Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Безметчная визуализация динамики накопления липидов у caenorhabditis elegans с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии

doi: 10.3791/61870 Published: May 28, 2021

Summary

Микроскопия с стимулированным рамановской рассеянием (SRS) позволяет селективно, без маркировки визуализировать конкретные химические части и эффективно используется для изображения липидных молекул in vivo. Здесь мы предоставляем краткое введение в принцип SRS-микроскопии и описываем методы его использования в визуализации хранения липидов у Caenorhabditis elegans.

Abstract

Липидный обмен является фундаментальным физиологическим процессом, необходимым для здоровья клеток и организма. Нарушение регуляции липидного обмена часто вызывает ожирение и многие связанные с ним заболевания, включая сердечно-сосудистые расстройства, диабет II типа и рак. Чтобы продвинуть современное понимание липидной метаболической регуляции, количественные методы точного измерения уровней хранения липидов in vivo во времени и пространстве становятся все более важными и полезными. Традиционные подходы к анализу накопления липидов являются полукоципными для микроскопической оценки или не имеют пространственно-временной информации для биохимического измерения. Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) представляет собой технологию химической визуализации без меток, которая позволяет быстро и количественно обнаруживать липиды в живых клетках с субклеточным разрешением. Поскольку контраст используется от внутренних молекулярных колебаний, микроскопия SRS также позволяет четырехмерное отслеживание липидов у живых животных. В последнее десятилетие микроскопия SRS широко используется для визуализации малых молекул в биомедицинских исследованиях и преодолевает основные ограничения обычных методов флуоресцентного окрашивания и экстракции липидов. В лаборатории мы объединили микроскопию SRS с генетическими и биохимическими инструментами, доступными мощному модельному организму Caenorhabditis elegans, чтобы исследовать распределение и неоднородность липидных капель в разных клетках и тканях и, в конечном счете, обнаружить новые сохраненные сигнальные пути, которые модулируют метаболизм липидов. Здесь мы представляем принципы работы и подробную настройку микроскопа SRS и предоставляем методы его использования для количественной оценки накопления липидов в различных временных точках развития мутанта C. elegans дикого типа и инсулина, сигнализирующих с дефицитом мутанта C. elegans.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ожирение стало глобальной проблемой здравоохранения, угрожающей одной трети населения во всем мире, и оно представляет собой серьезную медицинскую проблему, учитывая его связь с плохим психическим здоровьем1 и смертельными заболеваниями, включая диабет2,сердечно-сосудистые заболевания3 и некоторые виды рака4. Изучение липидного обмена имеет важное значение для лучшего понимания биологических проблем, стоящих за ожирением. Быстрая и специфическая количественная оценка накопления липидов влечет за собой обнаружение жирных кислот и их производных, а также стеролсодержащих метаболитов, с высокой чувствительностью и предпочтительно с пространственной информацией. Липиды являются сложными целями для изображения, потому что им не хватает внутренней флуоресценции и их нельзя легко пометить флуоресцентно. Флуоресцентные метки часто больше, чем молекулы липидов, и, следовательно, могут быть химически инвазивными и непрактичными для применения in vivo. Стратегия маркировки без меток или минимальная необходима для сохранения гидрофобной структуры липидных молекул5. Последние разработки в области технологий визуализации создали захватывающие возможности для визуализации липидов без маркировки в живых клетках, тканях и организмах.

Традиционные подходы к анализу хранения липидов в биологических образцах включают биохимические анализы и протоколы окрашивания липофильными красителями. Биохимические количественные анализы, включающие масс-спектрометрию (МС), не имеют себе равных по своей молекулярной рассасывляемости, но они требуют очень больших количеств образцов, и подготовка образцов обычно занимает несколько часов, ограничивая их применение для визуализации живых систем в режиме реальноговремени 5. Другим серьезным ограничением этих анализов является отсутствие пространственной информации. С другой стороны, липофильные красители, такие как Oil Red O и Sudan Black, обеспечивают тканевое и клеточное распределение органелл хранения липидов, и по сравнению с методами MS, эти методы окрашивания также являются недорогими и простыми в выполнении. Однако эти протоколы окрашивания требуют фиксации, которая может повлиять на гидрофобную природу липидных капель, вызвать искусственные изменения в их структуре и привести к несоответствиям между экспериментами6. Технические трудности, связанные с биохимическими методами и методами окрашивания, привели к поиску безмеклеточных методов для изображения липидных молекул и к быстрому увеличению использования когерентной рамановской рассеянной (CRS) микроскопии в липидной визуализации.

Эффект Рамана был впервые признан Раманом и Кришнаном, где они сообщили, что при взаимодействии с фотоном молекула может генерировать рассеянный свет без изменения длины волны (так называемое рэлеевское рассеяние) или редко с измененной длиной волны (называемой рамановским рассеянием), и это изменение длины волны характерно для функциональных химических групп внутри молекулы7. Когда химические связи внутри молекулы возбуждаются до более высокого вибрационного энергетического уровня падежаящим фотоном, называемым фотоном насоса, энергия рассеянного фотона, называемого фотоном Стокса, становится ниже. В противном случае химические связи могут достичь более низкого уровня вибрационной энергии, если они изначально находятся на более высоком уровне, а рассеянный фотон получает энергию, чтобы быть фотоном против Стокса. Разница частот между падающе и рассеянными фотонами известна как рамановский сдвиг. Каждая химическая связь внутри молекулы имеет характерный и поддающиеся количественной оценке рамановский сдвиг. Например, связь CH2 имеет рамановский сдвиг 2,845 см-1,который в изобилии присутствует в цепях жирных кислот8. Этот спонтанный рамановский сигнал, как правило, очень слаб, что значительно ограничивает скорость визуализации в обычной спонтанной рамановской микроскопии. На протяжении многих лет были разработаны различные подходы для повышения скорости изображения и чувствительности спонтанной рамановской микроскопии. Когерентная комбинационные рассеянные микроскопии, включая когерентную рамановское рассеяние против Стокса (CARS) и микроскопию стимулированного рамановского рассеяния (SRS), является самым последним прогрессом. CARS и SRS имеют несколько разные принципы работы, но оба являются методами без меток, которые имеют возможность визуализации в реальном времени, могут давать пространственную и временную информацию о динамике хранения липидов и требуют только небольшого размера выборки. Микроскопия CARS страдает от нереконсервного фона, который исходит от различных нелинейных процессов, а сигналы CARS также имеют нелинейную связь с концентрацией молекулы, что в совокупности усложняет процесс количественной оценки9. В отличие от микроскопии CARS, микроскопия SRS не генерирует невозвествующих фоновых сигналов и предлагает линейную зависимость от концентрации интересуемой молекулы. Таким образом, в настоящее время микроскопия SRS более широко используется для липидной визуализации.

В микроскопии SRS слабые спонтанные рамановские сигналы могут быть усилены при возбуждении двумя синхронизированными лазерными лучами, причем их разность частот соответствует частоте колебаний химической связи. Молекула будет испытывать усиленный переход в возбужденное состояние за счет когерентного возбуждения. В результате скорость генерации фотонов Стокса увеличивается. Следовательно, интенсивность передаваемого «стоксового» пучка увеличивается (стимулируется рамановский усиление, SRG) и уменьшается интенсивность передаваемого «насосного» пучка (стимулируются рамановские потери, SRL). Обнаружение сигналов SRG или SRL лежит в основе микроскопии стимулированного комбинационного рассеяния (SRS) микроскопии молекул со специфическими химическими связями10. Если разность частот между двумя лазерными лучами не соответствует колебательной частоте химической связи внутри интересующей молекулы, то ни SRG, ни SRL сигналы не будут генерироваться. Скорость визуализации SRS-микроскопии составляет около 2 мксек на пиксель или 1 секунду на кадр, что намного быстрее, чем спонтанная рамановская микроскопия11. Типичное боковое разрешение для SRS-микроскопии ограничено дифракцией и составляет около 300 нм. Кроме того, двухфотонные оптические процессы SRS-микроскопии позволяют проводить объемную 3D-визуализацию относительно толстых образцов тканей, а глубина изображения может достигать 300–500 мкм. В целом, микроскопия SRS представляет собой эффективный, без маркировки метод визуализации для обнаружения конкретных биомолекул, особенно липидов.

Липидные капли представляют собой одномембранные органеллы, которые являются основным клеточным местом хранения нейтральных липидов, включая триацилглицеролы (TAGs) и сложные эфиры холестерина (CEs). Связи CH2 в цепях жирных кислот этих липидных молекул генерируют сильные сигналы SRS при 2,845см-1 при возбуждении8,что позволяет обнаруживать и количественно определять уровни хранения липидов в интактных клетках, участках тканей и даже целых организмах12,13,14,15. В частности, C. elegans полезны для исследований липидной визуализации благодаря своей прозрачности. Как и млекопитающие, C. elegans также хранят липиды в липидных каплях, а пути синтеза и деградации молекул липидов высоко сохраняются16. В этом протоколе мы предоставим принцип работы SRS-микроскопии, ее фундаментальную настройку и опишем методы ее использования в липидной визуализации у C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Инструментальная установка для стимулированной рамановой рассеянной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Система микроскопии SRS построена на пикосекундном лазере со встроенным оптическим параметрическим осциллятором и конфокальным лазерным сканируемым микроскопом. Генератор обеспечивает два пикосекундных импульсных поезда, включая пучок Стокса на 1064 нм и пучок насоса, перестраиваемый между 700–990 нм. Временное и пространственное перекрытие двух лучей достигается внутри лазера. Встроенный электрооптический модулятор (EOM) разработан специально для SRS-микроскопии. Этот протокол будет сосредоточен на соединении лазера с микроскопом и ежедневной работе этой системы(рисунок 1). Конфигурация системы микроскопа SRS развивается в последнее десятилетие. Следует отметить, что следующее описание представляет только одну из нескольких конфигураций.

  1. Подача лазерных лучей в микроскоп
    1. Настройте перископ для подъема луча от пикосекундного выхода источника света к входному порту ИК-лазера на сканере микроскопа.
      ВНИМАНИЕ: Прочитайте руководство по лазерной системе перед эксплуатацией и примите все необходимые меры предосторожности, потому что ближнее инфракрасное излучение, генерируемое этой лазерной системой класса IV, может нанести серьезный вред глазам и коже. Пройдите обучение, которое требуется институциональными отделами экологической безопасности. Носите защитные очки и лабораторное пальто с рукавами с манжетами.
    2. Во-первых, установите луч накачки на 750 нм и понизьте мощность лазера до 50 мВт, который можно визуально осмотреть, согласовав выравнивание. Затем используйте расширительлуча (рисунок 1,L1 и L2), чтобы отрегулировать диаметр луча в соответствии с задней апертурой объективов микроскопа. Используйте два релейных зеркала(рисунок 1,M1 и M2) для направления лазерного луча к перископу(рисунок 1,P1 и P2). Перископ поднимет луч на высоту отверстия сканера и будет служить рулевым зеркалом для выравнивания.
    3. Установите ручки на перископ в центре диапазона настройки и выберите начальное положение и угол каждого зеркала так, чтобы лазерный луч попал в центр зеркала, приблизительно.
    4. Выполните грубое выравнивание с помощью пустого порта на башне объектива и поместите датчик мощности для измерения мощности проходящего света. Установите сканер микроскопа на самый высокий зум (50x), а затем измерьте мощность проходящего света с помощью сфокусированного лазерного луча. Оптимизируйте ручки на каждом зеркале, M1 и M2, итеративно для достижения максимальной мощности передаваемого лазера.
    5. Выполните точное выравнивание с помощью инструмента выравнивания. Поместите колпачок флуоресцентной мишени на пустое сиденье объектива и отрегулируйте ручки M1, чтобы центрировать точку. Затем введите удлинительную трубку для мишени и настройте ручки M2, чтобы центрировать точку.
    6. Повторяйте шаги 1.1.4 и 1.1.5 до тех пор, пока луч не центрирует цель в обоих положениях.
