Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi

Published: June 4, 2021 doi: 10.3791/61861
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 2
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

Summary

Bu protokol, sıralı radikal dozimetri ve flaş oksidasyon proteini ayak izi gerçekleştirmek için bir plazma ışık kaynağı kullanmak için bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein çalışmalarının hızlı fotokimyasal oksidasyonunun tekrarlanabilirliğini basitleştirmek ve iyileştirmek için tehlikeli UV lazerin yerini alır.

Abstract

Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein yapısındaki değişiklikler, protein-protein etkileşimleri veya protein-ligand etkileşimleri hakkında bilgi sağlayan gelişmekte olan ve umut verici bir yüksek sıralı yapısal analiz tekniğidir. HRPF, bir proteinin çözücü erişilebilir yüzeyini geri döndürülemez bir şekilde etiketlemek için hidroksil radikalleri(▪OH) kullanır. HRPF gerçekleştirmenin doğasında var olan karmaşıklık, maliyet ve tehlikeli doğa, biyofarmada geniş tabanlı benimsemeyi önemli ölçüde sınırladır. Bu faktörler şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren karmaşık, tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı; ve 2) HRPF'nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH'nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility. Bu yayın, lazersiz bir HRPF sisteminin çalışması için bir protokol sağlar. Bu lazersiz HRPF sistemi, sıralı radikal dozimetriye sahip yüksek enerjili, yüksek basınçlı plazma ışık kaynağı flaş oksidasyon teknolojisini kullanır. Plazma ışık kaynağı lazer tabanlı HRPF sistemlerine göre hidroksil radikalleri üretmede daha güvenli, kullanımı daha kolay ve daha verimlidir ve hat içi radikal dozimetre çalışmaların tekrarlanabilirliğini artırır. Lazersiz HRPF sistemi, lazer tabanlı tekniklerin belirtilen eksikliklerini ve sınırlamalarını bir araya getirdiğini ve adını ortaya çıkarmaktadır.

Introduction

Protein uyumu ve ilişkili yüksek düzen yapısı (HOS) uygun biyolojik fonksiyonun ve sapkın davranışın temel belirleyicileridir1. Aynı şey, yapısı ve fonksiyonel aktivitesi üretim ve çevrelerinin çeşitli yönlerine bağlı olan biyofarmasötikler için de geçerlidir. HOS'taki biyofarmasötik değişim, istenmeyen farmakoloji ve hasta immünolojik yanıtına atfedilen advers ilaç reaksiyonları (ADR) ile bağlantılıdır2,3. ADR'lerin ortaya çıkışı, biyofarmasötik endüstrisini protein HOS'un biyoterapötiklerin güvenliğinde ve verimliliğinde oynadığı kritik role karşı uyarmıştır ve yeni ve geliştirilmiş HOS analitiği ihtiyacını ortaya atmıştır4.

Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi (HRPF), protein HOS'taki değişimi izlemek için umut verici bir tekniktir. HRPF, proteinin5,6,7çözücü erişilebilir yüzeyini tanımlamak için kütle spektrometresi (MS) analizi ile takip edilen ▪OH ile bir proteinin dış yüzeyinin geri dönüşü olmayan etiketlemesini içerir. HRPF, protein HOS ve işlevi8 ,9,monoklonal antikorların HOS'u (mAb)10,11, 12,13,bir ligand14'ünbağlayıcı Kd'sini belirlemek ve çok daha fazlası15, 16,17,18,19'u karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. HRPF için ▪OH'yi oluşturmak için yaygın bir yöntem, H 2 O2fotolizisinden ▪OH üretmek için yüksek enerjili, hızlı UV lazerler kullanan Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonudur (FPOP). Çoğunlukla, FPOP solunum ve göz yaralanmalarını önlemek için önemli önlemler gerektiren tehlikeli gaz (KrF) kullanan pahalı excimer lazerler kullanır20. Soluma tehlikelerini önlemek için, diğerleri frekans dörtlü neodimyum alümünyum garnet (Nd:YAG) lazerlerikullandılar 21Toksik gaz kullanımını ortadan kaldırır, ancak hala maliyetlidir, önemli operasyonel uzmanlık gerektirir ve kullanıcıları göz yaralanmasından korumak için kapsamlı başıboş ışık kontrolleri talep eder.

HRPF kullanılarak geniş bilgi elde edilebilse de, biyofarmada geniş benimseme karşılanmadı. Sınırlı HRPF benimsemesi için iki engel şunlardır: 1) önemli güvenlik önlemleri gerektiren tehlikeli ve pahalı lazerlerin kullanımı20; ve 2) HRPF'nin, karşılaştırmalı çalışmaları sınırlayan ▪OH'nun arka plan çöplüğünden kaynaklanan irreproducibility22. Lazer kullanımını desteklemek için, FPOP'u facile bir şekilde güvenli bir şekilde gerçekleştirmek için yüksek hızlı, yüksek enerjili plazma flaş fotoliz ünitesi geliştirilmiştir. HRPF deneylerinin geri alınamazlığını geliştirmek için gerçek zamanlı radikal dozimetri uygulanır.

HRPF uygulaması, ▪OH22'ninarka plan çöplüğüne atfedilen geri alınamazlık ile sınırlanmıştır. ▪OH mükemmel protein topografyası probları olsa da, preparatlarda bulunan birçok bileşenle de reaksiyona girerek, hedef proteini oksitlemek için mevcut olan radikalin etkili konsantrasyonunun ölçülmesi gerekir. Tampon hazırlama, hidrojen peroksit konsantrasyonu, ligand özellikleri veya fotolizdeki varyasyonlar, HOS diferansiyel çalışmalarında belirsizlik yaratan kontrol ve deneysel gruplar arasında oksidasyon farklılıklarına neden olabilir. Gerçek zamanlı radikal dozimetrinin eklenmesi, OH yükü ▪etkinin ayarını sağlar ve bu nedenle bir HRPF deneyi sırasında güveni ve tekrarlanabilirliği arttırır. FPOP'ta radikal dozimetri kullanımı başka bir yerde açıklanmıştır23,24,25, ve yakın tarihli bir yayında daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır26. Burada, bir FPOP deneyindeki peptit oksidasyon seviyelerini bir ekscimer lazer kullanırken elde edilenlerle karşılaştırarak at apo-myoglobin 'i (aMb) etiketlemek için yeni bir flaş fotoliz sistemi ve gerçek zamanlı dozimetri kullanımını açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kılcal borunun takılması

  1. Bir silika dekolte taşı kullanarak, 250 μm iç çap (ID) silika kılcal damarı 27 inç'e bölün. Kılcal uçları temiz ve düz bir kesim için kontrol edin.
  2. Poliimid kaplamayı yakarak kabaca 15 mm uzunluğunda iki pencere oluşturun. "Alt uçtan" başlayarak, ilk fotoliz penceresini "alt uçtan" 90 mm ve ikinci dozimetre penceresini "alt uçtan" 225 mm uzağa yapın.
    NOT: Kaplama yandıktan sonra kılcal damar çok kırılgandır.
  3. 5 numaralı bağlantı noktasındaki somunu ve yüksükleri sökün ve kılcal damarın "alt ucunu" yüksük konik ucunun hemen ötesine yerleştirin (Şekil 1A).
  4. Fotoliz modülünde, fotoliz hücre kapağını doğrudan dışarı çekerek çıkarın ve ardından kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş metal maskeyi çıkarın.
    DİkKAT: Fotoliz hücre kapağının içinde kavisli bir ayna vardır, aynaya hiçbir şeyin dokunmasına izin vermeyin.
  5. Dozimetre modülünde, soldaki sekmeye basarak dozimetre hücresini açın ve dozimetre hücresini sağa doğru açın. Kılcal damarı yerinde tutacak manyetik olarak monte edilmiş klipsleri çıkarın.
  6. Kılcal damarı fotoliz hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin. Kılcal pencereyi fotoliz hücre penceresiyle ortala. Kılcal damarı tek elle yerinde tutarken, kılcal damarı yerinde tutmak için manyetik maskeyi ekleyin. Fotoliz kapağını yerine yerleştirin.
  7. Kılcal damarı dozimetre hücresinin tabanındaki yivli kanala yerleştirin. İkinci kılcal pencereyi dozimetre hücre tabanının ortasındaki küçük diyafram açıklığına ortala. Kılcal damarı bir elinizle yerinde tutarken, iki manyetik klipsi kılcal damarı yerinde tutacak şekilde yerleştirin. Dozimetre hücresini kapalı tıklatana kadar kapatın.
  8. Kılcal damarları, ürün toplayıcının kılcal asansörün üzerine tırtıklı somundan geçirin (Şekil 1B). Kılcal damarı şişenin hemen üstüne uzatın.
    NOT: Kılcal damarın şişenin dibine ulaşması, bir deney çalıştırırken kılcal damarın söndürme çözeltisine batırılmasını sağlamak için önemlidir.

2. Enjeksiyon döngüsü takma

  1. Dış çapı 1/16" ve iç çapı 0,015" (381 μm) olan Teflon boru kullanın. Denklem 1'i takip ederek istenen hacim için gereken boru uzunluğunu hesaplayın.
    Equation 1
    L'nin milimetre cinsinden boru uzunluğu olduğu durumlarda, V mikrolitrelerde istenen hacimdir ve d milimetre cinsinden tüp iç çapıdır. 25 μL enjeksiyon hacmi ve 381 μm iç çap için boru uzunluğunun kabaca 219,3 mm olması gerekir.
    NOT: 20 μL'den küçük hacimler için iç çapı 0,01" olan PTFE boru kullanın.
  2. Teflon boruyu bir tüp kesici kullanarak gerekli uzunluğa kadar kesin. Tüpün uçlarını temiz ve düz bir kesik için kontrol edin.
  3. Yeni enjeksiyon döngüsünün bir ucunun somunlarından bir ucuna yerleştirin ve tüpün ucuna yeni bir yüksük yerleştirin. Yüksük ve somunu yerinde tutun ve tüpü valfte dibe vurana kadar enjeksiyon vanasının 3 numaralı portuna yerleştirin. Tüpü sıkıca tutun ve somun parmağını sıkıca sıkın. Bir anahtar kullanarak, somunu 1/4 daha fazla sıkın. Montajı çıkarın ve inceleyin.
    NOT: Yüksük sabit değilse, 1/8'i yeniden yükleyin ve sıkın. Döngünün diğer ucuyla tekrarlayın.
  4. Her iki ucu da somun ve sabit yüksük olduğunda, bir ucunu 3 numaralı bağlantı noktasına, diğer ucunu da bağlantı noktası 6'ya(Şekil 1C)gevşek bir şekilde vidalayın. Pozisyona girdikten sonra her iki tarafı da sıkılaştırarak parmak sıkın, ardından 1/4'ü bir İngiliz anahtarıyla parmağınızı sıkıca geçin.

3. Fotoliz sistemini başlatın

  1. Fotoliz modüllerini aşağıdaki sırayla açın: (1) Akışkanlar Modülü (2) Fotoliz Modülü (3) Dozimetri Modülü (4) Ürün Toplayıcı ve son olarak (5) sistem bilgisayarı ve kontrol yazılımını başlatın
    NOT: Dozimetre Modülünün soğuk bir başlangıçtan itibaren ısınması için en az yarım saat izin verin.
  2. Şırınna pompası üzerindeki "Valf" konumundan boruyu tamamen10mL tampona batırın. Boruyu "Atık" konumundan (Şekil 1D) ve boruyu şırınna bağlantı noktası üzerindeki 2 numaralı bağlantı noktasından (Şekil 1C) atıkları toplamak için boş bir kaba yerleştirin.
    NOT: Proteininizin askıya alacağı tamponu kullanın. Önerilen arabellek 10 mM NaPO4 'dür.
  3. Ürün Toplayıcı atlıkarıncasına, 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini H ve 6 olarak işaretlenmiş konuma yerleştirin.
  4. 250 μm ID kılcal damar kullanıyorsanız, yük akış hızını 500 μL/dak, işleme akış hızını 7,5 μL/dak ve atık akış hızını 500 μL/dak olarak ayarlayın.
  5. Denklem 2'yi kullanarak Yarı Otomatik Modu kullanmak için flaş gecikmesini, ürün süresini ve zaman kaybetmeyi hesaplayın.
    Equation 2
    Burada t dakika cinsinden zaman, s milimetre cinsinden kılcal mesafe, d milimetre cinsinden kılcal damarın iç çapı ve f μL / dak'taki akış hızıdır.
    1. Flaş gecikmesi için, mesafe kılcal damarın "alt ucundan" kabaca 90 mm olması gereken ilk pencereye kadardır. 250 μm ID kılcal damar ve 7,5 μL/ dk işlem akış hızı kullanarak örnek yaklaşık 35 saniye içinde fotoliz penceresine ulaşacaktır. Numuneler gelmeden önce 1 Hz'de iki flaşın oluşmasına izin verin, bu nedenle flaş gecikmesini 33 saniye olarak ayarlayın.
    2. Ürün süresi için, enjekte edilen çözeltinin enjeksiyon vanasından kılcal damarın sonuna kadar akması için gereken süreyi girin. 27" uzunluğunda 250 μm ID kılcal damar için ürün süresini 4,5 dakika olarak ayarlayın.
    3. Boşa harcanan zaman için, enjekte edilen çözeltinin toplam hacminin toplanması için gereken süreyi girin. Şu anda, ürün toplayıcı ürün konumundan atık şişeye geçecektir. 25 μL enjeksiyon hacmi ve 7,5 μL/dk akış hızı için atık süresini 7,8 dakika olarak ayarlayın.
  6. Enjeksiyon vanası yük konumuna ayarlanmış olarak enjekte etme portuna 25 μL HPLC sınıfı su enjekte ederek enjeksiyon döngüsünü beş kez durulayın.
  7. Sistemin geri kalanını yıkamak için enjeksiyon vanasını manuel olarak 'enjeksiyon konumuna' getirin. Akan suya başlamak için kontrol yazılımında İşlem (Çıkış) seçeneğini belirleyin. Akarken, ürün toplayıcının altında Yukarı'yı seçerek ürün toplayıcı kılcal kaldırmayı kaldırın, böylece kılcal damarın ucunun görebilirsiniz. Bir damlacık oluşana kadar kılcal damardan su akışı.
    NOT: Bir damlacık oluşmazsa, enjektör valfini sızıntılara karşı kontrol edin. Bir sızıntı varsa, somunu gevşetin, kılcal damarı yeniden takın ve yeniden ısıtın.

4. Tampondan radikal atma etkilerini test etmek için gerçek ▪OH verimini belirleyin.

  1. Denetim Yazılımı'nda, İşlem (Çıkış)öğesini seçerek akışı başlatın. Ayarlar sekmesinde flaş voltajını 0 V olarak ayarlayın. Dozimetre verileri bölümündeki El ile Kontrol sekmesinin altında Verileri Başlat + Otomatik Sıfır 'ıseçin.
  2. Ürün şişesi (H) ve atık şişe (6) için pozisyonu seçin.
  3. Hazır'ıseçin, enjeksiyon vanasını manuel olarak yük konumuna getirin ve enjeksiyon portuna 100 mM H 2 O 2 ile25 μL1 mM Adenine enjekte edin. Enjekte edildikten sonra, enjeksiyon vanasını manuel olarak enjekte konumuna getirin.
    NOT: Bu, akışı başlatmak, plazma kaynağını açmak ve dozimetri verilerini almak için sistemi otomatik olarak tetikler.
  4. Ayarlar sekmesine gidin ve flaş voltajını değiştirerek voltajı artırın. 500 V, 750 V, 1000 V ve 1250 V kullanarak 4.2 ve 4.3 adımlarını tekrarlayın.
  5. Her örneğin ortalama emiciliğini belirlemek için hesaplamalar sekmesini seçin. İlk olarak, Seç'i tıklatın, sonra tepe emiciliğinin başlangıcını ve sonunu el ile seçin. Kullanılabilir alana, örneğin bir açıklamasını yazın. Elde edilen tüm veriler için yineleyin.
    NOT: Kabarcıklar dozimetre okumasında bir artışa neden olabilir. Ortalama emiciliği belirlemek için veri seçerken kabarcıklı alanları atla.
  6. Her voltaj için adenin emiciliğindeki ortalama değişimi hesaplamak için Excel'de verileri kopyalayıp yapıştırın, böylece etkili ▪OH verimini belirler.
  7. Her durum için etkili ▪ OH verimini normalleştirmek için birden fazla örnek koşul (farklı tampon/katkı maddeleri) kullanılıyorsa, 4.1-4.6adımlarını yineleyin.

5. Daha yüksek düzen yapısındaki değişiklikleri tespit etmek için proteinin değiştirilmesi.

  1. 2 mM adenin ve 10 μM protein içeren bir çözelti yapmak için 4 mM adenin ile 20 μM proteini bire bir oranında karıştırın.
  2. Kalan radikalleri söndürmek için fazla hidrojen peroksit ve 35 mM methionine amide parçalamak için 0.3 mg/mL katalaz kullanarak söndürme çözeltisini yapın. Aliquot 25 μL söndürme çözeltisi 200 μL mikrotüp içine solüsyon, böylece eşit miktarda söndürme ve etiketli ürün karıştırılır.
  3. H 2 O2ila200 mM'yi seyreltin ve buzda tutun.
  4. Ayarlar sekmesindeki Kontrol Yazılımı'nda, herhangi bir arka plan oksidasyonunu belirlemek için flaş voltajını 0 V'ta başlatın.
  5. Manuel kontrol sekmesinde, Verileri Başlat + Otomatik Sıfırla'yı seçin, ardından İşlem (Çıkış)ve ardından Hazır'ı seçin ve son olarak enjeksiyon vanasını yük konumuna getirin.
  6. Ürün toplama atlıkarıncasının 1 konumuna bir söndürme çözeltisi yerleştirin. Sistem Kontrol Yazılımı'nda ürün şişesini 1 olarak değiştirin.
  7. Enjeksiyondan hemen önce, 12,5 μL adenin ve protein karışımını 12,5 μL H2O 2 ile karıştırarak1 mM Adenin, 5 μM protein ve 100 mM H 2 O2konsantrasyonu yapın. Karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet, hızlı bir şekilde aşağı döndürün ve karıştırmadan sonraki 10 saniye içinde enjeksiyon portu kullanarak 25 μL enjekte edin.
  8. Enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin ve numune işlenirken bekleyin.
  9. 500 V, 750 V, 1000 V ve 1250 V ile tekrar edinim.
  10. Adım 4.5'te açıklandığı gibi ortalama emiciliği hesaplayın. Tüm verileri kopyalayıp Excel'e yapıştır.

6. Sistemi kapatın

  1. Tüm numuneler toplandıktan sonra, enjeksiyon vanasını yük konumuna indirerek şırınma portunu ve numune döngüsünü boşaltın ve beş kez 25 μL HPLC suyu enjekte edin.
  2. Sistemin geri kalanını HPLC suyuyla yıkamak için enjeksiyon vanasını enjeksiyon konumuna getirin.
  3. Akışı durdurun, sistem kontrol yazılımını kapatın ve ürün toplayıcı, dozimetre modülü, fotoliz modülü ve son olarak akışkanlar modülü ile başlayan modülleri kapatın.

7. Numune hazırlama ve sıvı kromatografi-kütle spektrometresi

  1. 50 mM Tris ve 1 mMCaCl2 varlığında 20 dakika boyunca 80 °C'de numuneleri inkübe ederek proteini denatüre edin. Numuneleri oda sıcaklığına soğutin ve proteine 1:20 trypsin ekleyin. Numune karıştırma ile proteini 37 °C'de bir gecede sindirin. Ertesi sabah, trypsin sindirimi numuneleri 10 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtarak sonlandırın.
  2. UPLC sistemine bağlı yüksek çözünürlüklü bir LC-MS/MS sistemi kullanarak peptitleri tespit edin.
  3. Numuneyi ilk olarak bindirme kolonuna yükleyin (300 μm ID X 5 mm 100 şgözenek boyutu, 5 μm partikül boyutu) ve %2 solvent B (asetonitril ve% 0,1 formik asit) içeren su ile 3 dakika boyunca 5,0 μL /mL'de yıkayın.
  4. Peptitleri bir C18 nanokolumn (0,75 mm x 150 mm, 2 μm parçacık boyutu, 100 şgözenek boyutu) üzerindeki peptitleri solvent A (%0,1 formik asit içeren su) ve solvent B arasında bir gradyan ile 300 nL/dk akış hızında ayırın. Peptit salınımı için gradyan, 22 dakika boyunca% 2'den% 35 B'ye doğrusal bir artıştan oluşur, 5 dakika boyunca% 95 B'ye rampalanmış ve sütunu yıkamak için 3 dakika boyunca tutulur ve daha sonra 3 dakika boyunca% 2 B'ye geri döner ve sütunu yeniden eşit hale getirmek için 9 dakika tutulur.
  5. Verileri pozitif iyon modunda alın. Püskürtme voltajını 2400 V'a ve iyon transfer tüpünün sıcaklığını 300 °C'ye ayarlayın.
  6. 250-2000 m/z'den tam MS taramalarını ve ardından en bol sekiz peptit iyonunda sekiz veriye bağımlı MS/MS taraması alın. Peptitleri parçalamak için %35 normalleştirilmiş enerjide çarpışma kaynaklı ayrışma kullanın.
  7. Protein dizisini ve ilgili proteolitik enzimi içeren gerekli FASTA dosyasına karşı mevcut bir protein analiz yazılımı kullanarak MS/MS analizinden tespit edilen tüm değiştirilmemiş peptitleri tanımlayın.
  8. HRPF Veri İşleme Yazılımı kullanarak değiştirilmiş peptitleri arayın ve ölçün. Tanımlanan her peptit için oksidasyonun kapsamı, değiştirilmiş bir peptitin toplam kromatografik tepe alanının, denklem 3 kullanılarak değiştirilen ve değiştirilmeyen peptitin toplam kromatografik tepe alanına bölünmesiyle hesaplanır.
    P = [I(tekli oksitlenmiş) X 1 + I (iki kat oksitlenmiş) X 2 + I(triply oksitlenmiş) X 3 + .../[Iunoxidized + I(tekli oksitlenmiş) + I(iki kat oksitlenmiş) + I( üçkat oksitlenmiş) ...]
    Burada P, peptid molekülü başına ortalama oksidasyon olay sayısını gösterir ve benoksidize peptid(Iunoxidized)ve n oksidasyon olayları ile peptidin tepe alanını temsil ederim.

8. Bir diferansiyel çalışma için, ikinci koşulda 5-7 arası adımları tekrarlayın.

NOT: Tekrarlanabilirliği doğrulamak için, her durum için teknik üç taraflılıklara ek olarak iki biyolojik çoğaltma önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gerçek zamanlı dozimetri ile birleştirilen yüksek basınçlı plazma kaynağı, daha yüksek dereceli protein yapısındaki değişiklikleri daha doğru bir şekilde gözlemlemek için ▪OH veriminin daha iyi kontrol etmesini sağlar. Adenin eklenmesi etkili bir gerçek zamanlı radikal dozimetre sağlar. Oksidasyon üzerine, adenin UV emiciliğini 265 nm'de kaybeder(Şekil 2A). Adenin emiciliğindeki değişiklik, HRPF için mevcut olan radikallerin konsantrasyonu ile doğrudan ilgilidir, böylece tamponlar, ekscipientler ve ligandlar gibi radikal leşçillerin varlığında radikal konsantrasyondaki değişiklikleri etkili bir şekilde izlemek için bir araç sağlar (Şekil 2B).

Apomyoglobin (aMb), dört artan plazma voltajında 100 mM H2O2 ve 1 mM adenin varlığında değiştirilmiştir (Şekil 3). Adenin UV 265 nm absorbansının değişmesiyle oksidasyonda doğrusal bir artışla altı peptit tespit edildi. Adenin UV absorbansı, etkili ▪OH konsantrasyonu için bir vekildir. Oksidasyondaki doğrusal değişim ile radikal konsantrasyondaki değişim, etiketleme sırasında proteinin yüksek sıralı yapısında artektsel değişimin olmadığını doğrular. Ayrıca yüksek basınçlı plazma kaynağı ile tespit edilen oksidasyonun boyutu lazer tabanlı yönteme göre çok daha yüksekti. Bu artış, yüksek basınçlı plazma kaynağının geniş spektrumlu UV emisyon spektrumundan kaynaklanmaktadır (Şekil 4). Geniş bir UV spektrumu üreterek, plazma kaynağı H 2 O2'ninemicilik etki alanıyla daha iyi örtüşür veH2O 2 fotolizi aracılığıyla daha verimli ▪OH üretimi sağlar (Şekil 5). Bu, HRPF çalışmalarında H 2O 2'yifotoleze eden yaygın kaynaklar olan KrF Excimer lazer ve Nd:YAG lazer ile doğrudan karşılaştırıldığında21,27,28. Bu lazerler H 2O2'nin fotometrik absorbans aralığının alt ucunda çok dar bir bant genişliğine sahiptir. KrF excimer lazer ile karşılaştırıldığında, yüksek basınçlı plazma kaynağı ▪OH'ların üretimini önemli ölçüde artırırken, gerekli optik fluans talebini önemli ölçüde azaltır (Şekil 6).

Figure 1
Şekil 1: Flaş fotoliz platformunun bileşenleri. (A) Monte kılcal boru, sendika tüpü, somun ve yüksük. Kılcal damarın "alt ucunun" ucu, sendikal tüpün hemen hemen ötesine uzanır. (B) Kılcal damarın ucunu takmak için ürün toplayıcıya tırtıklı somun. (C) Etiketli altı portlu enjeksiyon vanası. (D) Şırınd ile şırınna pompası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Dozimetri için kullanılan adenin emiciliğindeki değişiklik. (A) Oksidasyon üzerine, adenin UV emiliminde 265 nm'de azalır. (B) İki tampon için farklı flaş voltajlarında 265 nm'de adenin emiciliğinde değişiklik. Tampon 2, arabellek 1'e kıyasla adenin emiciliğindeki değişimi azaltacak radikal bir çöpçü içerir. Tampon 2'den gelen radikal atma etkilerinin üstesinden gelmek için daha fazla flaş voltajı gereklidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Apomyoglobin doz yanıt eğrisi. (A) Emicilikte altı peptit ve adenin değişiminin ortalama oksidasyonu gösterilmiştir. FPOP oksidasyon seviyeleri kesikli çizgilerde gösterilir. (B) Altı oksitlenmiş peptit miyoglobin kristal yapısı üzerinde etiketlenmiştir (PDB: 3RGK). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Plazma lambasının spektral işınlanma. Yüksek basınçlı Xe gaz lambası, görünür ışıkla birlikte 200-300 nm'den geniş spektrumlu UV radyasyonu yayar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: H2O2 fotometrik absorbans spektrumu. Siyah iz H 2 O2 29UVabsorbans spektrumudur. Mor renkle vurgulanan KrF excimer lazer (248 nm) ve Nd:YAG lazer (265 nm) dar dalga boyları üretirken, mavi ok yararlı H2O2 absorbans aralığını genişleten geniş spektrumlu plazma kaynağını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Plazma kaynağının H 2 O2'yifotoyazıya etkinliği. Artan plazma fluansı üzerindeki adenin emilımındaki değişim, üretilen ▪OH'ların konsantrasyonunun arttığını göstermektedir. Mor ile vurgulanan, KrF excimer lazer25'tenüretilen tipik bir emicilik maksimum değişimidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Herhangi bir HRPF deneyi sırasında proteinlerin doğru etiketlenebilmesini sağlamak için birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, numunenin her bolusunun bir kez ışınlandığını emin olmak için uygun bir akış hızı ve kaynak flaş hızı seçilir. Bu, proteinin yeni oluşan ▪OH'nin tek bir bolus'una maruz kalmasını sağlar. Bir protein oksitlendikten sonra, daha yüksek sıralı protein yapısı değiştirilebilir. Yerli protein yapısının araştırıldığından emin olmak için, her protein molekülü tek bir anda değiştirilmelidir. Dozimetri, yerli protein yapısının araştırılıp araştırılmak üzere test etmek için kullanılabilir. Hidroksil radikal konsantrasyonu arttıkça, yerli protein yapısı araştırılırsa oksidasyon kapsamı doğrusal olarak artar. Bununla birlikte, büyük bir hidroksil radikal konsantrasyonu, etiketleme sırasında proteinin kısmen ortaya çıkmasına neden olursa, oksidasyonun boyutu önemli ölçüde artacaktır, böylece yerel protein yapısının araştırılmasını sağlamak için etkili bir araç sağlayacaktır.

Reaksiyonun uygun şekilde söndürülmesini sağlamak da önemlidir. Bu, etiketleme işlemi sırasında proteinle karıştırılır uygun bir radikal çöpçü dahil etmeyi içerir. Bu yöntem için, adenin sadece dozimetri için değil, aynı zamanda proteini etiketlerken radikalin ömrünü sınırlayan ▪OH'yi de çöpe atmaktadır. Radikalin ömrünü sınırlayarak, yerli protein yapısının değiştirildiklerine dair güven kazanılmıştır. Etiketleme işlemi sonrasında, numunenin fazla H 2O 2'yiparçalayacak ve OH'▪çöpe atacak katalaz ve methionine amide içeren bir söndürme çözeltisinde toplanması önemlidir. Proteinin H 2O 2'yemaruz kalmasının sınırlandırılması, H2O2 indüklenmiş oksidasyonun en aza indirilmesini sağlar.

Peptit sindirimi için uygun şekilde bir proteaz seçmek de önemlidir. Birçok enzim proteini belirli yerlerde ayırır. Örneğin, arginin ve lizin kalıntılarının karboksin tarafında tripsin cleaves. Bu basit veri analizine izin verir, ancak ilgi proteini sınırlı sayıda arginin ve lizin varsa, aşağıdan yukarıya proteomik sırasında kabul edilebilir peptit kapsamı için alternatif bir proteaz veya proteaz karışımı gerekebilir. Ayrıca, toplama ve / veya çözünürlük sorunları nedeniyle oksitlenmiş protein kaybını önlemek için modifiye proteinin uzun süreli depolamadan önce sindirilmesi önerilir.

Protein yapısındaki ve protein etkileşimlerindeki değişiklikleri incelemek için HRPF'yi kullanmak çok başarılı olmuştur11,30,31,32,33, ancak heme bağlayıcı proteinleri veya glikoproteinleri etiketlerken ek komplikasyonlar vardır. Hem heme bağlama34 hem de glikoproteinler35 HRPF kullanılarak başarıyla araştırılmış olsa da, H 2 O2, radikalçöpçükonsantrasyonunda kapsamlı sorun giderme ve H 2 O2maruz kalma süresi dengelenmelidir. Ayrıca, bazı arabellekler ▪OH'ları kapsamlı bir şekilde söndürür. Bu nedenle, uygun bir arabellek seçmek ve DTT ve DMSO gibi ekscipientleri sınırlamak çok önemlidir. HRPF deneyi sırasında kullanılan tipik tamponlar asetat, sodyum fosfat, fosfat tamponlu salin veya düşük Tris tampon konsantrasyonlarını içerir. İlginçtir ki, Tris oh ▪biraz çöpe atar, ancak oksidasyondan sonra, 265 nm'de fotometrik emiciliği arttırır ve dozimetri için adenin yerine kullanılabilir36. Bazı tamponlar ▪OH'nin etkili konsantrasyonu azaltsa da, bir sıralı radikal dozimetre ekleyerek bu zorluklar aşılabilir.

HRPF, çözücü erişilebilirliğini araştırmak için ▪OH tarafından spesifik olmayan geri dönüşümsüz etiketleme kullanır. Etiketin spesifik olmayan doğası, N-ethylmaleimide37 ve glisin etil ester38dahil olmak üzere diğer daha hedefli ayak izi yöntemlerine kıyasla genel kapsamın artmasını sağlar. Değişiklik geri döndürülemez olduğundan, numune işleme sırasında geniş bir süre mevcuttur. Bu, tam protein sindirimi ve gelişmiş MS / MS analizi için uzun bir LC gradyanına izin verir. HRPF için ▪OH oluşturmak için çeşitli yöntemler vardır. Popüler bir yöntem, H 2O 2'yi ▪OH'ye fotolize etmek için bir lazer kullanır. Lazer tabanlı platformlar, yerel protein yapısını araştırmada çok başarılı olmuştur, ancak kapsamlı güvenlik önlemleri, sıkı bakım ve önemli miktarda alan gerektirir.

Burada açıklanan yüksek basınçlı plazma kaynağının kullanımı ile zararlı gazlara gerek yoktur ve başıboş UV radyasyon korkusu yoktur. Her yüksek basınçlı plazma kaynağının ömrü 180-200 numune arasında etiketlemek için yeterlidir ve dozimetre yanıtını izlemenin yanı sıra ek bakım gerektirmez. Plazma kaynağı yüksek basınç altındadır, bu nedenle plazma kaynağını kullanırken güvenlik gözlükleri takın. Plazma kaynağı ayrıca H 2 O2'yidaha verimli bir şekilde fotolizeederek protein modifikasyonun artmasını sağlar. Yetersiz etiketleme gözlenirse, H2O2 konsantrasyonu, ilave radikal üretim için lamba enerjisinin artırılması ile birlikte arttırılabilir. Ayrıca, gerçek zamanlı dozimetrinin dahililmesiyle, deneylerin tekrarlanabilirliğini artırabilir. Tamamen, otomatik FPOP veri hesaplaması için gerçek zamanlı dozimetri ve yazılım ile birleştirilmiş bir plazma kaynağının kullanılması, standart lazer tabanlı yöntemlere kıyasla HRPF deneylerini güvenli, kullanımı daha kolay ve geliştirilmiş tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmek için avantajlı bir paket sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

E.E.C., J.S.S., ve S.R.W., daha yüksek düzey protein yapısı analizi için teknolojileri ticarileştirmek isteyen erken aşama bir şirket olan GenNext Technologies, Inc.'e önemli bir finansal ilgiyi açıklamamaktadır. Sağlanan temsili veriler, finansal çıkar çatışması olmayan S.K.M.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R43GM125420 ve R44GM125420) tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Ultraviolet Absorption Spectrum of Hydrogen Peroxide. , Available from: http://www.h2o2.com/technical-library/physical-chemical-properties/radiation-properties/default.aspx?pid=65&name=Ultraviolet-Absorption-Spectrum (2016).
  30. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  31. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  32. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  33. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  34. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  35. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  36. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  37. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  38. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

Tags

Biyokimya Sayı 172 Biyofarmasötik Biyobenzer Yüksek Sıralı Yapı Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonu (FPOP) Hidroksil Radikal Protein Ayak İzlenmesi (HRPF) Epitop Haritalama Reseptör-İlaç Etkileşimi Protein-Protein Etkileşimi
Proteinlerin Daha Yüksek Sıralı Yapısal Analizini Gerçekleştirmek için Lazersiz Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinberger, S. R., Chea, E. E.,… More

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter