Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

Published: October 17, 2020 doi: 10.3791/61872
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cell and Developmental Biology Department and the Penn Institute for Regenerative Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Abstract

La gónada embrionaria masculina de Drosophila melanogaster es un modelo ventajoso para estudiar varios aspectos de la biología del desarrollo, incluidos, entre otros, el desarrollo de células germinales, la biología de piRNA y la formación de nichos. Aquí, presentamos una técnica de disección para obtener imágenes en vivo de la gónada ex vivo durante un período en el que las imágenes en vivo in vivo son altamente ineficaces. Este protocolo describe cómo transferir embriones a un plato de imágenes, elegir embriones masculinos en etapas adecuadas y diseccionar la gónada de su tejido circundante mientras se mantiene su integridad estructural. Después de la disección, las gónadas se pueden obtener imágenes utilizando un microscopio confocal para visualizar los procesos celulares dinámicos. El procedimiento de disección requiere un tiempo y una destreza precisos, pero proporcionamos información sobre cómo prevenir errores comunes y cómo superar estos desafíos. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo de disección para la gónada embrionaria de Drosophila , y permitirá la obtención de imágenes en vivo durante una ventana de tiempo que de otro modo sería inaccesible. Esta técnica se puede combinar con manipulaciones transgénicas farmacológicas o específicas de tipo celular para estudiar cualquier proceso dinámico que ocurra dentro o entre las células en su entorno gonadal natural.

Introduction

El Drosophila melanogaster testis ha servido como paradigma para nuestra comprensión de muchos procesos celulares dinámicos. Los estudios de este modelo han arrojado luz sobre la regulaciónde la división de células madre 1,2,3, el desarrollo de células germinales 4,5, la biología de piRNA 6,7,8 y los eventos de señalización de células madre de nicho 9,10,11,12,13. Este modelo es ventajoso porque es genéticamente tratable14,15 y es uno de los pocos en los que podemos vivir células madre en su entorno natural 3,16,17,18. Sin embargo, la imagen en vivo de este modelo se ha limitado al tejido adulto y a las etapas embrionarias tempranas, dejando un vacío en nuestro conocimiento de la dinámica gonadal en el embrión tardío, la etapa precisa en la que el nicho se está formando por primera vez y comienza a funcionar.

La gónada embrionaria en etapa tardía es una esfera, que consiste en células de nicho somáticas en la parte anterior, y células germinales enquistadas por células gonadales somáticas en las regiones más posteriores19. Este órgano puede ser fotografiado en vivo in vivo hasta la etapa embrionaria temprana 17 17,20,21. Se previenen más imágenes debido al inicio de contracciones musculares a gran escala. Estas contracciones son tan severas que empujan la gónada fuera del marco de la imagen, y tal movimiento no se puede corregir con el software de imágenes. Nuestro laboratorio está interesado en revelar los mecanismos de formación de nichos, que ocurre durante este período difícil de alcanzar para las imágenes en vivo. Por lo tanto, generamos un enfoque ex vivo para obtener imágenes en vivo de la gónada a partir de la etapa embrionaria 16, facilitando el estudio de la dinámica celular durante este período crucial de desarrollo de la gónada. Trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que esta imagen ex vivo recapitula fielmente el desarrollo de gónadas in vivo 17. Esta técnica es la primera y única de su tipo para la gónada embrionaria de Drosophila.

Aquí, presentamos el protocolo de disección requerido para la obtención de imágenes en vivo ex vivo de la gónada durante las etapas embrionarias tardías. Este protocolo se puede combinar con tratamientos farmacológicos o manipulación transgénica de linajes celulares específicos dentro de la gónada. Usando esta técnica, hemos fotografiado con éxito los pasos de la formación de nichos de células madre17. Este enfoque de imagen es, por lo tanto, instrumental para el campo de la biología de células madre, ya que permitirá la visualización de las etapas iniciales de la formación de nichos en tiempo real dentro de su entorno natural15,17. Si bien este método es beneficioso para el campo de la biología de células madre, también es aplicable para visualizar cualquier proceso dinámico que ocurra en la gónada durante este punto de tiempo de desarrollo, incluidos los reordenamientos celulares22, la adhesión celular 2,12,23 y la migración celular23. Este protocolo de disección mejorará así nuestra comprensión de muchos procesos biológicos celulares fundamentales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación del día antes de la disección

  1. Afila electrolíticamente una aguja de tungsteno24 para que el diámetro resultante sea de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste el voltaje suministrado a aproximadamente 14 V y use 3.3 M NaOH. El afilado no debe tomar más de 1 o 2 minutos.
    PRECAUCIÓN: El NaOH es altamente corrosivo y causará quemaduras al contacto con la piel. Use guantes y gafas mientras manipula, y trabaje dentro de una campana extractora.
    NOTA: Después de su uso, guarde NaOH en un tubo Falcon de polipropileno.
  2. Haga los medios de imagen preparados. En un tubo cónico de 15 ml, combinar 4,25 ml de medios de Schneider con 750 μL de suero fetal bovino (FBS, concentración final del 15%) y 27,5 μL de penicilina-estreptomicina (0,05 U/μL de penicilina, concentración final de 0,05 μg/μL). Guarde este medio de imagen preparado a 4 °C.
  3. Haga una solución de heptano-pegamento. Agregue aproximadamente 0,5 ml de heptano a un vial sellable de 20 ml relleno con cinta adhesiva de doble cara de unos 20 cm. Mece en un nutator durante aproximadamente una hora, o revuelva con una punta de pipeta hasta que se logre una consistencia entre la del agua y el glicerol. Esta solución de pegamento disuelto durará varios días antes de que el heptano se evapore. Para refrescar la solución, agregue 0.5 ml de heptano adicional y roca.
    NOTA: Se puede preparar una solución efectiva de heptano-pegamento utilizando varias proporciones de heptano a cinta, así como diferentes duraciones de balanceo / agitación. Las especificaciones anteriores son simplemente sugerencias para preparar o refrescar una de esas soluciones adecuadas.

2. Recolección de embriones: 15–17 h antes de la disección

  1. Agregue pasta de levadura fresca a un plato de agar de jugo de manzana25. Instale una jaula de recolección de embriones agregando moscas adultas (de menos de 10 días de edad) a una botella de alimento vacía, perforada con pequeños orificios26. Tapa la jaula de recolección con la placa de agar con levadura, pegada a la botella, y coloca la jaula con el lado de la placa hacia abajo en una incubadora oscura de 25 °C durante 1 h.
    NOTA: Las moscas deben expresar un transgén que marcará fluorescentemente la gónada, por ejemplo, six4-eGFP::Moesin20, porque la disección de embriones se llevará a cabo bajo un microscopio estereofresor. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de los genotipos utilizados para marcar la gónada.
  2. Retire la jaula de la incubadora y deseche esta primera colección. Reemplácelo con una placa de agar recién levadura y vuelva a colocar la jaula en la incubadora durante 2 h.
    NOTA: La primera colección de embriones se utiliza para limpiar a las hembras de embriones fertilizados en desarrollo, para lograr una segunda colección de embriones estrechamente programada.
  3. Retire la placa de agar de la jaula y colóquela (con el lado de levadura hacia arriba) sobre una toalla de papel húmeda dentro de un recipiente de plástico sellable. Coloque esta cámara húmeda en una incubadora de 25 °C para envejecer los embriones durante 14,5 h (edades finales, 14,5-16,5 h después de la puesta del huevo).
    NOTA: Inmediatamente antes de comenzar el paso 2.4, complete los pasos 3.1 y 3.2.
  4. Retire la placa de agar de la incubadora y, con una botella de chorro, agregue suficiente agua a la placa de agar para disolver la pasta de levadura cepillando ligeramente con un pincel. Enjuague los embriones y la levadura disuelta en una pequeña cesta de malla de malla que se encuentra dentro de un bote de pesaje. Enjuague la cesta con la botella de chorro de agua hasta que la mayor parte de la pasta de levadura se haya filtrado a través de la malla.
  5. Retire el agua del bote de pesaje y vuelva a colocar la cesta dentro. Descoronar los embriones sumergiéndolos en una solución de lejía al 50%, utilizando un frasco de chorro. La solución de lejía debe tener una profundidad de 3–5 mm. Mantenga los embriones sumergidos en lejía durante ~ 2 minutos, con remolinos ocasionales.
    PRECAUCIÓN: La lejía es corrosiva y puede irritar o dañar los ojos y el tracto respiratorio. Use guantes y gafas mientras manipula la lejía.
    NOTA: Durante este tiempo, complete tanto como sea posible el paso 3.3. El progreso de la descororonación se puede verificar colocando la canasta bajo un microscopio estereoscópico y verificando la ausencia de los apéndices dorsales. Sumerja los embriones en la solución de lejía durante más tiempo, si es necesario.
  6. Deseche la lejía y enjuague bien los embriones dentro de la canasta con agua de una botella de chorro (durante ~ 3 s, seque la canasta de malla con toallas de papel; repita 2-3 veces).

3. Preparación del día de la disección

  1. Añadir 30 μL de insulina (10 mg/ml) a 1.500 μL de soporte de imagen preparado (ver paso 1.2) en un tubo de Eppendorf de 1,5 ml (concentración final de 0,2 mg/ml). Mezcle bien y deje el tubo en la mesa de trabajo para equilibrar a temperatura ambiente.
  2. Prepare tiras de funda recubiertas con pegamento.
    1. Use un cuchillo con punta de diamante para cortar un trozo de cubierta de 22 mm x 22 mm en cuatro tiras de igual tamaño (Figura 1A).
    2. Use fórceps para recoger una tira y extienda un total de aproximadamente 30 μL de solución de pegamento de heptano a ambos lados de la tira (Figura 1B). Para lograr una capa uniforme de residuos de pegamento, incline la tira en varios ángulos mientras el heptano se evapora.
    3. Guarde la tira cubierta de pegamento en una ranura vacía de una caja de cubierta; para mantener su pegajosidad, coloque la tira en una posición inclinada, pero vertical, apoyada contra los bordes de la caja para minimizar el contacto con las superficies de la caja (Figura 1C). Cierre la caja para que las partículas en el aire no cubran el pegamento y disminuyan su pegajosidad.
  3. Coloque los siguientes elementos en la mesa de trabajo: una pipeta Pasteur de vidrio de 6 pulgadas, un portaobjetos de microscopio, un pipetador P200 y un P1000 con las puntas de pipeta apropiadas, la solución de Ringer27 (pH ajustado a 7.3 con NaOH) y un plato de imágenes de 35 mm cubierto con recubrimiento de poli-D-lisina.
  4. Transfiera embriones de la cesta de malla a un pequeño vaso de reloj lleno de heptano de 500 a 750 μL.
    1. Seque los lados y la parte inferior de la cesta con una toallita de pañuelos. Humedezca un pincel en el heptano, toque el pincel en los embriones (la membrana vitelline hidrofóbica debe adherirse a las cerdas) y sumerja el pincel de nuevo en el heptano en el vidrio del reloj (los embriones deben hundirse hasta el fondo).
      NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse lo más rápido posible para evitar que los embriones se sequen. Los embriones no deben exponerse al aire durante más de 20 s.
  5. Transfiera los embriones al portaobjetos del microscopio utilizando una pipeta Pasteur (Figura 1D). Extraiga los embriones en la pipeta lentamente y limítelos a la porción estrecha de la pipeta. Los embriones de pipeta en la diapositiva lentamente, de modo que se agregan justo dentro de la punta de la pipeta antes de fluir hacia la diapositiva. Gire la esquina de una toallita de tejido en una punta fina y elimine el heptano de los embriones en el portaobjetos. Se agregarán y cubrirán un área más pequeña, lo que facilitará su captura en una tira cubierta de pegamento en el siguiente paso.
  6. Con fórceps, tome una tira cubierta de pegamento y tóquela suavemente con los embriones (Figura 1E). Coloque la tira en el plato de imágenes, de lado del embrión hacia arriba y justo afuera del centro recubierto de poli-D-lisina. Presione la tira sobre el plato con fórceps, para asegurarse de que esté fija en su lugar. Inmediatamente inunde el plato con la solución de Ringer de 2 a 3.5 ml; sumergir primero los embriones para evitar que se sequen (Figura 1F).

4. Disección

NOTA: Estos pasos deben llevarse a cabo bajo un microscopio estereofresor.

  1. Desvitellinizar 10-15 embriones.
    NOTA: Esto puede variar desde dos embriones, para principiantes, hasta quince embriones, para expertos.
    1. Seleccione embriones en etapa 16 según la morfología intestinal (Figura 2). En esta etapa, los embriones tienen tres constricciones intestinales que crean cuatro segmentos intestinales apilados (Figura 2B, B'). Para comenzar la desvitellinización, perfore el embrión seleccionado en un extremo, preferiblemente el anterior, con la aguja de tungsteno. El embrión puede salir de su membrana vitelina, pero si no, pelar la membrana del embrión.
      NOTA: Los embriones que son demasiado jóvenes para diseccionar tienen intestinos no regionalizados (Figura 2C). La disección de embriones en etapa 17 es posible, pero más desafiante que la disección de embriones en etapa 16 porque la cutícula está comenzando a desarrollarse en esta etapa. Los embriones de la etapa temprana 17 presentan cuatro segmentos intestinales que se desplazan entre sí (Figura 2D, D').
    2. Engancha la aguja a través del embrión en una región alejada de las gónadas. Transfiera el embrión enganchado a la región recubierta de polilisina del plato (de aquí en adelante, simplemente "deslizamiento de cubierta") y arrástrelo contra el fondo hasta que se adhiera. Repita estos pasos y organice los embriones desvitellinizados en una fila a lo largo de la parte superior de la hoja de cubierta recubierta de polilisina (Figura 3A), dejando mucho espacio debajo para una mayor disección.
      NOTA: Las gónadas aparecen como pequeños agregados esféricos de células que deben fluorescenciar intensamente, dependiendo del marcador específico utilizado y el número de copias transgénicas. En esta etapa, las gónadas se encuentran lateralmente en el segmento A5, aproximadamente en el 70% -80% de la longitud del embrión desde la parte anterior. A lo largo del protocolo de disección, el tejido puede adherirse a la aguja. Para eliminar la aguja de los escombros, levántela justo por encima de la superficie de la solución de Ringer. La desvitellinización puede ser desordenada siempre y cuando la gónada propiamente dicha se altere lo menos posible.
  2. Afinar las gónadas fuera del embrión y en el plato (Figura 3C, D).
    1. Primero, filetear el embrión para exponer su interior (Figura 3C). Cortar a través del embrión desde su centro, moviendo la aguja hacia atrás, entre las gónadas. Desentraña un poco de tejido interno, ya que esto se pegará al plato mucho mejor que la cutícula externa. La pegajosidad del tejido permitirá que las siguientes manipulaciones revelen la gónada y le permitan adherirse al deslizamiento de la cubierta.
      NOTA: Si el tejido no se adhiere al plato, intente persuadirlo a una región no contaminada del resbalón de la cubierta recubierta; las regiones exteriores del deslizamiento de la cubierta serán particularmente pegajosas. Como se indica en el paso 4.1.2, no importa si las manipulaciones de disección dan como resultado un cadáver embrionario destrozado, siempre y cuando las gónadas permanezcan ilesas.
    2. Use la aguja para cortar alrededor de una gónada hasta que un pedazo de tejido, incluida la gónada, se separe de la carcasa restante. Con la aguja, dibuje este tejido a una región fresca de deslizamiento de cubierta recubierta y engatúelo contra la parte inferior hasta que se adhiera al plato.
      NOTA: La mejor imagen se logrará para aquellos casos en los que la gónada se adhiere directamente al deslizamiento de la cubierta, en lugar de la unión indirecta a través del tejido suprayacente. Por lo tanto, a medida que el tejido se aleja de la carcasa, intente que la gónada toque primero el deslizamiento de la cubierta, en lugar de tejido extraño.
    3. Retire la mayor cantidad posible de tejido circundante de la gónada (Figura 3D) arrastrando suavemente el tejido adherente lejos de la gónada con la aguja. Evite tocar la gónada directamente, lo que la dañaría (Figura 4E). Para asegurarse de que la gónada esté lo suficientemente adherida al plato, mueva la aguja en un movimiento circular suave alrededor de la gónada; si se mueve, toque la aguja con el tejido adherente restante y dirija la gónada hacia una región fresca de deslizamiento de cubierta pegajosa. Repita este proceso hasta que no haya un movimiento detectable de la gónada.
    4. Regrese al cadáver embrionario y diseccione la segunda gónada. Repita este proceso en tantos embriones como sea posible, pero NO exceda los 25 minutos. La viabilidad del tejido se verá comprometida en la solución de Ringer después de más de ~ 40-45 min.
  3. Una vez completadas las disecciones, use un marcador indeleble para agregar marcas de registro al borde exterior de la placa de imágenes para registrar su orientación durante la disección.
  4. Retire la tira recubierta de pegamento del plato.
    1. Inserte suavemente la punta inferior de un par de pinzas debajo de la tira, cierre e incline lentamente la tira hacia arriba para liberarla del plato con el menor chapoteo posible de la solución de Ringer para minimizar la perturbación de las gónadas adheridas.
      NOTA: La tira debe inclinarse lejos de las gónadas disecadas.
  5. Lleve suavemente el plato al microscopio de imágenes de una manera que evite el chapoteo de la solución de Ringer.

5. Imágenes

  1. Coloque el plato de imágenes en el soporte del escenario, utilizando las marcas de registro para colocar el plato en la orientación aproximada como durante la disección. Usando microscopía de campo brillante y un objetivo de baja potencia (~ 10x), identifique y enfoque cualquier pieza de tejido que esté adherida al deslizamiento de la cubierta. Cambie la configuración del ocular para revelar la fluorescencia y, utilizando los oculares binoculares, escanee sistemáticamente el plato, marcando la posición de cada gónada dentro del software de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Asegúrese de que las gónadas estén centradas en el campo de visión antes de marcar posiciones.
  2. Retire suavemente todo el conjunto del soporte del escenario, con el plato de imágenes en su soporte, y coloque el conjunto en el banco de trabajo.
  3. Reemplace la solución de Ringer por el soporte de imagen preparado que contenga insulina (ver pasos 1.2 y 3.1).
    1. Use un P1000 para quitar toda la solución de Ringer de la repisa superior interior del plato de imágenes (no pipetee Ringer de la región de deslizamiento de la cubierta central). A continuación, cambie a un P200 y coloque su punta justo debajo de la superficie del Ringer restante en la región central. Retire cuidadosamente 50–100 μL de Ringer; NO quite toda la solución.
    2. Dibuje ~ 200 μL de medios de imagen y, nuevamente colocando la punta P200 justo debajo de la superficie del Ringer restante, agregue lentamente este medio de imagen. A continuación, agregue los medios de imagen restantes (~ 1,300 μL) al plato, comenzando en el borde más externo de la repisa superior. Mientras pipetea, muévase hacia la cúpula central del fluido y, finalmente, fusione los dos cepillando la punta de la pipeta a través de ambos. Coloque la tapa en el plato.
      NOTA: Los soportes de imagen deben cubrir todo el diámetro interior del plato, con una profundidad de aproximadamente 2 mm, para evitar la evaporación (Figura 4D).
  4. Cambie el microscopio a un objetivo de mayor potencia (63x, 1.2 NA), aplique el fluido de inmersión adecuado según el objetivo utilizado (tipo de fluido de inmersión e índice de refracción requerido por el objetivo) y luego reemplace el conjunto del soporte de la etapa. Use microscopía de campo brillante para enfocar el tejido adherido a la parte inferior de la placa de imágenes.
    NOTA: Si la etapa no se movió, la última gónada debe aparecer a la vista una vez que el objetivo está enfocado.
  5. Pase por cada posición marcada de la gónada y ajuste esa posición, según sea necesario. Seleccione qué gónadas desea obtener una imagen en función de la claridad de la imagen, el sexo de las gónadas, etc. Personalice la configuración de imagen (multicanal, tiempos de exposición, intensidades láser, incrementos de la serie Z, lapso de tiempo con intervalos apropiados, etc.). Comience a tomar imágenes.
    NOTA: Las gónadas masculinas se pueden identificar por la presencia de un nicho y, en el extremo opuesto de la gónada, un grupo de células somáticas pequeñas y altamente circulares llamadas precursores gonadales somáticos específicos del hombre (msSGP). Si se utiliza el marcador fluorescente six4-eGFP::moesin, las células de nicho son las segundas células más brillantes de la gónada, siendo las más brillantes las msSGP. En esta etapa, las gónadas femeninas no tienen ni un nicho ni msSGPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ilustramos la preparación del plato de imágenes en la Figura 1, como se describe en "Preparación del día de la disección". En última instancia, estos métodos deberían dar como resultado embriones bien hidratados adheridos a una tira deslizante de cubierta, que se fija temporalmente al fondo del plato y se sumerge en la solución de Ringer (Figura 1F). Un cuchillo con punta de diamante permite cortar limpiamente un deslizamiento de cubierta de 22 x 22 mm en tres o cuatro tiras más pequeñas (Figura 1A). Al manipular estas tiras con fórceps, utilizamos una pipeta para transferir suficiente pegamento de heptano para recubrir estas tiras, lo que les da una superficie adhesiva y texturizada (Figura 1B). Las tiras recubiertas se almacenan fácilmente en una caja de resbalón de cubierta vacía para mantener las superficies adhesivas limpias hasta 2 h (Figura 1C). Una vez que se hacen estas tiras recubiertas, el objetivo es adherir embriones a la tira en un agregado, cerca del borde largo de la tira (Figura 1E). Es necesario transferir primero algunos embriones del vidrio del reloj a un portaobjetos de vidrio limpio y secarlos (Figura 1D). Luego, use rápidamente fórceps para tocar suavemente la tira recubierta a los embriones para que se adhieran (Figura 1E). Luego presionamos inmediatamente la tira en la parte inferior de la placa de disección con los embriones hacia arriba, y cubrimos los embriones con la solución de Ringer (Figura 1F). Si se cumple este objetivo, la visualización de embriones bajo un estereomicroscopio de campo brillante tradicional revelará embriones sanos y completamente hidratados dentro de sus membranas vitelinas (Figura 1G). Si, en cambio, el proceso de transferencia de estos embriones a la tira y cubrirlos con solución toma más de aproximadamente 30 s, los embriones se deshidratarán y se volverán flácidos (Figura 1G'). Los embriones flácidos no son saludables y son increíblemente difíciles de diseccionar, por lo que trabajar de manera eficiente durante este proceso es vital.

Figure 1
Figura 1: Montaje e hidratación de embriones antes de la disección. (A–F) Pasos para adherir embriones a una tira de funda recubierta con pegamento y asegurar la tira a un plato de imágenes. (A) Coverslip anotado una vez por un cuchillo con punta de diamante (cuchillo indicado por punta de flecha) para crear una tira. (B) Aplicación de pegamento de heptano a la tira de cubierta cortada, sostenida con un par de fórceps. (C) Cuatro tiras recubiertas de pegamento que se secan en una caja de cubierta. (D–E) Las flechas apuntan a los embriones. (D) Embriones descoronados que han sido recolectados en heptano y expulsados al borde de un portaobjetos de microscopio. El exceso de heptano se eliminó con un kimwipe. (E) Tira recubierta de pegamento con embriones adheridos. (F) La configuración final del plato inmediatamente antes de la disección. Observe la capa poco profunda de la solución de Ringer (punta de flecha) y la colocación de la tira (flecha) sobre el círculo de disección interno. (G–G') Los embriones se adhirieron a la tira en el plato. (G) Embriones turgentes adecuadamente hidratados. (G') Embriones que se han deshidratado debido a la exposición prolongada al aire, evidente por el colapso de las membranas vitelinas. Los asteriscos indican embriones flácidos. Las barras de escala son de 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La visualización de un embrión bajo un microscopio estereofresor permite una visualización clara del intestino, que autofluorescencia en el canal GFP. La morfología intestinal sirve como un indicador de la edad embrionaria al elegir embriones para diseccionar. Debido a que los embriones adheridos a la tira de deslizamiento de la cubierta variarán ligeramente en edad, presentarán una amplia gama de morfologías intestinales (Figura 2A). Para obtener imágenes vivas de la morfogénesis del nicho de la gónada, diseccionamos los embriones de la etapa temprana 16. Estos embriones presentan cuatro secciones intestinales regionalizadas que se apilan en una fila par (Figura 2B', líneas punteadas). Los embriones más jóvenes presentan un intestino no regionalizado en forma de saco (Figura 2C), y aún no tienen suficiente matriz extracelular (ECM) alrededor de sus gónadas para permitir un cultivo eficiente del órgano intacto. Los embriones más viejos que ya han comenzado la compactación de nichos presentan cuatro regiones intestinales que no están apiladas uniformemente y, en cambio, se desplazan entre sí (Figura 2D', líneas punteadas). Estos embriones tienen una cutícula más gruesa, lo que hace que el proceso de disección sea más desafiante.

Figure 2
Figura 2: Selección de embriones envejecidos adecuadamente para la disección de gónadas. Los embriones se adhirieron a un capa recubierto de pegamento antes de la disección. Los embriones expresan seis4-eGFP::moesin (verde), que marca la gónada y las células grasas del cuerpo. Tenga en cuenta que el intestino auto-fluorescencia en verde. Las flechas indican gónadas masculinas (discernidas por la presencia de msSGP brillantemente fluorescentes) que son visibles en cada panel. Las barras de escala indican 0,25 mm. (A) Embriones de varias etapas. (B–D) Embriones de distintas etapas en el centro de la imagen, orientados con anterior a la izquierda y dorsal hacia arriba. (B) Un embrión en etapa temprana 16 que envejece adecuadamente para la disección. (B') Las cuatro regiones intestinales apiladas se indican con líneas blancas punteadas. (C) Un embrión en estadio 15 que es demasiado joven para diseccionar (embrión inferior). Tenga en cuenta que el saco intestinal fluorescente justo antes de la gónada aún no tiene regiones discretas. (D) Un embrión de etapa 16 tardía que es difícil de diseccionar debido al desarrollo de la cutícula. Tenga en cuenta que las cuatro regiones intestinales han comenzado a rotar entre sí en preparación para el bucle intestinal. (D') Se delinean las cuatro regiones intestinales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Es importante diseccionar embriones que expresan un marcador fluorescente indeleble en la gónada, y este marcador debe ser visible bajo un microscopio estereofendente. Aquí, hemos elegido usar six4-eGFP::moesin20 para marcar la gónada (Figura 2 y Figura 3, flechas) para la visualización durante la disección.

Ilustramos el proceso de disección de gónadas en la Figura 3. La disección de embriones en etapas apropiadas en el plato recubierto de polilisina permite el aislamiento limpio de las gónadas de estos embriones (Figura 3D). Los embriones que se desvitellinizan se adherirán al plato y se pueden organizar en una fila conveniente antes de la disección (Figura 3A). La desvitellinización embrionaria y la transferencia a la polilisina es un proceso impreciso tal que el tejido puede extruirse de los confines del cuerpo embrionario (ver pedazo de tejido entre el embrión 1 y el embrión 2, y el embrión 4 destrozado; Figura 3A). Esta imprecisión no tiene importancia, siempre y cuando las gónadas permanezcan ilesas. Un microscopio estereofresor fluorescente estándar permite la identificación de la gónada dentro del cuerpo embrionario desvitellinizado (Figura 3B, flecha). Las primeras manipulaciones con una aguja de disección afilada deben separar las gónadas de la carcasa embrionaria, aunque parte del tejido autofluorenfálico permanecerá adherido (Figura 3C). Las manipulaciones adicionales dan como resultado gónadas aisladas que se adhieren directamente al plato recubierto (Figura 3D).

Figure 3
Figura 3: El proceso de disección. (A–D) Embriones que expresan six4-eGFP::moesin (verde) en etapas secuenciales en el protocolo de disección. (A) Cuatro embriones desvitellinizados que han sido transferidos a la región de disección recubierta de polilisina del plato. Observe cómo los embriones se alinean en una fila ordenada para facilitar las sucesivas disecciones hacia abajo en el plato. El pequeño trozo de tejido entre los embriones 1 y 2 es parte del intestino del embrión 2, extruido durante la desvitellinización de la mano. (B) Vista de mayor aumento del embrión desde (A), indicada por el asterisco. (C) El cadáver restante de un embrión que ha sido fileteado por la línea media. La punta de flecha indica una gónada ocluida, todavía fuertemente incrustada en los tejidos embrionarios. (D) Una gónada completamente diseccionada. Tenga en cuenta que solo queda un mínimo de tejido extraño (punta de flecha) cerca de la gónada. Las flechas apuntan a las gónadas masculinas. Las barras de escala son de 0,25 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez que se diseccionan las gónadas, se puede reemplazar la solución de Ringer con medios de imagen y gónadas cultivadas de imágenes directamente en el mismo plato utilizado para la disección. Utilizamos un microscopio confocal de disco giratorio. La visualización de campo brillante de una gónada aislada en un microscopio confocal revela una sombra oscura que rodea la periferia de la gónada (Figura 4A-B, flechas), que es la ECM que mantiene la integridad de la gónada durante la obtención de imágenes. Presentamos un ejemplo de una gónada sana y bien cultivada que expresa F-actina marcada con GFP en células gonadales somáticas20 y un marcador de histonas marcado con RFP para visualizar todos los núcleos28 (Figura 4C-C'). Debido a que todas las células de este embrión expresan el marcador de histonas RFP, tanto las células gonadales como las células de otro tejido adherente se observan al ver la emisión roja. Discernimos los límites de la gónada utilizando el marcador GFP específico de la gónada (Figura 4C', esquema). Está claro que esta gónada cultivada es saludable porque el límite de la gónada es liso y redondo (Figura 4C', contorno), y porque las células gonadales tienen niveles pares de fluorescencia de histonas RFP en todos los núcleos (Figura 4C', flecha). Si, en cambio, las gónadas no están lo suficientemente hidratadas durante las imágenes, los núcleos y la fluorescencia de seis4-eGFP::moesina pueden volverse punteados (Figura 4D, flecha) a medida que el tejido de la gónada se encoge. Además, si la ECM de la gónada se daña excesivamente durante la disección, el límite de la gónada se ve comprometido, lo que es evidente por la presencia de células específicas de la gónada (Figura 4E, asteriscos) fuera de los confines de la gónada (Figura 4E, flecha).

Figure 4
Figura 4: Localización de gónadas sanas durante la obtención de imágenes en vivo. (A) Vistas de campo brillante de bajo y (B) alto aumento de dos gónadas disecadas adheridas a la cubierta. (C–C') Un fotograma de película de imágenes ex vivo de compactación de nicho en una gónada sana. Las células gonadales somáticas expresan seis4-eGFP::moesina (verde), y todas las células expresan His2Av-mRFP (rojo). (C') Límite de la gónada marcado con una línea punteada blanca. His2Av-mRFP visible fuera del límite de la gónada es probablemente el cuerpo gordo que todavía está unido a la gónada diseccionada. Arrow apunta a un núcleo de células germinales con una señal uniforme de His2Av-mRFP, lo que indica que la gónada está sana. (D–E) Resultados negativos representativos del protocolo de disección ex vivo. (D) Un fotograma de una sesión de imágenes en la que la gónada se ha deshidratado debido a la evaporación de los medios. Nótese los núcleos picnóticos como His2Av-mRFP se condensa (flecha) y las manchas discontinuas de six4-eGFP::moesin a lo largo del límite de la gónada. (E) Marco de imágenes ex vivo en el que la matriz extracelular se ha visto comprometida durante la disección. Tenga en cuenta que algunas células germinales (asteriscos) están saliendo del límite de la gónada (flecha). Las células germinales están marcadas con nos-lifeact::tdtomato (magenta), y las células gonadales somáticas con six4-eGFP::moesin (verde). Las barras de escala muestran 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las gónadas se pueden cultivar durante aproximadamente 5 h utilizando este método de imágenes ex vivo , lo que permite la adquisición de imágenes de los eventos de morfogénesis dinámica que ocurren en el desarrollo tardío de las gónadas embrionarias. En nuestro laboratorio, hemos utilizado con éxito este protocolo para obtener imágenes de la compactación del nicho de células madre en formación17 (Figura 5). Antes de la compactación, el nicho es un agregado suelto de células somáticas en la gónada anterior (Figura 5A, verde), rodeado de células de la línea germinal marcadas con nos-lifeact::tdtomato29 (ver Tabla de Materiales), cuyo primer nivel serán las células madre de la línea germinal (Figura 5A, magenta). Este agregado de nicho se presenta inicialmente con un límite irregular (Figura 5A', línea punteada). A lo largo del curso de la imagen, observamos células de nicho individuales que reorganizan sus posiciones, mientras que el agregado de nicho adquiere bordes más suaves. Estos reordenamientos celulares también resultan en una disminución en el área del nicho (Figura 5C). Nuestras observaciones de los reordenamientos celulares y las divisiones de células germinales vecinas que ocurren simultáneamente con esta fase de desarrollo informaron nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la compactación de nicho17. Por lo tanto, este protocolo ofrece la capacidad de visualizar reordenamientos celulares, cambios de forma, divisiones y otros eventos celulares con la resolución requerida para analizar eventos morfogenéticos en gónadas en etapa tardía.

Figure 5
Figura 5: Una gónada cultivada ex vivo sometida a compactación de nicho. Fotogramas de una serie de imágenes adquiridas inmediatamente después de la disección de gónadas de embriones de la etapa temprana 16. (A–C) Las células germinales (magenta) están marcadas por nos-lifeact::tdtomato y las células gonadales somáticas (verdes) están marcadas por six4-eGFP::moesin. El nicho (línea blanca punteada) se describe en A'–C'. Las barras de escala muestran 10 μm. Anterior está a la izquierda, y posterior está a la derecha. (A) En el primer punto de tiempo (t = 0 min) en la serie de imágenes, las células de nicho han terminado de ensamblarse en la gónada anterior y se encuentran en una etapa temprana de compactación. (B) A mitad de la serie de imágenes y el proceso de compactación (t = 1 h 48 min), el nicho ha comenzado a circularizarse, pero su borde permanece irregular. (C) Cerca del final de la serie de imágenes (t = 4 h 21 min), el nicho tiene un límite circularizado altamente suavizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Durante la gonadogénesis, la gónada embrionaria, y particularmente el nicho de células madre dentro de la gónada masculina15, sufre cambios morfológicos rápidos. Los mecanismos de desarrollo que subyacen a estos cambios dinámicos se entienden mejor a través de técnicas de imágenes en vivo. Sin embargo, en la etapa embrionaria 17, las imágenes in vivo de la gónada se vuelven imposibles por el inicio de contracciones musculares a gran escala17. Con este protocolo, proporcionamos una alternativa exitosa: la disección de las gónadas directamente en un plato de imágenes para imágenes en vivo ex vivo . Este protocolo presenta el único método disponible para lograr imágenes en vivo de la gónada embrionaria en etapa tardía.

Los pasos críticos del protocolo deben ejecutarse con un enfoque agudo en la destreza y el tiempo. Antes de la disección, el montaje rápido de embriones es primordial para garantizar que los embriones no se deshidraten y permanezcan sanos y turgentes, lo que facilita la desvitelización y la disección. Durante la disección, es vital evitar la interrupción de la matriz extracelular gonadal, que se logra utilizando solo manipulaciones delicadas y precisas. El uso de tal destreza también asegurará que la gónada esté en contacto directo con el plato de imágenes, lo que permitirá obtener imágenes claras directamente a través de la cubierta. Después de la disección, la solución de Ringer debe cambiarse para medios de imagen utilizando solo succión y expulsión suaves con una pipeta para evitar el desalojo de gónadas. Finalmente, es importante limitar el tiempo total de disección a 25 min. Esto asegura que la cantidad de tiempo pasado en la solución de Ringer durante la disección, y la ubicación del tejido en el confocal, se limite a una exposición no tóxica. Con una mayor práctica, la velocidad de disección mejorará y se producirá la personalización de la secuencia de disección. En nuestra experiencia, se puede lograr una disección suficiente después de aproximadamente una semana de práctica regular, con un dominio completo de la disección alcanzable en aproximadamente 1 mes. Para facilitar el aprendizaje, recomendamos practicar pasos individuales antes de ejecutar todo el protocolo.

Hay una serie de mejores prácticas que mejoran los desafíos asociados con este protocolo, comenzando con el genotipo de los embriones utilizados para la disección. La incorporación de múltiples copias del transgén utilizado para marcar la gónada hará que la gónada sea más brillante y, por lo tanto, más fácil de visualizar y diseccionar. La disección en sí funciona mejor con una aguja afilada, aunque no debe afilarse demasiado, ya que se doblará contra la parte inferior de la placa de imágenes y se cargará con tejido extraño. Los medios de imagen de Schneider se autofluorescen en el espectro de emisión verde, lo que dificulta la localización de gónadas marcadas con GFP una vez que se agregan los medios. Por lo tanto, es fundamental utilizar el software de imágenes confocales para marcar la ubicación de las gónadas mientras todavía están en la solución de Ringer. Si la localización de las gónadas en el confocal sigue siendo difícil, después de la siguiente disección sugerimos dibujar o tomar una imagen de la posición relativa de las gónadas en el plato mientras aún se encuentra en el microscopio de disección. Luego, marque el exterior del plato para indicar su orientación durante la disección y haga coincidir esta orientación cuando haga la transición al microscopio confocal. Una vez localizada en el confocal, si una gónada aparece interrumpida o destrozada, en la siguiente disección intente dejar más tejido adherente rodeando la gónada. Por el contrario, si una gónada está presente pero aparece borrosa en todos los planos, es probable que haya tejido entre la cubierta y la gónada, y las disecciones futuras deben esforzarse por un mejor aislamiento de la gónada del tejido adherente. En nuestra experiencia, la adopción de estas prácticas ha facilitado el aprendizaje y la ejecución de este protocolo.

Durante la formación de este protocolo, identificamos varias alteraciones que podrían aplicarse. Para los estudios de compactación de nicho, nuestro objetivo es diseccionar embriones en la etapa 16. En esta etapa, el embrión aún no ha desarrollado cantidades significativas de cutícula y se adhiere fácilmente al plato recubierto de polilisina. Sin embargo, esta técnica puede modificarse para diseccionar embriones más viejos con cutícula pegándolos a la pared interna de la región recubierta de polilisina para la primera incisión. Una vez que los tejidos internos están expuestos, el cadáver del embrión se adherirá a la polilisina, y la disección puede proceder normalmente. Además de los ajustes para la edad embrionaria, hemos ajustado con éxito esta técnica para diseccionar múltiples genotipos en el mismo plato. Por ejemplo, los mutantes homocigotos se pueden separar de los heterocigotos hermanos mediante el uso de un marcador fácilmente discernible como el YFP deformado en el cromosoma equilibrador. Después de la desvitellinización, los embriones deben transferirse a ambos lados del cubrebocas en función de la presencia o ausencia del marcador. La disección debe proceder hacia abajo en el plato como se describe en el protocolo, con especial cuidado para mantener la segregación de diferentes genotipos. Además, este protocolo podría modificarse para usar un medio de cultivo que no sea el de Schneider, aunque una investigación superficial de Shields y Sang M3 Insect Media produjo gónadas inviables (datos no mostrados). Además, este protocolo combina bien con las manipulaciones farmacológicas simplemente combinando el medicamento con los medios de imagen. Durante un período de 5 h de imágenes, la re-adición de fármaco puede ser necesaria para mantener una concentración efectiva. Finalmente, aunque este protocolo se desarrolló con la intención de visualizar la compactación de nicho, un fenómeno específico de las gónadas masculinas, en teoría este protocolo también podría implementarse para obtener imágenes en vivo del ovario en desarrollo simplemente diseccionando e imaginando gónadas que carecen de un nicho y msSGPs.

Las limitaciones asociadas con esta técnica se relacionan con la duración del tiempo de cultivo y la naturaleza ex vivo de la cultura. Como es el caso de las cámaras de huevos de Drosophila en etapa media30, las gónadas cultivadas comienzan a morir después de aproximadamente 5 h de imágenes vivas ex vivo , evidenciadas por la pérdida de integridad del tejido (los núcleos se vuelven picnóticos y las membranas celulares se encogen). Por lo tanto, si uno quisiera explorar eventos de etapas posteriores en la gónada macho, uno necesitaría diseccionar gónadas de 1st instar o larvas más viejas haciendo modificaciones al protocolo presentado aquí, y luego obtener imágenes de ellas en condiciones similares a las presentadas aquí. Sin embargo, no descartamos la posibilidad de imágenes en vivo ex vivo después de cinco horas si se desarrollan mejores condiciones de cultivo, aunque puede haber un límite si las señales mecánicas desde el interior del embrión son necesarias para el desarrollo de la gónada. Quizás el inconveniente más grave de la técnica se debe a su naturaleza ex vivo inherente. Cuando se cultivan ex vivo, las células pueden tener un potencial antinatural que no es representativo de la biología in vivo 31. Además, las sutilezas de los entornos de cultivo, incluido el contenido de los medios y la rigidez de la matriz, pueden tener una influencia drástica sobre el comportamiento celular32. Con esta sensibilidad en mente, es vital garantizar que las condiciones de cultivo reflejen con precisión la biología in vivo . Hemos tomado medidas para atestiguar que el desarrollo y la señalización de nichos in vivo se recapitulan ex vivo17. Brevemente, comprobamos que el destino de las células de nicho se mantiene y el número de células de nicho no cambia utilizando los marcadores Fasciclin-III y E-cadherin. Además, la señalización STAT está presente y las células madre de la línea germinal se dividen ortogonalmente, lo que sugiere que se mantiene la funcionalidad de nicho. Sin embargo, no hemos verificado que la biología in vivo relevante permanezca intacta en otros tejidos no especializados dentro de la gónada. Las futuras investigaciones ex vivo de estos otros tejidos deben incluir un análisis exhaustivo para garantizar que este sea realmente el caso.

Una dirección futura que se podría tomar con este protocolo incluiría la incorporación de una barrera dentro de la placa de imágenes, de modo que una sesión de disección puede contener tanto un grupo de control como un grupo de tratamiento farmacológico. Esta mejora permitiría minimizar el error entre réplicas técnicas, mejorando así el rigor científico.

No hay otras alternativas verdaderas a este protocolo, ya que es el único método disponible para examinar los eventos vivos de este órgano durante el desarrollo embrionario tardío. Como tal, las preguntas previamente sin respuesta sobre la morfogénesis de la gónada ahora son accesibles con este avance. Estas preguntas incluyen las complejidades de las divisiones celulares, los cambios citoesqueléticos y los eventos de intercalación celular que gobiernan la formación de nichos de células madre y la gonadogénesis. Ninguno de estos eventos es detectable en las imágenes fijas de estos procesos adquiridos mediante una técnica de fijación y tinción. En general, este método desbloquea la posibilidad de investigar la dinámica en la gónada embrionaria tardía de Drosophila , y tal avance tiene fuertes implicaciones para el avance de una miríada de campos biológicos, incluida la biología de nicho de células madre, la biología de piRNA y la organogénesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Lindsey W. Plasschaert y Justin Sui por sus contribuciones sustanciales al desarrollo temprano de este protocolo. Los autores agradecen a la comunidad de moscas por su generosidad con los reactivos, y en particular a Ruth Lehmann y Benjamin Lin por su regalo de la línea nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' antes de su publicación. En este estudio se utilizaron las existencias obtenidas del Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Este trabajo fue apoyado por NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 y R35GM136270 (S.D), así como por becas de capacitación T32GM007229 (B.W.) y F32GM125123 (L.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alfa Aesar Tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) FBtp0056035 Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato Gift from Ruth Lehmann Lab Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin FBtp0083398 Sano et al., PLoS One, 2012
Diamond-tipped knife
Double-sided tape Scotch 665
Fetal Bovine Serum GIBCO 10082
Imaging dish MatTek P35GC-1.5-14-C
Imaging software Molecular Devices MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0
Insulin, bovine Sigma l0516 Store aliquots at 4 °C
Needle holder Fisher Scientific 08-955
Nytex basket
Penicillin/streptomycin Corning 30-002-Cl
Ringer's solution 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved
Schneider's Insect Media GIBCO 21720-024

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
  2. Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
  3. Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
  4. Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
  5. Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  6. Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
  7. Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
  8. Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
  9. Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
  10. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  11. Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
  12. Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
  13. Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
  14. Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
  15. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
  16. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
  17. Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
  18. Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  19. Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
  20. Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
  21. Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
  22. Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
  23. Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
  24. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
  25. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
  26. JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
  27. Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
  28. Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
  29. Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
  30. Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  31. Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
  32. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).

Tags

Biología del desarrollo Número 164 Drosophila embrión gónada testículo imágenes en vivo ex vivo disección células madre desarrollo de nichos
Disección e imágenes en vivo de la <em>Drosophila</em> gonad embrionaria tardía
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nelson, K. A., Warder, B. N.,… More

Nelson, K. A., Warder, B. N., DiNardo, S., Anllo, L. Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad. J. Vis. Exp. (164), e61872, doi:10.3791/61872 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter