उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी विशिष्ट रासायनिक moieties के चयनात्मक, लेबल मुक्त इमेजिंग की अनुमति देता है और यह प्रभावी ढंग से वीवो में लिपिड अणुओं छवि के लिए नियोजित किया गया है । यहां, हम एसआरएस माइक्रोस्कोपी के सिद्धांत का संक्षिप्त परिचय प्रदान करते हैं और कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंसमें इमेजिंग लिपिड भंडारण में इसके उपयोग के तरीकों का वर्णन करते हैं।
लिपिड चयापचय सेलुलर और जीव स्वास्थ्य के लिए आवश्यक एक मौलिक शारीरिक प्रक्रिया है। लिपिड चयापचय के Dysregulation अक्सर मोटापा और हृदय विकारों, प्रकार द्वितीय मधुमेह, और कैंसर सहित कई संबंधित रोगों प्रकाश में लाना । लिपिड मेटाबोलिक विनियमन की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने के लिए, समय और स्थान में वीवो लिपिड भंडारण स्तर में ठीक से मापने के लिए मात्रात्मक तरीके तेजी से महत्वपूर्ण और उपयोगी हो गए हैं। लिपिड भंडारण का विश्लेषण करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए अर्ध-मात्रात्मक हैं या जैव रासायनिक माप के लिए स्थानिक-लौकिक जानकारी की कमी है। उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी एक लेबल मुक्त रासायनिक इमेजिंग तकनीक है जो एक उपकोशिक संकल्प के साथ जीवित कोशिकाओं में लिपिड का तेजी से और मात्रात्मक पता लगाने में सक्षम बनाती है। चूंकि आंतरिक आणविक कंपन से इसके विपरीत का शोषण किया जाता है, एसआरएस माइक्रोस्कोपी जीवित जानवरों में लिपिड की चार-आयामी ट्रैकिंग की अनुमति भी देता है। पिछले दशक में, एसआरएस माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान में छोटे अणु इमेजिंग के लिए उपयोग किया गया है और पारंपरिक फ्लोरोसेंट धुंधला और लिपिड निष्कर्षण विधियों की प्रमुख सीमाओं को दूर किया गया है। प्रयोगशाला में, हमने विभिन्न कोशिकाओं और ऊतकों में लिपिड बूंदों के वितरण और विषमता की जांच करने के लिए शक्तिशाली मॉडल जीव, कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस के लिए उपलब्ध आनुवंशिक और जैव रासायनिक उपकरणों के साथ एसआरएस माइक्रोस्कोपी को संयुक्त किया है और अंततः लिपिड मेटाबॉलिज्म को मिलाने वाले उपन्यास संरक्षित सिग्नलिंग मार्गों की खोज करने के लिए। यहां, हम काम करने वाले सिद्धांतों और एसआरएस माइक्रोस्कोप के विस्तृत सेटअप को प्रस्तुत करते हैं और जंगली-प्रकार और इंसुलिन सिग्नलिंग की कमी उत्परिवर्ती सी एलिगेंसके अलग-अलग विकासात्मक समय बिंदुओं पर लिपिड भंडारण की मात्रा निर्धारित करने में इसके उपयोग के तरीके प्रदान करते हैं।
मोटापा एक वैश्विक स्वास्थ्य समस्या बन गया है जो दुनिया भर की आबादी के एक तिहाई लोगों को धमकी देता है, और यह एक गंभीर चिकित्सा चिंता प्रस्तुत करता है, जो मधुमेह2,हृदय रोग3 और कुछ प्रकार के कैंसर सहित खराब मानसिक स्वास्थ्य1 और घातक बीमारियों के साथ अपने संबंध को देखतेहुए 4। मोटापे के पीछे जैविक समस्याओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए लिपिड मेटाबॉलिज्म का अध्ययन जरूरी है। लिपिड भंडारण के तेजी से और विशिष्ट मात्राकरण में फैटी एसिड और उनके डेरिवेटिव का पता लगाने के साथ-साथ उच्च संवेदनशीलता और अधिमानतः स्थानिक जानकारी के साथ स्टेरॉल युक्त मेटाबोलाइट्स की आवश्यकता होती है। लिपिड छवि के लिए लक्ष्य को चुनौती दे रहे हैं क्योंकि वे आंतरिक फ्लोरेसेंस की कमी है और आसानी से फ्लोरोसेंटी टैग नहीं किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट टैग अक्सर लिपिड अणुओं की तुलना में बड़े होते हैं और इसलिए, वीवो अनुप्रयोगों में रासायनिक रूप से आक्रामक और अव्यावहारिक हो सकते हैं। लिपिड अणुओं5की हाइड्रोफोबिक संरचना को संरक्षित करने के लिए लेबल-मुक्त या न्यूनतम लेबलिंग रणनीति आवश्यक है। इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में हाल के घटनाक्रमों ने जीवित कोशिकाओं, ऊतकों और जीवों में लिपिड के लेबल-मुक्त इमेजिंग के लिए रोमांचक अवसर पैदा किए हैं।
जैविक नमूनों में लिपिड भंडारण विश्लेषण के लिए पारंपरिक दृष्टिकोणों में बायोकेमिकल परख और लिपोफिलिक रंगों के साथ धुंधला प्रोटोकॉल शामिल हैं। बायोकेमिकल क्वांटिफिकेशन परिरूप मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) शामिल है उनके आणविक समाधान में बेजोड़ हैं, लेकिन उन्हें बहुत बड़ी नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है और नमूना तैयारी में आमतौर पर कई घंटे लगते हैं, जो जीवित सिस्टम के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए उनके आवेदन को सीमित करते हैं5। इन परख की एक और बड़ी सीमा स्थानिक जानकारी की कमी है । दूसरी ओर, तेल लाल ओ और सूडान ब्लैक जैसे लिपोफिलिक रंग लिपिड स्टोरेज ऑर्गेनेल्स के ऊतक और सेलुलर वितरण प्रदान करते हैं और एमएस तकनीकों की तुलना में, ये धुंधला तरीके लागत में भी कम हैं और प्रदर्शन करने में आसान हैं। हालांकि, इन धुंधला प्रोटोकॉल निर्धारण की आवश्यकता है, जो लिपिड बूंदों की हाइड्रोफोबिक प्रकृति को प्रभावित कर सकते हैं, उनकी संरचना में कृत्रिम परिवर्तन उत्पन्न करते हैं और परिणामस्वरूप6प्रयोगों के बीच विसंगतियां होती हैं। जैव रासायनिक और धुंधला तकनीकों के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों लिपिड अणुओं छवि और लिपिड इमेजिंग में सुसंगत रमन बिखरने (सीआरएस) माइक्रोस्कोपी के उपयोग में तेजी से वृद्धि करने के लिए लेबल मुक्त तरीकों के लिए खोज करने के लिए नेतृत्व किया है ।
रमन प्रभाव को पहले रमन और कृष्णन द्वारा पहचाना गया था, जहां उन्होंने बताया कि फोटॉन के साथ बातचीत करने पर, एक अणु तरंगदैर्ध्य (जिसे रेले बिखरने) में कोई परिवर्तन नहीं होता है, या शायद ही कभी एक परिवर्तित तरंगदैर्ध्य (जिसे रमन बिखरने कहा जाता है) के साथ बिखरे हुए प्रकाश उत्पन्न कर सकता है और तरंगदैर्ध्य में यह परिवर्तन अणु7के भीतर कार्यात्मक रासायनिक समूहों की विशेषता है। जब एक अणु के भीतर रासायनिक बांड एक घटना फोटॉन द्वारा एक उच्च कंपन ऊर्जा स्तर के लिए उत्साहित हो, पंप फोटॉन कहा जाता है, बिखरे हुए फोटॉन की ऊर्जा, स्टोक्स फोटॉन कहा जाता है, कम हो जाते हैं । अन्यथा, रासायनिक बांड एक कम कंपन ऊर्जा स्तर तक पहुंच सकते हैं यदि वे मूल रूप से उच्च स्तर पर हैं, और बिखरे हुए फोटॉन विरोधी स्टोक्स फोटॉन होने के लिए ऊर्जा प्राप्त करते हैं। घटना और बिखरे फोटॉनों के बीच आवृत्ति अंतर को रमन शिफ्ट के नाम से जाना जाता है। एक अणु के भीतर प्रत्येक रासायनिक बंधन एक विशेषता और मात्रात्मक रमन बदलाव है । उदाहरण के लिए, सीएच2 बॉन्ड में 2,845 सेमी-1का रमन शिफ्ट है, जो फैटी एसिड चेन8में प्रचुर मात्रा में है। यह सहज रमन संकेत आम तौर पर बहुत कमजोर है, जिसने पारंपरिक सहज रमन माइक्रोस्कोपी में इमेजिंग गति को काफी सीमित कर दिया है। इन वर्षों में, सहज रमन माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गति और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। सुसंगत रमन बिखरने वाली माइक्रोस्कोपी, जिसमें सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने (कारें) माइक्रोस्कोपी और उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी शामिल हैं, सबसे हालिया प्रगति है । कारों और एसआरएस में थोड़ा अलग काम करने के सिद्धांत हैं, लेकिन दोनों लेबल-मुक्त तकनीकें हैं जिनमें लाइव इमेजिंग क्षमता है, लिपिड स्टोरेज गतिशीलता पर स्थानिक और लौकिक जानकारी प्राप्त कर सकती है, और केवल छोटे नमूना आकार की आवश्यकता होती है। कारें माइक्रोस्कोपी गैर-सुनाई देती पृष्ठभूमि से ग्रस्त है, जो विभिन्न गैर-रैखिक प्रक्रियाओं से आती है, और कारों के संकेतों में अणु एकाग्रता के साथ गैर-रैखिक संबंध भी होते हैं, जो एक साथ मात्राकरण प्रक्रिया9को जटिल बनाते हैं। कारों माइक्रोस्कोपी के विपरीत, एसआरएस माइक्रोस्कोपी गैर-सुनाई देती पृष्ठभूमि संकेतों को उत्पन्न नहीं करती है और ब्याज के अणु की एकाग्रता पर रैखिक निर्भरता प्रदान करती है। इस प्रकार, वर्तमान में एसआरएस माइक्रोस्कोपी लिपिड इमेजिंग के लिए अधिक व्यापक रूप से उपयोग की जाती है।
एसआरएस माइक्रोस्कोपी में, कमजोर सहज रमन संकेतों को तब परिलक्षित किया जा सकता है जब दो सिंक्रोनाइज्ड लेजर बीम से उत्साहित होते हैं, उनके आवृत्ति अंतर के साथ रासायनिक बांड कंपन आवृत्ति से मेल खाते हैं। अणु सुसंगत उत्तेजन के कारण एक उत्तेजित राज्य के लिए एक बढ़ाया संक्रमण का अनुभव होगा । नतीजतन स्टोक्स फोटॉन जेनरेशन के रेट को बूस्ट करते हैं । नतीजतन, प्रेषित “स्टोक्स” बीम की तीव्रता बढ़ जाती है (रमन लाभ, एसआरजी उत्तेजित) और प्रेषित “पंप” बीम की तीव्रता कम हो जाती है (रमन हानि, एसआरएल उत्तेजित)। एसआरजी या एसआरएल संकेतों का पता लगाने से विशिष्ट रासायनिक बांड10के साथ अणुओं की उत्तेजित रमन बिखरने (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का आधार रेखांकित होता है । यदि दो लेजर बीम के बीच आवृत्ति अंतर ब्याज के अणु के भीतर रासायनिक बांड की कंपन आवृत्ति से मेल नहीं खाती है, तो न तो एसआरजी और न ही एसआरएल सिग्नल उत्पन्न होंगे। एसआरएस माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग गति लगभग 2 माइक्रोसेक प्रति पिक्सेल या 1 सेकंड प्रति फ्रेम है, जो सहज रमन माइक्रोस्कोपी11की तुलना में बहुत तेज है। एसआरएस माइक्रोस्कोपी के लिए विशिष्ट पार्श्व संकल्प विवर्तन सीमित और लगभग 300 एनएम है। इसके अलावा, एसआरएस माइक्रोस्कोपी की दो-फोटॉन ऑप्टिकल प्रक्रियाएं सापेक्ष मोटे ऊतक नमूनों की वॉल्यूमेट्रिक 3 डी इमेजिंग के लिए अनुमति देती हैं और इमेजिंग गहराई 300-500 माइक्रोन तक पहुंच सकती है। कुल मिलाकर, एसआरएस माइक्रोस्कोपी विशिष्ट बायोमॉलिक्यूल्स, विशेष रूप से लिपिड का पता लगाने के लिए एक कुशल, लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीक प्रस्तुत करती है।
लिपिड बूंदें एकल झिल्ली ऑर्गेनेल्स हैं, जो तटस्थ लिपिड के लिए मुख्य सेलुलर भंडारण साइट हैं, जिनमें ट्राइसिलग्लिसॉल (TAGs) और कोलेस्ट्रॉल एस्टर (सीई) शामिल हैं। इन लिपिड अणुओं की फैटी एसिड चेन में सीएच2 बांड8उत्तेजित होने पर 2,845 सेमी-1 पर मजबूत एसआरएस संकेत उत्पन्न करते हैं, जिससे अक्षुण्ण कोशिकाओं, ऊतक वर्गों और यहां तक कि पूरे जीवों में भंडारण लिपिड के स्तर का पता लगाने और मात्रा में वृद्धि होती है12,13,14,15. विशेष रूप से, सी एलिगेंस अपनी पारदर्शिता के कारण लिपिड इमेजिंग अध्ययन के लिए उपयोगी हैं। स्तनधारियों की तरह, सी एलिगेंस लिपिड बूंदों में लिपिड भी स्टोर करते हैं और लिपिड अणुओं के संश्लेषण और क्षरण मार्गअत्यधिक संरक्षित हैं 16। इस प्रोटोकॉल में, हम एसआरएस माइक्रोस्कोपी, इसके मौलिक सेटअप के कार्य सिद्धांत प्रदान करेंगे और सी एलिगेंसमें लिपिड इमेजिंग में इसके उपयोग के तरीकों का वर्णन करेंगे।
मोटापे और उससे जुड़े मेटाबोलिक विकारों के खिलाफ रक्षा में, लिपिड होगोस्टेसिस के नियामक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण अनुसंधान प्रयासों को लागू किया गया है। जैविक नमूनों में लिपिड अणु?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एनआईएच ग्रांट R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.) द्वारा समर्थित किया गया था।), DP1DK113644 (M.C.W.), मार्च ऑफ डिम्स फाउंडेशन (एम.C डब्ल्यू), वेल्च फाउंडेशन (एम.C डब्ल्यू), और HHMI अन्वेषक (M..C.W.) द्वारा । हम सी एलिगेंस उपभेदों के लिए कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) का शुक्रिया अदा करते हैं।
A/D converter | Olympus | Analog Unit | |
Agarose | GeneMate | 3119 | For making agarose pads |
Alignment tool – adapter | Thorlabs | SM1A4 | For mounting the tool on scope |
Alignment tool – target | Thorlabs | VRC2SM1 | For viewing IR laser |
Alignment tool – tube | Thorlabs | SM1L40 | Length can vary |
Autocorrelator (Optional) | APE | pulseCheck | |
Bandpass filter | minicircuits | BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz | For signal with modulation frequency filtering |
BNC cables | |||
Dissection microscope | Nikon | SMZ800 | For handling and picking worms for imaging |
Dodecane | Sigma-Aldrich | 44010 | Used for calibration of the SRS signal |
Filter | Chroma Technology | 890/220 CARS | For removing Stokes beam |
General purpose laboratory labeling tape | VWR | 89097 | For making agarose pads |
Glass coverslips | VWR | 48393-106 | For covering worms for imaging |
Glass microscope slide | VWR | 16004-422 | For making agarose pads |
Laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
Lens | Thorlabs | L1: AC254-050-B L2: AC254-075-B |
For beam expander |
Lock-in amplifier | Zurich | HF2LI | |
Lowpass filter | minicircuits | BLP-1.9+ | For power supply noise suppression |
Mirrors | Thorlabs | BB1-E03 | For relay and periscope |
Objective | Olympus | UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20 | |
Photodiode | Thorlabs | FDS1010 | |
Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
Power supply | TEKPOWER | TP1342U | For photodiode, reversed 50V voltage |
Sodium azide | Sigma | S2002 | For anaesthesizing the worms |
Worm picker | WormStuff | 59-AWP |