक्शन लूप स्थापित करना

  1. एक बाहरी व्यास 1/16 "और 0.015 के एक आंतरिक व्यास" (381 माइक्रोन) के साथ टेफ्लॉन ट्यूबिंग का उपयोग करें। समीकरण 1 का पालन करें समीकरण 1 का उपयोग कर वांछित मात्रा के लिए आवश्यक ट्यूबिंग की लंबाई की गणना करने के लिए।
    Equation 1
    जहां एल मिलीमीटर में टयूबिंग की लंबाई है, वी माइक्रोलीटर में वांछित मात्रा है और डी मिलीमीटर में ट्यूब आंतरिक व्यास है । 25 माइक्रोन की एक इंजेक्शन मात्रा और 381 माइक्रोन के एक आंतरिक व्यास के लिए, ट्यूबिंग लंबाई लगभग 219.3 मिमी होने की आवश्यकता है।
    नोट: 20 माइक्रोन से कम मात्रा के लिए, 0.01 के आंतरिक व्यास के साथ पीएफई ट्यूबिंग का उपयोग करें"।
  2. ट्यूब कटर का उपयोग करके टेफ्लॉन ट्यूबिंग को आवश्यक लंबाई तक काटें। एक साफ, सीधे कटौती के लिए ट्यूब के सिरों की जांच करें।
  3. पागल में से एक के माध्यम से नए इंजेक्शन पाश के एक छोर डालें और ट्यूब के अंत पर एक नया फेरूल जगह है । फेरूल और अखरोट को जगह में रखें और ट्यूब को इंजेक्शन वाल्व के पोर्ट 3 में डालें जब तक कि यह वाल्व में नीचे से न हो जाए। ट्यूब को मजबूती से पकड़ें और अखरोट की उंगली को टाइट कस लें। रिंच का उपयोग करके, अखरोट को कस लें 1/4 आगे की ओर मुड़ें। विधानसभा को हटाएं और निरीक्षण करें।
    नोट: यदि फेरुल स्थिति में तय नहीं है, फिर से स्थापित करें और 1/8 आगे की बारी कस । लूप के दूसरे छोर के साथ दोहराएं।
  4. एक बार दोनों सिरों में एक अखरोट और निश्चित फेरुल होता है, तो पोर्ट 3 के लिए एक छोर को ढीला कर देता है और दूसरा अंत पोर्ट 6(चित्रा 1C)के लिए होता है। एक बार स्थिति में दोनों पक्षों को कस उंगली तंग तो 1/4 एक रिंच के साथ पिछले उंगली तंग बारी ।

3. फोटोलिसिस सिस्टम को आरंभ करना

  1. निम्नलिखित क्रम में फोटोलिसिस मॉड्यूल चालू करें: (1) फ्लूइडिक्स मॉड्यूल (2) फोटोलिसिस मॉड्यूल (3) डोसिमेट्री मॉड्यूल (4) उत्पाद कलेक्टर, और अंत में (5) सिस्टम कंप्यूटर और नियंत्रण सॉफ्टवेयर लॉन्च करें
    नोट: डोसिमेटर मॉड्यूल को ठंड शुरू होने से गर्म करने के लिए कम से कम आधे घंटे की अनुमति दें।
  2. पूरी तरह से बफर के 10 मिलीएल में सिरिंज पंप(चित्रा 1D)पर "वाल्व" स्थिति से टयूबिंग जलमग्न । कचरे को इकट्ठा करने के लिए "अपशिष्ट" स्थिति(चित्रा 1D)से टयूबिंग रखें और सिरिंज बंदरगाह(चित्रा 1 सी)पर पोर्ट 2 से टयूबिंग को एक खाली कंटेनर में रखें।
    नोट: बफर का उपयोग करें अपने प्रोटीन में निलंबित कर दिया जाएगा एक अनुशंसित बफर 10 एमएम नापो4है ।
  3. उत्पाद कलेक्टर हिंडोला पर, चिह्नित एच और 6 की स्थिति में 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें।
  4. यदि 250 माइक्रोन आईडी केशिका का उपयोग कर रहे हैं, तो लोड फ्लो दर को 500 माइक्रोन/न्यूनतम, प्रसंस्करण प्रवाह दर को 7.5 माइक्रोल/न्यूनतम और अपशिष्ट प्रवाह दर को 500 माइक्रोल/न्यूनतम तक सेट करें।
  5. समीकरण 2 का उपयोग करके अर्ध-स्वचालित मोड का उपयोग करने के लिए फ्लैश देरी, उत्पाद समय और बर्बाद समय की गणना करें।
    Equation 2
    जहां टी मिनट में समय है, एस मिलीमीटर में केशिका दूरी है, डी मिलीमीटर में केशिका के भीतरी व्यास है, और एफ μL में प्रवाह दर है/
    1. फ्लैश देरी के लिए, दूरी केशिका के "निचले छोर" से पहली खिड़की तक है, जो लगभग 90 मिमी होनी चाहिए। २५० माइक्रोन आईडी केशिका और ७.५ μL/min की एक प्रसंस्करण प्रवाह दर का उपयोग करना नमूना के बारे में ३५ सेकंड में फोटोलिसिस खिड़की के लिए आ जाएगा । नमूनों के आने से पहले 1 हर्ट्ज पर दो चमक की अनुमति दें, इसलिए फ्लैश देरी को 33 सेकंड तक सेट करें।
    2. उत्पाद समय के लिए, इंजेक्शन समाधान की मात्रा दर्ज करें इंजेक्शन वाल्व से केशिका के अंत तक प्रवाह में ले जाएगा। 27 "लंबे 250 माइक्रोन आईडी केशिका के लिए, उत्पाद का समय 4.5 मिनट तक सेट करें।
    3. अपशिष्ट समय के लिए, इंजेक्शन समाधान की कुल मात्रा एकत्र करने में लगने वाले समय की मात्रा दर्ज करें। इस समय, उत्पाद कलेक्टर उत्पाद की स्थिति से अपशिष्ट शीशी की ओर बढ़ेगा। 25 माइक्रोन की एक इंजेक्शन मात्रा और 7.5 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह दर के लिए, अपशिष्ट समय को 7.8 मिनट तक सेट करें।
  6. इंजेक्शन वाल्व लोड स्थिति के लिए सेट के साथ इंजेक्शन बंदरगाह में एचपीएलसी ग्रेड पानी के 25 माइक्रोन इंजेक्शन द्वारा इंजेक्शन पाश पांच बार कुल्ला ।
  7. मैन्युअल रूप से इंजेक्शन वाल्व को बाकी सिस्टम को फ्लश करने के लिए 'इंजेक्ट पोजीशन' तक चालू करें। बहते पानी को शुरू करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर प्रक्रिया (बाहर) का चयन करें। बहते समय, उत्पाद कलेक्टर के तहत ऊपर का चयन करके उत्पाद कलेक्टर केशिका लिफ्ट उठाएं ताकि आप केशिका का अंत देख सकें। एक बूंद रूपों तक केशिका के माध्यम से पानी प्रवाह।
    नोट: यदि कोई बूंद नहीं बनती है, तो लीक के लिए इंजेक्टर वाल्व की जांच करें। यदि कोई रिसाव होता है, तो अखरोट को ढीला करें, केशिका को फिर से ढिंढें, और फिर से तंग करें।

4. बफर से कट्टरपंथी मैला ढोने के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए वास्तविक ▪ओह उपज निर्धारित करें।

  1. नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, प्रक्रिया (बाहर)का चयन करके प्रवाह शुरू करें। सेटिंग्स टैब में, फ्लैश वोल्टेज को 0 वी सेट करें। डोसिमेटर डेटा सेक्शन में मैनुअल कंट्रोल टैब के तहत, स्टार्ट डेटा + ऑटोजीरोका चयन करें।
  2. उत्पाद शीशी (एच) और अपशिष्ट शीशी (6) के लिए स्थिति का चयन करें।
  3. तैयारचुनें, मैन्युअल रूप से इंजेक्शन वाल्व को लोड स्थिति में बदल दें, और इंजेक्शन पोर्ट में 100 mM H 2 O 2 के साथ 1 mM Adenine के25 माइक्रोनइंजेक्ट करें। एक बार इंजेक्शन लगाने के बाद, मैन्युअल रूप से इंजेक्शन वाल्व को इंजेक्ट की स्थिति तक बदल दें।
    नोट: यह स्वचालित रूप से सिस्टम को प्रवाह शुरू करने, प्लाज्मा स्रोत चालू करने और डोसिमेट्री डेटा प्राप्त करने के लिए ट्रिगर करता है।
  4. सेटिंग्स टैब पर नेविगेट करके वोल्टेज को रैंप करें, और फ्लैश वोल्टेज को बदलें। 500 वी, 750 वी, 1000 वी और 1250 वी का उपयोग करके चरण 4.2 और 4.3 दोहराएं।
  5. प्रत्येक नमूने के औसत अवशोषण का निर्धारण करने के लिए गणना टैब का चयन करें। सबसे पहले, चुनेंपर क्लिक करें, फिर मैन्युअल रूप से चोटी के अवशोषण की शुरुआत और अंत का चयन करें। उपलब्ध स्थान में, नमूने के विवरण में लिखें। सभी अधिग्रहीत डेटा के लिए दोहराएं।
    नोट: बुलबुले डोसिमेटर पढ़ने में एक स्पाइक के कारण बन सकते हैं। औसत अवशोषण निर्धारित करने के लिए डेटा का चयन करते समय, बुलबुले के साथ क्षेत्रों को छोड़ दें।
  6. प्रत्येक वोल्टेज के लिए एडेनिन अवशोषण में औसत परिवर्तन की गणना करने के लिए एक्सेल में डेटा की प्रतिलिपि और पेस्ट करें, इस प्रकार ओह यील्ड ▪प्रभावी का निर्धारण करें।
  7. यदि प्रत्येक स्थिति के लिए प्रभावी ▪ ओह यील्ड को सामान्य बनाने के लिए कई नमूना स्थितियों (विभिन्न बफर/एडिटिव्स) का उपयोग किया जा रहा है तो 4.1-4.6कदम दोहराएं।

5. उच्च क्रम संरचना में परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रोटीन का संशोधन।

  1. 2 एमएम एडेनिन और 10 माइक्रोन प्रोटीन युक्त समाधान बनाने के लिए एक-से-एक अनुपात में 20 माइक्रोन प्रोटीन के साथ 4 एमएमएम एडेनिन मिलाएं।
  2. किसी भी शेष कणों को बुझाने के लिए अतिरिक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड और 35 m m methionine अमीड को तोड़ने के लिए 0.3 मिलीग्राम/एमएल कैटालेज़ का उपयोग करके शमन समाधान बनाएं। एलिकोट 25 μL समाधान को 200 माइक्रोट्यूब में ताकि बुझाने की समान मात्रा और लेबल किए गए उत्पाद को मिलाया जा सके।
  3. तनु एच2O2 से 200 mM और बर्फ पर रहते हैं।
  4. सेटिंग्स टैब में कंट्रोल सॉफ्टवेयर पर, किसी भी पृष्ठभूमि ऑक्सीकरण का निर्धारण करने के लिए 0 वी पर फ्लैश वोल्टेज शुरू करें।
  5. मैनुअल कंट्रोल टैब में, स्टार्ट डेटा + ऑटोजीरोका चयन करें, इसके बाद प्रक्रिया (आउट),फिर तैयारहो जाएं, और अंत में इंजेक्शन वाल्व को लोड स्थिति में बदल दें।
  6. उत्पाद पर स्थिति 1 में एक शमन समाधान रखें हिंडोला इकट्ठा करें। सिस्टम कंट्रोल सॉफ्टवेयर पर उत्पाद शीशी को 1 में बदल देते हैं।
  7. इंजेक्शन से तुरंत पहले, 1 एमएम एडेनिन, 5 माइक्रोन प्रोटीन और 100 mm H 2 O 2 की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए एच2 ओ2के 12.5 माइक्रोन के साथ एडेनाइन और प्रोटीन मिश्रण के12.5माइक्रोन मिलाएं। मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें, जल्दी से नीचे स्पिन करें, और मिश्रण के 10 सेकंड के भीतर इंजेक्शन पोर्ट का उपयोग करके 25 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
  8. इंजेक्शन वाल्व को इंजेक्ट की स्थिति में स्विच करें और नमूने की प्रक्रिया के दौरान प्रतीक्षा करें।
  9. 500 वी, 750 वी, 1000 वी और 1250 वी के साथ अधिग्रहण दोहराएं।
  10. चरण 4.5 में वर्णित औसत अवशोषण की गणना करें। एक्सेल के लिए सभी डेटा को कॉपी और पेस्ट करें।

6. सिस्टम को बंद करें

  1. सभी नमूनों को एकत्र करने के बाद, इंजेक्शन वाल्व को लोड स्थिति में सेट करके सिरिंज बंदरगाह और नमूना लूप को बाहर निकालें और एचपीएलसी पानी के 25 माइक्रोल को पांच बार इंजेक्ट करें।
  2. इंजेक्शन वाल्व को एचपीएलसी पानी के साथ सिस्टम के बाकी हिस्सों को फ्लश करने के लिए इंजेक्शन की स्थिति तक चालू करें।
  3. प्रवाह को रोकें, सिस्टम नियंत्रण सॉफ्टवेयर को बंद करें, और उत्पाद कलेक्टर, डोसिमेटर मॉड्यूल, फोटोलिसिस मॉड्यूल से शुरू होने वाले मॉड्यूल को बंद कर दें, फिर अंत में तरल पदार्थ मॉड्यूल।

7. नमूना तैयारी और तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. 50 एमएम ट्रिस और 1 एमएमएमसीसीएल2 की उपस्थिति में 20 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने इनक्यूबेटिंग करके प्रोटीन को विकृत करें । कमरे के तापमान के लिए शांत नमूने और प्रोटीन के लिए 1:20 ट्रिपसिन जोड़ें । सैंपल मिक्सिंग के साथ प्रोटीन को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पचा लें। अगली सुबह, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक नमूनों को गर्म करके ट्राइपसिन पाचन समाप्त करें।
  2. यूपीएलसी सिस्टम से जुड़े हाई-रेजोल्यूशन एलसी-एमएस/एमएस सिस्टम का इस्तेमाल कर पेप्टाइड्स का पता लगाएं ।
  3. नमूना पहले ट्रैप कॉलम (300 माइक्रोन आईडी एक्स 5 मिमी 100 पोर आकार, 5 माइक्रोन कण आकार) पर लोड करें और 2% सॉल्वेंट बी (एसीटोनिट्रिल और 0.1% फॉर्मिक एसिड) वाले पानी के साथ 3 मिनट के लिए 5.0 माइक्रोन/
  4. एक C18 नैनोकोलम (0.75 मिमी x 150 मिमी, 2 माइक्रोन कण आकार, 100 Å pore आकार) पर पेप्टाइड्स को सॉल्वेंट ए (0.1% फॉरमिक एसिड युक्त पानी) और सॉल्वेंट बी के बीच ढाल के साथ 300 nL/मिनट की प्रवाह दर पर अलग करें। पेप्टाइड एल्यूशन के लिए ढाल में 22 मिनट से अधिक 2 से 35% बी तक रैखिक वृद्धि होती है, जो 5 मिनट से अधिक 95% बी तक होती है और कॉलम को धोने के लिए 3 मिनट के लिए आयोजित की जाती है, और फिर 3 मिनट से अधिक 2% बी पर लौट आई और कॉलम को फिर से बराबर करने के लिए 9 मिनट के लिए आयोजित की जाती है।
  5. सकारात्मक आयन मोड में डेटा प्राप्त करें। स्प्रे वोल्टेज को 2400 वी तक सेट करें, और आयन ट्रांसफर ट्यूब का तापमान 300 डिग्री सेल्सियस तक।
  6. 250-2000 मीटर/जेड से पूर्ण एमएस स्कैन प्राप्त करें और इसके बाद शीर्ष आठ सबसे प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड आयनों पर आठ बाद के डेटा-निर्भर एमएस/एमएस स्कैन करें । पेप्टाइड्स को खंडित करने के लिए 35% सामान्यीकृत ऊर्जा पर टकराव-प्रेरित वियोजन का उपयोग करें।
  7. प्रोटीन अनुक्रम और प्रासंगिक प्रोटियोलिटिक एंजाइम युक्त आवश्यक FASTA फ़ाइल के खिलाफ एक उपलब्ध प्रोटीन विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एमएस/एमएस विश्लेषण से पता लगाया गया सभी असंशोधित पेप्टाइड्स की पहचान करें ।
  8. एचआरपीएफ डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके संशोधित पेप्टाइड्स को खोजें और मात्रा दें। प्रत्येक पहचानित पेप्टाइड के लिए ऑक्सीकरण की सीमा की गणना एक संशोधित पेप्टाग्राफिक पीक क्षेत्र द्वारा संशोधित पेप्टाग्राफिक पीक क्षेत्र को विभाजित करके की जाती है जो समीकरण 3 का उपयोग करके संशोधित और असंशोधित है।
    पी = [मैं(अकेले ऑक्सीकरण) X 1 + I (दोगुना ऑक्सीकरण) X 2 + I(ट्रिपली ऑक्सीडाइज्ड) X 3 + .../[Iunoxidized + I(अकेले ऑक्सीकरण)+ मैं(दोगुना ऑक्सीकरण)+ मैं(ट्रिपल ऑक्सीकरण)...]
    जहां पी पेप्टाइड अणु प्रति ऑक्सीकरण घटनाओं की औसत संख्या को दर्शाता है, और मैं अनऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड(Iunoxidized)और एन ऑक्सीकरण घटनाओं के साथ पेप्टाइड के शिखर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है।

8. एक अंतर अध्ययन के लिए, दूसरी शर्त पर 5-7 कदम दोहराएं।

नोट: प्रजनन क्षमता की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक स्थिति के लिए तकनीकी ट्रिपलिट्स के अलावा दो जैविक प्रतिकृति की सिफारिश की जाती है।

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Representative Results

उच्च दबाव प्लाज्मा स्रोत वास्तविक समय dosimetry के साथ मिलकर उच्च क्रम प्रोटीन संरचना में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए ▪ओह उपज के बेहतर नियंत्रण की अनुमति देता है और अधिक सही । एडेनिन के अलावा एक प्रभावी वास्तविक समय कट्टरपंथी डोसिमेटर के लिए अनुमति देता है। ऑक्सीकरण पर, एडेनिन 265 एनएम (चित्रा 2 ए) पर यूवी अवशोषण खोदेता है। एडेनिन अवशोषण में परिवर्तन सीधे एचआरपीएफ के लिए उपलब्ध कट्टरपंथियों की एकाग्रता से संबंधित है इस प्रकार बफ़र्स, एक्सपिएजेंट्स और लिगामेंट्स(चित्रा 2B)जैसे कट्टरपंथी सफाई कर्मियों की उपस्थिति में कट्टरपंथी एकाग्रता में परिवर्तन की प्रभावी रूप से निगरानी करने का साधन प्रदान करता है।

Apomyoglobin (aMb) चार बढ़ती प्लाज्मा वोल्टेज(चित्रा 3)में १०० mM एच2O2 और 1 mm adenine की उपस्थिति में संशोधित किया गया था । एडेनिन यूवी 265 एनएम अवशोषण के परिवर्तन के साथ ऑक्सीकरण में रैखिक वृद्धि के साथ छह पेप्टाइड्स का पता चला। एडेनिन यूवी अवशोषण प्रभावी ▪ओह एकाग्रता के लिए एक किराए की है। कट्टरपंथी एकाग्रता में परिवर्तन बनाम ऑक्सीकरण में रैखिक परिवर्तन लेबलिंग के दौरान प्रोटीन की उच्च क्रम संरचना में विरूपण साक्ष्य परिवर्तन के अभाव की पुष्टि करता है। इसके अलावा, उच्च दबाव प्लाज्मा स्रोत के साथ पता चला ऑक्सीकरण की हद तक लेजर आधारित विधि की तुलना में बहुत अधिक था । यह वृद्धि उच्च दबाव वाले प्लाज्मा स्रोत के व्यापक स्पेक्ट्रम यूवी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम(चित्रा 4)से उत्पन्न होती है। एक व्यापक यूवी स्पेक्ट्रम का उत्पादन करके, प्लाज्मा स्रोत बेहतर एच 2 O 2 के अवशोषण डोमेन ओवरलैप एच2O2 (चित्रा 5)के फोटोलिसिस के माध्यम से ▪ओह का अधिक कुशल उत्पादन प्रदान करते हैं । यह केआरएफ एक्सीमर लेजर और एनडी: वाईएजी लेजर की सीधी तुलना में है, जो आम स्रोत हैं जो एचआरपीएफ अध्ययन21, 27, 28में एच2ओ2कोफोटोलीज़ करते हैं। इन लेजर एच 2O2'फोटोमैट्रिक अवशोषण रेंज के निचले छोर पर एक बहुत ही संकीर्ण बैंडविड्थ है। केआरएफ एक्सीमर लेजर की तुलना में, उच्च दबाव प्लाज्मा स्रोत ओएचएस ▪के उत्पादन में काफी वृद्धि करता है, जबकि सहवर्ती रूप से आवश्यक ऑप्टिकल फ्लूसेंस(चित्रा 6)की मांग को काफी कम करता है।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लैश फोटोलिसिस प्लेटफॉर्म के घटक। (A)इकट्ठे केशिका ट्यूब, यूनियन ट्यूब, नट और फेरुल । केशिका के "निचले छोर" की नोक संघ ट्यूब से परे बमुश्किल फैली हुई है। (ख)केशिका के अंत में डालने के लिए उत्पाद कलेक्टर पर अखरोट को कनीय। (ग)लेबल छह बंदरगाह इंजेक्शन वाल्व । (घ)सिरिंज के साथ सिरिंज पंप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डोसिमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले एडेनिन अवशोषण में परिवर्तन। (क)ऑक्सीकरण पर, एडेनिन 265 एनएम पर यूवी अवशोषण में कमी आती है। (ख)दो बफ़र्स के लिए विभिन्न फ्लैश वोल्टेज पर 265 एनएम पर एडेनिन अवशोषण में परिवर्तन। बफर 2 में एक कट्टरपंथी मेहतर होता है जो बफर 1 की तुलना में एडेनिन अवशोषण में परिवर्तन को कम करेगा। बफर 2 से कट्टरपंथी मैला ढोने के प्रभाव को दूर करने के लिए, बढ़ी हुई फ्लैश वोल्टेज की आवश्यकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एपोमायोग्लोबिन खुराक प्रतिक्रिया वक्र। (A)अवशोषण में छह पेप्टाइड्स बनाम एडेनिन परिवर्तन का औसत ऑक्सीकरण दिखाया गया है । एफपीओपी ऑक्सीकरण का स्तर धराशायी लाइनों में दिखाया गया है। (ख)छह ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स को मायोग्लोबिन (पीडीबी: 3RGK) की क्रिस्टल संरचना पर लेबल किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्लाज्मा लैंप के स्पेक्ट्रल विकिरण। उच्च दबाव वाले एक्सई गैस लैंप दृश्य प्रकाश के साथ 200-300 एनएम से व्यापक स्पेक्ट्रम यूवी विकिरण उत्सर्जित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एच2O2 फोटोमैट्रिक अवशोषण स्पेक्ट्रा। ब्लैक ट्रेस एच 2 ओ2 229का यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रम है। बैंगनी में हाइलाइट किया गया केआरएफ एक्सीमर लेजर (248 एनएम) और एनडी: वाईएजी लेजर (265 एनएम) का संकीर्ण तरंगदैर्ध्य है, जबकि नीला तीर व्यापक स्पेक्ट्रम प्लाज्मा स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है जो उपयोगी एच2ओ2 अवशोषण की सीमा का विस्तार करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: प्लाज्मा स्रोत की प्रभावकारिता एच2O2फोटोलाइज करने के लिए । बढ़ी हुई प्लाज्मा प्रवाह पर एडेनिन अवशोषण में परिवर्तन उत्पन्न ▪ओएचएस की एकाग्रता को दर्शाता है। बैंगनी रंग में हाइलाइट किया गया एक केआरएफ एक्सिमर लेजर25से उत्पादित अवशोषित में एक विशिष्ट अधिकतम परिवर्तन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

किसी भी एचआरपीएफ प्रयोग के दौरान प्रोटीन की उचित लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए गए हैं । सबसे पहले, एक उपयुक्त प्रवाह दर और स्रोत फ्लैश दर का चयन किया जाता है ताकि नमूने के प्रत्येक बोलस को एक बार विकिरणित किया जा सके। यह सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन नवगठित ▪ओह के एक बोलस के संपर्क में है। एक बार प्रोटीन ऑक्सीकरण हो जाने के बाद, उच्च क्रम प्रोटीन संरचना को बदला जा सकता है। विश्वास करने के लिए देशी प्रोटीन संरचना की जांच की जाती है, प्रत्येक प्रोटीन अणु को एक ही पल में संशोधित किया जाना चाहिए। यदि देशी प्रोटीन संरचना की जांच की जाती है तो डॉसिमेट्री का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि हाइड्रोक्सिल रेडिकल की एकाग्रता से ऑक्सीकरण की सीमा बढ़ जाती है यदि देशी प्रोटीन संरचना की जांच की जाती है। हालांकि, यदि हाइड्रोक्सिल कणों की एक बड़ी एकाग्रता प्रोटीन को लेबलिंग के दौरान आंशिक रूप से प्रकट करने का कारण बनती है, तो ऑक्सीकरण की सीमा में काफी वृद्धि होगी इस प्रकार देशी प्रोटीन संरचना को सुनिश्चित करने के लिए एक प्रभावी साधन प्रदान की जांच की जाती है।

यह सुनिश्चित करना भी महत्वपूर्ण है कि प्रतिक्रिया को उचित रूप से बुझाया जाए । इसमें लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन के साथ मिश्रित एक उचित कट्टरपंथी मेहतर को शामिल करना शामिल है। इस विधि के लिए, एडेनिन का उपयोग न केवल डोसिमेट्री के लिए किया जाता है बल्कि ओएच ▪को कट्टरपंथी के जीवनकाल को सीमित करने के लिए भी मैला किया जाता है क्योंकि यह प्रोटीन को लेबल करता है। कट्टरपंथी के जीवनकाल को सीमित करके, विश्वास है कि देशी प्रोटीन संरचना संशोधित किया जा रहा है प्राप्त की है । लेबलिंग प्रक्रिया के बाद, कैटालेज़ और मेथियोनाइन अमीड युक्त शमन समाधान में नमूना एकत्र करना महत्वपूर्ण है जो अतिरिक्त एच2ओ2 को तोड़ देगा और ओह ▪सफाई करेगा। एच 2O 2के लिए प्रोटीन के जोखिम को सीमित एच2O2 प्रेरित ऑक्सीकरण कम से कम है सुनिश्चित करता है।

पेप्टाइड पाचन के लिए एक प्रोटीज का उचित चयन करना भी महत्वपूर्ण है। कई एंजाइम विशिष्ट स्थानों पर प्रोटीन को क्लीव करते हैं। उदाहरण के लिए, आर्जिनिन और लिसिन अवशेषों के कार्बोक्सिल पक्ष पर ट्राइपसिन क्लीव्स। यह सरल डेटा विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, लेकिन यदि ब्याज के प्रोटीन में सीमित संख्या में आर्जिनिन और lysines है, तो बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स के दौरान स्वीकार्य पेप्टाइड कवरेज के लिए एक वैकल्पिक प्रोटीज या प्रोटीज़ का मिश्रण आवश्यक हो सकता है। यह भी सलाह दी जाती है कि एकत्रीकरण और/या घुलनशीलता के मुद्दों के कारण ऑक्सीडाइज्ड प्रोटीन के नुकसान से बचने के लिए दीर्घकालिक भंडारण से पहले संशोधित प्रोटीन को पचा लें ।

प्रोटीन संरचना और प्रोटीन इंटरैक्शन में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एचआरपीएफ का उपयोग करना बहुत सफल रहा है11,30,31,32,33,लेकिन हेम-बाइंडिंग प्रोटीन या ग्लाइकोप्रोटीन लेबलिंग करते समय जटिलताएं बढ़ जाती हैं। जबकि एचआरपीएफ का उपयोग करके हेम बाइंडिंग34 और ग्लाइकोप्रोटीनदोनों की सफलतापूर्वक जांच की गई है, एच 2 ओ2,कट्टरपंथी मेहतर की एकाग्रता में पूरीतरहसे समस्या निवारण, और एच2ओ2 एक्सपोजर की समय सीमा संतुलित की जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, कुछ बफ़र्स बड़े पैमाने पर ओएचएस ▪बुझाते हैं। इसलिए, एक उपयुक्त बफर का चयन करना और डीटीटी और डीएमएसओ जैसे एक्सपिएंट्स को सीमित करना महत्वपूर्ण है। एचआरपीएफ प्रयोग के दौरान उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट बफ़र्स में एसीटेट, सोडियम फॉस्फेट, फॉस्फेट बफर नमकीन, या ट्रिस बफर की कम सांद्रता शामिल है। दिलचस्प बात यह है कि ट्रों ने कुछ ▪ओह की सफाई की, लेकिन ऑक्सीकरण के बाद, यह 265 एनएम पर फोटोमेट्रिक अवशोषण में बढ़ जाता है और डोसिमेट्री36के लिए एडेनिन के स्थान पर उपयोग किया जा सकता है। हालांकि कुछ बफ़र्स ओह ▪की प्रभावी एकाग्रता को कम कर सकते हैं, एक इन-लाइन कट्टरपंथी डोसिमीटर को शामिल करके इन चुनौतियों को पार किया जा सकता है।

एचआरपीएफ सॉल्वेंट एक्सेसिबिलिटी की जांच करने के लिए ▪ओह द्वारा गैर-विशिष्ट अपरिवर्तनीय लेबलिंग का उपयोग करता है। लेबल की गैर-विशिष्ट प्रकृति एन-एथिलमलेइमाइड37 और ग्लाइसिन एथिल एस्टर38सहित अन्य अधिक लक्षित पदचिह्न विधियों की तुलना में समग्र कवरेज प्रदान करती है। चूंकि संशोधन अपरिवर्तनीय है, इसलिए नमूना हैंडलिंग के दौरान पर्याप्त समय उपलब्ध है। यह पूर्ण प्रोटीन पाचन और बेहतर एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए एक लंबे एलसी ढाल के लिए अनुमति देता है । एचआरपीएफ के लिए ▪ओह उत्पन्न करने के कई तरीके हैं। एक लोकप्रिय विधि ▪ ओह में एच2O2 को फोटोलाइज करने केलिए एक लेजर का उपयोग करती है। लेजर आधारित प्लेटफार्मों देशी प्रोटीन संरचना की जांच में बहुत सफल रहा है, लेकिन वे व्यापक सुरक्षा सावधानियों, कठोर रखरखाव, और अंतरिक्ष की एक पर्याप्त राशि की आवश्यकता है ।

यहां बताए गए हाई प्रेशर प्लाज्मा सोर्स के इस्तेमाल से हानिकारक गैसों की जरूरत नहीं होती और आवारा यूवी रेडिएशन का डर नहीं रहता। प्रत्येक उच्च दबाव प्लाज्मा स्रोत के जीवनकाल के लिए 180-200 नमूनों के बीच लेबल के लिए पर्याप्त है, और डोसिमेटर प्रतिक्रिया की निगरानी के अलावा, कोई अतिरिक्त रखरखाव की आवश्यकता है । प्लाज्मा स्रोत उच्च दबाव में है, इसलिए प्लाज्मा स्रोत को संभालते समय, सुरक्षा चश्मा पहनें। प्लाज्मा स्रोत भी फोटो लच2O2 को अधिक कुशलता से फोटोलाइज करता है, जिससे प्रोटीन संशोधन में वृद्धि होती है। यदि अपर्याप्त लेबलिंग देखी जाती है, तोइसकेअलावा कट्टरपंथी उत्पादन के लिए लैंप ऊर्जा बढ़ाने के साथ एच 2 ओ2 एकाग्रता को बढ़ाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वास्तविक समय के डॉसिमेट्री के समावेश के साथ, कोई भी प्रयोगों की पुनरुत्पादन क्षमता को बढ़ा सकता है। कुल मिलाकर, स्वचालित एफपीओपी डेटा गणना के लिए वास्तविक समय के डॉसिमेट्री और सॉफ्टवेयर के साथ मिलकर प्लाज्मा स्रोत के उपयोग के साथ मानक लेजर-आधारित तरीकों की तुलना में सुरक्षित, काम करने में आसान और बेहतर प्रजनन क्षमता के साथ एचआरपीएफ प्रयोग करने के लिए एक लाभप्रद पैकेज प्रदान करता है।

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Disclosures

ईई.C, जेएस, और एसआरडब्ल्यू जेननेक्स्ट टेक्नोलॉजीज, इंक, एक प्रारंभिक चरण के लिए उच्च आदेश प्रोटीन संरचना विश्लेषण के लिए प्रौद्योगिकियों का व्यावसायीकरण की मांग कंपनी में एक महत्वपूर्ण वित्तीय हित का खुलासा । उपलब्ध कराए गए प्रतिनिधि आंकड़ों की समीक्षा एस.के.M द्वारा की गई है, जिनका हितों का कोई वित्तीय टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज (R43GM125420 और R44GM125420) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

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References

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum (2016).
  30. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  31. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  32. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  33. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  34. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  35. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  36. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  37. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  38. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

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बायोकेमिस्ट्री अंक 172 बायोफार्मास्युटिकल बायोसमान हायर ऑर्डर स्ट्रक्चर फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन ऑफ प्रोटीन (एफओपी) हाइड्रोक्सिल रेडिकल प्रोटीन फुटप्रिंटिंग (एचआरपीएफ) एपिटोप मैपिंग रिसेप्टर-ड्रग इंटरैक्शन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन
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Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).

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