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Biochemistry

Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61861
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

Summary

Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l'impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell'ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.

Abstract

L'impronta proteica radicale idrossile (HRPF) è una tecnica di analisi strutturale emergente e promettente di ordine superiore che fornisce informazioni sui cambiamenti nella struttura proteica, sulle interazioni proteina-proteina o sulle interazioni proteina-ligando. HRPF utilizza radicali idrossilici(▪OH) per etichettare irreversibilmente la superficie accessibile al solvente di una proteina. La complessità intrinseca, i costi e la natura pericolosa delle prestazioni hrpf hanno sostanzialmente limitato l'adozione su larga scala in biofarmacia. Questi fattori includono: 1) l'uso di laser complicati, pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezza sostanziali; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studi comparativi. Questa pubblicazione fornisce un protocollo per il funzionamento di un sistema HRPF senza laser. Questo sistema HRPF senza laser utilizza una tecnologia di ossidazione flash sorgente di luce al plasma ad alta energia e alta pressione con dosimetria radicale in linea. La sorgente luminosa al plasma è più sicura, più facile da usare e più efficiente nella generazione di radicali idrossili rispetto ai sistemi HRPF basati su laser, e il dosimetro radicale in linea aumenta la riproducibilità degli studi. Combinato, il sistema HRPF senza laser risolve e supera le carenze e i limiti menzionati delle tecniche basate su laser.

Introduction

La conformazione proteica e la struttura di ordine superiore associata (HOS) sono i principali determinanti della corretta funzione biologica e del comportamento aberrante1. Lo stesso vale per i biofarmaci, la cui struttura e attività funzionale dipendono da vari aspetti della loro produzione e del loro ambiente. Il cambiamento biofarmaceutico nell'HOS è stato collegato a reazioni avverse ai farmaci (ADR) attribuite alla farmacologia indesiderabile e alla risposta immunologicadel paziente 2,3. La comparsa di ADR ha allertato l'industria biofarmaceutica sul ruolo critico che la proteina HOS svolge nella sicurezza e nell'efficacia della bioterapia e hanno stabilito la necessità di nuove e migliorate analisi HOS4.

L'ingombro di proteine radicali idrossili (HRPF) è una tecnica promettente per tenere traccia del cambiamento nella proteina HOS. HRPF comporta l'etichettatura irreversibile dell'esterno di una proteina con ▪OH seguita da analisi di spettrometria di massa (MS) per identificare la superficie accessibile al solventedella proteina 5,6,7. HRPF è stato utilizzato con successo per rilevare difetti nella proteina HOS e la suafunzione 8,9, caratterizzano l'HOS degli anticorpi monoclonali (mAb)10,11,12,13,determinare il Kd legante di un ligando14,e molto altro15,16,17,18,19. Un metodo comune per generare il ▪OH per HRPF è l'ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP), che impiega laser UV veloci ad alta energia per produrre ▪ OH dallafotolisi di H2O2. Per la maggior parte, FPOP utilizza costosi laser ad eccimeri che impiegano gas pericoloso (KrF) che richiede garanzie sostanziali per evitare lesioni respiratorie eoculari 20. Per evitare rischi di inalazione, altri hanno utilizzato laser in alluminio al neodimio yttrium alluminio quadruplicati a frequenza (Nd:YAG)21, che eliminano l'uso di gas tossici ma sono ancora costosi, richiedono una significativa competenza operativa e richiedono ampi controlli della luce vagante per proteggere gli utenti dalle lesioni agli occhi.

Sebbene sia possibile ottenere ampie informazioni utilizzando HRPF, non è stata soddisfatta un'ampia adozione in biofarmacia. Due ostacoli per la limitata adozione dell'HRPF comprendono: 1) l'uso di laser pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezzasostanziali 20; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studicomparativi 22. Per soppiantare l'uso del laser, è stata sviluppata un'unità di fotolisi flash al plasma ad alta velocità e ad alta energia per eseguire in modo sicuro FPOP in modo semplice. Per migliorare l'irriducibilità degli esperimenti HRPF, viene implementata la dosimetria radicale in tempo reale.

La pratica dell'HRPF è stata limitata dall'irriducibilità attribuita allo scavenging di fondo ▪OH22. Mentre ▪OH sono eccellenti sonde di topografia proteica, reagiscono anche con molti costituenti trovati nei preparati, rendendo necessario misurare l'effettiva concentrazione di radicale disponibile per ossidare una proteina bersaglio. Variazioni nella preparazione del tampone, concentrazione di perossido di idrogeno, proprietà del ligando o fotolisi possono causare differenze di ossidazione tra il controllo e gruppi sperimentali che creano ambiguità negli studi differenziali HOS. L'aggiunta della dosimetria radicale in tempo reale consente la regolazione dell'effetto ▪carico OH e quindi aumenta la confidenza e la riproducibilità durante un esperimento HRPF. L'uso della dosimetria radicale nell'FPOP è stato descritto altrove23,24,25, ed è ulteriormente discusso in dettaglio in una recente pubblicazione26. Qui descriviamo l'uso di un nuovo sistema di fotolisi flash e dosimetria in tempo reale per etichettare l'apo-mioglobina equina (aMb), confrontando i livelli di ossidazione peptidica in un esperimento FPOP con quello ottenuto quando si utilizza un laser ad eccimeri.

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Protocol

1. Installazione del tubo capillare

  1. Utilizzando una pietra di scissione della silice, scindere il capillare di silice di diametro interno (ID) di 250 μm a 27 pollici. Controllare le estremità capillari per un taglio pulito e dritto.
  2. Creare due finestre di circa 15 mm di lunghezza bruciando via il rivestimento in poliimmide. Partendo dall'"estremità inferiore" si fa la prima finestra di fotolisi a 90 mm di distanza dall'"estremità inferiore" e la seconda finestra del dosimetro a 225 mm di distanza dall'"estremità inferiore".
    NOTA: Una volta bruciato il rivestimento, il capillare è molto fragile.
  3. Svitare il dado e il ferrule alla porta 5 e inserire l'"estremità inferiore" del capillare appena oltre l'estremità conica del ferrule(Figura 1A).
  4. Sul modulo di fotolisi, rimuovere il cappuccio della cella di fotolisi tirandolo direttamente fuori e quindi rimuovere la maschera metallica montata magneticamente che terrà il capillare in posizione.
    ATTENZIONE: All'interno del cappuccio della cella di fotolisi c'è uno specchio curvo, non permettere a nulla di toccare lo specchio.
  5. Sul modulo dosimetro aprire la cella del dosimetro spingendo sulla linguetta a sinistra e aprire la cella del dosimetro a destra. Rimuovere le clip montate magneticamente che tratteneranno il capillare in posizione.
  6. Posizionare il capillare nel canale scanalato nella base della cella di fotolisi. Centrare la finestra capillare con la finestra della cella di fotolisi. Tenendo il capillare in posizione con una mano, aggiungere la maschera magnetica per tenere il capillare in posizione. Riposizionare il cappuccio della fotolisi.
  7. Posizionare il capillare nel canale scanalato nella base della cella del dosimetro. Centrare la seconda finestra capillare sulla piccola apertura al centro della base cellulare del dosimetro. Tenendo il capillare in posizione con una mano, posizionare le due clip magnetiche in posizione per mantenere il capillare in posizione. Chiudere la cella del dosimetro fino a quando non fa clic su chiuso.
  8. Inserire il capillare attraverso il dado zigrinato in cima al sollevatore capillare del raccoglitore di prodotti(Figura 1B). Estendere il capillare appena sopra il fondo del flaconcino.
    NOTA: È importante che il capillare raggiunga il fondo del flaconcino per assicurarsi che il capillare sia immerso nella soluzione di tempra durante l'esecuzione di un esperimento.

2. Installazione di un ciclo di iniezione

  1. Utilizzare tubi in teflon con un diametro esterno di 1/16" e un diametro interno di 0,015" (381 μm). Seguire l'equazione 1 per calcolare la lunghezza dei tubi necessari per il volume desiderato utilizzando l'equazione 1.
    Equation 1
    Dove L è la lunghezza del tubo in millimetri, V è il volume desiderato nei microlitri e d è il diametro interno del tubo in millimetri. Per un volume di iniezione di 25 μL e un diametro interno di 381 μm, la lunghezza del tubo deve essere di circa 219,3 mm.
    NOTA: Per volumi inferiori a 20 μL, utilizzare tubi PTFE con diametro interno di 0,01".
  2. Tagliare i tubi in teflon alla lunghezza necessaria utilizzando una fresa a tubo. Controllare le estremità del tubo per un taglio pulito e dritto.
  3. Inserire un'estremità del nuovo ciclo di iniezione attraverso uno dei dadi e posizionare un nuovo ferrule sull'estremità del tubo. Tenere il ferrule e il dado in posizione e inserire il tubo nella porta 3 della valvola di iniezione fino a quando non si escola nella valvola. Tenere saldamente il tubo e stringere il dito del dado stretto. Utilizzando una chiave inglese, stringere ulteriormente il dado 1/4 di giro. Rimuovere e ispezionare l'assieme.
    NOTA: Se il ferrule non è fissato in posizione, reinstallare e stringere ulteriormente 1/8. Ripetere con l'altra estremità del ciclo.
  4. Una volta che entrambe le estremità hanno un dado e un ferrule fisso, avvitare liberamente un'estremità alla porta 3 e l'altra estremità alla porta 6 (Figura 1C). Una volta in posizione stringere entrambi i lati a dito stretto, quindi 1/4 girare oltre il dito stretto con una chiave inglese.

3. Inizializzare il sistema di fotolisi

  1. Accendere i moduli di fotolisi nel seguente ordine: (1) Modulo fluidics (2) Modulo di fotolisi (3) Modulo dosimetrico (4) Raccoglitore prodotti, e infine (5) il computer di sistema e avviare il software di controllo
    NOTA: Lasciare che il modulo dosimetro almeno mezz'ora si il riscaldamento da un avvio a freddo.
  2. Immergere completamente i tubi dalla posizione "Valve" sulla pompa della siringa (Figura 1D) in 10 ml di tampone. Posizionare i tubi dalla posizione "Rifiuti"(figura 1D)e i tubi della porta 2 sulla porta della siringa (Figura 1C) in un contenitore vuoto per raccogliere i rifiuti.
    NOTA: Usa il buffer in cui la tua proteina verrà sospesa. Un buffer consigliato è 10 mM NaPO4.
  3. Sulla giostra Del Collettore di Prodotto, posizionare tubi a microcentrifugo da 1,5 ml nella posizione contrassegnata con H e 6.
  4. Se si utilizza un capillare ID 250 μm, impostare la portata di carico su 500 μL/min, la portata di elaborazione a 7,5 μL/min e la portata di scarto a 500 μL/min.
  5. Calcola il ritardo del flash, il tempo del prodotto e il tempo di perdita per utilizzare la modalità semiautomatica usando l'equazione 2.
    Equation 2
    Dove t è il tempo in minuti, s è la distanza capillare in millimetri, d è il diametro interno del capillare in millimetri, e f è la portata in μL/min.
    1. Per il ritardo del flash, la distanza è dall'"estremità inferiore" del capillare alla prima finestra, che dovrebbe essere di circa 90 mm. Utilizzando un capillare ID 250 μm e una portata di elaborazione di 7,5 μL/min, il campione arriverà alla finestra di fotolisi in circa 35 secondi. Consentire due flash a 1 Hz prima dell'arrivo dei campioni, quindi impostare il ritardo del flash su 33 secondi.
    2. Per il tempo del prodotto, inserire la quantità di tempo che la soluzione iniettata richiederà per fluire dalla valvola di iniezione alla fine del capillare. Per un capillare ID lungo 27" da 250 μm, impostare il tempo di prodotto su 4,5 minuti.
    3. Per il tempo di perdita, immettere il tempo necessario per raccogliere il volume totale della soluzione iniettata. In questo momento, il collettore di prodotti si sposterà dalla posizione del prodotto al flaconcino di scarto. Per un volume di iniezione di 25 μL e una portata di 7,5 μL/min, impostare il tempo di perdita su 7,8 minuti.
  6. Risciacquare il circuito di iniezione cinque volte iniettando 25 μL di acqua di grado HPLC nella porta di iniezione con la valvola di iniezione impostata sulla posizione di carico.
  7. Ruotare manualmente la valvola di iniezione fino a "posizione di iniezione" per scaricare il resto del sistema. Selezionare Processo (Out) sul software di controllo per iniziare a scorrere l'acqua. Durante il flusso, sollevare il sollevatore capillare del collettore di prodotto selezionando Su sotto il raccoglitore di prodotti in modo da poter vedere la fine del capillare. Scorrere l'acqua attraverso il capillare fino a regolare una goccia.
    NOTA: Se una goccia non si forma, controllare la presenza di perdite nella valvola dell'iniettore. Se c'è una perdita, allentare il dado, risediare il capillare e il retighten.

4. Determinare l'▪o rendimento OH per testare gli effetti di scavenging radicale dal buffer.

  1. Nel software di controllo avviare il flusso selezionando Processo (Out). Nella scheda impostazioni impostare la tensione flash su 0 V. Nella scheda Controllo manuale della sezione dati del dosimetro selezionare Avvia dati + AutoZero.
  2. Selezionare la posizione per il flaconcino del prodotto (H) e il flaconcino di scarto (6).
  3. Selezionare Pronto, abbassare manualmente la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 μL di 1 mM di Adenine con 100 mM H2O2 nella porta di iniezione. Una volta iniettato, ruotare manualmente la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione.
    NOTA: Questo attiva automaticamente il sistema per iniziare il flusso, accendere la sorgente plasmatica e acquisire i dati di dosimetria.
  4. Aumentare la tensione navigando verso la scheda impostazioni e modificando la tensione del flash. Ripetere i passaggi 4.2 e 4.3 utilizzando 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Eseguire la lettura dell'assorbanza di adenina ad ogni tensione in triplicati.
  5. Selezionare la scheda calcoli per determinare l'assorbanza media di ogni campione. Fare innanzitutto clic su Seleziona, quindi selezionare manualmente l'inizio e la fine dell'assorbanza del picco. Nello spazio disponibile scrivere in una descrizione dell'esempio. Ripetere l'evento per tutti i dati acquisiti.
    NOTA: Le bolle possono formarsi causando un picco nella lettura del dosimetro. Quando si selezionano i dati per determinare l'assorbanza media, omettere le aree con bolle.
  6. Copiare e incollare i dati in Excel per calcolare la variazione media dell'assorbanza dell'adenina per ogni tensione, determinando così l'effettiva ▪di OH.
  7. Ripetere i passaggi 4.1-4.6 se vengono utilizzate più condizioni del campione (buffer/additivi diversi) per normalizzare l'efficace ▪OH per ogni condizione.

5. Modifica delle proteine per rilevare i cambiamenti nella struttura di ordine superiore.

  1. Mescolare 4 mM di adenina con 20 μM di proteine in un rapporto uno a uno per creare una soluzione contenente 2 mM di adenina e 10 μM di proteine.
  2. Fare la soluzione di tempra utilizzando 0,3 mg/mL di catalasi per abbattere il perossido di idrogeno in eccesso e l'ammide metoionina da 35 mM per spegnere eventuali radicali rimanenti. Aliquota 25 μL di soluzione di tempra in un microtubo da 200 μL in modo che un volume uguale di tempra e il prodotto etichettato sia miscelato.
  3. Diluire H2Oda 2 a 200 mM e tenere sul ghiaccio.
  4. Nel software di controllo nella scheda impostazioni, avviare la tensione flash a 0 V per determinare eventuali ossidazioni di fondo.
  5. Nella scheda controllo manuale selezionare Avvia dati + AutoZero, seguito da Processo (Out),quindi Pronto, e infine abbassare la valvola di iniezione nella posizione di carico.
  6. Posizionare una soluzione di tempra nella posizione 1 sul carosello di raccolta del prodotto. Nel software di controllo del sistema cambiare il flaconcino del prodotto su 1.
  7. Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare 12,5 μL della miscela di adenina e proteine con 12,5 μL di H2O2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM di Adenina, 5 μM di proteina e 100 mM H2O2. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare, girare rapidamente verso il basso e iniettare 25 μL utilizzando la porta di iniezione entro 10 secondi dalla miscelazione.
  8. Passare alla valvola di iniezione nella posizione di iniezione e attendere durante l'elaborazione del campione.
  9. Ripetere l'acquisizione con 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Eseguire ogni misurazione della tensione in triplice copia.
  10. Calcolare l'assorbanza media descritta nel passaggio 4.5. Copiare e incollare tutti i dati in Excel.

6. Arrestare il sistema

  1. Dopo aver raccolto tutti i campioni, sciacquare la porta della siringa e il ciclo del campione impostando la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 μL di acqua HPLC cinque volte.
  2. Ruotare la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione per scaricare il resto del sistema con acqua HPLC.
  3. Interrompere il flusso, chiudere il software di controllo del sistema e spegnere i moduli a partire dal raccoglitore di prodotti, modulo dosimetro, modulo di fotolisi, quindi infine il modulo fluidico.

7. Preparazione del campione e cromatografia liquida-spettrometria di massa

  1. Denaturare la proteina incubando campioni a 80 °C per 20 min in presenza di Tris da 50 mM e 1 mM CaCl2. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 1:20 tripina alle proteine. Digerire la proteina durante la notte a 37 °C con miscelazione del campione. La mattina successiva, terminare la digestione della tripina riscaldando i campioni a 95 °C per 10 minuti.
  2. Rilevare peptidi utilizzando un sistema LC-MS/MS ad alta risoluzione collegato a un sistema UPLC.
  3. Caricare prima il campione sulla colonna trappola (ID X 5 mm 5 mm 100 Å pore, dimensione delle particelle di 5 μm) e lavare a 5,0 μL/mL per 3 minuti con acqua contenente il 2% di solvente B (acetonitrile e 0,1% di acido formico).
  4. Separare i peptidi su una nanocolonna C18 (0,75 mm x 150 mm, dimensione delle particelle di 2 μm, dimensione del poro 100 Å) ad una portata di 300 nL/min con un gradiente tra il solvente A (acqua contenente lo 0,1% di acido formico) e il solvente B. Il gradiente per l'eluizione peptidica consiste in un aumento lineare dal 2 al 35% B su 22 min, rampato al 95% B su 5 min e tenuto per 3 minuti per lavare la colonna, per poi tornare al 2% B su 3 min e tenuto per 9 minuti per ri-equilibrare la colonna.
  5. Acquisire i dati in modalità ioni positivi. Impostare la tensione di spruzzatura su 2400 V e la temperatura del tubo di trasferimento ionino a 300 °C.
  6. Acquisire le scansioni MS complete da 250-2000 m/z seguite da otto successive scansioni MS/MS dipendenti dai dati sui primi otto ioni peptidici più abbondanti. Usa la dissociazione indotta da collisione al 35% di energia normalizzata per frammentare i peptidi.
  7. Identificare tutti i peptidi non modificati rilevati dall'analisi MS/MS utilizzando un software di analisi proteica disponibile rispetto al file FASTA necessario contenente la sequenza proteica e l'enzima proteolitico pertinente.
  8. Ricercare e quantificare peptidi modificati utilizzando un software di elaborazione dati HRPF. L'estensione di ossidazione per ogni peptide identificato è calcolata dividendo l'area di picco cromatografica sommata di un peptide modificato per l'area di picco cromatografica totale di quel peptide modificata e non modificata usando l'equazione 3.
    P = [I(singolarmente ossidato) X 1 + I (doppiamente ossidato) X 2 + I(tripli ossidato) X 3 + .../[Iunoxidizzato + I(singolarmente ossidato) + I(doppiamente ossidato) + I(tripli ossidato)...]
    dove P denota il numero medio di eventi di ossidazione per molecola peptidica, e I rappresenta l'area di picco del peptide non idrossizzato(Iunoxidizzato)e il peptide con n eventi di ossidazione.

8. Per uno studio differenziale, ripetere i passaggi 5-7 sulla seconda condizione.

NOTA: Per confermare la riproducibilità, si raccomandano due repliche biologiche oltre a triplicati tecnici per ogni condizione.

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Representative Results

La sorgente plasmatica ad alta pressione accoppiata con la dosimetria in tempo reale consente un migliore controllo della resa di ▪OH per osservare i cambiamenti nella struttura proteica di ordine superiore in modo più accurato. L'aggiunta di adenina consente un dosimetro radicale efficace in tempo reale. Al momento dell'ossidazione, l'adenina perde assorbanza UV a 265 nm (Figura 2A). Il cambiamento nell'assorbanza dell'adenina è direttamente correlato alla concentrazione di radicali disponibile per l'HRPF, fornendo così un mezzo per monitorare efficacemente i cambiamenti nella concentrazione radicale in presenza di spazzini radicali come tamponi, eccipienti e ligandi(Figura 2B).

L'apomioglobina (aMb) è stata modificata in presenza di 100 mM H2O2 e 1 mM di adenina a quattro crescenti tensioni plasmatiche(figura 3). Sei peptidi sono stati rilevati con un aumento lineare dell'ossidazione con il cambiamento dell'assorbanza UV 265 nm di adenina. L'assorbanza UV di adenina è un surrogato per un'▪concentrazione oh. Il cambiamento lineare nell'ossidazione rispetto al cambiamento nella concentrazione radicale conferma l'assenza di cambiamenti artefatto nella struttura di ordine superiore della proteina durante l'etichettatura. Inoltre, l'estensione dell'ossidazione rilevata con la sorgente plasmatica ad alta pressione era molto più alta del metodo basato su laser. Questo aumento deriva dallo spettro di emissione UV ad ampio spettro della sorgente plasmatica ad alta pressione (Figura 4). Producendo un ampio spettro UV, la sorgente plasmatica si sovrappone meglio al dominio di assorbanza di H2O2 fornendo una produzionepiù efficiente di ▪ OH attraverso la fotolisi di H2O2 (Figura 5). Questo è in confronto diretto con il laser KrF Excimer e il laser Nd:YAG, che sono fonti comuni che fotolizzano H2O2 negli studi HRPF21,27,28. Questi laser hanno una larghezza di banda molto stretta all'estremità inferiore dell'intervallo di assorbanza fotometrica di H2O2. Rispetto al laser ad eccimeri KrF, la sorgente plasmatica ad alta pressione aumenta significativamente la produzione di ▪OH, riducendo concomitantemente significativamente la domanda di fluenza ottica richiesta ( Figura6).

Figure 1
Figura 1: Componenti della piattaforma di fotolisi flash. (A) Tubo capillare assemblato, tubo di unione, dado e ferrule. La punta dell'"estremità inferiore" del capillare si estende appena oltre il tubo di unione. (B) Dado zigrinato sul collettore del prodotto per inserire l'estremità del capillare. (C) Valvola di iniezione a sei porte etichettata. ( D )Pompasiringa con la siringa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Variazione dell'assorbanza di adenina utilizzata per la dosimetria. (A) All'ossidazione, l'adenina diminuisce dell'assorbanza UV a 265 nm. (B) Variazione dell'assorbanza dell'adenina a 265 nm a diverse tensioni flash per due buffer. Il tampone 2 contiene uno spazzino radicale che ridurrà la variazione dell'assorbanza dell'adenina rispetto al buffer 1. Per superare gli effetti di scavenging radicali dal buffer 2, è necessaria una maggiore tensione flash. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Curva di risposta alla dose di apomioglobina. (A) Viene mostrata l'ossidazione media di sei peptidi rispetto al cambiamento di assorbanza dell'adenina. I livelli di ossidazione FPOP sono mostrati nelle linee tratteggiate. (B) I sei peptidi ossidati sono etichettati su una struttura cristallina di mioglobina (PDB: 3RGK). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Irraggiamento spettrale della lampada al plasma. La lampada a gas Xe ad alta pressione emette radiazioni UV ad ampio spettro da 200-300 nm insieme alla luce visibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5:Spettri di assorbanzafotometrica H 2 O2.  La traccia nera è lo spettro di assorbanza UV di H2O229. Evidenziate in viola sono le lunghezze d'onda strette del laser ad eccimeri KrF (248 nm) e del laser Nd:YAG (265 nm) mentre la freccia blu rappresenta la sorgente plasmatica ad ampio spettro che estende l'intervallo di assorbanza utile H2O2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Efficacia della sorgente plasmatica per fotolizzare H2O2. Il cambiamento nell'assorbanza dell'adenina rispetto all'aumento della fluenza plasmatica dimostra la concentrazione ▪OH generati. Evidenziato in viola è un tipico cambiamento massimo di assorbanza prodotto da un laser ad eccimeriKrF 25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Ci sono diversi passaggi critici per garantire una corretta etichettatura delle proteine durante qualsiasi esperimento HRPF. In primo luogo, vengono selezionate una portata appropriata e una velocità di infiammamento della sorgente per assicurarsi che ogni bolo del campione sia irradiato una volta. Ciò garantisce che la proteina sia esposta a un singolo bolo di nuovo ▪OH. Una volta che una proteina viene ossidata, la struttura proteica di ordine superiore può essere alterata. Per essere sicuri che la struttura proteica nativa sia sondata, ogni molecola proteica deve essere modificata in un singolo istante. La dosimetria può essere usata per testare se la struttura proteica nativa è sondata. Man mano che la concentrazione di radicale idrossile aumenta linearmente l'estensione dell'ossidazione se la struttura proteica nativa viene sondata. Tuttavia, se una grande concentrazione di radicali idrossili fa sì che la proteina si dispiega parzialmente durante l'etichettatura, l'entità dell'ossidazione aumenterà significativamente fornendo così un mezzo efficace per garantire che la struttura proteica nativa sia sondata.

È inoltre fondamentale garantire che la reazione sia spenta in modo appropriato. Ciò include l'incorporazione di un corretto spazzino radicale mescolato con la proteina durante il processo di etichettatura. Per questo metodo, l'adenina non viene utilizzata solo per la dosimetria, ma anche per scavenges ▪OH limitando la vita del radicale mentre etichetta la proteina. Limitando la durata del radicale, si guadagna la fiducia che la struttura proteica nativa venga modificata. Dopo il processo di etichettatura, è importante raccogliere il campione in una soluzione di tempra contenente catalasi e metinina ammide che scompone l'eccesso di H2O2 e scavenge ▪OH. Limitare l'esposizione della proteina a H2O2 garantisce che l'ossidazione indotta da H2O2 sia ridotta al minimo.

È anche fondamentale selezionare in modo appropriato una proteasi per la digestione peptidica. Molti enzimi scindono la proteina in luoghi specifici. Ad esempio, la tripsina si stacca sul lato carbossile dei residui di arginina e lisina. Ciò consente una semplice analisi dei dati, ma se la proteina di interesse ha un numero limitato di arginine e lisina, potrebbe essere necessaria una proteasi alternativa o una miscela di proteasi per una copertura peptidica accettabile durante la proteomica dal basso verso l'alto. Si consiglia inoltre di digerire la proteina modificata prima della conservazione a lungo termine per evitare la perdita di proteine ossidate a causa di problemi di aggregazione e / o solubilità.

L'utilizzo di HRPF per studiare i cambiamenti nella struttura proteica e nelle interazioni proteiche ha avuto moltosuccesso 11,30,31,32,33 , ma ci sono complicazioni aggiunte durante l'etichettatura di proteine leganti eme o glicoproteine. Mentre sia l'eme binding34 che le glicoproteine35 sono stati sondati con successo utilizzando HRPF, è necessario bilanciare la risoluzione dei problemi approfonditi nella concentrazione di H2O2,spazzino radicale e il periodo di esposizione a H2O2. Inoltre, alcuni buffer si temprano ampiamente ▪OH. Pertanto, è fondamentale selezionare un buffer appropriato e limitare gli eccipienti come DTT e DMSO. I buffer tipici utilizzati durante un esperimento HRPF includono acetato, fosfato di sodio, salina tamponata con fosfato o basse concentrazioni di tampone Tris. È interessante notare che Tris scavenges alcuni ▪OH, ma a seguito dell'ossidazione, aumenta l'assorbanza fotometrica a 265 nm e può essere utilizzato al posto dell'adenina per la dosimetria36. Sebbene alcuni buffer possano ridurre l'effettiva concentrazione di ▪OH, incorporando un dosimetro radicale in linea queste sfide possono essere superate.

HRPF utilizza l'etichettatura irreversibile non specifica ▪ OH per sondarel'accessibilità dei solventi. La natura non specifica dell'etichetta fornisce una maggiore copertura complessiva rispetto ad altri metodi di footprinting più mirati tra cui N-etilmaleimide37 e glicina estere etilico38. Poiché la modifica è irreversibile, è disponibile molto tempo durante la manipolazione del campione. Ciò consente una completa digestione proteica e un lungo gradiente LC per una migliore analisi MS / MS. Per HRPF esistono diversi metodi per generare ▪OH. Un metodo popolare utilizza un laser per fotolizzare H2O2 in ▪OH. Le piattaforme basate su laser hanno avuto molto successo nel sondare la struttura proteica nativa, ma richiedono ampie precauzioni di sicurezza, una manutenzione rigorosa e una notevole quantità di spazio.

Con l'uso di una sorgente plasmatica ad alta pressione qui descritta, non c'è bisogno di gas nocivi e non c'è paura delle radiazioni UV vagante. La durata di ogni sorgente plasmatica ad alta pressione è sufficiente per etichettare tra 180-200 campioni e, oltre a monitorare la risposta del dosimetro, non è necessaria alcuna manutenzione aggiuntiva. La sorgente di plasma è ad alta pressione, quindi durante la manipolazione della fonte plasmatica, indossare occhiali di sicurezza. La sorgente plasmatica fotolizza anche H2O2 in modo più efficiente, consentendo una maggiore modifica delle proteine. Se si osserva un'etichettatura insufficiente, la concentrazione di H2O2 può essere aumentata insieme all'aumento dell'energia della lampada per la produzione di radicali di addizione. Inoltre, con l'incorporazione della dosimetria in tempo reale, si può aumentare la riproducibilità degli esperimenti. Complessivamente, con l'uso di una sorgente plasmatica accoppiata con dosimetria in tempo reale e software per il calcolo automatizzato dei dati FPOP fornisce un pacchetto vantaggioso per eseguire esperimenti HRPF in modo sicuro, più facile da usare e con una migliore riproducibilità, rispetto ai metodi standard basati su laser.

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Disclosures

E.E.C., J.S.S. e S.R.W. rivelano un significativo interesse finanziario in GenNext Technologies, Inc., una società in fase iniziale che cerca di commercializzare tecnologie per l'analisi della struttura proteica di ordine superiore. I dati rappresentativi forniti sono stati esaminati da S.K.M., che non ha alcun conflitto di interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 e R44GM125420).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

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References

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Biochimica Numero 172 Biofarmaceutica Biosimilare Struttura di Ordine Superiore Ossidazione Fotochimica Veloce delle Proteine (FPOP) Impronta proteica radicale idrossile (HRPF) Mappatura epitopica Interazione recettore-farmaco Interazione proteina-proteina
Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine
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Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).

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