  2. Подключение обнаружения и электроники
    1. Настройте модуль обнаружения SRS. Поместите блок разветвителя луча после конденсатора, чтобы направить передаваемый лазер на фотодиодный модуль. Модуль включает в себя телескоп для ретрансляции и изменения размера луча, чтобы соответствовать активной области фотодиода, а также оптический фильтр для удаления модулированного пучка Стокса и пропускания пучка насоса для демодуляции.
    2. Настройте подключение электроники(рисунок 1). Интенсивность луча Стокса модулируется встроенным EOM на частоте 20 МГц внутри пикосекундного перестраиваемого лазера. Выходная частота модуляции от лазера входит в блокирующий усилитель в качестве опорной частоты для демодуляции. Подавайте выходной сигнал фотодиода в блокирующий усилитель для демодуляции SRL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерные системы с одной коробкой могут быть модернизированы, и, таким образом, их спецификации могут варьироваться в зависимости от даты производства. Предыдущая версия пикосекундной перестраиваемой лазерной системы, используемая в этом протоколе, имеет луч Стокса 1064 нм, но последняя версия имеет луч Стокса 1031 нм. Частота модуляции EOM, используемая в этом протоколе, настроена на 8 МГц, но частота модуляции по умолчанию для последней системы может составлять 10 или 20 МГц.
    3. Наконец, подать блокирующий выход усилителя в аналоговую коробку микроскопа для преобразования электрического аналогового сигнала в цифровой. Система должна быть готова к обработке сигнала SRS.
  3. Оптимизация условий обработки изображений
    1. Сделайте химический образец для выравнивания системы. Например, используйте додекан для оптимизации микроскопа, потому что додекан имеет очень сильный сигнал SRS от связей C-H. Используйте надежное уплотнение, чтобы сделать мини-камеру; положить 5 мкл додекана и покрыть его крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замените образец додекана, как только он выглядит неясным или представляет собой мусор, новым образцом, который можно использовать для выравнивания в течение 2-3 месяцев.
    2. Поместите образец на ступень микроскопа. Правильно сфокусироваться на каплях жидкости. Это можно сделать быстрее, ища край додекановой прокладки. Отрегулируйте конденсатор для освещения Kohler.
    3. Задайте параметры изображения. Проверьте, находится ли этап задержки на правильных числах. Установите длину волны пучка насоса на 795,8 нм. Используя карту ИК-датчика и ИК-просмотрщик, проверьте, является ли траектория луча насоса правильной.
    4. Установите мощность пучка насоса на 200 мВт, а луча Стокса на 400 мВт на пикосекундной панели управления системой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пропускная способность лазера от выхода лазера до пост-объектива двух лучей составляет примерно 25% для накачки и 14% для Стокса для этой системы. Таким образом, постижевая мощность пучка насоса составляет примерно 50 мВт, а для луча Стокса она составляет около 56 мВт. Длительность импульса недавней пикосекундной лазерной системы изменилась с 6 пс до 2 пс, поэтому прикладная мощность лазера должна быть еще ниже.
    5. Установите максимальный коэффициент усиления запираемого усилителя. Откройте затвор как для лучей, так и для основного затвора лазера.
    6. Отсканируйте образец и проверьте изображение на экране компьютера. Измените режим отображения на Hi-Lo в программном обеспечении для обработки изображений. Отрегулируйте диапазон, чтобы увидеть насыщенность ~50%. Проверьте, центрирована ли насыщенность изображения. Если нет, тщательно отрегулируйте зеркала рулевого управления M1 и M2, чтобы максимизировать интенсивность изображения и центрировать пиковую интенсивность.
    7. Тонкая настройка стадии задержки и определение максимальной интенсивности сигнала SRS из образца додекана. После этого система готова к использованию.

2. Подготовка образцов C. elegans для визуализации микроскопии SRS

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве модельных организмов caenorhabditis elegans оказался очень полезным для нескольких методов визуализации. Они прозрачны по всему телу, поэтому различные ткани могут быть изображены у неповрежденного животного без необходимости рассечения. У C. elegans нейтральные липиды хранятся в липидных каплях, расположенных в кишечнике, который состоит из 20 эпителиальных клеток, расположенных бисимметрично вокруг просвета кишечника16. Подкожные клетки и ооциты также хранят липиды. Основной формой хранения липидов в липидных каплях C. elegans являются триацилглицеролы (TAGs)17,которые генерируют сильные сигналы SRS из-за обилия связей CH2, присутствующих в их цепях жирных кислот. В этом разделе основное внимание будет уделено тому, как подготовить образцы C. elegans для визуализации микроскопии SRS и количественной оценке их общего уровня хранения липидов в кишечнике.

  1. Подготовка слайдов изображений
    1. Сначала приготовьте 2% раствор агарозы в дистиллированномH2O и убедитесь, что вся агароза плавится перед приготовлением подушечек агарозы.
    2. Добавьте одну каплю теплой 2% агарозы на пустой слайд (примерно 100 мкл), который помещается между опорными слайдами с помощью двух слоев лабораторной ленты, и быстро поместите второй слайд поверх первого слайда. Осторожно надавите, чтобы создать тонкую, ровную агарозную прокладку.
    3. Отставьте эти слайды в сторону в закрытом положении и не отделяйте их до тех пор, пока черви не будут готовы к установке. Готовьте свежие слайды перед каждым сеансом визуализации, так как прокладки высохнут через 1 день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте камеры визуализации с несколькими скважинами, если визуализирует несколько червей в высокопроизводительных генетических скринингах18. Используйте живые настройки визуализации для изображения пространственно-временной динамики липидного обмена через развитие и старение19.
  2. Монтаж червей
    1. Готовят обезболивающее средство, добавляя азид натрия или левамизол в буфер М9 до конечной концентрации 100 мМ или 1 мМ соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте левамизол, если черви необходимо восстановить после визуализации для генотипирования после генетических скринингов.
      ВНИМАНИЕ: Некоторые обезболивающие агенты, включая азид натрия и левамизол, вредны при вдыхании. Надевайте защитные перчатки и одежду, а также используйте химический вытяжной капюшон при приготовлении этих рабочих решений.
    2. Поместите каплю обезболивающего средства в укрытие (примерно 4–5 мкл на 10–20 червей).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество обезболивающего агента в соответствии с номером червя, чтобы держать червей как можно ближе друг к другу. Использование слишком большого количества жидкости для нескольких червей может привести к тому, что черви будут распространяться по агарозной подушке.
    3. Выберите червей для изображения под микроскопией рассечения и перенесите их в каплю обезболивающего агента. После того, как все черви добавлены в каплю, перемещайте их с помощью сборщика червей и убедитесь, что они не перекрывают друг друга.
    4. Отделите стеклянные слайды (от шага 2.1), не возмущая агарозную прокладку.
    5. Накройте каплю червя стеклянной горкой, которая имеет агарозную прокладку. Убедитесь, что подушечка агарозы обращена к червям. Альтернативно, обезболивающая капля старения также может быть добавлена на агарозную прокладку, а черви могут быть покрыты крышкой.
    6. Наконец, отметьте местоположение червей с помощью постоянного маркера на стеклянной горке.

3. Получение и анализ изображений

  1. Получение изображений с помощью системы микроскопа SRS.
    1. Перед визуализацией любого образца определите параметры изображения и проверьте сигналы SRS (как описано в Протоколе 1).
    2. Установите затвор с помощью крышки, обращенной к объективу. Включите яркий полевой источник света и направляйте его на окуляр, чтобы найти червей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте объектив 20x для изображения хранения липидов во всей кишечнике. Рассмотрите возможность использования объектива 60x для изображения подкожной жировой кладки или для количественной оценки размера / количества капель липидов.
    3. Поместите червей в фокус и отрегулируйте положение конденсатора соответствующим образом.
    4. Выключите источник света яркого поля и переключитесь на блок лазерного сканирования. Начните сканирование первого червя с высокой скоростью сканирования (например, 512 x 512 пикселей) и отрегулируйте тонкую фокусировку, чтобы найти интересующую область. Чтобы первый образец был визуазирован, отрегулируйте мощность лазера до уровня, при котором сигналы SRS не насыщены.
    5. Для получения изображения SRS переключитесь на более медленную скорость сканирования (например, 2 мкс/пиксель) и более высокое разрешение (например, 1024 x 1024 пикселя).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите мощность лазера постоянной для каждого образца, который будет визуализирован во время сеанса визуализации.
    6. Сохраните изображение SRS в нужном формате, обеспечивающем высокое разрешение (например, файл .tiff). В зависимости от используемого программного обеспечения для создания образов и настроек сохраните местоположение первого червя перед переходом к следующему.
    7. Полное изображение всех червей, которые были установлены на слайде. Выключите затвор, чтобы заблокировать лазерные лучи. Не выключайте лазерный источник до тех пор, пока не будут получены все образцы.
    8. Удалите слайд перед размещением следующего образца слайда. Повторите шаги 3.1.2–3.1.7.
    9. После того, как все образцы были получены, переключите лазерный источник в режим ожидания и выключите соответствующее оборудование, включая усилитель, детектор, микроскоп и компьютер.
  2. Анализ изображений с помощью ImageJ
    1. Откройте файлы изображений (обычно .tiff) для количественной оценки в ImageJ, выбрав файлы и перетащив их в окно ImageJ. Загрузите соответствующие плагины ImageJ, если используете определенные форматы микроскопов Olympus (например, OIB-файлы).
    2. Выберите свойства для анализа (Анализ > Набор измерений). Для определения общего количества хранения липидов выберите Площадь, Минимальное и Максимальное значение серого и Среднее значение Серого.
    3. Используйте инструмент выделения полигонов и наметьте область кишечника червя для количественной оценки. Чтобы измерить параметры, выбранные на шаге 3.2.2, нажмите «Анализировать > измерение». Появится новое окно с результатами измерений. Повторите этот шаг для всех открытых изображений.
    4. Выберите измерения для всех червей в заданном генотипе и скопируйте /вставьте результаты в новую электронную таблицу. Повторите шаги 3.2.1–3.2.4 для всех генотипов в одном сеансе визуализации.
    5. Выберите область в непосредственной близости от червя, которая не имеет сигнала SRS, для количественной оценки в качестве фона. Убедитесь, что область, выбранная для фонового измерения, не содержит бактерий или мусора, которые также могут дать сигнал SRS.
    6. Вычтите среднее значение серого фона из измерений каждого отдельного червя. Рассчитайте среднее и стандартное отклонение фона, вычитаемого среднего серого значения из всех червей в данной генотипической/тестовой группе. Нормализуйте это значение до среднего значения контрольной группы.
    7. Наконец, выполните соответствующий статистический анализ, используя среднее значение серого цвета в качестве меры для уровня липидов у каждого червя. Как правило, используйте t-тестStudent для двух групп и используйте односторонний ANOVA с соответствующим множественным сравнительным тестом для более чем двух групп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе изображений для представления рисунков убедитесь, что выбранные изображения имеют одинаковое распределение интенсивности пикселей. Установите одинаковые значения яркости и контрастности для всех изображений на одном рисунке (Image > Adjust > Brightness and Contrast).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Передача сигналов инсулина является важным эндокринным путем, который влияет на развитие, размножение, продолжительность жизни и метаболизм. У червей передача сигналов инсулина состоит из около 40 инсулиноподобных пептидных лигандов, инсулиноподобного рецептора фактора роста ортолога DAF-2, нисходящего каскада киназы PI3K / AKT и ортолога транскрипционного фактора FoxO, DAF-1620. Мутанты daf-2, у которых отсутствует рецептор инсулина, имеют больше липидных капель в кишечнике, глист липидов храненияткани 21,22. Используя микроскопию SRS, мы количественно оценили уровни липидов кишечника у синхронизированных по возрасту червей дикого типа и мутантов daf-2 во взрослом возрасте. В соответствии с предыдущими результатами, мы обнаружили, что мутанты daf-2 имеют более высокие уровни липидов23,24 (рисунок 2A). Мы наблюдали снижение уровня липидов у диких червей, начиная с 1-го по 9-й день взрослой жизни(рисунок 2А). Однако уровни липидов у мутантов daf-2 увеличивались до тех пор, пока им не исполнилось 5 дней, а затем они были постоянными примерно на уровне 2,5-3,0 раза выше, чем у диких(рисунок 2A).

DAF-16, ортолог транскрипционного фактора C. elegans FoxO, управляет большинством последующих функций сигнального пути инсулина. Нулевые мутации daf-16 подавляют несколько фенотипов, наблюдаемых у мутантов daf-2, включая накопление жира. Геномный локус daf-16 кодирует 8 различных транскриптов(daf-16a-h),которые генерируются либо альтернативным сайтом начала транскрипции, либо альтернативным сплайсингом20. Среди них daf-16a, daf-16b и daf-16d / f / h являются наиболее распространенными транскриптами, и они кодируют белки с различными N-терминами. Исследования с изоформ-специфическими мутациями и трансгенами показали, что изоформы DAF-16A и DAF-16D/F/H регулируют развитие и продолжительность жизни дауэра24,25,тогда как DAF-16B важен для ремоделирования глотки во время формирования дауэра26. В этом исследовании, используя микроскопию SRS, мы исследовали изоформную специфичность DAF-16 в регулировании накопления липидов в кишечнике. Мы обнаружили, что инактивация daf-16 подавляет повышение уровня липидов мутантов daf-2 (рисунок 2B,C). Экспрессия изоформы daf-16a или daf-16b в daf-2; двойные мутанты daf-16 не восстанавливают уровень липидов. Однако экспрессия изоформы daf-16d/f/h достаточна для восстановления уровней липидов в daf-2; daf-16 до уровней, наблюдаемых у одиночных мутантов daf-2 (рисунок 2B,C). Эти результаты показали, что специфически изоформы DAF-16D / F / H модулируют липидный метаболизм у мутантных червей daf-2. Это также согласуется с результатами недавнего исследования, которое показало, что обонятельная регуляция накопления липидов также опосредована транскрипционной активностью DAF-16D / F / H27.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрация системы микроскопа SRS. Лазер «все-в-одном» обеспечивает временное и пространственное сочетание пучков накачки и пучков Стокса, встроенный электрооптический модулятор (EOM) и опорную частоту для блокированного усилителя. Комбинированный луч расширяется телескопом (L1 и L2), передается двумя релейными зеркалами (M1 и M2) и поднимается перископом (P1 и P2), а затем отправляется в сканер микроскопа. Комбинированный луч сканируется сканирующей установкой (SU) в микроскопе и фокусируется на образце. Проходящий свет собирается конденсатором. Фильтр удалит пучок Стокса и оставит пучок насоса для обнаружения фотодиодом (PD). Серые пунктирные стрелки показывают связь между электроникой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Снижение передачи сигналов инсулина у C. elegans приводит к увеличению накопления липидов. Спомощью микроскопии SRS уровни липидов в кишечнике червей-мутантов дикого типа и daf-2 количественно определяются на 1, 3, 5, 7 и 9 день взрослой жизни. У диких червей уровень липидов со временем снижается, тогда как мутанты daf-2 накапливают липиды до 5-го дня, и у них примерно в 2,7 раза больше липидов по сравнению с червями дикого типа. (B)делеция daf-16 подавляет повышенные уровни липидов у мутантов daf-2. Восстановление экспрессии изоформы daf-16d/f/h в daf-2; двойных мутантов daf-16 достаточно для повышения уровня липидов до уровней мутантов daf-2, тогда как восстановление экспрессии изоформ daf-16a или daf-16b не является. *** p < 0,001, н.с. не значимо односторонним ANOVA с тестом множественных сравнений Бонферрони. (C) Репрезентативные изображения СФО. Желтые пиксели указывают на более высокий уровень липидов. Количественная площадь кишечника показана пунктирными линиями. Шкала шкалы составляет 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В защиту от ожирения и связанных с ним метаболических нарушений были предприняты важные исследовательские усилия для лучшего понимания регуляторных механизмов липидного гомеостаза. Для количественного обнаружения молекул липидов в биологических образцах было доказано, что визуализация без меток с помощью микроскопии SRS является надежной альтернативой биохимическим анализам и другим методам окрашивания. Наша группа и другие выявили новые биологические механизмы в регуляции метаболизма липидов, объединив использование C. elegans и микроскопии SRS12,18,28,29,30,31. В этом протоколе, используя микроскопию SRS, мы продемонстрировали, что снижение уровня передачи сигналов инсулина у червей приводит к увеличению общего уровня липидов в кишечнике. Мы наблюдали, что начиная с 1-го дня взрослой жизни липиды накапливаются в кишечнике мутантов daf-2, которые имеют мутацию потери функции в гене рецептора инсулина, тогда как у диких червей уровень липидов в кишечнике снижается. Кроме того, в соответствии с предыдущими исследованиями23,24,мы обнаружили, что инактивация daf-16 может полностью подавлять увеличение накопления липидов у мутантов daf-2, а среди различных изоформ daf-16 изоформа daf-16d / f / h специфически регулирует липидный гомеостаз. Как показали предыдущие исследования, разница в общих уровнях хранения липидов в кишечнике у мутантов DAF-2, вероятно, обусловлена сочетанием факторов: увеличением синтеза липидов de novo 32,снижением использования липидов33,а также уменьшением размножения и накоплением желтка34. Последние достижения в методах когерентной рамановской спектроскопии (SRS и CARS) помогут дополнительно прояснить механизмы того, как передача сигналов инсулина способствует регуляции различных типов хранения липидов в различных тканях, включая кишечник, гиподерму и ооциты.

Микроскопия SRS использовалась для изображения не только липидов, но и других биомолекул, включая ДНК35,РНК14,белки13иглюкозу 36. Он был реализован, чтобы обеспечить важную информацию о многих аспектах биологии, таких как клеточная биология, микробиология, биология рака и биология развития11. В последнее время использование биоортогональных меток (например, алкиновых и дейтериевых меток) для минимальной маркировки интересующих молекул еще больше повысило чувствительность и специфичность обнаружения. Эти минимальные вибрационные метки не нарушают химические свойства молекулы, но обеспечивают специфический химический контраст, так как их рамановский сигнал находится в пределах «бесшумного окна» рамановского спектра14,37. В дополнение к улучшению чувствительности и специфичности, достижение изображения SRS со сверхвысоким разрешением также является захватывающей областью исследований. Несколько исследовательских групп также прилагают усилия для минимизации размера оборудования путем создания ручного SRS-микроскопа38. Таким образом, применение визуализации SRS к биомедицинским исследованиям открыло новые возможности для технологических и химических улучшений для продвижения липидной визуализации.

По сравнению с традиционными методами количественного определения липидов, SRS-микроскопия имеет ряд преимуществ. Прежде всего, он выполняется без меток, и даже если этикетка должна использоваться, этикетка может быть такой же маленькой, как два атома. Таким образом, он также не страдает от проблемы фотоотбеливания, как другие методы флуоресцентной маркировки и окрашивания. Во-вторых, возможность живой визуализации с использованием целых организмов позволяет отслеживать динамику специфических метаболитов29,39,40. Наконец, микроскопия SRS позволяет более высокую степень мультиплексирования и, следовательно, может быть реализована для одновременного изображения нескольких биомолекул в различных клеточных компартментах. Гиперспектральная микроскопия SRS/CARS имеет большое будущее в изучении метаболической динамики нескольких различных биомолекул, а также различных типов липидных отсеков хранения, таких как частицы желтка в C. elegans41 или холестериловом эфире и богатые TAG липидные капли в различных клетках и тканях млекопитающих31. С другой стороны, микроскопия SRS сталкивается с такими ограничениями, как высокая стоимость аппаратного обеспечения и отсутствие полной коммерческой доступности. Кроме того, для обслуживания и запуска системы требуются специальные знания, что может усложнить ее принятие. Развитие источников света и системной интеграции улучшает ситуацию. Низкокачественный лазерный источник на основе волокон и полностью интегрированные системы открывают новые возможности в коммерциализации и помогут снизить стоимость в будущем11,42,43. Кроме того, несмотря на новые технологические подходы к улучшению скорости визуализации и пространственного разрешения изображений SRS, ограниченная чувствительность обнаружения может по-прежнему препятствовать возможности зондирования метаболитов с низким содержанием. В целом, использование микроскопии SRS в биомедицинских исследованиях значительно выросло за последнее десятилетие. Визуализация SRS еще больше выиграет от технологических улучшений в чувствительности обнаружения, пространственном разрешении и возможности мультиплексирования и в конечном итоге расширит свое использование в количественном мониторинге биомолекул, особенно липидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIH R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), March of Dimes Foundation (M.C.W.), Welch Foundation (M.C.W.) и исследователем HHMI (M.C.W.). Мы благодарим Генетический центр Caenorhabditis (CGC) за штаммы C. elegans.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D converter Olympus Analog Unit
Agarose GeneMate 3119 For making agarose pads
Alignment tool - adapter Thorlabs SM1A4 For mounting the tool on scope
Alignment tool - target Thorlabs VRC2SM1 For viewing IR laser
Alignment tool - tube Thorlabs SM1L40 Length can vary
Autocorrelator (Optional) APE pulseCheck
Bandpass filter minicircuits BBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHz For signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscope Nikon SMZ800 For handling and picking worms for imaging
Dodecane Sigma-Aldrich 44010 Used for calibration of the SRS signal
Filter Chroma Technology 890/220 CARS For removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tape VWR 89097 For making agarose pads
Glass coverslips VWR 48393-106 For covering worms for imaging
Glass microscope slide VWR 16004-422 For making agarose pads
Laser scanning microscope Olympus FV3000
Lens Thorlabs L1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B
For beam expander
Lock-in amplifier Zurich HF2LI
Lowpass filter minicircuits BLP-1.9+ For power supply noise suppression
Mirrors Thorlabs BB1-E03 For relay and periscope
Objective Olympus UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
Photodiode Thorlabs FDS1010
Picosecond laser source APE picoEmerald
Power supply TEKPOWER TP1342U For photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azide Sigma S2002 For anaesthesizing the worms
Worm picker WormStuff 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67, (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34, (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26, (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384, (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5, (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10, (1), Palo Alto, Calif. 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, Palo Alto, Calif. 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322, (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16, (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8, (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11, (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851, (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8, (1), 865 (2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54, (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207, (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466, (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11, (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11, (1), 1450 (2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19, (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91, (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19, (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136, (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8, (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1, (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28, (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54, (2), Cambridge, England. 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142, (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5, (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53, (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16, (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8, (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10, (9), 4437-4449 (2019).
Безметчная визуализация динамики накопления липидов у <em>caenorhabditis elegans</em> с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).More

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (171), e61870, doi:10.3791/61870 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter