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Biology

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Published: May 28, 2021 doi: 10.3791/61870
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Huffington Center on Aging, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Howard Hughes Medical Institute, Baylor College of Medicine

Summary

A microscopia de dispersão de Raman estimulada (SRS) permite imagens seletivas e livres de rótulos de moieties químicos específicos e tem sido efetivamente empregada para imagens de moléculas lipídicas in vivo. Aqui, fornecemos uma breve introdução ao princípio da microscopia SRS e descrevemos métodos para seu uso no armazenamento lipídeto de imagem em Caenorhabditis elegans.

Abstract

O metabolismo lipídico é um processo fisiológico fundamental necessário para a saúde celular e do organismo. A desregulação do metabolismo lipídico muitas vezes provoca obesidade e muitas doenças associadas, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes tipo II e câncer. Para avançar no entendimento atual da regulação metabólica lipídica, os métodos quantitativos para medir precisamente os níveis de armazenamento lipídóide in vivo no tempo e no espaço tornaram-se cada vez mais importantes e úteis. As abordagens tradicionais para analisar o armazenamento lipídico são semi-quantitativas para avaliação microscópica ou falta de informações diarrecenciais para medição bioquímica. A microscopia de dispersão Raman estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem química livre de rótulos que permite a detecção rápida e quantitativa de lipídios em células vivas com resolução subcelular. Como o contraste é explorado a partir de vibrações moleculares intrínsecas, a microscopia SRS também permite o rastreamento quadridimensional de lipídios em animais vivos. Na última década, a microscopia SRS tem sido amplamente utilizada para imagens de pequenas moléculas em pesquisas biomédicas e superar as principais limitações dos métodos convencionais de coloração fluorescente e extração lipídica. Em laboratório, combinamos microscopia srs com as ferramentas genéticas e bioquímicas disponíveis para o poderoso organismo modelo, Caenorhabditis elegans, para investigar a distribuição e heterogeneidade de gotículas lipídicas em diferentes células e tecidos e, finalmente, descobrir novas vias de sinalização conservadas que modulam o metabolismo lipídico. Aqui, apresentamos os princípios de trabalho e a configuração detalhada do microscópio SRS e fornecemos métodos para seu uso na quantificação do armazenamento lipídico em pontos de tempo distintos de desenvolvimento de tipo selvagem e insulina sinalizando mutantes deficientes C. elegans.

Introduction

A obesidade tornou-se um problema de saúde global que ameaça um terço da população em todo o mundo, e apresenta uma séria preocupação médica, dada a sua associação com a saúde mental ruim1 e doenças mortais, incluindo diabetes2, doenças cardiovasculares3 e alguns tipos de câncer4. O estudo do metabolismo lipídico é essencial para entender melhor os problemas biológicos por trás da obesidade. A quantificação rápida e específica do armazenamento lipídico implica a detecção de ácidos graxos e seus derivados, bem como metabólitos contendo esterol, com alta sensibilidade e preferencialmente com informações espaciais. Lipídios são alvos desafiadores para a imagem porque não têm fluorescência intrínseca e não podem ser facilmente marcados fluorescentemente. As etiquetas fluorescentes são muitas vezes maiores que as moléculas lipídicas e, portanto, podem ser quimicamente invasivas e impraticáveis para aplicações in vivo. A estratégia de rotulagem sem rótulos ou mínimas é necessária para preservar a estrutura hidrofóbica das moléculas lipídicas5. Desenvolvimentos recentes em tecnologias de imagem criaram oportunidades emocionantes para imagens sem rótulos de lipídios em células vivas, tecidos e organismos.

Abordagens tradicionais para análises de armazenamento lipídico em amostras biológicas incluem ensaios bioquímicos e protocolos de coloração com corantes lipofílicos. Ensaios de quantificação bioquímica envolvendo espectrometria de massa (MS) são incomparáveis em sua resolução molecular, mas requerem quantidades de amostra muito grandes e a preparação da amostra geralmente leva várias horas, limitando sua aplicação para imagens em tempo real de sistemas vivos5. Outra grande limitação desses ensaios é a falta de informação espacial. Por outro lado, corantes lipofílicos como Oil Red O e Sudan Black fornecem tecido e distribuição celular de organelas de armazenamento lipídico e comparados às técnicas de ESM, esses métodos de coloração também são de baixo custo e fáceis de executar. No entanto, esses protocolos de coloração requerem fixação, que pode impactar a natureza hidrofóbica das gotículas lipídicas, gerar mudanças artificiais em sua estrutura e resultar em inconsistências entre os experimentos6. As dificuldades técnicas associadas às técnicas bioquímicas e de coloração levaram à busca de métodos livres de rótulos para imagens de moléculas lipídicas e ao rápido aumento do uso de microscopia coerente de dispersão de Raman (CRS) em imagens lipídicas.

