Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

Resumen

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Resumen

La gónada embrionaria masculina de Drosophila melanogaster es un modelo ventajoso para estudiar varios aspectos de la biología del desarrollo, incluidos, entre otros, el desarrollo de células germinales, la biología de piRNA y la formación de nichos. Aquí, presentamos una técnica de disección para obtener imágenes en vivo de la gónada ex vivo durante un período en el que las imágenes en vivo in vivo son altamente ineficaces. Este protocolo describe cómo transferir embriones a un plato de imágenes, elegir embriones masculinos en etapas adecuadas y diseccionar la gónada de su tejido circundante mientras se mantiene su integridad estructural. Después de la disección, las gónadas se pueden obtener imágenes utilizando un microscopio confocal para visualizar los procesos celulares dinámicos. El procedimiento de disección requiere un tiempo y una destreza precisos, pero proporcionamos información sobre cómo prevenir errores comunes y cómo superar estos desafíos. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo de disección para la gónada embrionaria de Drosophila , y permitirá la obtención de imágenes en vivo durante una ventana de tiempo que de otro modo sería inaccesible. Esta técnica se puede combinar con manipulaciones transgénicas farmacológicas o específicas de tipo celular para estudiar cualquier proceso dinámico que ocurra dentro o entre las células en su entorno gonadal natural.

Introducción

El Drosophila melanogaster testis ha servido como paradigma para nuestra comprensión de muchos procesos celulares dinámicos. Los estudios de este modelo han arrojado luz sobre la regulación^de la división de células madre ^1,2,3, el desarrollo de células germinales ^4,5, la biología de piRNA ^6,7,8 y los eventos de señalización de células madre de nicho ^{9,10,11,12,13}

Protocolo

1. Preparación del día antes de la disección

1. Afila electrolíticamente una aguja de tungsteno²⁴ para que el diámetro resultante sea de aproximadamente 0,03 mm. Ajuste el voltaje suministrado a aproximadamente 14 V y use 3.3 M NaOH. El afilado no debe tomar más de 1 o 2 minutos.
   PRECAUCIÓN: El NaOH es altamente corrosivo y causará quemaduras al contacto con la piel. Use guantes y gafas mientras manipula, y trabaje dentro de una campana extractora.
   NOTA: Después de su uso, guarde NaOH en un tubo Falcon de polipropileno.
2. Haga los medios de imagen preparados. En un tubo cónico de 15 ml, combinar 4,25 ml de medios de Schneid....

Resultados

Ilustramos la preparación del plato de imágenes en la Figura 1, como se describe en "Preparación del día de la disección". En última instancia, estos métodos deberían dar como resultado embriones bien hidratados adheridos a una tira deslizante de cubierta, que se fija temporalmente al fondo del plato y se sumerge en la solución de Ringer (Figura 1F). Un cuchillo con punta de diamante permite cortar limpiamente un deslizamiento de cubierta de 22 x 22 mm en tres o.......

Discusión

Durante la gonadogénesis, la gónada embrionaria, y particularmente el nicho de células madre dentro de la gónada masculina¹⁵, sufre cambios morfológicos rápidos. Los mecanismos de desarrollo que subyacen a estos cambios dinámicos se entienden mejor a través de técnicas de imágenes en vivo. Sin embargo, en la etapa embrionaria 17, las imágenes in vivo de la gónada se vuelven imposibles por el inicio de contracciones musculares a gran escala¹⁷. Con este protocolo, pr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alambre de tungsteno Alfa Aesar	Fisher Scientific	AA10408G6	0,25 mm (0,01 pulg.) de diámetro, 99,95% (base de metales)
D. melanogaster: His2Av::mRFP1	Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)	FBtp0056035	Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007
D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato	Regalo de Ruth Lehmann Lab		Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3'
D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin		FBtp0083398	Sano et al., PLoS One, 2012
Cuchillo
Cinta de doble cara	Scotch	665
Suero fetal bovino	GIBCO	10082
Plato de imagen	MatTek	P35GC-1.5-14-C
Software de imagen	Molecular Devices MetaMorph		Microscopy Software de automatización y análisis de imágenes v7.8.4.0
Insulina bovina	Sigma	l0516	Almacene alícuotas a 4 & deg; C
Portaagujas	Fisher Scientific	08-955
Cesta
Penicilina/estreptomicina	Corning	30-002-Cl
Solución			2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 36 mM Sacarosa, 5 mM Hepe' s Búfer; ajustado con NaOH hasta alcanzar un pH de 7,3
Schneider's Insect Media	GIBCO	21720-024

con punta de diamanteNytex de Ringer