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Developmental Biology

विच्छेदन और देर से भ्रूण ड्रोसोफिला गोनाड के लाइव-इमेजिंग

Published: October 17, 2020 doi: 10.3791/61872
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cell and Developmental Biology Department and the Penn Institute for Regenerative Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

यहां, हम देर से भ्रूण ड्रोसोफिला पुरुष गोनाड को लाइव-इमेज करने के लिए आवश्यक एक विच्छेदन प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल सामान्य परिस्थितियों में या ट्रांसजेनिक या औषधीय हेरफेर के बाद गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं के अवलोकन की अनुमति देगा।

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर पुरुष भ्रूण गोनाड विकासात्मक जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक लाभप्रद मॉडल है, जिसमें रोगाणु कोशिका विकास, पीआईआरएनए जीव विज्ञान और आला गठन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। यहां, हम एक विच्छेदन तकनीक पेश करते हैं ताकि एक अवधि के दौरान गोनाड पूर्व वीवो को लाइव-इमेजिंग की लाइव-इमेजिंग अत्यधिक अप्रभावी हो। यह प्रोटोकॉल रेखांकित करता है कि भ्रूण को इमेजिंग डिश में कैसे स्थानांतरित किया जाए, उचित रूप से मंचित पुरुष भ्रूण का चयन करें, और अभी भी अपनी संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखते हुए अपने आसपास के ऊतकों से गोनाड को विच्छेदित करें। विच्छेदन के बाद, गोनाड्स को गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की कल्पना करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। विच्छेदन प्रक्रिया के लिए सटीक समय और निपुणता की आवश्यकता होती है, लेकिन हम आम गलतियों को रोकने और इन चुनौतियों को दूर करने के तरीके के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। हमारे ज्ञान के लिए यह ड्रोसोफिला भ्रूण गोनाड के लिए पहला विच्छेदन प्रोटोकॉल है, और समय की अन्यथा दुर्गम खिड़की के दौरान लाइव-इमेजिंग की अनुमति देगा। इस तकनीक को औषधीय या सेल-प्रकार के विशिष्ट ट्रांसजेनिक जोड़तोड़ के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि उनके प्राकृतिक गोनाडल वातावरण में कोशिकाओं के भीतर या बीच में होने वाली किसी भी गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सके।

Introduction

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर वृषण ने कई गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं की हमारी समझ के लिए एक प्रतिमान के रूप में कार्य किया है। इस मॉडल के अध्ययन ने स्टेम सेल डिवीजन विनियमन 1,2,3, रोगाणु कोशिका विकास 4,5, पीआरएनए जीव विज्ञान 6,7,8, और आला-स्टेम सेल सिग्नलिंग घटनाओं 9,10,11,12,13 पर प्रकाश डाला है। यह मॉडल लाभप्रद है क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से14,15 तक चलने योग्य है और उन कुछ लोगों में से एक है जहां हम अपने प्राकृतिक वातावरण 3,16,17,18 में स्टेम कोशिकाओं को जीवित कर सकते हैं। हालांकि, इस मॉडल की लाइव-इमेजिंग वयस्क ऊतक और प्रारंभिक भ्रूण चरणों तक सीमित है, जिससे देर से भ्रूण में गोनाडल गतिशीलता के हमारे ज्ञान में अंतर छोड़ दिया गया है, सटीक चरण जब आला पहली बार बन रहा है और कार्य करना शुरू कर रहा है।

देर से चरण भ्रूण गोनाड एक गोला है, जिसमें पूर्वकाल में दैहिक आला कोशिकाएं होती हैं, और रोगाणु कोशिकाएं अधिक पीछे के क्षेत्रों में दैहिक गोनाडल कोशिकाओं द्वारा एनिस्टेड होतीहैं। इस अंग को प्रारंभिक भ्रूण चरण 17 17,20,21 तक विवो में लाइव चित्रित किया जा सकता है। बड़े पैमाने पर मांसपेशियों के संकुचन की दीक्षा के कारण आगे की इमेजिंग को रोका जाता है। ये संकुचन इतने गंभीर हैं कि वे गोनाड को इमेजिंग फ्रेम से बाहर धकेलते हैं, और इस तरह के आंदोलन को इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के साथ ठीक नहीं किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला आला गठन के तंत्र का अनावरण करने में रुचि रखती है, जो लाइव-इमेजिंग के लिए इस मायावी अवधि के दौरान होती है। इसलिए, हमने भ्रूण चरण 16 पर शुरू होने वाले गोनाड को लाइव छवि के लिए एक पूर्व विवो दृष्टिकोण उत्पन्न किया, जिससे गोनाड विकास की इस महत्वपूर्ण अवधि के दौरान सेल गतिशीलता के अध्ययन की सुविधा मिलती है। हमारी प्रयोगशाला से पिछले काम से पता चलता है कि यह पूर्व विवो इमेजिंग ईमानदारी से vivo gonad विकास17 में recapitulates. यह तकनीक ड्रोसोफिला भ्रूण गोनाड के लिए अपनी तरह की पहली और एकमात्र तकनीक है।

यहां, हम देर से भ्रूण चरणों के दौरान गोनाड के पूर्व विवो लाइव-इमेजिंग के लिए आवश्यक विच्छेदन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल को औषधीय उपचार, या गोनाड के भीतर विशिष्ट सेल वंशों के ट्रांसजेनिक हेरफेर के साथ जोड़ा जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने स्टेम सेल आला गठन17 के चरणों को सफलतापूर्वक चित्रित किया है। यह इमेजिंग दृष्टिकोण इस प्रकार स्टेम सेल जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह अपने प्राकृतिक वातावरण15,17 के भीतर वास्तविक समय में आला गठन के प्रारंभिक चरणों के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करेगा। हालांकि यह विधि स्टेम सेल जीव विज्ञान के क्षेत्र के लिए फायदेमंद है, यह इस विकासात्मक टाइमपॉइंट के दौरान गोनाड में होने वाली किसी भी गतिशील प्रक्रियाओं को देखने के लिए अतिरिक्त रूप से लागू होती है, जिसमें सेलुलर पुनर्व्यवस्था22, सेल आसंजन 2,12,23 और सेल माइग्रेशन23 शामिल हैं। यह विच्छेदन प्रोटोकॉल इस प्रकार कई मौलिक सेल जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ को बढ़ाएगा।

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Protocol

1. दिन से पहले विच्छेदन तैयारी

  1. इलेक्ट्रोलाइटिक रूप से एक टंगस्टन सुई24 को तेज करें ताकि परिणामी व्यास लगभग 0.03 मिमी हो। लगभग 14 V को आपूर्ति किए गए वोल्टेज को समायोजित करें, और 3.3 M NaOH का उपयोग करें। तेज करने में 1 या 2 मिनट से अधिक समय नहीं लगना चाहिए।
    सावधानी: NaOH अत्यधिक संक्षारक है और त्वचा के साथ संपर्क में आने पर जलन का कारण होगा। हैंडलिंग करते समय दस्ताने और चश्मे पहनें, और एक धुएं के हुड के अंदर काम करें।
    नोट:: उपयोग करने के बाद, एक polypropylene फाल्कन ट्यूब में NaOH संग्रहीत करें।
  2. तैयार इमेजिंग मीडिया बनाएं। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, 15% अंतिम एकाग्रता) के 750 μL और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 27.5 μL (पेनिसिलिन के 0.05 U / μL, 0.05 μg / μL अंतिम एकाग्रता) के साथ श्नाइडर के मीडिया के 4.25 मिलीलीटर को मिलाएं। इस तैयार इमेजिंग मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. हेप्टेन-गोंद समाधान बनाएं। के बारे में 0.5 mL हेप्टेन एक 20 mL sealable शीशी के बारे में 20 सेमी डबल-साइडेड टेप के साथ भरवां करने के लिए जोड़ें। लगभग एक घंटे के लिए एक nutator पर रॉक, या पानी और ग्लिसरॉल के बीच एक स्थिरता प्राप्त होने तक एक पिपेट टिप के साथ हलचल। हेप्टेन के वाष्पित होने से पहले भंग गोंद का यह समाधान कई दिनों तक चलेगा। समाधान को तरोताजा करने के लिए, एक अतिरिक्त 0.5 एमएल हेप्टेन जोड़ें, और रॉक।
    नोट: टेप करने के लिए हेप्टेन के विभिन्न अनुपातों का उपयोग करके एक प्रभावी हेप्टेन-गोंद समाधान तैयार किया जा सकता है, साथ ही साथ रॉकिंग / सरगर्मी की अलग-अलग अवधि। उपर्युक्त विनिर्देश केवल एक ऐसे पर्याप्त समाधान को तैयार करने या तरोताजा करने के लिए सुझाव हैं।

2. भ्रूण संग्रह-विच्छेदन से पहले 15-17 ज

  1. एक सेब का रस अगर प्लेट25 करने के लिए ताजा खमीर पेस्ट जोड़ें. एक खाली भोजन की बोतल में वयस्क मक्खियों (10 दिनों से कम पुरानी) को जोड़कर एक भ्रूण संग्रह पिंजरे की स्थापना करें, जो छोटे छेद26 के साथ छिद्रित है। खमीर आगर प्लेट का उपयोग करके संग्रह पिंजरे को कैप करें, बोतल पर टेप किया गया, और 1 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस अंधेरे इनक्यूबेटर में प्लेट साइड के साथ पिंजरे को नीचे रखें।
    नोट: मक्खियों को एक ट्रांसजीन व्यक्त करना चाहिए जो गोनाड को फ्लोरोसेंट रूप से चिह्नित करेगा, उदाहरण के लिए, 64-eGFP:: Moesin20, क्योंकि भ्रूण का विच्छेदन एक स्टीरियो-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे होगा। गोनाड को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले जीनोटाइप की एक सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. इनक्यूबेटर से पिंजरे को हटा दें और इस पहले संग्रह को छोड़ दें। इसे एक ताजा खमीर वाले आगर प्लेट के साथ बदलें और पिंजरे को 2 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    नोट: पहले भ्रूण संग्रह का उपयोग निषेचित, विकासशील भ्रूण की मादाओं को साफ करने के लिए किया जाता है, ताकि भ्रूण के एक कसकर समयबद्ध दूसरे संग्रह को प्राप्त किया जा सके।
  3. पिंजरे से आगर प्लेट निकालें और इसे एक सील करने योग्य प्लास्टिक कंटेनर के अंदर एक नम कागज तौलिया पर (खमीर पक्ष ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है) रखें। इस आर्द्र कक्ष को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें ताकि भ्रूण को 14.5 घंटे के लिए उम्र दी जा सके (अंतिम उम्र, अंडे देने के बाद 14.5-16.5 घंटे)।
    नोट:: चरण 2.4 प्रारंभ करने से ठीक पहले, चरण 3.1 और 3.2 पूरा करें।
  4. इनक्यूबेटर से आगर प्लेट को हटा दें, और एक धारा निकलना बोतल का उपयोग करके, पेंट ब्रश के साथ हल्के से ब्रश करके खमीर पेस्ट को भंग करने के लिए आगर प्लेट में पर्याप्त पानी जोड़ें। भ्रूण और भंग खमीर एक छोटे से जाल स्क्रीन टोकरी में एक वजन नाव के अंदर बैठे कुल्ला. पानी की धारा निकलना बोतल के साथ टोकरी कुल्ला जब तक कि सबसे खमीर पेस्ट जाल के माध्यम से फ़िल्टर किया गया है.
  5. वजन नाव से पानी निकालें और टोकरी को वापस अंदर रखें। एक धारा निकलना बोतल का उपयोग कर उन्हें एक 50% ब्लीच समाधान में विसर्जित करके भ्रूण dechorionate. ब्लीच समाधान में 3-5 मिमी की गहराई होनी चाहिए। भ्रूण को कभी-कभी घूमने के साथ ~ 2 मिनट के लिए ब्लीच में डूबे रखें।
    सावधानी: ब्लीच संक्षारक है और आंखों और श्वसन पथ को परेशान या नुकसान पहुंचा सकता है। ब्लीच को संभालते समय दस्ताने और चश्मे पहनें।
    नोट:: इस समय के दौरान, चरण 3.3 के जितना संभव हो उतना पूरा करें। एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे टोकरी रखने और पृष्ठीय उपांगों की अनुपस्थिति के लिए जाँच करके dechorionation प्रगति की जांच की जा सकती है। यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त समय के लिए ब्लीच समाधान में भ्रूण को डुबोएं।
  6. ब्लीच को छोड़ दें, और टोकरी के अंदर भ्रूण को एक धारा निकलना बोतल से पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें (~ 3 एस के लिए, कागज के तौलिए के साथ जाल टोकरी को ब्लोटिंग; 2-3 बार दोहराएं)।

3. विच्छेदन तैयारी के दिन

  1. 1.5 mL Eppendorf ट्यूब (0.2 mg/ mL अंतिम एकाग्रता) में 1,500 μL तैयार इमेजिंग मीडिया (चरण 1.2 देखें) में 30 μL इंसुलिन (10 mg / mL) जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए बेंचटॉप पर ट्यूब छोड़ दें।
  2. गोंद के साथ लेपित coverslip स्ट्रिप्स तैयार करें।
    1. एक हीरे की इत्तला वाले चाकू का उपयोग करें एक 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप को चार, समान रूप से आकार की स्ट्रिप्स (चित्रा 1 ए) में काटने के लिए।
    2. एक पट्टी लेने के लिए संदंश का उपयोग करें और पट्टी के दोनों किनारों पर हेप्टेन-गोंद समाधान के लगभग 30 μL की कुल मात्रा फैलाएं (चित्रा 1 B)। गोंद अवशेषों की एक भी परत प्राप्त करने के लिए, विभिन्न कोणों पर पट्टी को झुकाएं जबकि हेप्टेन वाष्पित हो जाता है।
    3. एक coverslip बॉक्स के एक खाली स्लॉट में गोंद-कवर पट्टी स्टोर; इसकी चिपचिपाहट को बनाए रखने के लिए, पट्टी को एक तिरछी, लेकिन सीधी स्थिति में रखें, बॉक्स सतहों के साथ संपर्क को कम करने के लिए बॉक्स के किनारों के खिलाफ झुकाव (चित्रा 1 सी)। बॉक्स को बंद करें ताकि हवा में कण गोंद को कोट न करें और इसकी चिपचिपाहट को कम करें।
  3. बेंचटॉप पर निम्नलिखित वस्तुओं को रखें: एक 6 इंच ग्लास पाश्चर पिपेट, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड, एक P200 और उपयुक्त पिपेट युक्तियों के साथ एक P1000 पिपेटमैन, रिंगर का समाधान27 (पीएच NaOH के साथ 7.3 में समायोजित), और एक खुला, पॉली-डी-लाइसिन-लेपित 35 मिमी इमेजिंग डिश।
  4. जाल स्क्रीन टोकरी से 500-750 μL हेप्टेन से भरे एक छोटे से घड़ी ग्लास में भ्रूण को स्थानांतरित करें।
    1. एक ऊतक पोंछने के साथ सूखी टोकरी के पक्षों और नीचे धब्बा. हेप्टेन में एक पेंटब्रश को नम करें, पेंटब्रश को भ्रूण को स्पर्श करें (हाइड्रोफोबिक विटेलिन झिल्ली को ब्रिस्टल्स का पालन करना चाहिए), और पेंटब्रश को घड़ी के ग्लास में हेप्टेन में वापस डुबोएं (भ्रूण को नीचे तक डूबना चाहिए)।
      नोट: भ्रूण को सूखने से रोकने के लिए अगले चरणों को जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। भ्रूण को 20 सेकंड से अधिक समय तक हवा के संपर्क में नहीं लाया जाना चाहिए।
  5. एक पाश्चर पिपेट (चित्रा 1 डी) का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर भ्रूण को स्थानांतरित करें। भ्रूण को धीरे-धीरे पिपेट में खींचें और उन्हें पिपेट के संकीर्ण हिस्से तक सीमित करें। पिपेट धीरे-धीरे स्लाइड पर भ्रूण करता है, जैसे कि वे स्लाइड पर बहने से पहले पिपेट की नोक के अंदर एकत्र होते हैं। एक ऊतक पोंछने के कोने को एक ठीक टिप में मोड़ें, और स्लाइड पर भ्रूण से हेप्टेन को दूर कर दें। वे एक छोटे से क्षेत्र को एकत्रित और कवर करेंगे, जिससे उन्हें अगले चरण में गोंद-कवर की गई पट्टी पर कब्जा करना आसान हो जाएगा।
  6. संदंश के साथ, एक गोंद-कवर पट्टी उठाएं, और धीरे से इसे भ्रूण (चित्रा 1 ई) को स्पर्श करें। इमेजिंग डिश, भ्रूण साइड-अप, और पॉली-डी-लाइसिन-लेपित केंद्र के बाहर स्ट्रिप रखें। संदंश का उपयोग करके डिश पर पट्टी दबाएं, यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह जगह में तय किया गया है। तुरंत 2-3.5 एमएल रिंगर के समाधान के साथ पकवान बाढ़; भ्रूण को सूखने से रोकने के लिए पहले उन्हें डुबोएं (चित्रा 1 एफ)।

4. विच्छेदन

नोट: इन चरणों को स्टीरियो-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए।

  1. Devitellinize 10-15 भ्रूण।
    नोट: यह दो भ्रूणों से लेकर, शुरुआती लोगों के लिए, पंद्रह भ्रूण तक, विशेषज्ञों के लिए हो सकता है।
    1. आंत आकृति विज्ञान (चित्रा 2) के आधार पर चरण 16 भ्रूण का चयन करें। इस स्तर पर, भ्रूण में तीन आंत कसना होता है जो चार स्टैक्ड आंत खंडों (चित्रा 2बी, बी') बनाते हैं। devitellinization शुरू करने के लिए, एक छोर पर चयनित भ्रूण को छेदें, अधिमानतः पूर्वकाल, टंगस्टन सुई के साथ। भ्रूण अपनी विटेलिन झिल्ली से बाहर निकल सकता है, लेकिन यदि नहीं, तो भ्रूण से झिल्ली को छील लें।
      नोट: भ्रूण जो विच्छेदन करने के लिए बहुत छोटे हैं, उनमें गैर-क्षेत्रीयकृत हिम्मत होती है (चित्रा 2 सी)। स्टेज 17 भ्रूण का विच्छेदन संभव है, लेकिन चरण 16 भ्रूण के विच्छेदन की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इस चरण में छल्ली विकसित होना शुरू हो गया है। प्रारंभिक चरण 17 भ्रूण चार आंत खंडों के साथ मौजूद होते हैं जो एक दूसरे के सापेक्ष स्थानांतरित होते हैं (चित्रा 2डी, डी')।
    2. गोनाड्स से दूर एक क्षेत्र में भ्रूण के माध्यम से सुई हुक। हुक किए गए भ्रूण को डिश के पॉली-लाइसिन-लेपित क्षेत्र में स्थानांतरित करें (यहां से आगे बस "कवर स्लिप" के रूप में संदर्भित किया जाता है) और इसे नीचे के खिलाफ खींचें जब तक कि यह पालन न करे। इन चरणों को दोहराएं, और पॉली-लाइसिन-लेपित कवर स्लिप (चित्रा 3 ए) के शीर्ष के साथ एक पंक्ति में डेविटेलिनाइज्ड भ्रूण की व्यवस्था करें, जिससे आगे के विच्छेदन के लिए नीचे बहुत सारी जगह बची है।
      नोट: गोनाड्स कोशिकाओं के छोटे गोलाकार समुच्चय के रूप में दिखाई देते हैं जिन्हें उपयोग किए गए विशिष्ट मार्कर और ट्रांसजीन कॉपी नंबर के आधार पर चमकीले रूप से फ्लोरेस करना चाहिए। इस स्तर पर, गोनाड्स सेगमेंट ए 5 में पार्श्व रूप से स्थित होते हैं, पूर्वकाल से भ्रूण की लंबाई के लगभग 70% -80% पर। विच्छेदन प्रोटोकॉल के दौरान, ऊतक सुई से चिपक सकता है। मलबे की सुई से छुटकारा पाने के लिए, इसे रिंगर के समाधान की सतह के ठीक ऊपर उठाएं। Devitellinization के रूप में लंबे समय के रूप में गोनाड उचित के रूप में संभव के रूप में कम के रूप में परेशान है के रूप में अव्यवस्थित किया जा सकता है।
  2. भ्रूण से बाहर और पकवान पर गोनाड्स को चालाकी करें (चित्रा 3सी, डी)।
    1. सबसे पहले, भ्रूण को इसके इंटीरियर को उजागर करने के लिए फाइल करें (चित्रा 3 सी)। इसके केंद्र से भ्रूण के माध्यम से स्लाइस करें, सुई को पीछे की ओर ले जाएं, गोनाड्स के बीच। कुछ आंतरिक ऊतकों को चिढ़ाएं, क्योंकि यह बाहरी छल्ली की तुलना में डिश से बेहतर होगा। ऊतक की चिपचिपाहट अगले जोड़तोड़ को गोनाड को प्रकट करने में सक्षम करेगी और इसे कवर स्लिप का पालन करने की अनुमति देगी।
      नोट: यदि ऊतक पकवान से चिपका नहीं है, तो इसे लेपित कवर स्लिप के एक अदूषित क्षेत्र में मनाने का प्रयास करें; कवर स्लिप के बाहरी क्षेत्र विशेष रूप से चिपचिपा होंगे। जैसा कि चरण 4.1.2 में कहा गया है, इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि विच्छेदन जोड़तोड़ के परिणामस्वरूप एक उलझा हुआ भ्रूण शव होता है, जब तक कि गोनाड्स असुरक्षित रहते हैं।
    2. एक गोनाड के चारों ओर स्लाइस करने के लिए सुई का उपयोग करें जब तक कि ऊतक का एक टुकड़ा, गोनाड सहित, शेष शव से अलग न हो जाए। सुई के साथ, इस ऊतक को लेपित कवर स्लिप के एक ताजा क्षेत्र में खींचें, और इसे नीचे के खिलाफ तब तक मनाएं जब तक कि यह पकवान का पालन न करे।
      नोट: सबसे अच्छा इमेजिंग उन मामलों के लिए प्राप्त किया जाएगा जहां गोनाड स्वयं सीधे कवर स्लिप से जुड़ता है, बजाय ओवरलाइंग ऊतक के माध्यम से अप्रत्यक्ष लगाव के। इसलिए, जैसा कि ऊतक को शव से दूर निर्देशित किया जाता है, बाहरी ऊतक के बजाय पहले गोनैड को कवर स्लिप को छूने का प्रयास करें।
    3. गोनाड से जितना संभव हो उतना आसपास के ऊतक को हटा दें (चित्रा 3 डी) धीरे से सुई के साथ गोनाड से दूर अनुयायी ऊतक को खींचकर। गोनाड को सीधे छूने से बचें, जो इसे नुकसान पहुंचाएगा (चित्रा 4 ई)। यह सुनिश्चित करने के लिए कि गोनाड पर्याप्त रूप से पकवान का पालन किया जाता है, सुई को गोनाड के चारों ओर एक कोमल परिपत्र गति में ले जाएं- यदि यह चलता है, तो सुई को शेष अनुयायी ऊतक को स्पर्श करें, और गोनाड को चिपचिपा कवर स्लिप के एक ताजा क्षेत्र की ओर निर्देशित करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि गोनाड का कोई पता लगाने योग्य आंदोलन न हो।
    4. भ्रूण के शव पर लौटें और दूसरे गोनाड को विच्छेदित करें। इस प्रक्रिया को यथासंभव कई भ्रूणों पर दोहराएं लेकिन 25 मिनट से अधिक न करें। ~ 40-45 मिनट से अधिक समय के बाद रिंगर के समाधान में ऊतक व्यवहार्यता से समझौता किया जाएगा।
  3. विच्छेदन पूरा होने के बाद, विच्छेदन के दौरान अपने अभिविन्यास को रिकॉर्ड करने के लिए इमेजिंग डिश के बाहरी रिम में पंजीकरण चिह्न जोड़ने के लिए एक अमिट मार्कर का उपयोग करें।
  4. पकवान से गोंद लेपित पट्टी निकालें।
    1. धीरे पट्टी के नीचे संदंश की एक जोड़ी के नीचे prong डालें, अकवार और धीरे-धीरे पट्टी ऊपर की ओर झुकाव के रूप में रिंगर के समाधान के रूप में कम के रूप में संभव के रूप में रिंगर के समाधान के रूप में कम sloshing के साथ पकवान से मुक्त करने के लिए पालन gonads की गड़बड़ी को कम करने के लिए.
      नोट: पट्टी को विच्छेदित-आउट गोनाड्स से दूर झुकाया जाना चाहिए।
  5. धीरे से डिश को इमेजिंग माइक्रोस्कोप में इस तरह से ले जाएं जो रिंगर के समाधान के स्लोशिंग से बचाता है।

5. इमेजिंग

  1. स्टेज होल्डर में इमेजिंग डिश रखें, विच्छेदन के दौरान डिश को अनुमानित अभिविन्यास में रखने के लिए पंजीकरण चिह्नों का उपयोग करके। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी और कम शक्ति (~ 10x) उद्देश्य का उपयोग करके, ऊतक के किसी भी टुकड़े की पहचान करें और ध्यान में लाएं जो कवर स्लिप का पालन किया जाता है। प्रतिदीप्ति प्रकट करने के लिए आईपीस सेटिंग्स को स्विच करें, और दूरबीन आईपीस का उपयोग करके, डिश को व्यवस्थित रूप से स्कैन करें, इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के भीतर प्रत्येक गोनाड की स्थिति को चिह्नित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट:: सुनिश्चित करें कि gonads स्थिति को चिह्नित करने से पहले फ़ील्ड-की-दृश्य में केंद्रित हैं।
  2. धीरे से अपने धारक में इमेजिंग डिश के साथ पूरे चरण धारक असेंबली को हटा दें, और असेंबली को काम की बेंच पर रखें।
  3. रिंगर के समाधान को इंसुलिन युक्त तैयार इमेजिंग मीडिया के साथ बदलें (चरण 1.2 और 3.1 देखें)।
    1. इमेजिंग डिश के अंदर के ऊपरी किनारे से सभी रिंगर के समाधान को हटाने के लिए एक P1000 का उपयोग करें (केंद्रीय कवर स्लिप क्षेत्र से रिंगर के पिपेट न करें)। अगला, एक P200 पर स्विच करें, और इसकी नोक को केंद्रीय क्षेत्र में शेष रिंगर की सतह के नीचे रखें। ध्यान से रिंगर के 50-100 μL निकालें; पूरे समाधान को न निकालें।
    2. इमेजिंग मीडिया के ~ 200 μL को ड्रा करें, और फिर से शेष रिंगर की सतह के नीचे P200 टिप को रखते हुए, धीरे-धीरे इस इमेजिंग मीडिया को जोड़ें। इसके बाद, शेष इमेजिंग मीडिया (~ 1,300 μL) को पकवान में जोड़ें, जो ऊपरी किनारे के सबसे बाहरी रिम से शुरू होता है। पिपेटिंग करते समय, तरल पदार्थ के केंद्रीय गुंबद की ओर बढ़ें, और अंततः उन दोनों में पिपेट टिप को ब्रश करके दोनों को विलय करें। ढक्कन को पकवान पर रखें।
      नोट: इमेजिंग मीडिया को वाष्पीकरण को रोकने के लिए लगभग 2 मिमी की गहराई के साथ, डिश के पूरे अंदर के व्यास को कवर करना चाहिए (चित्रा 4 डी)।
  4. माइक्रोस्कोप को एक उच्च शक्ति उद्देश्य (63x, 1.2 एनए) पर स्विच करें, उपयोग किए गए उद्देश्य (विसर्जन द्रव प्रकार और उद्देश्य द्वारा आवश्यक अपवर्तक सूचकांक) के आधार पर उचित विसर्जन तरल पदार्थ लागू करें, और फिर चरण धारक असेंबली को प्रतिस्थापित करें। इमेजिंग डिश के नीचे चिपके ऊतक पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
    नोट: यदि चरण को स्थानांतरित नहीं किया गया था, तो उद्देश्य केंद्रित होने के बाद अंतिम गोनाड को दृश्य में आना चाहिए।
  5. प्रत्येक चिह्नित गोनाड स्थिति के माध्यम से कदम उठाएं और उस स्थिति को समायोजित करें, जैसा कि आवश्यक हो। चुनें कि छवि स्पष्टता, गोनाड सेक्स, आदि के आधार पर छवि के लिए कौन से गोनाड्स हैं। इमेजिंग सेटिंग्स (मल्टी-चैनल, एक्सपोज़र समय, लेजर तीव्रता, जेड-श्रृंखला वृद्धि, उचित अंतराल के साथ समय-अंतराल, आदि) को अनुकूलित करें। इमेजिंग शुरू करें।
    नोट: पुरुष गोनाड्स को एक आला दोनों की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है, और गोनाड के विपरीत छोर पर, छोटे, अत्यधिक परिपत्र दैहिक कोशिकाओं का एक समूह जिसे पुरुष-विशिष्ट दैहिक गोनाडल अग्रदूत (MSSGPs) कहा जाता है। यदि six4-eGFP::moesin फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग किया जाता है, तो आला कोशिकाएं गोनाड में दूसरी सबसे चमकीली कोशिकाएं हैं, सबसे उज्ज्वल msSGPs हैं। इस स्तर पर, महिला गोनाड्स के पास न तो एक आला है और न ही एमएसजीपी।

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Representative Results

हम चित्रा 1 में इमेजिंग डिश की तैयारी का वर्णन करते हैं, जैसा कि "डे-ऑफ-विच्छेदन तैयारी" में वर्णित है। इन तरीकों के परिणामस्वरूप अंततः अच्छी तरह से हाइड्रेटेड भ्रूण एक कवर स्लिप स्ट्रिप का पालन किया जाना चाहिए, जो अस्थायी रूप से पकवान के नीचे तय किया जाता है और रिंगर के समाधान (चित्रा 1 एफ) में डूब जाता है। एक हीरे की इत्तला वाला चाकू एक को 22 x 22 मिमी कवर स्लिप को तीन से चार छोटी स्ट्रिप्स (चित्रा 1 ए) में साफ-सफाई से स्लाइस करने की अनुमति देता है। संदंश के साथ इन स्ट्रिप्स को संभालने के दौरान, हम इन स्ट्रिप्स को कोट करने के लिए पर्याप्त हेप्टेन-गोंद को स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करते हैं, जो उन्हें एक चिपकने वाला, बनावट वाली सतह देता है (चित्रा 1 बी)। लेपित स्ट्रिप्स को आसानी से एक खाली कवर स्लिप बॉक्स में संग्रहीत किया जाता है ताकि चिपकने वाली सतहों को 2 घंटे तक साफ रखा जा सके (चित्रा 1 सी)। एक बार जब ये लेपित स्ट्रिप्स बनाए जाते हैं, तो लक्ष्य स्ट्रिप के लंबे किनारे के पास एक समग्र में पट्टी के लिए भ्रूण का पालन करना है (चित्रा 1 ई)। पहले घड़ी ग्लास से कुछ भ्रूणों को एक साफ ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करना और उन्हें सूखाना आवश्यक है (चित्रा 1 डी)। फिर, भ्रूण को लेपित पट्टी को धीरे से छूने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि वे पालन कर सकें (चित्रा 1 ई)। फिर हम तुरंत स्ट्रिप को विच्छेदन डिश के नीचे दबाते हैं, जिसमें भ्रूण का सामना करना पड़ता है, और रिंगर के समाधान के साथ भ्रूण को कवर करते हैं (चित्रा 1 एफ)। यदि यह लक्ष्य पूरा हो जाता है, तो पारंपरिक ब्राइटफील्ड स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण को देखने से उनके विटेलिन झिल्ली (चित्रा 1 जी) के भीतर पूरी तरह से हाइड्रेटेड, स्वस्थ भ्रूण प्रकट होंगे। यदि, इसके बजाय, इन भ्रूणों को पट्टी पर स्थानांतरित करने और उन्हें समाधान के साथ कवर करने की प्रक्रिया लगभग 30 सेकंड से अधिक समय लेती है, तो भ्रूण निर्जलित हो जाएंगे और फ्लैकिड हो जाएंगे (चित्रा 1 जी')। फ्लैक्सिड भ्रूण स्वस्थ नहीं हैं और विच्छेदन के लिए अविश्वसनीय रूप से चुनौतीपूर्ण हैं, इसलिए इस प्रक्रिया के दौरान कुशलतासे काम करना महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदन से पहले बढ़ते और हाइड्रेटिंग भ्रूण। (A-F) गोंद लेपित कवरस्लिप की एक पट्टी के लिए भ्रूण का पालन करने के लिए कदम, और एक इमेजिंग डिश के लिए पट्टी को सुरक्षित करना। (ए) कवरस्लिप एक पट्टी बनाने के लिए हीरे-इत्तलादार चाकू (एरोहेड द्वारा इंगित चाकू) द्वारा एक बार स्कोर किया गया था। (बी) कटे हुए कवरस्लिप पट्टी के लिए हेप्टेन-गोंद का अनुप्रयोग, संदंश की एक जोड़ी के साथ आयोजित किया जाता है। (C) एक कवरस्लिप बॉक्स में सूखने वाली चार गोंद-लेपित स्ट्रिप्स। (D-E) तीर भ्रूण को इंगित करते हैं। (d) Dechorionated भ्रूण जो हेप्टेन में एकत्र किए गए हैं और एक माइक्रोस्कोप स्लाइड के किनारे पर निष्कासित कर दिए गए हैं। अतिरिक्त हेप्टेन को एक किमवाइफ के साथ हटा दिया गया था। (ई) गोंद-लेपित पट्टी जिसमें भ्रूण संलग्न होते हैं। (च) विच्छेदन से ठीक पहले पकवान का अंतिम सेटअप। रिंगर के समाधान (एरोहेड) की उथली परत और आंतरिक विच्छेदन सर्कल के ऊपर पट्टी (तीर) के प्लेसमेंट पर ध्यान दें। (G-G') भ्रूण पकवान में पट्टी का पालन किया। (जी) ठीक से हाइड्रेटेड, टर्गिड भ्रूण। (G') भ्रूण जो लंबे समय तक हवा के संपर्क में रहने के कारण निर्जलित हो गए हैं, जो ढह गए विटेलिन झिल्ली द्वारा स्पष्ट हैं। तारांकन फ्लैक्सिड भ्रूण को इंगित करते हैं। स्केल बार 0.5 मिमी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्टीरियो-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत एक भ्रूण को देखने से आंत के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है, जो जीएफपी चैनल में ऑटो-फ्लोरेसेस करता है। आंत आकृति विज्ञान भ्रूण की उम्र के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में कार्य करता है जब विच्छेदन के लिए भ्रूण का चयन करता है। क्योंकि कवर स्लिप की पट्टी का पालन करने वाले भ्रूण उम्र में थोड़ा भिन्न होंगे, वे आंत आकृति विज्ञान (चित्रा 2 ए) की एक विविध सरणी पेश करेंगे। लाइव-इमेज गोनाड आला मॉर्फोजेनेसिस के लिए, हम प्रारंभिक चरण 16 भ्रूण को विच्छेदित करते हैं। ये भ्रूण चार क्षेत्रीयकृत आंत वर्गों को प्रस्तुत करते हैं जो एक सम पंक्ति में स्टैक किए जाते हैं (चित्रा 2बी', बिंदीदार रेखाएं)। छोटे भ्रूण एक थैली की तरह, गैर-क्षेत्रीयकृत आंत (चित्रा 2 सी) पेश करते हैं, और अभी तक बरकरार अंग के कुशल संवर्धन की अनुमति देने के लिए उनके गोनाड्स के चारों ओर पर्याप्त बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) नहीं है। पुराने भ्रूण जो पहले से ही आला संघनन शुरू कर चुके हैं, चार आंत क्षेत्रों को प्रस्तुत करते हैं जो समान रूप से स्टैक्ड नहीं होते हैं और इसके बजाय एक दूसरे के सापेक्ष स्थानांतरित हो जाते हैं (चित्रा 2डी', बिंदीदार रेखाएं)। इन भ्रूणों में मोटा छल्ली होता है, जो विच्छेदन प्रक्रिया को अधिक चुनौतीपूर्ण बनाता है।

Figure 2
चित्रा 2: गोनाड विच्छेदन के लिए उचित रूप से आयु वर्ग के भ्रूण का चयन करना। भ्रूण विच्छेदन से पहले एक गोंद-लेपित कवरस्लिप का पालन करते थे। भ्रूण छह4-eGFP: मोसिन (हरे) को व्यक्त करते हैं, जो गोनाड और वसा शरीर की कोशिकाओं को चिह्नित करता है। ध्यान दें कि आंत ऑटो-फ्लोरेसेस हरे रंग में। तीर पुरुष गोनाड्स को इंगित करते हैं (चमकीले फ्लोरेसिंग एमएसजीपी की उपस्थिति से समझते हैं) जो प्रत्येक पैनल में दिखाई देते हैं। स्केल बार 0.25 मिमी (ए) विभिन्न चरणों के भ्रूण को इंगित करते हैं। (B-D) छवि के केंद्र में अलग-अलग चरणों के भ्रूण, बाईं ओर पूर्वकाल और पृष्ठीय ऊपर के साथ उन्मुख। (बी) एक प्रारंभिक चरण 16 भ्रूण जो विच्छेदन के लिए उचित रूप से वृद्ध है। (B') चार स्टैक्ड आंत क्षेत्रों को बिंदीदार सफेद लाइनों के साथ इंगित किया जाता है। (सी) एक चरण 15 भ्रूण जो विच्छेदन करने के लिए बहुत छोटा है (कम भ्रूण)। ध्यान दें कि फ्लोरोसेंट आंत थैली सिर्फ गोनाड के लिए पूर्वकाल अभी तक असतत क्षेत्रों नहीं है। (d) एक देर से चरण 16 भ्रूण जो छल्ली के विकास के कारण विच्छेदन करना मुश्किल है। ध्यान दें कि चार आंत क्षेत्रों ने आंत लूपिंग की तैयारी में एक दूसरे के सापेक्ष घूमना शुरू कर दिया है। (D') चार आंत क्षेत्रों को रेखांकित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

भ्रूण को विच्छेदित करना महत्वपूर्ण है जो गोनाड में एक अमिट फ्लोरोसेंट मार्कर को व्यक्त करता है, और यह मार्कर स्टीरियो-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई देना चाहिए। यहां, हमने विच्छेदन के दौरान विज़ुअलाइज़ेशन के लिए गोनाड (चित्रा 2 और चित्रा 3, तीर) को चिह्नित करने के लिए छह4-eGFP::moesin20 का उपयोग करने के लिए चुना है।

हम चित्र 3 में गोनाड विच्छेदन प्रक्रिया को स्पष्ट करते हैं। पॉली-लाइसिन-लेपित पकवान पर उचित रूप से मंचित भ्रूण का विच्छेदन इन भ्रूणों से गोनाड्स के स्वच्छ अलगाव के लिए अनुमति देता है (चित्रा 3 डी)। भ्रूण जो devitellinized हैं, पकवान का पालन करेंगे, और विच्छेदन से पहले एक सुविधाजनक पंक्ति में व्यवस्थित किया जा सकता है (चित्रा 3 ए)। भ्रूण devitellinization और पॉली-लाइसिन के लिए स्थानांतरण एक imprecise प्रक्रिया है जैसे कि ऊतक भ्रूण शरीर की सीमाओं से बाहर निकाला जा सकता है (भ्रूण 1 और भ्रूण 2 के बीच ऊतक का टुकड़ा देखें, और mangled भ्रूण 4; चित्रा 3ए)। इस अशुद्धता का कोई महत्व नहीं है, जब तक कि गोनाड्स असुरक्षित रहते हैं। एक मानक स्टीरियो-फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप devitellinized भ्रूण शरीर (चित्रा 3B, तीर) के भीतर गोनाड की पहचान करने में सक्षम बनाता है। एक तेज विच्छेदन सुई के साथ पहले कुछ जोड़तोड़ को भ्रूण के शव से गोनाड्स को अलग करना चाहिए, हालांकि कुछ ऑटो-फ्लोरोसेंट ऊतक का पालन किया जाएगा (चित्रा 3 सी)। अतिरिक्त जोड़तोड़ के परिणामस्वरूप अलग-थलग गोनाड्स होते हैं जो सीधे लेपित पकवान (चित्रा 3 डी) का पालन करते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: विच्छेदन प्रक्रिया। (A-D) भ्रूण जो विच्छेदन प्रोटोकॉल में अनुक्रमिक चरणों में छह4-eGFP::moesin (हरा) व्यक्त करते हैं। (ए) चार devitellinized भ्रूण है कि पकवान के पॉली-लाइसिन लेपित विच्छेदन क्षेत्र में स्थानांतरित कर दिया गया है। ध्यान दें कि पकवान में क्रमिक नीचे विच्छेदन की सुविधा के लिए भ्रूण को एक साफ पंक्ति में कैसे संरेखित किया जाता है। भ्रूण 1 और 2 के बीच ऊतक का छोटा टुकड़ा भ्रूण 2 से आंत का हिस्सा है, जो हाथ के विचलन के दौरान बाहर निकाला जाता है। (बी) (ए) से भ्रूण का उच्च आवर्धन दृश्य, तारांकन चिह्न द्वारा इंगित किया गया है। (c) एक भ्रूण का शेष शव जो मध्यरेखा के नीचे भरा गया है। एरोहेड एक occluded गोनाड को इंगित करता है, जो अभी भी भ्रूण के ऊतकों में भारी एम्बेडेड है। (d) एक पूरी तरह से विच्छेदित गोनाड। ध्यान दें कि केवल न्यूनतम बाहरी ऊतक (एरोहेड) गोनाड के पास रहता है। तीर नर गोनाड्स को इंगित करते हैं। स्केल बार 0.25 मिमी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक बार गोनाड्स को विच्छेदित करने के बाद, कोई इमेजिंग मीडिया के साथ रिंगर के समाधान को बदल सकता है, और विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही डिश में सीधे छवि सुसंस्कृत गोनाड्स की जगह ले सकता है। हम एक कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. एक confocal माइक्रोस्कोप पर एक अलग गोनाड के ब्राइटफील्ड विज़ुअलाइज़ेशन से गोनाड परिधि (चित्रा 4ए-बी, तीर) के आसपास एक अंधेरे छाया का पता चलता है, जो ईसीएम है जो इमेजिंग के दौरान गोनाड की अखंडता को बनाए रखता है। हम एक स्वस्थ, अच्छी तरह से सुसंस्कृत गोनाड का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं जो दैहिक गोनाडल कोशिकाओं20 में जीएफपी-लेबल वाले एफ-एक्टिन को व्यक्त करता है और सभी नाभिक28 (चित्रा 4सी-सी') की कल्पना करने के लिए एक आरएफपी-लेबल हिस्टोन मार्कर। क्योंकि इस भ्रूण में सभी कोशिकाएं आरएफपी हिस्टोन मार्कर को व्यक्त करती हैं, दोनों गोनाडल कोशिकाएं, और अन्य अनुयायी ऊतक की कोशिकाएं लाल उत्सर्जन को देखने में देखी जाती हैं। हम गोनाड-विशिष्ट जीएफपी मार्कर (चित्रा 4सी', रूपरेखा) का उपयोग करके गोनाड की सीमाओं को समझते हैं। यह स्पष्ट है कि यह सुसंस्कृत गोनाड स्वस्थ है क्योंकि गोनाड सीमा चिकनी और गोल है (चित्रा 4सी', रूपरेखा), और क्योंकि गोनाडल कोशिकाओं में नाभिक में आरएफपी हिस्टोन प्रतिदीप्ति का स्तर भी होता है (चित्रा 4सी', तीर)। यदि, इसके बजाय, गोनाड्स इमेजिंग के दौरान पर्याप्त रूप से हाइड्रेटेड नहीं होते हैं, तो नाभिक और 64-ईजीएफपी:: मोसिन प्रतिदीप्ति पंक्टेट (चित्रा 4 डी, तीर) बन सकती है क्योंकि गोनाड ऊतक सिकुड़ जाता है। इसके अलावा, यदि विच्छेदन के दौरान गोनाड ईसीएम अत्यधिक क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो गोनाड सीमा से समझौता किया जाता है, जो गोनाड की सीमाओं के बाहर गोनाड-विशिष्ट कोशिकाओं (चित्रा 4 ई, तारांकन) की उपस्थिति से स्पष्ट होता है (चित्रा 4 ई, तीर)।

Figure 4
चित्रा 4: लाइव-इमेजिंग के दौरान स्वस्थ गोनाड्स का पता लगाना। (ए) कम और (बी) दो विच्छेदित गोनाड्स के उच्च आवर्धन ब्राइटफील्ड दृश्यों ने कवरस्लिप का पालन किया। (C-C') एक स्वस्थ गोनाड में आला संघनन के पूर्व विवो इमेजिंग से एक फिल्म फ्रेम। दैहिक गोनाडल कोशिकाएं छह4-eGFP: मोसिन (हरा) व्यक्त करती हैं, और सभी कोशिकाएं His2Av-mRFP (लाल) व्यक्त करती हैं। (C') गोनाड सीमा एक सफेद बिंदीदार रेखा के साथ चिह्नित है। गोनाड सीमा के बाहर दिखाई देने वाला His2Av-mRFP संभवतः वसा शरीर है जो अभी भी विच्छेदित गोनाड से जुड़ा हुआ है। तीर समान His2Av-mRFP संकेत के साथ एक रोगाणु सेल नाभिक को इंगित करता है, यह दर्शाता है कि गोनाड स्वस्थ है। (D-E) पूर्व विवो विच्छेदन प्रोटोकॉल के प्रतिनिधि नकारात्मक परिणाम। (D) एक इमेजिंग सत्र से एक फ्रेम जिसमें गोनाड मीडिया वाष्पीकरण के कारण निर्जलित हो गया है। His2Av-mRFP संघनित (तीर) के रूप में pyknotic नाभिक नोट करें, और गोनाड सीमा के साथ छह4-eGFP: : moesin के असंतत धब्बे। (ई) एक्स वीवो इमेजिंग फ्रेम जिसमें विच्छेदन के दौरान एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स से समझौता किया गया है। ध्यान दें कि कुछ रोगाणु कोशिकाएं (तारांकन) गोनाड सीमा (तीर) से बाहर निकल रही हैं। रोगाणु कोशिकाओं को nos-lifeact के साथ लेबल किया जाता है: tdtomato (मैजेंटा), और छह4-eGFP के साथ दैहिक गोनाडल कोशिकाओं: : मोसिन (हरे रंग)। स्केल सलाखों 20 μm दिखाने के लिए. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

गोनाड्स को इस पूर्व विवो इमेजिंग विधि का उपयोग करके लगभग 5 घंटे के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, जिससे देर से भ्रूण गोनाड विकास में होने वाली गतिशील मॉर्फोजेनेसिस घटनाओं की छवि अधिग्रहण को सक्षम किया जा सकता है। हमारी प्रयोगशाला में, हमने स्टेम सेल आला17 (चित्रा 5) बनाने के संघनन की छवि के लिए इस प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। संघनन से पहले, आला गोनाड पूर्वकाल (चित्रा 5 ए, हरे) पर दैहिक कोशिकाओं का एक ढीला समुच्चय है, जो नोस-लाइफएक्ट के साथ लेबल किए गए जर्मलाइन कोशिकाओं से घिरा हुआ है: टीडीटोमेटो29 ( सामग्री की तालिका देखें), जिनमें से पहला स्तर जर्मलाइन स्टेम सेल (चित्रा 5 ए, मैजेंटा) होगा। यह आला समुच्चय शुरू में एक अनियमित सीमा (चित्रा 5ए', बिंदीदार रेखा) के साथ प्रस्तुत करता है। इमेजिंग के दौरान, हम व्यक्तिगत आला कोशिकाओं को अपने पदों को पुनर्व्यवस्थित करते हुए देखते हैं जबकि आला समुच्चय चिकनी सीमाओं को प्राप्त करता है। इन सेलुलर पुनर्व्यवस्थाओं के परिणामस्वरूप आला क्षेत्र में कमी आती है (चित्रा 5 सी)। सेल पुनर्व्यवस्था की हमारी टिप्पणियों, और पड़ोसी रोगाणु कोशिका विभाजन जो विकास के इस चरण के साथ समवर्ती रूप से होते हैं, ने आला संघनन17 अंतर्निहित तंत्र की हमारी समझ को सूचित किया। इस प्रकार यह प्रोटोकॉल सेल पुनर्व्यवस्था, आकार परिवर्तन, विभाजन, और अन्य सेलुलर घटनाओं को देर से चरण गोनाड्स में मॉर्फोजेनेटिक घटनाओं का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक संकल्प के साथ कल्पना करने की क्षमता प्रदान करता है।

Figure 5
चित्रा 5: एक पूर्व विवो सुसंस्कृत गोनाड आला संघनन के दौर से गुजर रहा है। प्रारंभिक चरण 16 भ्रूण से गोनाड्स के विच्छेदन के तुरंत बाद प्राप्त एक इमेजिंग श्रृंखला से स्टिल। (A-C) रोगाणु कोशिकाओं (मैजेंटा) को nos-lifeact द्वारा लेबल किया जाता है: tdtomato और दैहिक गोनाडल कोशिकाओं (हरे) को छह4-eGFP::moesin द्वारा लेबल किया जाता है। आला (बिंदीदार सफेद रेखा) को ए '-सी' में रेखांकित किया गया है। स्केल सलाखों 10 μm दिखाने के लिए. पूर्वकाल बाईं ओर है, और पीछे दाईं ओर है। (ए) इमेजिंग श्रृंखला में पहले टाइमपॉइंट (टी = 0 मिनट) पर, आला कोशिकाओं ने गोनाड पूर्वकाल में इकट्ठा होना समाप्त कर दिया है और संघनन के शुरुआती चरण में हैं। (बी) इमेजिंग श्रृंखला और संघनन प्रक्रिया (टी = 1 ज 48 मिनट) के माध्यम से मिडवे, आला ने परिपत्र करना शुरू कर दिया है, लेकिन इसका किनारा अनियमित रहता है। (सी) इमेजिंग श्रृंखला के अंत के पास (टी = 4 ज 21 मिनट), आला में एक अत्यधिक चिकनी, गोलाकार सीमा होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

गोनाडोजेनेसिस के दौरान, भ्रूण गोनाड, और विशेष रूप से पुरुष गोनाड15 के भीतर स्टेम सेल आला, तेजी से रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरता है। विकासात्मक तंत्र जो इन गतिशील परिवर्तनों को रेखांकित करते हैं, उन्हें लाइव-इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से सबसे अच्छा समझा जाता है। हालांकि, भ्रूण चरण 17 में, गोनाड के विवो इमेजिंग में बड़े पैमाने परमांसपेशियों के संकुचन की शुरुआत से असंभव हो जाता है। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम एक सफल विकल्प प्रदान करते हैं: पूर्व विवो लाइव-इमेजिंग के लिए एक इमेजिंग डिश पर सीधे गोनाड्स का विच्छेदन। यह प्रोटोकॉल देर से चरण भ्रूण गोनाड के लाइव-इमेजिंग को पूरा करने के लिए उपलब्ध एकमात्र विधि प्रस्तुत करता है।

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों को निपुणता और समय पर एक तीव्र ध्यान देने के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए। विच्छेदन से पहले, भ्रूण का तेजी से बढ़ना यह सुनिश्चित करने के लिए सर्वोपरि है कि भ्रूण निर्जलित न हों और स्वस्थ और टर्गिड रहें, जो devitellinization और विच्छेदन को कम करता है। विच्छेदन के दौरान, गोनाडल एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के विघटन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो केवल नाजुक और सटीक जोड़तोड़ का उपयोग करके पूरा किया जाता है। इस तरह की निपुणता का उपयोग यह भी सुनिश्चित करेगा कि गोनाड इमेजिंग डिश के साथ सीधे संपर्क में है, जिससे कवरस्लिप के माध्यम से सीधे स्पष्ट इमेजिंग को सक्षम किया जा सकता है। विच्छेदन के बाद, रिंगर के समाधान को इमेजिंग मीडिया के लिए स्विच किया जाना चाहिए, जो गोनाड विघटन को रोकने के लिए केवल कोमल सक्शन और एक पिपेट के साथ निष्कासन का उपयोग करता है। अंत में, समग्र विच्छेदन समय को 25 मिनट तक सीमित करना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि विच्छेदन के दौरान रिंगर के समाधान में बिताए गए समय की मात्रा, और कॉन्फोकल में ऊतक का स्थान, एक गैर-विषाक्त जोखिम तक सीमित है। बढ़े हुए अभ्यास के साथ, विच्छेदन की गति में सुधार होगा, और विच्छेदन अनुक्रम का निजीकरण होगा। हमारे अनुभव में, नियमित अभ्यास के लगभग एक सप्ताह के बाद पर्याप्त विच्छेदन प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें विच्छेदन की पूरी महारत लगभग 1 महीने में प्राप्य है। सीखने को आसान बनाने के लिए, हम पूरे प्रोटोकॉल को निष्पादित करने से पहले व्यक्तिगत चरणों का अभ्यास करने की सलाह देते हैं।

कई सर्वोत्तम प्रथाएं हैं जो इस प्रोटोकॉल से जुड़ी चुनौतियों को सुधारती हैं, विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले भ्रूण के जीनोटाइप से शुरू होती हैं। गोनाड को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्रांसजीन की कई प्रतियों को शामिल करने से गोनाड उज्ज्वल हो जाएगा, और इसलिए कल्पना करना और विच्छेदन करना आसान होगा। विच्छेदन स्वयं एक तेज सुई के साथ सबसे अच्छा काम करता है, हालांकि इसे अत्यधिक तेज नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह इमेजिंग डिश के नीचे के खिलाफ झुक जाएगा और बाहरी ऊतक के साथ बोझ बन जाएगा। हरे उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में श्नाइडर का इमेजिंग मीडिया ऑटो-फ्लोरेसेस है, जो मीडिया को जोड़ने के बाद जीएफपी के साथ चिह्नित गोनाड्स का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है। इसलिए, गोनाड्स के स्थान को चिह्नित करने के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, जबकि वे अभी भी रिंगर के समाधान में हैं। यदि कॉन्फोकल पर गोनाड्स का पता लगाना मुश्किल रहता है, तो अगले विच्छेदन के बाद हम स्केचिंग या विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर अभी भी डिश में गोनाड्स की सापेक्ष स्थिति की छवि लेने का सुझाव देते हैं। फिर, विच्छेदन के दौरान इसके अभिविन्यास को इंगित करने के लिए डिश के बाहर को चिह्नित करें, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में संक्रमण करते समय इस अभिविन्यास से मेल खाएं। एक बार confocal पर स्थित है, अगर एक gonad बाधित या mangled प्रकट होता है, अगले विच्छेदन में गोनाड के आसपास और अधिक अनुयायी ऊतक छोड़ने की कोशिश करो. इसके विपरीत, यदि एक गोनाड मौजूद है, लेकिन सभी विमानों में धुंधला दिखाई देता है, तो कवरस्लिप और गोनाड के बीच संभावित ऊतक है, और भविष्य के विच्छेदन को अनुयायी ऊतक से गोनाड के बेहतर अलगाव के लिए प्रयास करना चाहिए। हमारे अनुभव में, इन प्रथाओं को अपनाने से इस प्रोटोकॉल को सीखने और निष्पादित करने में मदद मिली है।

इस प्रोटोकॉल के गठन के दौरान, हमने कई परिवर्तनों की पहचान की जिन्हें लागू किया जा सकता है। आला संघनन अध्ययन के लिए, हम चरण 16 पर भ्रूण विच्छेदन करने का लक्ष्य रखते हैं। इस स्तर पर, भ्रूण ने अभी तक छल्ली की महत्वपूर्ण मात्रा विकसित नहीं की है, और आसानी से पॉली-लाइसिन-लेपित पकवान से चिपक जाता है। हालांकि, इस तकनीक को पहले चीरे के लिए पॉली-लाइसिन-लेपित क्षेत्र की आंतरिक दीवार से चिपकाकर छल्ली के साथ पुराने भ्रूण को विच्छेदित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक बार आंतरिक ऊतकों के उजागर होने के बाद, भ्रूण का शव पॉली-लाइसिन से चिपक जाएगा, और विच्छेदन सामान्य रूप से आगे बढ़ सकता है। भ्रूण की उम्र के लिए समायोजन के अलावा, हमने एक ही डिश में कई जीनोटाइप को विच्छेदित करने के लिए इस तकनीक को सफलतापूर्वक समायोजित किया है। उदाहरण के लिए, होमोजाइगस म्यूटेंट को सिबलिंग हेटरोजाइगोट्स से अलग किया जा सकता है, जो बैलेंसर क्रोमोसोम पर विकृत-वाईएफपी जैसे आसानी से समझदार मार्कर के उपयोग से अलग किया जा सकता है। devitellinization के बाद, भ्रूण मार्कर की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर coverslip के दोनों ओर स्थानांतरित किया जाना चाहिए। विच्छेदन को प्रोटोकॉल में वर्णित डिश में नीचे की ओर आगे बढ़ना चाहिए, जिसमें विभिन्न जीनोटाइप के अलगाव को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जाती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को संभावित रूप से श्नाइडर के अलावा अन्य संस्कृति माध्यम का उपयोग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, हालांकि शील्ड्स और सांग एम 3 कीट मीडिया की सतही जांच ने अव्यवहार्य गोनाड्स (डेटा नहीं दिखाया गया है) प्राप्त किया। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल केवल इमेजिंग मीडिया के साथ दवा के संयोजन से औषधीय जोड़तोड़ के साथ अच्छी तरह से जोड़ता है। इमेजिंग की 5 घंटे की अवधि में, एक प्रभावी एकाग्रता बनाए रखने के लिए दवा के फिर से जोड़ना आवश्यक हो सकता है। अंत में, हालांकि इस प्रोटोकॉल को आला संघनन की कल्पना करने के इरादे से विकसित किया गया था, जो पुरुष गोनाड्स के लिए विशिष्ट एक घटना है, सिद्धांत रूप में इस प्रोटोकॉल को केवल विच्छेदन और इमेजिंग गोनाड्स द्वारा विकासशील अंडाशय को लाइव-इमेज करने के लिए भी लागू किया जा सकता है जिसमें एक आला और एमएसजीपी की कमी है।

इस तकनीक से जुड़ी सीमाएं कृषि समय की लंबाई, और संस्कृति की पूर्व विवो प्रकृति से संबंधित हैं। जैसा कि मध्य-चरण ड्रोसोफिला अंडे के कक्षों30 के साथ होता है, सुसंस्कृत गोनाड्स पूर्व विवो लाइव-इमेजिंग के लगभग 5 घंटे के बाद मरना शुरू कर देते हैं, जो ऊतक अखंडता के नुकसान से स्पष्ट होता है (नाभिक पाइकनोटिक बन जाते हैं और कोशिका झिल्ली सिकुड़ जाते हैं)। इस प्रकार, यदि कोई पुरुष गोनाड में बाद के चरण की घटनाओं का पता लगाना चाहता है, तो किसी को यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में संशोधन करके 1 इंस्टार या पुराने लार्वा से गोनाड्स को विच्छेदित करने की आवश्यकता होगी, और फिर यहां प्रस्तुत किए गए लोगों के समान परिस्थितियों में उन लोगों की छवि बनाएं। हालांकि, हम पिछले पांच घंटों में पूर्व विवो लाइव-इमेजिंग की संभावना से इनकार नहीं करते हैं यदि बेहतर संस्कृति की स्थिति विकसित की जाती है, हालांकि एक सीमा हो सकती है यदि भ्रूण के भीतर से यांत्रिक संकेत गोनाड विकास के लिए आवश्यक हैं। शायद तकनीक का सबसे गंभीर दोष इसकी अंतर्निहित पूर्व विवो प्रकृति के कारण है। जब सुसंस्कृत पूर्व विवो, कोशिकाओं में अप्राकृतिक क्षमता हो सकती है जो विवो जीव विज्ञान31 में अप्रेजेंटेटिव है। इसके अतिरिक्त, मीडिया सामग्री और मैट्रिक्स कठोरता सहित वातावरण को संवर्धित करने की सूक्ष्मता, सेल व्यवहार32 पर कठोर प्रभाव डाल सकती है। इस संवेदनशीलता को ध्यान में रखते हुए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि संस्कृति की स्थिति विवो जीव विज्ञान में सटीक रूप से प्रतिबिंबित हो। हमने यह प्रमाणित करने के लिए उपाय किए हैं कि विवो आला विकास और सिग्नलिंग में पूर्व विवो17 को दोहराया गया है। संक्षेप में, हमने पता लगाया कि आला सेल भाग्य बनाए रखा जाता है और आला कोशिकाओं की संख्या मार्करों Fasciclin-III और E-कैडरिन का उपयोग करके अपरिवर्तित है। इसके अलावा, STAT सिग्नलिंग मौजूद है और जर्मलाइन स्टेम कोशिकाएं ऑर्थोगोनल रूप से विभाजित होती हैं, यह सुझाव देती हैं कि आला कार्यक्षमता बनाए रखी जाती है। हालांकि, हमने सत्यापित नहीं किया है कि विवो जीव विज्ञान में प्रासंगिक गोनाड के भीतर अन्य, गैर-आला ऊतकों में बरकरार रहता है। इन अन्य ऊतकों की भविष्य की पूर्व विवो जांच में यह सुनिश्चित करने के लिए एक व्यापक विश्लेषण शामिल होना चाहिए कि यह वास्तव में मामला है।

इस प्रोटोकॉल के साथ भविष्य की दिशा में एक बाधा को शामिल करना शामिल होगा, जैसे कि एक विच्छेदन सत्र में नियंत्रण समूह के साथ-साथ एक दवा-उपचार समूह दोनों हो सकते हैं। यह वृद्धि तकनीकी प्रतिकृतियों के बीच त्रुटि को कम करने की अनुमति देगी, जिससे वैज्ञानिक कठोरता में सुधार होगा।

इस प्रोटोकॉल के लिए कोई अन्य वास्तविक विकल्प नहीं हैं, क्योंकि यह देर से भ्रूण के विकास के दौरान इस अंग की लाइव घटनाओं की जांच करने के लिए उपलब्ध एकमात्र विधि है। जैसे, गोनाड मॉर्फोजेनेसिस के बारे में पहले अनुत्तरित प्रश्न अब इस प्रगति के साथ सुलभ हैं। इन प्रश्नों में सेल डिवीजनों की पेचीदगियां, साइटोस्केलेटल परिवर्तन, और सेल इंटरकैलेशन घटनाएं शामिल हैं जो स्टेम सेल आला गठन और गोनाडोजेनेसिस को नियंत्रित करती हैं। इन घटनाओं में से कोई भी इन प्रक्रियाओं की अभी भी छवियों में पता लगाने योग्य नहीं है जो फिक्स-एंड-स्टेन तकनीक का उपयोग करके प्राप्त की गई हैं। कुल मिलाकर, यह विधि देर से भ्रूण ड्रोसोफिला गोनाड में गतिशीलता की जांच करने की संभावना को अनलॉक करती है, और इस तरह की सफलता में स्टेम सेल-आला जीव विज्ञान, पीआईआरएनए जीव विज्ञान और ऑर्गेनोजेनेसिस सहित असंख्य जैविक क्षेत्रों की प्रगति के लिए मजबूत निहितार्थ हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इस प्रोटोकॉल के शुरुआती विकास में उनके पर्याप्त योगदान के लिए लिंडसे डब्ल्यू प्लास्चेर्ट और जस्टिन सुई को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखकों अभिकर्मकों के साथ उनकी उदारता के लिए मक्खी समुदाय के लिए आभारी हैं, और विशेष रूप से रूथ Lehmann और बेंजामिन लिन के लिए नंबर5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax नंबर3 'लाइन के अपने उपहार के लिए अपने प्रकाशन से पहले लाइन. ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (एनआईएच पी 40ओडी018537) से प्राप्त स्टॉक का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था। यह काम NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 और R35GM136270 (एसडी) के साथ-साथ प्रशिक्षण अनुदान T32GM007229 (B.W.) और F32GM125123 (एल.ए.) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alfa Aesar Tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) FBtp0056035 Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato Gift from Ruth Lehmann Lab Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin FBtp0083398 Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape Scotch 665
Fetal Bovine Serum GIBCO 10082
Imaging dish MatTek P35GC-1.5-14-C
Imaging software Molecular Devices MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine Sigma l0516 Store aliquots at 4 °C
Needle holder Fisher Scientific 08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Ringer's solution 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media GIBCO 21720-024

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 164 ड्रोसोफिला भ्रूण गोनाड वृषण लाइव-इमेजिंग पूर्व विवो विच्छेदन स्टेम सेल आला विकास
विच्छेदन और देर से भ्रूण <em>ड्रोसोफिला</em> गोनाड के लाइव-इमेजिंग
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Nelson, K. A., Warder, B. N., DiNardo, S., Anllo, L. Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad. J. Vis. Exp. (164), e61872, doi:10.3791/61872 (2020).

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