O efeito Raman foi reconhecido pela primeira vez por Raman e Krishnan, onde eles relataram que ao interagir com um fóton, uma molécula pode gerar luz dispersa sem alteração no comprimento de onda (chamado dispersão de Rayleigh) ou raramente com um comprimento de onda alterado (chamado de dispersão de Raman) e essa mudança no comprimento de onda é característica dos grupos químicos funcionais dentro da molécula7. Quando as ligações químicas dentro de uma molécula ficam excitadas a um nível de energia vibracional mais alto por um fóton incidente, chamado fóton bomba, a energia do fóton disperso, chamado de fóton Stokes, fica mais baixa. Caso contrário, as ligações químicas podem atingir um nível de energia vibracional mais baixo se estiverem originalmente em um nível mais alto, e o fóton disperso ganhar energia para ser o fóton anti-Stokes. A diferença de frequência entre o incidente e os fótons dispersos é conhecida como a mudança de Raman. Cada ligação química dentro de uma molécula tem uma mudança raman característica e quantificável. Por exemplo, o vínculo CH2 tem uma mudança raman de 2.845 cm-1, que é abundante nas cadeias de ácidos graxos8. Este sinal espontâneo de Raman é geralmente muito fraco, o que limitou muito a velocidade de imagem na microscopia espontâneo convencional de Raman. Ao longo dos anos, várias abordagens foram desenvolvidas para aumentar a velocidade de imagem e a sensibilidade da microscopia espontânea de Raman. A microscopia de dispersão de Raman coerente, incluindo microscopia coerente de dispersão de Raman (CARS) e microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS), é o progresso mais recente. Carros e SRS têm princípios de trabalho ligeiramente diferentes, mas ambos são técnicas livres de rótulos que têm capacidade de imagem ao vivo, podem produzir informações espaciais e temporais sobre a dinâmica de armazenamento lipídial, e requerem apenas um pequeno tamanho amostral. A microscopia cars sofre de fundo não ressonante, que vem de vários processos não lineares, e os sinais CARS também têm relação não linear com a concentração da molécula, que juntas complicam o processo de quantificação9. Ao contrário da microscopia CARS, a microscopia SRS não gera sinais de fundo não ressonantes e oferece dependência linear da concentração da molécula de interesse. Assim, atualmente a microscopia SRS é mais amplamente utilizada para imagens lipídicas.

Na microscopia SRS, os sinais fracos espontâneos de Raman podem ser amplificados quando excitados por dois raios laser sincronizados com sua diferença de frequência que corresponde à frequência vibracional da ligação química. A molécula experimentará uma transição aprimorada para um estado animado devido à excitação coerente. Como resultado, a taxa de geração de fótons Stokes é aumentada. Consequentemente, a intensidade do feixe "Stokes" transmitido aumenta (estimulado o ganho de Raman, SRG) e a intensidade do feixe de "bomba" transmitido diminui (estimulado perda de Raman, SRL). A detecção de sinais SRG ou SRL está fundamentada para a imagem de microscopia de Dispersão de Raman (SRS) estimulada de moléculas com ligações químicas específicas10. Se a diferença de frequência entre os dois raios laser não corresponder à frequência vibracional da ligação química dentro de uma molécula de interesse, nem sinais SRG nem SRL serão gerados. A velocidade de imagem da microscopia SRS é de cerca de 2 μseg por pixel ou 1 segundo por quadro, o que é muito mais rápido do que a microscopia ramanespontânea 11. A resolução lateral típica para microscopia SRS é limitada e em torno de 300 nm. Além disso, os processos ópticos de dois fótons da microscopia SRS permitem imagens volumostricas 3D de amostras de tecido de espessura relativa e a profundidade de imagem pode chegar a 300-500 μm. No geral, a microscopia SRS apresenta uma técnica de imagem eficiente e livre de rótulos para detectar biomoléculas específicas, especialmente lipídios.

Gotículas lipídicas são organelas de membrana única, que são o principal local de armazenamento celular para lipídios neutros, incluindo os triacylglycerols (TAGs) e ésteres de colesterol (CEs). As ligações CH2 nas cadeias de ácidos graxos dessas moléculas lipídicas geram fortes sinais de SRS a 2.845 cm-1 quando excitadas8, permitindo assim a detecção e quantificação dos níveis lipídicos de armazenamento em células intactas, seções teciduais e até organismos inteiros12,13,14,15. Em particular, c. elegans são úteis para estudos de imagem lipídica devido à sua transparência. Como os mamíferos, os C. elegans também armazenam lipídios em gotículas lipídicas e as vias de síntese e degradação das moléculas lipídicas são altamente conservadas16. Neste protocolo, forneceremos o princípio de trabalho da microscopia SRS, sua configuração fundamental e descreveremos os métodos para seu uso em imagens lipídicas em C. elegans.

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Protocol

1. Configuração instrumental para Microscopia de Dispersão Raman Estimulada

NOTA: O sistema de microscopia SRS é construído sobre um laser picosegundo com oscilador óptico integrado de bomba e um microscópio de varredura a laser confocal. O oscilador fornece dois trens de pulso picosegundo, incluindo um feixe de Stokes a 1.064 nm e um feixe de bomba incapaz entre 700-990 nm. A sobreposição temporal e espacial dos dois feixes são alcançadas dentro do laser. Um modulador eletro-óptico embutido (EOM) foi projetado especificamente para microscopia SRS. Este protocolo se concentrará no acoplamento do laser com o microscópio, e no funcionamento diário deste sistema(Figura 1). A configuração de um sistema de microscópio SRS está evoluindo na última década. Deve-se notar que a descrição a seguir representa apenas uma das várias configurações.

  1. Alimentando raios laser no microscópio
    1. Configure o periscópio para levantar o feixe da saída de fonte de luz picosegundo para a porta de entrada de laser IR no scanner do microscópio.
      ATENÇÃO: Leia o manual do sistema de laser antes da operação e tome todas as precauções necessárias, pois a radiação infravermelha próxima gerada por este sistema laser classe IV pode causar danos graves aos olhos e à pele. Complete os treinamentos exigidos pelas secretarias institucionais de segurança ambiental. Use óculos de proteção e jaleco com mangas algemadas.
    2. Primeiro, coloque o feixe da bomba em 750 nm e abaixe a potência do laser para 50 mW, que pode ser inspecionada visualmente, afiliadando o alinhamento. Em seguida, use um expansor de feixe(Figura 1,L1 e L2) para ajustar o diâmetro do feixe para se encaixar na abertura traseira dos objetivos do microscópio. Use dois espelhos de relé(Figura 1,M1 e M2) para guiar o raio laser até o periscópio(Figura 1,P1 e P2). O periscópio levantará o feixe até a altura da abertura do scanner e servirá como espelho de direção para alinhamento também.
    3. Coloque os botões no periscópio no centro da faixa de sintonia e escolha a posição inicial e o ângulo de cada espelho de forma que o raio laser atinja o centro do espelho, aproximadamente.
    4. Realize o alinhamento grosseiro usando uma porta vazia na torre objetiva e coloque a sonda do medidor de potência para medir a potência da luz transmitida. Defina o scanner do microscópio no zoom mais alto (50x) e, em seguida, meça a potência da luz transmitida com o ponto de raio laser focalizado. Otimize os botões em cada espelho, M1 e M2, iterativamente para alcançar a maior potência laser transmitida.
    5. Realize o alinhamento fino com a ferramenta de alinhamento. Coloque a tampa de alinhamento do alvo da fluorescência no assento objetivo vazio e ajuste os botões de M1 para centralizar o local. Em seguida, introduza o tubo de extensão para o alvo e sintonize os botões de M2 para centralizar o local.
    6. Repita as etapas 1.1.4 e 1.1.5 até que a viga centraliza o alvo em ambas as posições.
  2. Conexão de detecção e eletrônica
    1. Configure o módulo de detecção srs. Coloque um cuber divisor de feixe após o condensador para direcionar o laser transmitido para o módulo fotodiodo. O módulo inclui um telescópio para retransmitir e alterar o tamanho do feixe para se encaixar na área ativa do fotodiodo, bem como um filtro óptico para remover o feixe de Stokes modulado e deixar o feixe da bomba passar para a desmodulação.
    2. Configurar a conexão eletrônica(Figura 1). A intensidade do feixe de Stokes é modulada por um EOM embutido a 20 MHz dentro do laser picosegundo tunable. A saída de frequência de modulação do laser é entrada no amplificador lock-in como a frequência de referência para demodulação. Alimente o sinal de saída do fotodiodo no amplificador de travamento para desmodular o SRL.
      NOTA: Os sistemas laser de uma caixa podem ser atualizados e, portanto, suas especificações podem variar devido a diferentes datas de produção. A versão anterior do sistema laser picosegundo tunable, usado neste protocolo, tem um feixe stokes de 1.064 nm, mas a versão recente tem um feixe Stokes de 1.031 nm. A frequência de modulação do EOM usado neste protocolo é personalizada a 8 MHz, mas a frequência de modulação padrão para o sistema recente pode ser de 10 ou 20 MHz.
    3. Finalmente, alimente a saída do amplificador de travamento na caixa analógica do microscópio para converter sinal analógico elétrico em sinal digital. O sistema deve estar pronto para processar o sinal SRS.
  3. Otimizar as condições de imagem
    1. Faça uma amostra química para alinhamento do sistema. Por exemplo, use dodecano para otimizar o microscópio, porque o dodecano tem um sinal SRS muito forte das ligações C-H. Use um selo seguro para fazer uma mini câmara; coloque 5 μL de dodecano e cubra-o com um deslizamento de tampa.
      NOTA: Substitua a amostra de dodecano uma vez que pareça pouco clara ou apresente detritos, com uma nova amostra que poderia ser usada para alinhamento por 2-3 meses.
    2. Coloque a amostra no estágio do microscópio. Concentre-se corretamente na gota líquida. Pode ser feito mais rápido procurando a borda do bloco dodecano. Ajuste o condensador para iluminação Kohler.
    3. Defina os parâmetros de imagem. Verifique se a etapa de atraso está nos números certos. Coloque o comprimento de onda do feixe da bomba para 795,8 nm. Usando um cartão de sensor IR e um visualizador de RI, verifique se o caminho do feixe da bomba ainda está correto.
    4. Defina a potência do feixe da bomba para 200 mW e o feixe stokes para 400 mW no painel de controle do sistema picosegundo.
      NOTA: Os throughputs de laser da saída a laser para o objetivo pós dos dois feixes são aproximadamente 25% para a bomba e 14% para Stokes para esta configuração do sistema. Portanto, uma potência pós-objetiva do feixe de bomba é de aproximadamente 50 mW e para o feixe stokes é em torno de 56 mW. A largura de pulso do recente sistema laser picosegundo mudou de 6 ps para 2 ps, portanto, a potência laser aplicada deve ser ainda menor.
    5. Defina o ganho do amplificador de travamento ao máximo. Abra o obturador tanto para os feixes, quanto para o obturador principal do laser.
    6. Escaneie a amostra e verifique a imagem na tela do computador. Altere o modo de exibição para Hi-Lo no software de imagem. Ajuste o intervalo para ver uma saturação de ~50%. Verifique se a saturação está centrada na imagem. Caso não, ajuste cuidadosamente os espelhos de direção, M1 e M2, para maximizar a intensidade da imagem e centralizar a intensidade máxima.
    7. Ajuste ajuste o estágio de atraso e encontre a intensidade máxima do sinal SRS a partir da amostra dodecane. O sistema está então pronto para uso.

2. Preparação de amostras de C. elegans para imagens de microscopia SRS

NOTA: Como organismos modelo, os elegans de Caenorhabditis provaram ser muito úteis para múltiplas técnicas de imagem. São transparentes em todo o corpo, portanto, vários tecidos podem ser imagens no animal intacto sem a necessidade de dissecção. Em C. elegans, lipídios neutros são armazenados em gotículas lipídicas localizadas no intestino, que consiste em 20 células epiteliais localizadas bisemetricamente ao redor do lúmen intestinal16. Células hipodérmicas e oócitos também armazenam lipídios. A principal forma de armazenamento de lipídios em C. elegans gotículas lipídicas são os triacylglycerols (TAGs)17, que geram fortes sinais de SRS devido à abundância de ligações CH2 presentes em suas cadeias de ácidos graxos. Esta seção se concentrará em como preparar amostras de C. elegans para imagens de microscopia SRS e quantificação de seus níveis totais de armazenamento lipídado intestinal.

  1. Preparação dos slides de imagem
    1. Primeiro, prepare 2% de solução agarose em H2O destilado, e certifique-se de que toda a agarose derrete antes de preparar as almofadas agarose.
    2. Adicione uma gota de 2% de agarose quente em um slide em branco (aproximadamente 100 μL) que é colocado entre slides de suporte com duas camadas de fita de laboratório e coloque rapidamente um segundo slide em cima do primeiro slide. Pressione suavemente para criar uma almofada fina e até mesmo agarose.
    3. Coloque esses slides de lado em posição fechada e não os separe até que os vermes estejam prontos para serem montados. Prepare slides frescos antes de cada sessão de imagem, pois as almofadas secarão após 1 dia.
      NOTA: Use câmaras de imagem multi-poços, se a imagem de vários worms em telas genéticas de alto rendimento18. Use configurações de imagem ao vivo para imagem da dinâmica espátula-temporal do metabolismo lipídico através do desenvolvimento e envelhecimento19.
  2. Montando os vermes
    1. Prepare o agente anestesizante adicionando azida de sódio ou levamisole no tampão M9 à concentração final de 100 mM ou 1 mM, respectivamente.
      NOTA: Use levamisole se os vermes precisarem ser recuperados após a imagem para genotipagem após as telas genéticas.
      ATENÇÃO: Vários agentes anestesizantes, incluindo azida de sódio e levamisole, são prejudiciais se inalados. Use luvas de proteção e roupas, bem como use um capuz de fumaça química ao preparar essas soluções de trabalho.
    2. Coloque uma gota de agente anestesiante em um deslizamento de tampa (aproximadamente 4-5 μL para 10-20 worms).
      NOTA: Ajuste a quantidade do agente anestesiador de acordo com o número do verme para manter os vermes o mais próximos possível. Usar muito líquido para poucos vermes pode fazer com que os vermes se espalhem na almofada de agarose.
    3. Escolha os vermes a serem imagens sob a microscopia de dissecção e transfira-os para a gotícula do agente anestesiante. Depois que todos os worms forem adicionados à gota, mova-os usando o colhedor de vermes e certifique-se de que eles não se sobrepõem uns aos outros.
    4. Separe os slides de vidro (da etapa 2.1) sem perturbar a almofada agarose.
    5. Cubra a gota de verme com o escorregador de vidro que tem a almofada de agarose. Certifique-se de que a almofada de agarose está voltada para os vermes. Alternativamente, a gotícula de envelhecimento anestesiante também pode ser adicionada na almofada de agarose e os vermes podem ser cobertos com o deslizamento de tampas.
    6. Finalmente, marque a localização dos vermes usando um marcador permanente no escorregador de vidro.

3. Aquisição e análise de imagens

  1. Aquisição das imagens usando o sistema de microscópio SRS.
    1. Antes de fotografar qualquer amostra, determine os parâmetros de imagem e verifique os sinais de SRS (conforme explicado no Protocolo 1).
    2. Monte o slide com a mancha de cobertura voltada para a lente objetiva. Ligue a fonte de luz de campo brilhante e direcione-a para a ocular para localizar os vermes.
      NOTA: Use uma lente objetiva de 20x para imaginar o armazenamento lipídudo em todo o intestino. Considere usar uma lente objetiva de 60x para imagem de armazenamento de gordura hipodérmica ou para quantificar o tamanho/número da gota lipídica.
    3. Coloque os vermes em foco e ajuste a posição do condensador de acordo.
    4. Desligue a fonte de luz de campo brilhante e mude para a unidade de varredura a laser. Comece a digitalizar o primeiro worm a uma taxa de varredura rápida (por exemplo, 512 x 512 pixels), e ajuste o foco fino para encontrar a área de interesse. Para que a primeira amostra seja imageda, ajuste os poderes laser ao nível onde os sinais SRS não estão saturados.
    5. Mude para uma taxa de varredura mais lenta (por exemplo, 2 μs/pixel) e maior resolução (por exemplo, 1024 x 1024 pixels) para obter a imagem SRS.
      NOTA: Mantenha os poderes de laser constantes para que cada amostra seja imagen durante a sessão de imagem.
    6. Salve a imagem SRS no formato desejado que permite alta resolução (como um arquivo .tiff). Dependendo do software de imagem e configuração usado, salve a localização do primeiro worm antes de passar para o próximo.
    7. Imagens completas de todos os vermes que foram montados no slide. Desligue o obturador para bloquear os raios laser. Não desligue a fonte de laser até que todas as amostras sejam imagens.
    8. Remova o slide antes de colocar o próximo slide de amostra. Repetição de passos 3.1.2-3.1.7.
    9. Uma vez que todas as amostras tenham sido imagens, coloque a fonte laser em espera e desligue o equipamento associado, incluindo o amplificador, o detector, o microscópio e o computador.
  2. Análise de imagens usando ImageJ
    1. Abra os arquivos de imagem (geralmente .tiff) a serem quantificados no ImageJ, selecionando os arquivos e arrastando-os e soltando-os na janela ImageJ. Baixe os plug-ins imageJ apropriados, se usar formatos específicos de microscópio Olympus (como arquivos .oib).
    2. Selecione as propriedades a serem analisadas(Analisar > definir medidas). Para a quantitação total de armazenamento lipídico, selecione Área, Valor Cinza Min e Max e Valor Cinza Médio.
    3. Use a ferramenta de seleção de polígonos e delineie a região do intestino do verme a ser quantificada. Para medir os parâmetros selecionados na etapa 3.2.2, clique em Analisar > Medida. Uma nova janela com os resultados de medição aparecerá. Repita este passo para todas as imagens abertas.
    4. Selecione as medições para todos os worms em um determinado genótipo e copie/cole os resultados para uma nova planilha. Repita as etapas 3.2.1-3.2.4 para todos os genótipos na mesma sessão de imagem.
    5. Selecione uma área nas proximidades do worm que não tenha nenhum sinal SRS, para quantificar como plano de fundo. Certifique-se de que a área selecionada para medição de fundo não contenha nenhuma bactéria ou detrito que também possa dar um sinal SRS.
    6. Subtrair o valor cinzento médio de fundo das medidas de cada verme individual. Calcule o desvio médio e padrão dos valores médios de cinza subtraídos de todos os vermes em um determinado grupo de genótipo/teste. Normalize esse valor para a média do grupo controle.
    7. Finalmente, realize a análise estatística adequada usando o valor cinzento médio como medida para os níveis lipídes de cada verme. Normalmente, use o teste tdo Student para dois grupos e use ANOVA unidirecional com um teste de comparação múltipla apropriado para mais de dois grupos.
      NOTA: Ao selecionar imagens para apresentação de figuras, certifique-se de que essas imagens selecionadas tenham a mesma distribuição de intensidade de pixel. Defina o brilho e contraste com os mesmos valores para todas as imagens na mesma figura (Imagem > Ajuste > Brilho e Contraste).

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Representative Results

A sinalização de insulina é um importante caminho endócrino que impacta o desenvolvimento, a reprodução, a vida útil e o metabolismo. Em vermes, a sinalização de insulina consiste em cerca de 40 ligantes de peptídeo semelhantes à insulina, ortopal receptor de fator de crescimento semelhante à insulina DAF-2, cascata de quinase PI3K/AKT a jusante, e ortopal do fator de transcrição FoxO, DAF-1620. mutantes daf-2, que não possuem o receptor de insulina, têm mais gotículas lipídicas em seu intestino, o tecido de armazenamento lipídecade vermes 21,22. Usando microscopia srs, quantificamos os níveis lipídicos intestinais em vermes do tipo selvagem sincronizados por idade e mutantes daf-2 durante a idade adulta. Consistente com os resultados anteriores, descobrimos que os mutantes daf-2 têm níveis lipídes mais elevados23,24 (Figura 2A). Observamos um declínio nos níveis lipídes em vermes do tipo selvagem a partir do primeiro dia até o dia 9 da idade adulta (Figura 2A). No entanto, os níveis lipídes em mutantes daf-2 aumentaram até os 5 dias de idade e, em seguida, eles foram constantes em torno do nível de 2,5-3,0 vezes maior do que o tipo selvagem(Figura 2A).

DAF-16, o ortolog do fator de transcrição de C. elegans FoxO, orquestra a maioria das funções a jusante da via de sinalização de insulina. mutações nulas daf-16 suprimem vários fenótipos observados em mutantes daf-2, incluindo o acúmulo de gordura. daf-16 códigos de locus genômicos para 8 transcrições diferentes(daf-16a-h),que são geradas por um site de início de transcrição alternativo, ou emenda alternativa20. Entre eles, daf-16a, daf-16b e daf-16d/f/h são as transcrições mais abundantes e codificam proteínas com diferentes n termini. Estudos com mutações específicas de isoforme e transgenes sugeriram que as isoformas DAF-16A e DAF-16D/F/H regulam o desenvolvimento do dauer e a vida útil24,25, enquanto o DAF-16B é importante para a remodelação do faringeal durante a formação do dauer26. Neste estudo, utilizando-se a microscopia SRS, foram investigadas a especificidade isoforme do DAF-16 na regulação do armazenamento lipídal intestinal. Descobrimos que a inativação daF-16 suprime o aumento dos níveis lipídes dos mutantes daf-2 (Figura 2B,C). Expressar daf-16a ou isoform daf-16b no daf-2; daf-16 mutantes duplos não restaura os níveis lipídes. No entanto, a expressão da isoforma daf-16d/f/h é suficiente para restaurar os níveis lipídides em daf-2; daf-16 aos níveis observados em mutantes únicos daf-2 (Figura 2B,C). Esses resultados revelaram que especificamente os isoforms DAF-16D/F/H modulam o metabolismo lipídico em vermes mutantes daf-2. Isso também é consistente com os resultados de um estudo recente que mostrou que a regulação olfativa do armazenamento lipídudo também é mediada através das atividades transcritivas do DAF-16D/F/H27.

Figure 1
Figura 1: Ilustração do sistema de microscópio SRS. O laser all-in-one fornece bombas combinadas temporal e espacialmente e feixes de Stokes, modulador eletro-óptico embutido (EOM) e frequência de referência para amplificador de travamento. O feixe combinado é expandido pelo telescópio (L1 e L2), retransmitido por dois espelhos de relé (M1 e M2) e levantado pelo periscópio (P1 e P2), e depois enviado para o scanner do microscópio. O feixe combinado é escaneado pela unidade de digitalização (SU) no microscópio e focado na amostra. A luz transmitida é coletada pelo condensador. Um filtro removerá o feixe de Stokes e deixará o feixe da bomba a ser detectado pelo fotodiodo (PD). As setas cor-de-corrida cinza mostram a conexão entre os eletrônicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A redução da sinalização de insulina em C. elegans leva ao aumento do armazenamento lipídudo. (A) Utilizando microscopia srs, níveis lipídicos intestinais de vermes mutantes do tipo selvagem e daf-2 são quantificados nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 da idade adulta. Em vermes do tipo selvagem, os níveis lipíduos diminuem ao longo do tempo, enquanto os mutantes daf-2 acumulam lipídios até o dia 5 e eles têm cerca de 2,7 dobradas mais lipídios em comparação com vermes do tipo selvagem. (B) a exclusão daf-16 suprime o aumento dos níveis lipídes em mutantes daf-2. Restaurando a expressão do isoforme daf-16d/f/h em daf-2; daf-16 mutantes duplos é suficiente para aumentar os níveis lipídicos para os níveis de mutantes daf-2, enquanto restaurar a expressão de isoforms daf-16a ou daf-16b não é. *** p < 0,001, n.s. não é significativo por uma forma ANOVA com o teste de múltiplas comparações de Bonferroni. (C) Imagens srs representativas. Pixels amarelos indicam níveis lipídes mais altos. A área intestinal quantificada é mostrada em linhas tracejadas. A barra de escala é de 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Em defesa contra a obesidade e seus distúrbios metabólicos associados, importantes esforços de pesquisa têm sido implementados para entender melhor os mecanismos regulatórios da homeostase lipídica. Para a detecção quantitativa de moléculas lipídicas em amostras biológicas, a imagem livre de rótulos por microscopia srs tem sido comprovadamente uma alternativa confiável para ensaios bioquímicos e outros métodos de coloração. Nosso grupo e outros revelaram novos mecanismos biológicos na regulação metabólica lipídica, combinando o uso de C. elegans e microscopia SRS12,18,28,29,30,31. Neste protocolo, usando microscopia srs demonstramos que a queda da sinalização de insulina em vermes leva a um aumento nos níveis totais de lipídio intestinal. Observamos que a partir do primeiro dia da idade adulta, os lipídios se acumulam no intestino dos mutantes daf-2, que têm mutação de perda de função no gene do receptor de insulina, enquanto que nos vermes do tipo selvagem os níveis lipídides intestinais diminuem. Além disso, consistente com estudos anteriores23,24, descobrimos que a inativação daf-16 pode suprimir totalmente o aumento do armazenamento lipídial em mutantes daf-2 e entre os diferentes isoformes daf-16, daf-16d/f/h isoform especificamente regula a homeostase lipídica. Como estudos anteriores sugeriram, a diferença nos níveis totais de armazenamento de lipídios intestinais em mutantes daf-2 é provavelmente devido a uma combinação de fatores: aumento da síntese lipídica de novo32,diminuição da utilização lipídica33,bem como reprodução reduzida, e acúmulo de gema34. Os recentes avanços nas técnicas coerentes de espectroscopia de Raman (SRS e CARS) ajudariam a elucidar ainda mais os mecanismos de como a sinalização de insulina contribui para a regulação de diferentes tipos de armazenamento lipídudo em tecidos distintos, incluindo intestino, hipodermis e oócitos.

A microscopia SRS tem sido utilizada para a imagem não apenas lipídios, mas também outras biomoléculas, incluindo DNA35, RNA14,proteínas13e glicose36. Foi implementado para fornecer insights importantes sobre muitos aspectos da biologia, como biologia celular, microbiologia, biologia do câncer e biologia do desenvolvimento11. Mais recentemente, o uso de etiquetas bioortogonais (por exemplo, alkyne e marcas de deutério), para rotular minimamente as moléculas de interesse, aumentou ainda mais a sensibilidade e especificidade da detecção. Essas etiquetas vibracionais mínimas não interrompem as propriedades químicas da molécula, mas fornecem contraste químico específico, pois seu sinal de Raman está dentro da "janela silenciosa" do espectro Raman14,37. Além de melhorar a sensibilidade e a especificidade, alcançar imagens SRS de super resolução também é uma área de pesquisa empolgante. Vários grupos de pesquisa também têm esforços para minimizar o tamanho do equipamento, criando microscópio SRSportátil 38. Assim, a aplicação de imagens SRS à pesquisa biomédica abriu novos espaços para melhorias tecnológicas e químicas para o avanço da imagem lipídica.

Em comparação com os métodos tradicionais de quantitação lipídica, a microscopia SRS tem várias vantagens. Em primeiro lugar, é realizado de forma livre de rótulos e mesmo que um rótulo tenha que ser usado, o rótulo pode ser tão pequeno quanto dois átomos. Portanto, também não sofre do problema de fotobleaching como outros métodos fluorescentes de marcação e coloração. Em segundo lugar, a capacidade de imagem viva usando organismos inteiros permite rastrear a dinâmica de metabólitos específicos29,39,40. Finalmente, a microscopia SRS permite maior grau de multiplexação e, portanto, pode ser implementada para imagem múltiplas biomoléculas em compartimentos celulares distintos simultaneamente. A microscopia hiperespectral SRS/CARS tem grande futuro na exploração da dinâmica metabólica de várias biomoléculas distintas, bem como diferentes tipos de compartimentos de armazenamento lipídicos, como partículas de gema em C. elegans41 ou ésteryl e gotículas lipídicas ricas em diferentes células e tecidos mamíferos31. Por outro lado, a microscopia SRS está enfrentando limitações como alto custo em hardware e falta de disponibilidade comercial total. Além disso, requer expertise para manter e executar o sistema, o que pode complicar sua adoção. Os desenvolvimentos na fonte de luz e na integração do sistema estão melhorando a situação. A fonte laser de baixo custo baseada em fibra e sistemas totalmente integrados oferecem novas oportunidades de comercialização e ajudarão a reduzir o custo no futuro11,42,43. Além disso, apesar das novas abordagens tecnológicas para melhorar a velocidade de imagem e a resolução espacial das imagens SRS, a sensibilidade limitada de detecção pode continuar a dificultar a capacidade de sondar metabólitos de baixa abundância. No geral, o uso da microscopia SRS em pesquisas biomédicas cresceu tremendamente na última década. A imagem SRS beneficiará ainda mais das melhorias tecnológicas na sensibilidade de detecção, resolução espacial e capacidade multiplexal, e, finalmente, expandirá seu uso no monitoramento quantitativo de biomoléculas, especialmente lipídios.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W..), DP1DK113644 (M.C.W.), Fundação March of Dimes (M.C.W.), Fundação Welch (M.C.W.), e por investigador do HHMI (M.C.W.). Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) pelas cepas de C. elegans.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D converter Olympus Analog Unit
Agarose GeneMate 3119 For making agarose pads
Alignment tool - adapter Thorlabs SM1A4 For mounting the tool on scope
Alignment tool - target Thorlabs VRC2SM1 For viewing IR laser
Alignment tool - tube Thorlabs SM1L40 Length can vary
Autocorrelator (Optional) APE pulseCheck
Bandpass filter minicircuits BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope Nikon SMZ800 For handling and picking worms for imaging
Dodecane Sigma-Aldrich 44010 Used for calibration of the SRS signal
Filter Chroma Technology 890/220 CARS For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape VWR 89097 For making agarose pads
Glass coverslips VWR 48393-106 For covering worms for imaging
Glass microscope slide VWR 16004-422 For making agarose pads
Laser scanning microscope Olympus FV3000
Lens Thorlabs L1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		 For beam expander
Lock-in amplifier Zurich HF2LI
Lowpass filter minicircuits BLP-1.9+ For power supply noise suppression
Mirrors Thorlabs BB1-E03 For relay and periscope
Objective Olympus UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode Thorlabs FDS1010
Picosecond laser source APE picoEmerald
Power supply TEKPOWER TP1342U For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide Sigma S2002 For anaesthesizing the worms
Worm picker WormStuff 59-AWP

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References

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Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).

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