Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Laserfri hydroksylradikale proteinfotavtrykk for å utføre strukturell analyse av proteiner med høyere orden

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61861
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

Summary

Denne protokollen presenterer en metode for å bruke inline radikal dosimetri og en plasma lyskilde for å utføre flash oksidasjon protein fotavtrykk. Denne metoden erstatter den farlige UV-laseren for å forenkle og forbedre reproduserbarheten av rask fotokjemisk oksidasjon av proteinstudier.

Abstract

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en fremvoksende og lovende strukturell analyseteknikk med høyere rekkefølge som gir informasjon om endringer i proteinstruktur, proteinproteininteraksjoner eller proteinligandinteraksjoner. HRPF bruker hydroksylradikaler(▪OH) til å irreversibelt merke et proteins løsningsmiddel tilgjengelige overflate. Den iboende kompleksiteten, kostnaden og den farlige karakteren av å utføre HRPF har vesentlig begrenset bred adopsjon i biofarma. Disse faktorene inkluderer: 1) bruk av kompliserte, farlige og dyre lasere som krever betydelige sikkerhetsforanstaltninger; og 2) irreproducibility av HRPF forårsaket av bakgrunn scavenging av ▪OH som begrenser komparative studier. Denne publikasjonen inneholder en protokoll for drift av et laserfritt HRPF-system. Dette laserfrie HRPF-systemet bruker en høyenergi plasmalyskilde for høytrykksblits oksidasjonsteknologi med in-line radikal dosimetri. Plasmalyskilden er tryggere, enklere å bruke og mer effektiv i å generere hydroksylradikaler enn laserbaserte HRPF-systemer, og det in-line radikale dosimeteret øker reproduserbarheten av studier. Kombinert adresserer og overgår det laserfrie HRPF-systemet de nevnte manglene og begrensningene ved laserbaserte teknikker.

Introduction

Proteinkonformasjon og tilhørende høyere ordensstruktur (HOS) er de viktigste determinantene for riktig biologisk funksjon og avvikende oppførsel1. Det samme gjelder biofarmasøytiske stoffer, hvis struktur og funksjonelle aktivitet er avhengig av ulike aspekter av produksjon og miljø. Biofarmasøytisk endring i HOS har vært knyttet til bivirkninger (ADR) som tilskrives uønsket farmakologi og pasientens immunologiske respons2,3. Utseendet til BIVIRKNINGER har varslet den biofarmasøytiske industrien om den kritiske rollen som protein HOS spiller i sikkerhet og effekt av bioterapeutikk, og de har etablert behovet for ny og forbedret HOS-analyse4.

Hydroxyl Radical Protein Footprinting (HRPF) er en lovende teknikk for å spore endringen i protein HOS. HRPF innebærer irreversibel merking av et proteins eksteriør med ▪OH etterfulgt av massespektrometri (MS) analyse for å identifisere den løsningsmiddeltilgjengelige overflaten av proteinet5,6,7. HRPF har med hell blitt brukt til å oppdage defekter i protein HOS og dens funksjon8,9, karakteriserer HOS av monoklonale antistoffer (mAb)10,11,12,13, bestemme bindingen Kd av en ligand14, og mye mer15,16,17,18,19. En vanlig metode for å generere ▪OH for HRPF er Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP), som bruker høyenergiske, raske UV-lasere for å produsere ▪OH fra fotolyse av H2O2. For det meste bruker FPOP dyre ekssitasjonslasere som bruker farlig gass (KrF) som krever betydelige sikkerhetstiltak for å unngå åndedretts- og øyeskader20. For å unngå innåndingsfarer har andre brukt frekvens firedoblet neodymium yttrium aluminiumspynt (Nd:YAG) lasere21, som eliminerer bruken av giftig gass, men som fortsatt er kostbare, krever betydelig driftskompetanse og krever omfattende bortkomne lyskontroller for å beskytte brukere mot øyeskader.

Selv om rikelig med informasjon kan innhentes ved hjelp av HRPF, er bred adopsjon i biofarma ikke oppfylt. To barrierer for begrenset HRPF-adopsjon inkluderer: 1) bruk av farlige og dyre lasere som krever betydelige sikkerhetsforanstaltninger20; og 2) irreproducibility av HRPF forårsaket av bakgrunn scavenging av ▪OH som begrenser komparative studier22. For å erstatte laserbruk ble en høyhastighets plasmablitsfotolyseenhet med høy energi utviklet for å utføre FPOP på en facile måte. For å forbedre irreproducibility av HRPF eksperimenter, sanntid radikal dosimetri er implementert.

Praktiseringen av HRPF har vært begrenset av irreproducibility tilskrives bakgrunnsoppfinnelse av ▪OH22. Mens ▪OH er gode sonder av proteintopografi, reagerer de også med mange bestanddeler som finnes i preparater, noe som gjør det nødvendig å måle den effektive konsentrasjonen av radikal tilgjengelig for å oksidere et målprotein. Variasjoner i bufferforberedelse, hydrogenperoksidkonsentrasjon, ligandegenskaper eller fotolyse kan føre til oksidasjonsforskjeller mellom kontroll og eksperimentelle grupper som skaper tvetydighet i HOS-differensialstudier. Tillegg av sanntids radikal dosimetri muliggjør justering av effekten ▪OH-belastning og øker derfor tilliten og reproduserbarheten under et HRPF-eksperiment. Bruk av radikal dosimetri i FPOP er beskrevet andre steder23,24,25, og diskuteres nærmere i en nylig publikasjon26. Her beskriver vi bruken av et nytt flash fotolysesystem og sanntids dosimetri for å merke hesteapinoglobin (aMb), og sammenligne nivåer av peptidoksidasjon i et FPOP-eksperiment med det som oppnås ved bruk av en excimer laser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Montering av kapillærrøret

  1. Ved hjelp av en silikaklyngestein, cleave 250 μm indre diameter (ID) silika kapillær til 27 tommer. Kontroller kapillærendene for et rent, rett snitt.
  2. Lag to vinduer omtrent 15 mm lange ved å brenne bort polyimidbelegget. Fra den "nedre enden" gjør du det første fotolysevinduet 90 mm fra den "nedre enden" og det andre dosimetervinduet 225 mm fra den "nedre enden".
    MERK: Når belegget er brent bort, er kapillæren svært skjør.
  3. Skru av mutteren og ferrule ved port 5 og sett inn den "nedre enden" av kapillæren like utenfor den koniske enden av ferrule (figur 1A).
  4. På fotolysemodulen fjerner du fotolysecellehetten ved å trekke den rett ut og deretter fjerne den magnetisk monterte metallmasken som holder kapillæren på plass.
    FORSIKTIG: Inne i fotolysecellehetten er et buet speil, ikke la noe berøre speilet.
  5. På dosimetermodulen åpner du dosimetercellen ved å trykke på fanen til venstre og svinge dosimetercellen åpen til høyre. Fjern de magnetisk monterte klipsene som holder kapillæren på plass.
  6. Plasser kapillæren i den rillede kanalen i bunnen av fotolysecellen. Midtstill kapillærvinduet med fotolysecellevinduet. Mens du holder kapillæren på plass med en hånd, legg til den magnetiske masken for å holde kapillæren på plass. Sett fotolysehetten tilbake på plass.
  7. Plasser kapillæren i den rillede kanalen i bunnen av dosimetercellen. Midtstill det andre kapillærvinduet på den lille blenderåpningen i midten av dosimetercellebasen. Mens du holder kapillæren på plass med den ene hånden, plasserer du de to magnetiske klipsene på plass for å holde kapillæren på plass. Lukk dosimetercellen til den klikker lukket.
  8. Sett kapillæren gjennom den riflede mutteren på toppen av produktoppsamlerens kapillære løft (figur 1B). Utvid kapillæren til rett over bunnen av hetteglasset.
    MERK: Det er viktig for kapillæren å nå bunnen av hetteglasset for å sikre at kapillæren er nedsenket i slukkeløsningen mens du kjører et eksperiment.

2. Installere en injeksjonssløyfe

  1. Bruk Teflon-slangen med en ytre diameter 1/16" og en indre diameter på 0,015" (381 μm). Følg ligning 1 for å beregne lengden på slangen som trengs for ønsket volum ved hjelp av ligning 1.
    Equation 1
    Der L er lengden på slangen i millimeter, er V ønsket volum i mikroliter og d er rørets indre diameter i millimeter. For et injeksjonsvolum på 25 μL og en indre diameter på 381 μm, må rørlengden være omtrent 219,3 mm.
    MERK: For volumer som er mindre enn 20 μL, bruk PTFE-slange med en indre diameter på 0,01".
  2. Klipp Teflon-slangen til den nødvendige lengden ved hjelp av en rørkutter. Kontroller endene av røret for et rent, rett snitt.
  3. Sett den ene enden av den nye injeksjonssløyfen gjennom en av mutterne og legg en ny ferrule på enden av røret. Hold ferrule og mutter på plass og sett røret inn i port 3 på injeksjonsventilen til den bunner ut i ventilen. Hold røret godt fast og stram mutterfingeren stramt. Stram mutteren 1/4 med en skiftenøkkel og vri den videre. Fjern og inspiser enheten.
    MERK: Hvis ferrule ikke er festet på plass, må du installere på nytt og stramme 1/8 omdreining videre. Gjenta med den andre enden av løkken.
  4. Når begge ender har en mutter og fast ferrule, skru den ene enden løst til port 3 og den andre enden til port 6 (Figur 1C). Når du er i posisjon, stram begge sider til fingeren stramt, og drei deretter 1/4 forbi fingeren stramt med en skiftenøkkel.

3. Initialiser fotolysesystemet

  1. Slå på fotolysemodulene i følgende rekkefølge: (1) Fluidics Module (2) Photolysis Module (3) Dosimetry Module (4) Product Collector, og til slutt (5) systemdatamaskinen og start kontrollprogramvaren
    MERK: La Dosimeter-modulen være minst en halvtimes oppvarming etter en kald start.
  2. Senk slangen helt ned fra "Valve"-posisjonen på sprøytepumpen (Figur 1D) til 10 ml buffer. Plasser slangen fra "Avfall"-stilling (Figur 1D) og slanger fra port 2 på sprøyteporten (figur 1C) til en tom beholder for å samle avfall.
    MERK: Bruk bufferen som proteinet skal henges i. En anbefalt buffer er 10 mM NaPO4.
  3. På produktoppsamlerkarusellen plasserer du 1,5 ml mikrosenterfugerør i den posisjonen som er merket H og 6.
  4. Hvis du bruker 250 μm ID-kapillær, setter du laststrømningshastigheten til 500 μL/min, prosesseringsstrømningshastigheten til 7,5 μL/min og avfallsmengden til 500 μL/min.
  5. Beregn blitsforsinkelsen, produkttiden og bortkastet tid for å bruke halvautomatisk modus ved hjelp av ligning 2.
    Equation 2
    Hvor t er tiden i minutter, s er kapillæravstanden i millimeter, d er kapillærens indre diameter i millimeter, og f er strømningshastigheten i μL / min.
    1. For blitsforsinkelsen er avstanden fra den "nedre enden" av kapillæren til det første vinduet, som skal være omtrent 90 mm. Ved hjelp av 250 μm ID kapillær og en prosesseringsstrømningshastighet på 7,5 μL / min vil prøven komme til fotolysevinduet om ca. 35 sekunder. La to blink på 1 Hz oppstå før prøvene ankommer, så sett blitsforsinkelsen til 33 sekunder.
    2. For produkttiden vil det ta tid å angi hvor lang tid injisert oppløsning vil ta å strømme fra injeksjonsventilen til slutten av kapillæren. For en 27" lang 250 μm ID kapillær, sett produkttiden til 4,5 minutter.
    3. For avfallstiden, angi hvor lang tid det totale volumet av injisert løsning vil ta å bli samlet inn. På dette tidspunktet vil produktoppsamleren flytte fra produktposisjonen til hetteglasset med avfall. For et injeksjonsvolum på 25 μL og en strømningshastighet på 7,5 μL/min, sett avfallstiden til 7,8 minutter.
  6. Skyll injeksjonssløyfen fem ganger ved å injisere 25 μL HPLC-vann i injiseringsporten med injeksjonsventilen satt i lasteposisjon.
  7. Drei injeksjonsventilen manuelt opp til "injiser posisjon" for å skylle resten av systemet. Velg Prosess (ut) på kontrollprogramvaren for å begynne å strømme vann. Mens du flyter, hev produktinnsamlerkapillærheisen ved å velge Opp under produktsamleren slik at du kan se slutten på kapillæren. Strømning vann gjennom kapillæren til en dråpe dannes.
    MERK: Hvis det ikke dannes en dråpe, må du kontrollere injektorventilen for lekkasjer. Hvis det er en lekkasje, løsne mutteren, sett på kapillæren igjen og fest den igjen.

4. Bestem faktisk ▪OH-utbytte for å teste radikale scavenging effekter fra bufferen.

  1. Start flyten i kontrollprogramvaren ved å velge Prosess (ut). I innstillingsfanen setter du blitsspenningen til 0 V. Velg Start data + AutoZerounder Manuell kontroll under Dosimeterdata .
  2. Velg posisjon for hetteglasset med produktet (H) og hetteglasset med avfall (6).
  3. Velg Klar, vri injeksjonsventilen manuelt ned til lasteposisjonen, og injiser 25 μL 1 mM Adenin med 100 mM H2O2 i injeksjonsporten. Når injeksjonsventilen er injisert, må den dreie den manuelt opp til injiseringsposisjonen.
    MERK: Dette utløser automatisk systemet for å starte flyten, slå på plasmakilden og hente dosimetridataene.
  4. Skru opp spenningen ved å navigere til innstillingsfanen og endre blitsspenningen. Gjenta trinn 4.2 og 4.3 ved hjelp av 500 V, 750 V, 1000 V og 1250 V. Utfør avlesningen av adeninabsorbering ved hver spenning i triplikater.
  5. Velg kategorien beregninger for å bestemme gjennomsnittlig absorbans for hvert utvalg. Først klikker du Merk, og deretter merker du begynnelsen og slutten av toppabsorberingen manuelt. Skriv i en beskrivelse av eksemplet på den tilgjengelige plassen. Gjenta dette for alle innsamvede data.
    MERK: Bobler kan dannes forårsaker en spike i dosimeter avlesning. Når du velger data for å bestemme gjennomsnittlig absorbans, utelater du områder med bobler.
  6. Kopier og lim inn data i Excel for å beregne den gjennomsnittlige endringen i adeninabsorbering for hver spenning, og dermed bestemme den effektive ▪OH-utbyttet.
  7. Gjenta trinn 4.1-4.6 hvis flere prøvebetingelser (forskjellige buffere/tilsetningsstoffer) brukes til å normalisere det effektive ▪OH-utbyttet for hver betingelse.

5. Modifikasjon av protein for å oppdage endringer i høyere rekkefølge struktur.

  1. Bland 4 mM adenin med 20 μM protein i et en-til-en-forhold for å lage en løsning som inneholder 2 mM adenin og 10 μM protein.
  2. Lag slukkeløsningen ved hjelp av 0,3 mg/ml katase for å bryte ned overflødig hydrogenperoksid og 35 mM metionin midt i slukking av eventuelle gjenværende radikaler. Aliquot 25 μL slukkeløsning i et 200 μL mikrorør slik at et likt volum slukking og det merkede produktet blandes.
  3. Fortynn H2O2 til 200 mM og hold på is.
  4. På kontrollprogramvaren i innstillingsfanen starter du blitsspenningen ved 0 V for å bestemme eventuell bakgrunnsoksidasjon.
  5. I kategorien Manuell kontroll velger du Start data + AutoZeroetterfulgt av Prosess (ut), deretter Klar, og til slutt skrur du injeksjonsventilen ned til lasteposisjonen.
  6. Plasser en slukkeløsning i posisjon 1 på produktet samle karusell. På System Control Software endre produktet hetteglasset til 1.
  7. Umiddelbart før injeksjon blander du 12,5 μL av adenin- og proteinblandingen med 12,5 μL H2O2 for å lage en endelig konsentrasjon på 1 mM Adenin, 5 μM protein og 100 mM H2O2. Rør forsiktig opp og ned for å blande, spinn raskt ned og injiser 25 μL ved hjelp av injeksjonsporten innen 10 sekunder etter blanding.
  8. Sett injeksjonsventilen i injeksjonsposisjon og vent mens prøven behandles.
  9. Gjenta oppkjøpet med 500 V, 750 V, 1000 V og 1250 V. Utfør hver spenningsmåling i triplikat.
  10. Beregn gjennomsnittlig absorbans som beskrevet i trinn 4.5. Kopier og lim inn alle data i Excel.

6. Slå av systemet

  1. Når alle prøvene er samlet inn, spyler du ut sprøyteporten og prøvesløyfen ved å sette injeksjonsventilen ned til lasteposisjonen og injisere 25 μL HPLC-vann fem ganger.
  2. Vri injeksjonsventilen opp til injeksjonsposisjonen for å skylle resten av systemet med HPLC-vann.
  3. Stopp flyten, lukk systemkontrollprogramvaren, og slå av modulene som starter med produktoppsamleren, dosimetermodulen, fotolysemodulen, og til slutt fluidikkmodulen.

7. Prøvepreparering og flytende kromatografi-massespektrometri

  1. Denaturer proteinet ved å inkubere prøver ved 80 °C i 20 minutter i nærvær av 50 mM Tris og 1 mM CaCl2. Avkjøl prøver til romtemperatur og tilsett 1:20 trypsin til protein. Fordøye proteinet over natten ved 37 °C med prøveblanding. Neste morgen, avslutt trypsin fordøyelsen ved oppvarming prøver til 95 °C i 10 minutter.
  2. Oppdag peptider ved hjelp av et høyoppløselig LC-MS/MS-system koblet til et UPLC-system.
  3. Legg prøven først på fellesøylen (300 μm ID X 5 mm 100 Å porestørrelse, 5 μm partikkelstørrelse) og vask ved 5,0 μL/ml i 3 min med vann som inneholder 2% løsningsmiddel B (acetonitril og 0,1% maursyre).
  4. Skill peptidene på en C18 nanocolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm partikkelstørrelse, 100 Å porestørrelse) med en strømningshastighet på 300 nL/min med en gradient mellom løsningsmiddel A (vann som inneholder 0,1 % maursyre) og løsningsmiddel B. Gradienten for peptid elution består av en lineær økning fra 2 til 35% B over 22 min, trappet til 95% B over 5 min og holdt i 3 min for å vaske kolonnen, og deretter returnert til 2% B over 3 min og holdt i 9 minutter for å re-likevekte kolonnen.
  5. Hent dataene i positiv ionmodus. Sett sprayspenningen til 2400 V, og temperaturen på ionoverføringsrøret til 300 °C.
  6. Hent de fullstendige MS-skanningene fra 250-2000 m/z etterfulgt av åtte påfølgende dataavhengige MS/MS-skanninger på de åtte mest tallrike peptidionene. Bruk kollisjonsindusert dissosiasjon ved 35 % normalisert energi for å fragmentere peptidene.
  7. Identifiser alle de umodifiserte peptidene som er oppdaget fra MS / MS-analyse ved hjelp av en tilgjengelig proteinanalyseprogramvare mot den nødvendige FASTA-filen som inneholder proteinsekvensen og det relevante proteolytiske enzymet.
  8. Søk etter og kvantifiser modifiserte peptider ved hjelp av en HRPF-programvare for databehandling. Omfanget av oksidasjon for hvert identifiserte peptid beregnes ved å dele det oppsummerte kromatografiske toppområdet til et modifisert peptid ved det totale kromatografiske toppområdet til det peptidmodifiserte og umodifiserte ved hjelp av ligning 3.
    P = [I(singly oksidert) X 1 + I (dobbelt oksidert) X 2 + I(triply oksidert) X 3 + .../[Iunoxidized + I(enkeltoksidert) + I(dobbelt oksidert) + I(triply oksidert) ...]
    hvor P betegner gjennomsnittlig antall oksidasjonshendelser per peptidmolekyl, og jeg representerer toppområdet til det oksiderte peptidet (Iunoxidized) og peptidet med n oksidasjonshendelser.

8. For en differensialstudie gjentar du trinn 5-7 på den andre tilstanden.

MERK: For å bekrefte reproduserbarhet anbefales to biologiske replikasjoner i tillegg til tekniske triplikater for hver tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Høytrykks plasmakilden kombinert med sanntidsdosimetri gir bedre kontroll over ▪OH-utbytte for å observere endringer i høyere ordens proteinstruktur mer nøyaktig. Tilsetningen av adenin gir mulighet for et effektivt radikalt dosimeter i sanntid. Ved oksidasjon mister adenin UV-absorbans ved 265 nm (Figur 2A). Endringen i adeninabsorbering er direkte relatert til konsentrasjonen av radikalere som er tilgjengelige for HRPF, og gir dermed et middel til effektivt å overvåke endringer i radikal konsentrasjon i nærvær av radikale scavengers som buffere, hjelpestoffer og ligander (Figur 2B).

Apomyoglobin (aMb) ble modifisert i nærvær av 100 mM H2O2 og 1 mM adenin ved fire økende plasmaspenninger (Figur 3). Seks peptider ble påvist med en lineær økning i oksidasjon med endring av adenin UV 265 nm absorbans. Adenin UV-absorbans er en surrogat for effektiv ▪OH-konsentrasjon. Den lineære endringen i oksidasjon kontra endringen i radikal konsentrasjon bekrefter fraværet av artefaktuell endring i proteinets høyere ordens struktur under merking. Videre var omfanget av oksidasjon oppdaget med høytrykks plasmakilden mye høyere enn den laserbaserte metoden. Denne økningen kommer fra høytrykks plasmakildens bredspektret UV-utslippsspekter (figur 4). Ved å produsere et bredt UV-spektrum overlapper plasmakilden absorbansdomenet H2O2 bedre og gir mer effektiv produksjon av ▪OH gjennom fotolysen til H2O2 (figur 5). Dette er i direkte sammenligning med KrF Excimer laser og Nd:YAG laser, som er vanlige kilder som fotolyser H2O2 i HRPF-studier21,27,28. Disse laserne har en veldig smal båndbredde i den nedre enden av H2O2's fotometriske absorbansområde. Sammenlignet med KrF-eksitasjonslaseren øker høytrykksplasmakilden produksjonen av ▪OH-er betydelig, samtidig som etterspørselen etter nødvendig optisk influensa reduseres betydelig (Figur 6).

Figure 1
Figur 1: Komponenter i flash-fotolyseplattformen. (A) Montert kapillærrør, koblingsrør, mutter og ferrule. Spissen av den "nedre enden" av kapillæren strekker seg knapt utover koblingsrøret. (B) Riflet mutter på produktoppsamleren for å sette inn enden av kapillæren. (C) Merket seksports injeksjonsventil. (D) Sprøytepumpe med sprøyten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Endring i adeninabsorbering som brukes til dosimetri. (A) Ved oksidasjon reduseres adenin ved UV-absorbans ved 265 nm. (B) Endring i adeninabsorbering ved 265 nm ved forskjellige blitsspenninger for to buffere. Buffer 2 inneholder en radikal scavenger som vil redusere endringen i adeninabsorbering sammenlignet med buffer 1. For å overvinne de radikale scavenging effektene fra buffer 2, er økt blitsspenning nødvendig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Responskurve for apomyoglobindose. (A) Gjennomsnittlig oksidasjon av seks peptider vs adenin endring i absorbans er vist. FPOP-oksidasjonsnivåer vises i de stiplede linjene. (B) De seks oksiderte peptidene er merket på en krystallstruktur av myoglobin (PDB: 3RGK). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Spektral bestråling av plasmalampen. Høytrykks Xe gasslampe avgir bredspektret UV-stråling fra 200-300 nm sammen med synlig lys. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: H2O2 fotometrisk absorbansspektra. Det svarte sporet er UV-absorbansspekteret av H2O229. Uthevet i lilla er de smale bølgelengdene til KrF excimer laser (248 nm) og Nd:YAG laser (265 nm) produserer mens den blå pilen representerer bredspektret plasmakilde som utvider rekkevidden av nyttig H2O2 absorbans. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Effekt av plasmakilden for å fotolysere H2O2. Endringen i adeninabsorbering over økt plasmafluensa viser konsentrasjonen av ▪OHs generert. Uthevet i lilla er en typisk maks endring i absorbans produsert fra en KrF excimer laser25. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er flere kritiske trinn for å sikre riktig merking av proteiner under et HRPF-eksperiment. For det første velges en passende strømningshastighet og kildeblitshastighet for å sikre at hver bolus av prøven bestråles en gang. Dette sikrer at proteinet blir utsatt for en enkelt bolus av nydannede ▪OH. Når et protein er oksidert, kan proteinstrukturen med høyere rekkefølge endres. For å være trygg på at den opprinnelige proteinstrukturen er undersøkt, må hvert proteinmolekyl endres på et enkelt øyeblikk. Dosimetri kan brukes til å teste om den opprinnelige proteinstrukturen er undersøkt. Ettersom konsentrasjonen av hydroksylradikale øker omfanget av oksidasjon lineært øker hvis den opprinnelige proteinstrukturen er undersøkt. Men hvis en stor konsentrasjon av hydroksylradikaler får proteinet til å utfolde seg delvis under merking, vil omfanget av oksidasjon øke betydelig og dermed gi et effektivt middel for å sikre at den opprinnelige proteinstrukturen blir undersøkt.

Det er også viktig å sikre at reaksjonen slukkes på riktig måte. Dette inkluderer å inkorporere en riktig radikal scavenger blandet med proteinet under merkeprosessen. For denne metoden brukes adenin ikke bare til dosimetri, men også scavenges ▪OH som begrenser levetiden til det radikale da det merker proteinet. Ved å begrense levetiden til det radikale, oppnås tillit til at den innfødte proteinstrukturen blir modifisert. Etter merkingsprosessen er det viktig å samle prøven i en slukkeløsning som inneholder katase og metionin midt i som vil bryte ned overflødig H2O2 og scavenge ▪OH. Begrensning av proteinets eksponering for H2O2 sikrer at H2O2 indusert oksidasjon minimeres.

Det er også viktig å velge en protease for peptid fordøyelse. Mange enzymer cleave proteinet på bestemte steder. For eksempel, trypsin cleaves på karboksylsiden av arginin og lysinrester. Dette gir mulighet for enkel dataanalyse, men hvis proteinet av interesse har et begrenset antall argininer og lysiner, kan en alternativ protease eller en blanding av proteaser være nødvendig for akseptabel peptiddekning under nedenfra-og-opp-proteomikk. Det anbefales også å fordøye det modifiserte proteinet før langtidslagring for å unngå tap av oksidert protein på grunn av aggregering og / eller løselighetsproblemer.

Å bruke HRPF til å studere endringer i proteinstruktur og proteininteraksjoner har vært svært vellykket11,30,31,32,33, men det er tilsatt komplikasjoner mens du merker hemebindende proteiner eller glykoproteiner. Mens både hemebinding34 og glykoproteiner35 har blitt vellykket undersøkt ved hjelp av HRPF, må grundig feilsøking i konsentrasjonen av H2O2, radikal scavenger og tidsrammen for H2O2-eksponering balanseres. I tillegg slukker noen buffere mye ▪OHs. Derfor er det viktig å velge en passende buffer og begrense hjelpestoffer som DTT og DMSO. Typiske buffere som brukes under et HRPF-eksperiment inkluderer acetat, natriumfosfat, fosfatbufret saltvann eller lave konsentrasjoner av Tris-buffer. Interessant nok scavenges Tris noen ▪OH, men etter oksidasjon øker den i fotometrisk absorbans ved 265 nm og kan brukes i stedet for adenin for dosimetri36. Selv om noen buffere kan redusere den effektive konsentrasjonen av ▪OH, kan disse utfordringene overgås ved å innlemme et in-line radikalt dosimeter.

HRPF bruker ikke-spesifikk irreversibel merking ved å ▪OH for å undersøke tilgjengeligheten av løsningsmidler. Etikettens ikke-spesifikke karakter gir økt generell dekning sammenlignet med andre mer målrettede fotavtrykksmetoder, inkludert N-etylmaleimid37 og glycin etyl ester38. Siden modifikasjonen er irreversibel, er god tid tilgjengelig under prøvehåndtering. Dette gir mulighet for fullstendig protein fordøyelse og en lang LC gradient for forbedret MS / MS analyse. For HRPF er det flere metoder for å generere ▪OH. En populær metode bruker en laser for å fotolysere H2O2 i ▪OH. Laserbaserte plattformer har vært svært vellykkede med å undersøke innfødt proteinstruktur, men de krever omfattende sikkerhetsforanstaltninger, strengt vedlikehold og en betydelig mengde plass.

Ved bruk av en høytrykks plasmakilde beskrevet her, er det ikke behov for skadelige gasser og ingen frykt for bortkommen UV-stråling. Levetiden til hver høytrykks plasmakilde er nok til å merke mellom 180-200 prøver, og i tillegg til å overvåke dosimeterresponsen, er det ikke nødvendig med ytterligere vedlikehold. Plasmakilden er under høyt trykk, så mens du håndterer plasmakilden, bruk vernebriller. Plasmakilden fotolyserer også H2O2 mer effektivt, noe som gir økt proteinmodifisering. Hvis det ikke observeres tilstrekkelig merking, kan H2O2-konsentrasjonen økes sammen med å øke lampeenergien for tilsetning av radikal produksjon. I tillegg, med inkorporering av sanntids dosimetri, kan man øke reproduserbarheten av eksperimenter. Til sammen, med bruk av en plasmakilde kombinert med sanntids dosimetri og programvare for automatisert FPOP-databeregning, gir en fordelaktig pakke for å utføre HRPF-eksperimenter i en trygg, enklere å betjene og med forbedret reproduserbarhet, sammenlignet med standard laserbaserte metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

E.E.C., J.S.S., og S.R.W. avslører en betydelig økonomisk interesse i GenNext Technologies, Inc., et tidlig selskap som søker å kommersialisere teknologier for høyere orden proteinstrukturanalyse. De oppgitte representative dataene er gjennomgått av S.K.M., som ikke har noen økonomisk interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 og R44GM125420).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum (2016).
  30. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  31. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  32. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  33. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  34. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  35. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  36. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  37. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  38. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

Tags

Biokjemi utgave 172 biofarmasøytisk biosimilar høyere ordrestruktur rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) hydroksylradikale proteinfotavtrykk (HRPF) epitopkartlegging reseptor-legemiddelinteraksjon proteinproteininteraksjon
Laserfri hydroksylradikale proteinfotavtrykk for å utføre strukturell analyse av proteiner med høyere orden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinberger, S. R., Chea, E. E.,… More

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter