Summary
כאן, אנו מספקים פרוטוקול דיסקציה הנדרש כדי לצלם בשידור חי את הגונד הזכר העוברי המנוח של דרוזופילה . פרוטוקול זה יאפשר תצפית על תהליכים תאיים דינמיים בתנאים רגילים או לאחר מניפולציה מהונדסת או פרמקולוגית.
Abstract
הגונד העוברי הזכרי Drosophila melanogaster הוא מודל יתרון לחקר היבטים שונים של ביולוגיה התפתחותית, כולל, אך לא רק, התפתחות תאי נבט, ביולוגיה של פירנ"א והיווצרות נישה. כאן, אנו מציגים טכניקת דיסקציה כדי לצלם בשידור חי את ה- gonad ex vivo בתקופה שבה הדמיה חיה in vivo אינה יעילה מאוד. פרוטוקול זה מתווה כיצד להעביר עוברים לצלחת הדמיה, לבחור עוברים זכריים בשלבים מתאימים ולנתח את הגונד מהרקמה הסובבת אותו תוך שמירה על שלמותו המבנית. לאחר הניתוח, ניתן לצלם את הגונדות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להמחיש תהליכים תאיים דינמיים. הליך הנתיחה דורש תזמון ומיומנות מדויקים, אך אנו מספקים תובנה כיצד למנוע טעויות נפוצות וכיצד להתגבר על אתגרים אלה. למיטב ידיעתנו זהו פרוטוקול הנתיחה הראשון של הגונד העוברי דרוזופילה , והוא יאפשר הדמיה חיה בחלון זמן בלתי נגיש אחרת. ניתן לשלב טכניקה זו עם מניפולציות מהונדסות פרמקולוגיות או מסוג תאים ספציפיים כדי לחקור תהליכים דינמיים המתרחשים בתוך או בין התאים בסביבתם הגונדלית הטבעית.
Introduction
אשכי Drosophila melanogaster שימשו פרדיגמה להבנתנו תהליכים תאיים דינמיים רבים. מחקרים על מודל זה שפכו אור על ויסות חלוקת תאי גזע 1,2,3, התפתחות תאי נבט 4,5, ביולוגיה של פירנ"א 6,7,8, ואירועי איתות תאי גזע נישה 9,10,11,12,13. מודל זה הוא יתרון מכיוון שהוא ניתן למתיחה גנטיתשל 14,15 והוא אחד הבודדים שבהם אנו יכולים לדמות תאי גזע חיים בסביבתם הטבעית 3,16,17,18. עם זאת, הדמיה חיה של מודל זה הוגבלה לרקמות בוגרות ולשלבים עובריים מוקדמים, והותירה פער בידע שלנו על דינמיקה של גונדאל בעובר המאוחר, השלב המדויק שבו הנישה נוצרת לראשונה ומתחילה לתפקד.
הגונד העוברי בשלב מאוחר הוא כדור, המורכב מתאי נישה סומאטיים בחלק הקדמי, ותאי נבט הנספים על ידי תאי גונדל סומטיים באזורים אחוריים יותר19. ניתן לדמות איבר זה חי ב- vivo עד שלב העוברי המוקדם 1717,20,21. הדמיה נוספת נמנעת עקב ייזום התכווצויות שרירים בקנה מידה גדול. התכווצויות אלה כה חמורות עד שהן דוחפות את הגונד אל מחוץ למסגרת ההדמיה, ותנועה כזו אינה ניתנת לתיקון באמצעות תוכנת הדמיה. המעבדה שלנו מעוניינת לחשוף את המנגנונים של היווצרות נישה, המתרחשת בתקופה חמקמקה זו להדמיה חיה. לכן, יצרנו גישת ex vivo לדימוי חי של הגונד החל משלב 16 העוברי, מה שמקל על חקר הדינמיקה של התאים בתקופה מכרעת זו של התפתחות הגונד. עבודות קודמות מהמעבדה שלנו מראות כי הדמיית ex vivo זו משחזרת בנאמנות את פיתוח ה-in vivo gonad17. טכניקה זו היא הראשונה והיחידה מסוגה עבור הגונד העוברי של דרוזופילה.
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול הנתיחה הנדרש להדמיה חיה ex vivo של הגונד בשלבים העובריים המאוחרים. פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם טיפולים פרמקולוגיים, או מניפולציה מהונדסת של שושלות תאים ספציפיות בתוך הגונד. באמצעות טכניקה זו, צילמנו בהצלחה את השלבים של היווצרות נישה של תאי גזע17. גישת הדמיה זו היא אפוא חיונית לתחום הביולוגיה של תאי הגזע, שכן היא תאפשר הדמיה של השלבים הראשונים של היווצרות נישה בזמן אמת בסביבתה הטבעית15,17. בעוד ששיטה זו מועילה לתחום הביולוגיה של תאי גזע, היא גם ישימה להדמיה של תהליכים דינמיים המתרחשים בגונד במהלך נקודת זמן התפתחותית זו, כולל סידור מחדש של תאים22, הידבקות תאים 2,12,23 ונדידת תאים23. פרוטוקול דיסקציה זה ישפר אפוא את הבנתנו לגבי תהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים של התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה ליום לפני הנתיחה
- באופן אלקטרוליטי מחדדים מחט טונגסטן24 כך שהקוטר המתקבל הוא כ-0.03 מ"מ. התאם את המתח המסופק לכ- 14 וולט, והשתמש ב- 3.3 M NaOH. חידוד צריך לקחת לא יותר מ 1 או 2 דקות.
אזהרה: NaOH הוא מאוד קורוזיבי ויגרום לכוויות במגע עם העור. הרכיבו כפפות ומשקפי מגן בזמן הטיפול, ועבדו בתוך מכסה אדים.
הערה: לאחר השימוש, אחסן את NaOH בצינור פלקון פוליפרופילן. - הפוך את מדיית ההדמיה המוכנה. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, שלבו 4.25 מ"ל של המדיה של שניידר עם 750 μL של סרום בקר עוברי (FBS, 15% ריכוז סופי) ו-27.5 μL של פניצילין-סטרפטומיצין (0.05 U/μL של פניצילין, 0.05 מיקרוגרם/מיקרול ריכוז סופי). אחסן את מדיית ההדמיה המוכנה הזו בטמפרטורה של 4 °C (75 °F).
- הכינו תמיסת דבק הפטן. הוסיפו כ-0.5 מ"ל הפטאן לבקבוקון אטום בגודל 20 מ"ל ממולא בנייר דבק דו-צדדי בקוטר 20 ס"מ. מתנדנדים על אגוז במשך כשעה, או מערבבים עם קצה פיפטה עד שמתקבלת עקביות בין זו של מים לגליצרול. פתרון זה של דבק מומס יימשך מספר ימים לפני שהפטן יתאדה. כדי לרענן את הפתרון, הוסיפו עוד 0.5 מ"ל הפטאן, וסלע.
הערה: ניתן להכין תמיסת דבק הפטאן יעילה באמצעות יחסים שונים של הפטאן לטייפ, כמו גם משכי זמן משתנים של נדנדה/ערבוב. המפרטים הנ"ל הם רק הצעות להכנה או לרענון של פתרון הולם כזה.
2. איסוף עוברים – 15–17 שעות לפני הכריתה
- מוסיפים ממרח שמרים טרי לצלחת אגר מיץ תפוחים25. הקימו כלוב איסוף עוברים על ידי הוספת זבובים בוגרים (בני פחות מ-10 ימים) לבקבוק מזון ריק, מחורר בחורים קטנים26. מכסים את כלוב האיסוף באמצעות צלחת האגר השמרים, מודבקים לבקבוק, ומניחים את הכלוב עם צד הצלחת למטה באינקובטור כהה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
הערה: הזבובים חייבים לבטא טרנסגן שיסמן באופן פלואורסצנטי את הגונד, לדוגמה, six4-eGFP::Moesin20, מכיוון שניתוח העוברים יתבצע תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. ראה טבלת חומרים לקבלת רשימה של גנוטיפים המשמשים לסימון הגונד. - מוציאים את הכלוב מהחממה ומשליכים את האוסף הראשון הזה. החליפו אותו בצלחת אגר טרייה עם שמרים והחזירו את הכלוב לאינקובטור למשך שעתיים.
הערה: איסוף העוברים הראשון משמש לניקוי נקבות מעוברים מופרים ומתפתחים, כדי להשיג אוסף שני מתוזמן היטב של עוברים. - מוציאים את צלחת האגר מהכלוב ומניחים אותה (כשצד השמרים פונה כלפי מעלה) על מגבת נייר לחה בתוך מיכל פלסטיק אטום. מניחים את החדר הלח הזה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס כדי להזדקן העוברים במשך 14.5 שעות (גילאים סופיים, 14.5-16.5 שעות לאחר הטלת הביצה).
הערה: מיד לפני תחילת שלב 2.4, השלם את שלבים 3.1 ו- 3.2. - מוציאים את צלחת האגר מהאינקובטור, ובעזרת בקבוק שפריץ מוסיפים מספיק מים לצלחת האגר כדי להמיס את משחת השמרים על ידי הברשה קלה עם מברשת צבע. שוטפים את העוברים ומומסים את השמרים בסלסלת רשת קטנה היושבת בתוך סירת שקילה. יש לשטוף את הסל עם בקבוק התזת המים עד שרוב משחת השמרים מסוננת דרך הרשת.
- מוציאים את המים מסירת השקילה ומחזירים את הסל פנימה. הפחיתו את העוברים על ידי טבילתם בתמיסת אקונומיקה של 50%, באמצעות בקבוק שפריץ. תמיסת האקונומיקה צריכה להיות בעלת עומק של 3-5 מ"מ. יש לשמור את העוברים שקועים באקונומיקה למשך כ-2 דקות, עם מערבולות מזדמנות.
אזהרה: אקונומיקה היא קורוזיבית ועלולה לגרות או לפגוע בעיניים ובדרכי הנשימה. לבשו כפפות ומשקפי מגן בזמן הטיפול באקונומיקה.
הערה: במהלך תקופה זו, השלם ככל האפשר של שלב 3.3. ניתן לבדוק את התקדמות ההפחתה על ידי הנחת הסל מתחת למיקרוסקופ סטריאו ובדיקת היעדר התוספות הגביות. טבלו את העוברים בתמיסת האקונומיקה למשך זמן נוסף, במידת הצורך. - משליכים את האקונומיקה, ושוטפים היטב את העוברים בתוך הסל במים מבקבוק השפריץ (במשך כ-3 שניות, מכתימים את סלסלת הרשת במגבות נייר; חוזרים על הפעולה 2-3 פעמים).
3. הכנת יום של דיסקציה
- הוסיפו 30 μL אינסולין (10 מ"ג/מ"ל) ל-1,500 μL אמצעי הדמיה מוכנים (ראו שלב 1.2) בצינור אפנדורף של 1.5 מ"ל (ריכוז סופי של 0.2 מ"ג/מ"ל). מערבבים היטב ומשאירים את הצינור על הספסל כדי להתאימם לטמפרטורת החדר.
- מכינים רצועות כיסוי מצופות בדבק.
- השתמשו בסכין עם קצה יהלום כדי לחתוך כיסוי בגודל 22 מ"מ על 22 מ"מ לארבע רצועות בגודל שווה (איור 1A).
- השתמשו במלקחיים כדי להרים רצועה אחת ולפזר סך של כ-30 μL של תמיסת דבק הפטאן על שני צידי הרצועה (איור 1B). כדי להשיג שכבה אחידה של שאריות דבק, הטו את הרצועה בזוויות שונות בזמן שההפטן מתאדה.
- אחסן את הרצועה המכוסה בדבק בחריץ ריק של קופסת כיסויים; כדי לשמור על דביקותה, הניחו את הרצועה במצב משופע אך זקוף, תוך הישענות על קצות הקופסה כדי למזער את המגע עם משטחי הקופסה (איור 1C). סגור את הקופסה כך שחלקיקים באוויר לא יצפו את הדבק ויפחיתו את דביקותו.
- הניחו את הפריטים הבאים על הספסל: פיפטת פסטר זכוכית בגודל 6 אינץ', מגלשת מיקרוסקופ, P200 ופיפטמן P1000 עם קצות הפיפטה המתאימים, הפתרון של רינגר27 (pH מותאם ל-7.3 עם NaOH), וצלחת הדמיה חשופה, מצופה פולי-D-ליזין 35 מ"מ.
- מעבירים עוברים מסל המסך של הרשת לכוס שעון קטנה מלאה בהפטן 500–750 מיקרול'.
- מדביקים את הצדדים והחלק התחתון של הסל יבשים עם מגבון טישו. להרטיב מכחול בהפטן, לגעת במברשת לעוברים (קרום הוויטלין ההידרופובי צריך להיצמד לזיפים), ולטבול את המכחול בחזרה לתוך ההפטאן שבזכוכית השעון (העוברים צריכים לשקוע לתחתית).
הערה: יש לבצע את הצעדים הבאים במהירות האפשרית כדי למנוע מהעוברים להתייבש. אין לחשוף עוברים לאוויר במשך יותר מ -20 שניות.
- מדביקים את הצדדים והחלק התחתון של הסל יבשים עם מגבון טישו. להרטיב מכחול בהפטן, לגעת במברשת לעוברים (קרום הוויטלין ההידרופובי צריך להיצמד לזיפים), ולטבול את המכחול בחזרה לתוך ההפטאן שבזכוכית השעון (העוברים צריכים לשקוע לתחתית).
- מעבירים את העוברים לשקופית המיקרוסקופ באמצעות פיפטה של פסטר (איור 1D). משכו עוברים לתוך הפיפטה באיטיות והגבילו אותם לחלק הצר של הפיפטה. פיפטה עוברת על המגלשה באיטיות, כך שהם מצטברים ממש בתוך קצה הפיפטה לפני שהם זורמים אל המגלשה. סובבו את הפינה של מגבון טישו לקצה דק, וזרקו את ההפטאן מהעוברים על המגלשה. הם יצברו ויכסו שטח קטן יותר, מה שיקל על לכידתם על רצועה מכוסה דבק בשלב הבא.
- בעזרת מלקחיים, הרימו רצועה מכוסה דבק ונגעו בה בעדינות בעוברים (איור 1E). מניחים את הרצועה בצלחת ההדמיה, את העובר בצד, וממש מחוץ למרכז המצופה פולי-D-ליזין. לוחצים את הרצועה על התבשיל באמצעות מלקחיים, כדי לוודא שהיא קבועה במקומה. מיד להציף את המנה עם 2-3.5 מ"ל תמיסה של רינגר; הטביעו תחילה את העוברים כדי למנוע מהם להתייבש (איור 1F).
4. דיסקציה
הערה: שלבים אלה חייבים להתבצע תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי.
- דוויטלין 10-15 עוברים.
הערה: זה עשוי לנוע בין שני עוברים, למתחילים, לחמישה עשר עוברים, למומחים.- בחר עוברים שלב 16 בהתבסס על מורפולוגיה של המעיים (איור 2). בשלב זה, לעוברים יש שלוש התכווצויות מעיים שיוצרות ארבעה מקטעי מעיים מוערמים (איור 2B,B' ). כדי להתחיל devitellinization, לחדור את העובר שנבחר בקצה אחד, רצוי הקדמי, עם מחט טונגסטן. העובר עשוי לבלוט מתוך קרום הוויטלין שלו, אך אם לא, לקלף את הקרום מהעובר.
הערה: לעוברים צעירים מכדי לנתח יש מעיים לא אזוריים (איור 2C). כריתה של עוברים שלב 17 אפשרית, אך מאתגרת יותר מאשר כריתה של עוברים שלב 16 מכיוון שהציפורן מתחילה להתפתח בשלב זה. עוברים בשלב מוקדם 17 נמצאים עם ארבעה מקטעי מעיים שמוזזים יחסית זה לזה (איור 2D,D'). - חברו את המחט דרך העובר באזור רחוק מהגונדות. מעבירים את העובר המחובר לאזור המצופה פולי-ליזין של התבשיל (מכאן והלאה מכונה פשוט "החלקת כיסוי") וגוררים אותו על הקרקעית עד שהוא נדבק. חזרו על השלבים האלה, וסדרו עוברים שעברו דה-ויטלין בשורה לאורך החלק העליון של החלקת הכיסוי המצופה פולי-ליזין (איור 3A), והשאירו הרבה מקום למטה להמשך ניתוח.
הערה: הגונדות מופיעות כאגרגטים כדוריים קטנים של תאים שאמורים להיות זוהרים בבהירות, בהתאם לסמן הספציפי שבו נעשה שימוש ומספר ההעתקה הטרנסגני. בשלב זה, הגונדות ממוקמות לרוחב בקטע A5, בערך 70%-80% מאורך העובר מלפני. לאורך פרוטוקול הנתיחה, הרקמה עשויה להידבק למחט. כדי להיפטר מהמחט של הפסולת, הרם אותה ממש מעל פני השטח של תמיסת הרינגר. דה-ויטליניזציה יכולה להיות לא מסודרת כל עוד הגונד תקין מופרע כמה שפחות.
- בחר עוברים שלב 16 בהתבסס על מורפולוגיה של המעיים (איור 2). בשלב זה, לעוברים יש שלוש התכווצויות מעיים שיוצרות ארבעה מקטעי מעיים מוערמים (איור 2B,B' ). כדי להתחיל devitellinization, לחדור את העובר שנבחר בקצה אחד, רצוי הקדמי, עם מחט טונגסטן. העובר עשוי לבלוט מתוך קרום הוויטלין שלו, אך אם לא, לקלף את הקרום מהעובר.
- עדינו את הגונדות מתוך העובר אל המנה (איור 3C,D).
- ראשית, פילה את העובר כדי לחשוף את פנים העובר (איור 3C). פורסים את העובר ממרכזו, מזיזים את המחט לאחור, בין הגונדות. להקניט החוצה רקמה פנימית כלשהי, שכן זה יידבק למנה הרבה יותר טוב מאשר הציפורן החיצונית. הדביקות של הרקמה תאפשר למניפולציות הבאות לחשוף את הגונד ולאפשר לו להיצמד להחליק הכיסוי.
הערה: אם הרקמה אינה נדבקת לתבשיל, נסו לשדל אותו לאזור לא מזוהם של החלקת הכיסוי המצופה; האזורים החיצוניים של החלקת הכיסוי יהיו דביקים במיוחד. כאמור בשלב 4.1.2, אין זה משנה אם מניפולציות הנתיחה גורמות לפגר עוברי מגולען, כל עוד הגונדות נותרות ללא פגע. - השתמשו במחט כדי לחתוך סביב גונד עד שפיסת טישו, כולל הגונד, מופרדת מהפגר שנותר. בעזרת המחט, משכו את הרקמה לאזור רענן של החלקת כיסוי מצופה, והצמידו אותה לתחתית עד שהיא נצמדת לתבשיל.
הערה: ההדמיה הטובה ביותר תושג עבור אותם מקרים שבהם הגונד עצמו מתחבר ישירות לתלוש הכיסוי, ולא חיבור עקיף באמצעות רקמה מעל. לכן, כאשר הרקמה מונחית הרחק מהפגר, נסו לגרום לגונד לגעת תחילה בהחלקת הכיסוי, ולא ברקמה זרה. - הסר כמה שיותר רקמות מסביב מהגונד (איור 3D) על-ידי גרירת רקמה דביקה בעדינות הרחק מהגונד עם המחט. הימנעו מלגעת ישירות בגונד, מה שיפגע בו (איור 4E). כדי לוודא שהגונאד נדבק מספיק לתבשיל, הזיזו את המחט בתנועה מעגלית עדינה סביב הגונד – אם הוא זז, אם הוא זז, גע במחט ברקמה הדבקה הנותרת, והפנה את הגונד לאזור רענן של החלקת כיסוי דביקה. חזור על תהליך זה עד שלא תהיה תנועה ניתנת לזיהוי של הגונד.
- חוזרים לפגר העוברים ומנתחים את הגונד השני. חזור על תהליך זה על עוברים רבים ככל האפשר, אך אל תעלה על 25 דקות. כדאיות הרקמות תיפגע בתמיסה של רינגר לאחר יותר מ-40-45 דקות.
- ראשית, פילה את העובר כדי לחשוף את פנים העובר (איור 3C). פורסים את העובר ממרכזו, מזיזים את המחט לאחור, בין הגונדות. להקניט החוצה רקמה פנימית כלשהי, שכן זה יידבק למנה הרבה יותר טוב מאשר הציפורן החיצונית. הדביקות של הרקמה תאפשר למניפולציות הבאות לחשוף את הגונד ולאפשר לו להיצמד להחליק הכיסוי.
- לאחר השלמת הניתוחים, השתמש בסמן בל יימחה כדי להוסיף סימני רישום לשפה החיצונית של צלחת ההדמיה כדי לרשום את הכיוון שלה במהלך הנתיחה.
- מוציאים את הרצועה המצופה בדבק מהתבשיל.
- מכניסים בעדינות את המוט התחתון של זוג מלקחיים מתחת לרצועה, אוחזים ומטים באיטיות את הרצועה כלפי מעלה כדי לשחרר אותה מהצלחת עם כמה שפחות רפש של תמיסת הרינגר כדי למזער את ההפרעה של הגונדות הנדבקות.
הערה: יש להטות את הרצועה הרחק מהגונדות המנותחות.
- מכניסים בעדינות את המוט התחתון של זוג מלקחיים מתחת לרצועה, אוחזים ומטים באיטיות את הרצועה כלפי מעלה כדי לשחרר אותה מהצלחת עם כמה שפחות רפש של תמיסת הרינגר כדי למזער את ההפרעה של הגונדות הנדבקות.
- נשאו בעדינות את המנה למיקרוסקופ ההדמיה באופן שימנע טשטוש של תמיסת הרינגר.
5. הדמיה
- הניחו את צלחת ההדמיה במחזיק הבמה, תוך שימוש בסימני הרישום כדי למקם את המנה בכיוון המשוער כמו במהלך הנתיחה. באמצעות שימוש במיקרוסקופיית שדה בהיר ובמטרה בהספק נמוך (~פי 10), זהה והביא לפוקוס כל פיסת רקמה המודבקת לתלוש הכיסוי. החלף את הגדרות העינית כדי לחשוף פלואורסצנטיות, ובאמצעות עיניות המשקפת, סרוק באופן שיטתי את המנה, וסימנו את המיקום של כל גונד בתוך תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים).
הערה: ודא שהגונאדים ממורכזים בשדה הראייה לפני סימון מיקומים. - הסר בעדינות את כל מכלול מחזיקי הבמה, עם צלחת ההדמיה במחזיק שלה, והנח את ההרכבה על ספסל העבודה.
- החלף את תמיסת הצלצול במדיית ההדמיה המוכנה המכילה אינסולין (ראה שלבים 1.2 ו-3.1).
- השתמשו ב-P1000 כדי להסיר את כל תמיסת ה-Ringer מהמדף העליון הפנימי של צלחת ההדמיה (אין למקם את ה-pipette Ringer's מאזור החלקת הכיסוי המרכזית). לאחר מכן, עברו ל-P200, והניחו את קצהו ממש מתחת לפני השטח של הרינגר הנותרים באזור המרכז. הסר בזהירות 50-100 μL של רינגר; אל תסיר את הפתרון כולו.
- ציירו כ-200 μL של מדיית הדמיה, ושוב הניחו את קצה ה-P200 ממש מתחת לפני השטח של הרינג'רים הנותרים, הוסיפו לאט לאט את מדיית ההדמיה הזו. לאחר מכן, הוסיפו את מדיית ההדמיה הנותרת (כ-1,300 μL) למנה, החל מהשוליים החיצוניים ביותר של המדף העליון. תוך כדי צנרת, התקדמו לעבר הכיפה המרכזית של הנוזל, ובסופו של דבר מזגו את השניים על ידי הברשה של קצה הפיפטה על פני שניהם. מניחים את המכסה על התבשיל.
הערה: מדיית ההדמיה צריכה לכסות את כל הקוטר הפנימי של המנה, בעומק של כ-2 מ"מ, כדי למנוע אידוי (איור 4D).
- החלף את המיקרוסקופ למטרה בהספק גבוה יותר (63x, 1.2 NA), החל את נוזל הטבילה המתאים בהתבסס על המטרה שבה נעשה שימוש (סוג נוזל טבילה ומקדם שבירה הנדרש על ידי המטרה), ולאחר מכן החלף את מכלול מחזיקי הבמה. השתמשו במיקרוסקופיה של ברייטפילד כדי להתמקד ברקמות שנצמדות לתחתית צלחת ההדמיה.
הערה: אם הבמה לא הוזזה, הגונד האחרון צריך לבוא לידי ביטוי ברגע שהמטרה ממוקדת. - צעדו דרך כל תנוחת גונד מסומנת והתאימו את התנוחה הזו, לפי הצורך. בחר אילו גונדות לצלם על סמך בהירות התמונה, סקס גונד וכו '. התאם אישית את הגדרות ההדמיה (רב ערוצי, זמני חשיפה, עוצמות לייזר, דרגות מסדרת Z, קיטועי זמן עם מרווחים מתאימים וכו '). התחילו בהדמיה.
הערה: ניתן לזהות גונדות זכריות על ידי נוכחות של נישה, ובקצה הנגדי של הגונד, מקבץ של תאים סומאטיים קטנים, מעגליים מאוד, הנקראים מבשרי גונדל סומטיים ספציפיים לזכר (msSGPs). אם נעשה שימוש בסמן הפלואורסצנטי six4-eGFP::moesin, תאי הנישה הם התאים השניים בבהירותם בגונד, כאשר הבהירים ביותר הם ה-msSGPs. בשלב זה, לגונדות נשיות אין נישה ולא msSGPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו ממחישים את ההכנה של צלחת ההדמיה באיור 1, כפי שמתואר ב"הכנת יום הנתיחה". שיטות אלה אמורות לגרום בסופו של דבר לכך שעוברים בעלי לחות טובה יידבקו לרצועת החלקה, המקובעת באופן זמני לתחתית המנה ושקועה בתמיסה של רינגר (איור 1F). סכין עם קצה יהלום מאפשרת לפרוס בצורה נקייה כיסוי בגודל 22x22 מ"מ לתוך שלוש עד ארבע רצועות קטנות יותר (איור 1A). בזמן שאנחנו מטפלים ברצועות האלה עם מלקחיים, אנחנו משתמשים בפיפטה כדי להעביר מספיק דבק הפטאן כדי לצפות את הרצועות האלה, מה שנותן להם משטח דביק בעל מרקם (איור 1B). הרצועות המצופות מאוחסנות בקלות בקופסת כיסוי ריקה כדי לשמור על משטחי ההדבקה נקיים עד 2 שעות (איור 1C). ברגע שיוצרים את הרצועות המצופים האלה, המטרה היא להדביק את העוברים לרצועה במצטבר, ליד הקצה הארוך של הרצועה (איור 1E). תחילה יש צורך להעביר כמה עוברים מזכוכית השעון למגלשת זכוכית נקייה ולייבש אותם (איור 1D). לאחר מכן, השתמשו במהירות במלקחיים כדי לגעת בעדינות ברצועה המצופה בעוברים, כך שהם יידבקו (איור 1E). לאחר מכן אנו לוחצים מיד את הרצועה לתחתית צלחת הנתיחה עם עוברים הפונים כלפי מעלה, ומכסים את העוברים בתמיסת רינגר (איור 1F). אם המטרה הזו תושג, הצפייה בעוברים תחת סטריאומיקרוסקופ שדה בהיר מסורתי תגלה עוברים בריאים ומלאי לחות בתוך ממברנות הוויטלין שלהם (איור 1G). אם, במקום זאת, תהליך העברת העוברים האלה לרצועה וכיסוים בתמיסה לוקח יותר מ-30 שניות, העוברים יתייבשו ויהפכו לרפויים (איור 1G). עוברים רפויים אינם בריאים ומאתגרים מאוד לנתח אותם, ולכן עבודה יעילה בתהליך זה היא חיונית.
איור 1: הרכבה והתייבשות של עוברים לפני הנתיחה. (א–ו) צעדים להדבקת העוברים לרצועה של כיסוי מצופה דבק, והצמדת הרצועה לצלחת הדמיה. (A) כיסויים שהובקעו פעם אחת על ידי סכין עם קצה יהלום (סכין המסומנת על ידי ראש חץ) כדי ליצור רצועה. (B) מריחת דבק הפטן על רצועת כיסוי קטועה, המוחזקת בזוג מלקחיים. (C) ארבע רצועות מצופות דבק המתייבשות בקופסת כיסוי. (ד–ה) חצים מצביעים על עוברים. (D) נטרלו עוברים שנאספו בהפטאן וגורשו אל קצה שקופית מיקרוסקופ. עודף הפטאן הוסר עם קימבייפ. (E) רצועה מצופה דבק עם עוברים מחוברים. (ו) ההתקנה הסופית של המנה מיד לפני הנתיחה. שימו לב לשכבה הרדודה של תמיסת רינגר (ראש החץ) ולמיקום הרצועה (חץ) מעל מעגל הדיסקציה הפנימי. (ג'י-ג') העוברים דבקו ברצועה שבמנה. (G) עוברים שעברו הידרציה נכונה, טורגיים. (ז') עוברים שהתייבשו עקב חשיפה ממושכת לאוויר, והדבר ניכר על ידי ממברנות ויטלין שהתמוטטו. כוכביות מצביעות על עוברים רפויים. סרגלי קנה מידה הם 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
צפייה בעובר תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי מאפשרת הדמיה ברורה של המעיים, אשר פלואורסצים באופן אוטומטי בתעלת ה-GFP. מורפולוגיה של המעיים משמשת כמייצגת את הגיל העוברי בעת בחירת העוברים לנתח. מאחר שעוברים שנדבקו לרצועת הכיסוי ישתנו מעט בגילם, הם יציגו מגוון רחב של מורפולוגיות מעיים (איור 2A). כדי לתדמית חיה של מורפוגנזה של גונאד, אנו מנתחים עוברים מוקדמים של שלב 16. העוברים האלה מציגים ארבעה מקטעי מעיים אזוריים שנערמים בשורה אחידה (איור 2B', קווים מנוקדים). עוברים צעירים יותר מציגים מעיים דמויי שק, שאינם אזוריים (איור 2C), ועדיין אין להם מספיק מטריצה חוץ-תאית (ECM) סביב הגונדות שלהם כדי לאפשר התרבות יעילה של האיבר השלם. עוברים ישנים יותר שכבר החלו בדחיסת נישה מציגים ארבעה אזורי מעיים שאינם נערמים באופן שווה ובמקום זאת הם זזים יחסית זה לזה (איור 2D', קווים מנוקדים). לעוברים אלה יש קוטיקולה עבה יותר, מה שהופך את תהליך הנתיחה למאתגר יותר.
איור 2: בחירת עוברים בגיל המתאים לנתיחה של גונד. העוברים דבקו בכיסוי מצופה דבק לפני הנתיחה. עוברים מבטאים six4-eGFP::moesin (ירוק), המסמן את הגונד ותאי הגוף השמן. שימו לב שהמעיים פלורסצים באופן אוטומטי בירוק. חצים מציינים גונדות זכריות (המובחנות על ידי נוכחות של msSGPs פלואורסצנטיים בהירים) הנראים לעין בכל פאנל. סרגלי קנה מידה מציינים 0.25 מ"מ. (A) עוברים של שלבים שונים. (ב–ד) עוברים של שלבים מובחנים במרכז התמונה, מכוונים עם קדמי שמאלה וגבה למעלה. (ב) עובר בשלב מוקדם 16 המזדקן כראוי לצורך כריתה. (ב') ארבעת אזורי המעיים הערומים מסומנים בקווים לבנים מנוקדים. (C) עובר שלב 15 שהוא צעיר מכדי לנתח אותו (מוריד את העובר). שימו לב שלשק המעיים הפלואורסצנטי רק קדמי לגונד אין עדיין אזורים בדידים. (D) עובר שלב 16 מאוחר שקשה לנתח עקב התפתחות קוטיקולה. שימו לב שארבעת אזורי המעיים החלו להסתובב זה ביחס זה לזה כהכנה ללולאת מעיים. (ד') ארבעת אזורי המעיים מתוארים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
חשוב לנתח עוברים המבטאים סמן פלואורסצנטי בל יימחה בגונד, וסמן זה חייב להיראות תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. כאן בחרנו להשתמש ב-six4-eGFP::moesin20 כדי לסמן את הגונד (איור 2 ואיור 3, חצים) להדמיה במהלך כריתה.
אנו ממחישים את תהליך כריתת הגונד באיור 3. הנתיחה של עוברים בשלבים מתאימים על הכלים המצופה פולי-ליזין מאפשרת בידוד נקי של הגונדות מהעוברים האלה (איור 3D). עוברים שעברו דה-ויטמיליזציה ידבקו במנה, וניתן לסדר אותם בשורה נוחה לפני הנתיחה (איור 3A). דה-לוויטליניזציה של העובר והעברתו לפולי-ליזין הוא תהליך לא מדויק, כך שרקמה עלולה להיות מובלטת מגבולות גוף העובר (ראו פיסת רקמה בין עובר 1 לעובר 2, לבין עובר 4; איור 3א). לאי-דיוק זה אין כל חשיבות, כל עוד הגונדות נותרות ללא פגע. מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי סטנדרטי מאפשר זיהוי של הגונד בתוך גוף העובר שעבר דה-ויטלין (איור 3B, חץ). המניפולציות הראשונות עם מחט כריתה חדה אמורות להפריד בין הגונדות לפגר העובר, אם כי חלק מהרקמה האוטו-פלואורסצנטית תישאר דבוקה (איור 3C). מניפולציות נוספות גורמות לגונדות מבודדות שנצמדות ישירות לצלחת המצופה (איור 3D).
איור 3: תהליך הנתיחה. (א–ד) עוברים המבטאים six4-eGFP::moesin (ירוק) בשלבים רציפים בפרוטוקול הנתיחה. (A) ארבעה עוברים שעברו דה-ויטלין שהועברו לאזור הנתיחה המצופה פולי-ליזין של המנה. שימו לב כיצד העוברים מיושרים בשורה מסודרת כדי להקל על ניתוחים רצופים כלפי מטה בצלחת. פיסת הרקמה הקטנה בין עוברים 1 ו-2 היא חלק מהמעיים מעובר 2, שהובלט במהלך דה-ויטליניזציה של היד. (B) תצוגת הגדלה גבוהה יותר של העובר מ-(A), המסומנת על-ידי הכוכבית. (C) הפגר הנותר של עובר שנשלף לאורך קו האמצע. ראש החץ מציין גונד סתום, שעדיין מוטבע בכבדות ברקמות עובריות. (ד) גונד מנותח לחלוטין. שימו לב שרק רק רקמה חיצונית מינימלית (ראש חץ) נשארת ליד הגונד. חצים מצביעים על גונדות זכריות. סרגלי קנה מידה הם 0.25 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
לאחר ניתוח הגונדות, ניתן להחליף את תמיסת הרינגר במדיית הדמיה, ואת הגונדות המתורבתות בתמונה ישירות באותה מנה המשמשת לנתיחה. אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. הדמיה של ברייטפילד של גונד מבודד על מיקרוסקופ קונפוקלי חושפת צל כהה המקיף את פריפריית הגונדות (איור 4A–B, חצים), שהוא ה-ECM ששומר על שלמות הגונד במהלך ההדמיה. אנו מציגים דוגמה של גונד בריא, בעל תרבית טובה, המבטא F-אקטין עם תווית GFP בתאי גונדלסומטיים 20 וסמן היסטון המסומן ב-RFP כדי לדמיין את כל הגרעינים28 (איור 4C–C'). מאחר שכל התאים בעובר זה מבטאים את סמן ההיסטון RFP, גם תאי הגונדל וגם תאים של רקמה דביקה אחרת נצפים בצפייה בפליטה אדומה. אנו מבחינים בגבולות הגונד באמצעות סמן ה-GFP הספציפי לגונאד (איור 4C', מתאר). ברור שהגונד הזה בתרבית הוא בריא משום שגבול הגונד הוא חלק ועגול (איור 4C', מתאר), ומכיוון שלתאי גונדאל יש רמות שוות של פלואורסצנציה של היסטון RFP בכל הגרעינים (איור 4C', חץ). אם, במקום זאת, גונדות אינן מקבלות הידרציה מספקת במהלך ההדמיה, גרעינים ו-six4-eGFP::moesin fluorescence יכולים להפוך לנקבים (איור 4D, חץ) כאשר רקמת הגונד מצטמקת. יתר על כן, אם ה-ECM של הגונאד ניזוק יתר על המידה במהלך הנתיחה, גבול הגונד נפגע, מה שניכר על ידי נוכחותם של תאים ספציפיים לגונד (איור 4E, כוכביות) מחוץ לגבולות הגונד (איור 4E, חץ).
איור 4: איתור גונדות בריאות במהלך הדמיה חיה. (A) תצוגות נמוכות ו-(B) בהגדלה גבוהה של שדה בהיר של שני גונדות מנותחות שנדבקו לכיסוי. (ג'-ג') פריים סרט אחד מהדמיית ex vivo של דחיסת נישה בגונד בריא. תאי גונדל סומטיים מבטאים 64-eGFP::moesin (ירוק), וכל התאים מבטאים את His2Av-mRFP (אדום). (ג') גבול גונד מסומן בקו מקווקו לבן. His2Av-mRFP הנראה מחוץ לגבול הגונד הוא ככל הנראה גוף שמן שעדיין מחובר לגונד המנותח. חץ מצביע על גרעין של תא נבט עם אות His2Av-mRFP אחיד, מה שמעיד על כך שהגונאד בריא. (ד–ה) תוצאות שליליות מייצגות של פרוטוקול דיסקציה ex vivo . (D) מסגרת מפגישת הדמיה שבה הגונד התייבש בגלל אידוי מדיה. שימו לב לגרעינים פיקנוטיים כעיבויים His2Av-mRFP (חץ), וכתמים לא רציפים של six4-eGFP::moesin לאורך גבול הגונד. (E) מסגרת הדמיה Ex vivo שבה מטריצה חוץ-תאית נפגעה במהלך הנתיחה. שים לב שחלק מתאי הנבט (כוכביות) יוצאים מגבול הגונד (חץ). תאי נבט מסומנים ב-nos-lifeact::tdtomato (magenta), ותאי גונדל סומטיים עם 64-eGFP::moesin (ירוק). סרגלי קנה מידה מראים 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ניתן לתרבת את הגונדות במשך כ-5 שעות באמצעות שיטת הדמיה זו של ex vivo , המאפשרת רכישת תמונה של אירועי המורפוגנזה הדינמיים המתרחשים בהתפתחות גונד העוברית המאוחרת. במעבדה שלנו, השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול הזה כדי לדמות את הדחיסה של נישה של תאי גזע יוצרים17 (איור 5). לפני הדחיסה, הגומחה היא צבירה רופפת של תאים סומטיים בקצה הקדמי של הגונד (איור 5A, ירוק), מוקפת בתאי נבט המסומנים ב-nos-lifeact::tdtomato29 (ראו טבלת חומרים), שהשכבה הראשונה שבה תהיה תאי גזע של חיידקים (איור 5A, magenta). צבירה נישה זו מציגה בתחילה גבול לא סדיר (איור 5A', קו מקווקו). במהלך ההדמיה, אנו צופים בתאי נישה בודדים המסדירים מחדש את מיקומם בעוד שצביר הנישה רוכש גבולות חלקים יותר. הסידור מחדש של התאים האלה גורם גם לירידה בשטח הנישה (איור 5C). התצפיות שלנו על סידור מחדש של תאים, וחלוקות תאי נבט שכנות המתרחשות במקביל לשלב זה של התפתחות, ביססו את הבנתנו את המנגנונים העומדים בבסיס דחיסת נישה17. פרוטוקול זה מעניק אפוא את היכולת לדמיין סידור מחדש של תאים, שינויי צורה, חלוקות ואירועים תאיים אחרים עם הרזולוציה הנדרשת לניתוח אירועים מורפוגנטיים בגונדות בשלב מאוחר.
איור 5: גונד מתורבת לשעבר שעובר דחיסת נישה. תמונות סטילס מסדרת הדמיה שנרכשו מיד לאחר ניתוח של גונדות מעוברי שלב 16 המוקדמים. (א–ג) תאי נבט (magenta) מסומנים על ידי nos-lifeact::tdtomato ותאי גונדל סומטיים (ירוק) מסומנים על ידי six4-eGFP::moesin. הגומחה (קו לבן מנוקד) מתוארת ב-A'–C'. סרגלי קנה מידה מראים 10 מיקרומטר. קדמי הוא משמאל, ואחורי הוא מימין. (A) בנקודת הזמן הראשונה (t = 0 דקות) בסדרת ההדמיה, תאי נישה סיימו להרכיב את עצמם בחזית הגונד ונמצאים בשלב מוקדם של דחיסה. (B) באמצע סדרת ההדמיה ותהליך הדחיסה (t = 1 h 48 דקות), הגומחה החלה להתעגל, אך הקצה שלה נשאר לא סדיר. (C) לקראת סוף סדרת ההדמיה (t = 4 שעות 21 דקות), לגומחה יש גבול חלק ומעוגל מאוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך הגונדוגנזה, הגונד העוברי, ובמיוחד גומחת תאי הגזע בתוך הגונדהזכרי 15, עוברים שינויים מורפולוגיים מהירים. מנגנונים התפתחותיים העומדים בבסיס השינויים הדינמיים הללו מובנים בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות הדמיה חיה. עם זאת, בשלב העוברי 17, הדמיית in vivo של הגונד הופכת לבלתי אפשרית על ידי הופעת התכווצויות שרירים בקנה מידה גדול17. עם פרוטוקול זה, אנו מספקים אלטרנטיבה מוצלחת: כריתה של הגונדות ישירות לצלחת הדמיה להדמיה חיה ex vivo . פרוטוקול זה מציג את השיטה היחידה הזמינה לביצוע הדמיה חיה של הגונד העוברי בשלב מאוחר.
השלבים הקריטיים של הפרוטוקול צריכים להתבצע תוך התמקדות חריפה במיומנות ובתזמון. לפני הנתיחה, הרכבה מהירה של עוברים היא בעלת חשיבות עליונה כדי להבטיח שהעוברים לא יתייבשו ויישארו בריאים וסוערים, מה שמקל על דה-ויטליניזציה ונתיחה. במהלך הנתיחה, חיוני להימנע משיבוש של המטריצה החוץ-תאית הגונדלית, אשר מושגת באמצעות מניפולציות עדינות ומדויקות בלבד. שימוש במיומנות כזו גם יבטיח שהגונאד יהיה במגע ישיר עם צלחת ההדמיה, ובכך יאפשר הדמיה ברורה ישירות דרך הכיסוי. לאחר הנתיחה, יש להחליף את הפתרון של רינגר למדיית הדמיה באמצעות יניקה עדינה וגירוש בלבד עם פיפטה כדי למנוע ניתוק גונד. לבסוף, חשוב להגביל את זמן הנתיחה הכולל ל -25 דקות. זה מבטיח כי כמות הזמן המושקע בתמיסה של רינגר במהלך הנתיחה, ומיקום הרקמה בקונפוקל, מוגבלים לחשיפה לא רעילה. עם תרגול מוגבר, מהירות הנתיחה תשתפר, והתאמה אישית של רצף הנתיחה תתרחש. מניסיוננו, ניתן להשיג דיסקציה מספקת לאחר כשבוע של תרגול קבוע, עם שליטה מלאה בניתוח שניתן להשיג תוך כחודש. כדי להקל על הלמידה, אנו ממליצים לתרגל שלבים בודדים לפני ביצוע הפרוטוקול כולו.
ישנן מספר שיטות עבודה מומלצות המשלימות את האתגרים הקשורים לפרוטוקול זה, החל מהגנוטיפ של העוברים המשמשים לניתוח. שילוב של עותקים מרובים של הטרנסג'ין המשמש לסימון הגונד יהפוך את הגונד לבהיר יותר, ולכן קל יותר לדמיין ולנתח אותו. הנתיחה עצמה פועלת בצורה הטובה ביותר עם מחט חדה, אם כי אין לחדד אותה יתר על המידה, שכן היא תתכופף כנגד תחתית צלחת ההדמיה ותהפוך לנטל ברקמה זרה. מדיית ההדמיה של שניידר מפליאה באופן אוטומטי בספקטרום הפליטה הירוקה, מה שמקשה על איתור גונדות המסומנות ב-GFP לאחר הוספת המדיה. לכן, חשוב מאוד להשתמש בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית כדי לסמן את מיקומם של הגונדות בזמן שהן עדיין נמצאות בפתרון של הרינגר. אם איתור הגונדות בקונפוקל עדיין קשה, לאחר הניתוח הבא אנו מציעים לשרטט או לצלם תמונה של המיקום היחסי של גונדות בצלחת בעודן במיקרוסקופ הנתיחה. לאחר מכן, סמן את החלק החיצוני של המנה כדי לציין את הכיוון שלה במהלך הנתיחה, והתאם כיוון זה בעת המעבר למיקרוסקופ הקונפוקלי. לאחר מיקום בקונפוקל, אם גונד נראה משובש או מעוות, בניתוח הבא נסו להשאיר רקמה דביקה יותר המקיפה את הגונד. להיפך, אם גונד נוכח אך נראה מטושטש בכל המישורים, סביר להניח שיש רקמה בין הכיסוי לגונד, ומנותקים עתידיים צריכים לשאוף לבידוד טוב יותר של הגונד מהרקמה הדבקה. מניסיוננו, אימוץ פרקטיקות אלה הקל על למידה וביצוע של פרוטוקול זה.
במהלך היווצרות פרוטוקול זה, זיהינו מספר שינויים שניתן ליישם. עבור מחקרי דחיסת נישה, אנו שואפים לנתח עוברים בשלב 16. בשלב זה, העובר עדיין לא פיתח כמויות משמעותיות של קוטיקולה, ונדבק בקלות לצלחת המצופה פולי-ליזין. עם זאת, ניתן לשנות טכניקה זו כדי לנתח עוברים מבוגרים יותר עם קוטיקולה על ידי הדבקתם לדופן הפנימית של האזור המצופה פולי-ליזין עבור החתך הראשון. ברגע שהרקמות הפנימיות נחשפות, פגר העובר יידבק לפולי-ליזין, והנתיחה יכולה להמשיך כרגיל. בנוסף להתאמות לגיל העובר, התאמנו בהצלחה את הטכניקה הזו כדי לנתח גנוטיפים מרובים באותה מנה. לדוגמה, ניתן להפריד בין מוטנטים הומוזיגוטיים לבין הטרוזיגוטים אחים על ידי שימוש בסמן קל להבחנה כגון deformed-YFP על כרומוזום האיזון. לאחר הדה-ויטליניזציה, יש להעביר את העוברים לשני צדי הכיסוי על סמך נוכחותו או היעדרו של הסמן. דיסקציה צריכה להתקדם כלפי מטה במנה כמתואר בפרוטוקול, תוך הקפדה יתרה על שמירה על הפרדה בין גנוטיפים שונים. כמו כן, פרוטוקול זה עשוי להשתנות לשימוש במדיום תרבית שאינו של שניידר, אם כי חקירה שטחית של שילדס וסאנג M3 Insect Media הניבה גונדות בלתי ניתנות להשגה (נתונים שלא הוצגו). בנוסף, פרוטוקול זה משתלב היטב עם מניפולציות פרמקולוגיות פשוט על ידי שילוב התרופה עם מדיית ההדמיה. במשך תקופה של 5 שעות של הדמיה, ייתכן שיהיה צורך בהוספה מחדש של תרופה כדי לשמור על ריכוז יעיל. לבסוף, למרות שפרוטוקול זה פותח מתוך כוונה לדמיין דחיסת נישה, תופעה ספציפית לגונדות גבריות, בתיאוריה פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם כדי לצלם בשידור חי את השחלה המתפתחת פשוט על ידי ניתוח והדמיה של גונדות חסרות נישה ו- msSGPs.
המגבלות הקשורות לטכניקה זו מתייחסות לאורך זמן התרבות, ולאופי האקס-ויוו של התרבות. כמו במקרה של תאי ביצת דרוזופילה בשלב הביניים30, גונדות בתרבית מתחילות למות לאחר כ-5 שעות של הדמיה חיה של ex vivo , עדות לאובדן שלמות הרקמות (גרעינים הופכים לפיקנוטיים וקרומי התאים מצטמקים). לפיכך, אם רוצים לחקור אירועים בשלב מאוחר יותר בגונד הזכרי, היה צורך לנתח גונדות מזחלים 1 או זחלים ישנים יותר על ידי ביצוע שינויים בפרוטוקול המוצג כאן, ואז לדמות אותם בתנאים דומים לאלה המוצגים כאן. עם זאת, איננו שוללים את האפשרות של הדמיה חיה ex vivo מעבר לחמש שעות אם יפותחו תנאי תרבית משופרים, אם כי ייתכן שיהיה גבול אם רמזים מכניים מתוך העובר נחוצים להתפתחות גונד. אולי החיסרון החמור ביותר של הטכניקה נובע מאופי האקס-ויוו הטבוע בה. כאשר הם מתרבתים ב-ex vivo, לתאים יכול להיות פוטנציאל לא טבעי שאינו מייצג את הביולוגיה של in vivo 31. בנוסף, לדקויות של סביבות תרבות, כולל תוכן מדיה ונוקשות מטריצה, יכולה להיות השפעה דרסטית על התנהגות התא32. מתוך מחשבה על רגישות זו, חיוני להבטיח שתנאי התרבות ישקפו במדויק את הביולוגיה של in vivo . נקטנו צעדים כדי להעיד על כך שהתפתחות ואיתות נישת in vivo הם recapitulated ex vivo17. בקצרה, הבנו כי גורל תאי נישה נשמר ומספר תאי הנישה אינו משתנה באמצעות הסמנים Fasciclin-III ו- E-cadherin. כמו כן, קיים איתות STAT ותאי גזע של חיידקים מתחלקים באופן אורתוגונלי, מה שמרמז על כך שפונקציית הנישה נשמרת. עם זאת, לא וידאנו שהביולוגיה הרלוונטית של in vivo נשארת שלמה ברקמות אחרות, שאינן נישה, בתוך הגונד. חקירות ex vivo עתידיות של רקמות אחרות אלה צריכות לכלול ניתוח מקיף כדי להבטיח שזה אכן המקרה.
כיוון עתידי שאפשר לקחת עם פרוטוקול זה יכלול שילוב של מחסום בתוך צלחת ההדמיה, כך שפגישת דיסקציה אחת עשויה להכיל גם קבוצת ביקורת וגם קבוצת טיפול תרופתי. שיפור זה יאפשר למזער את השגיאה בין שכפולים טכניים, ובכך לשפר את ההקפדה המדעית.
אין חלופות אמיתיות אחרות לפרוטוקול זה, שכן זוהי השיטה היחידה הזמינה לבחינת האירועים החיים של איבר זה במהלך התפתחות עוברית מאוחרת. ככזה, שאלות שלא היו ניתנות לפתרון בעבר על מורפוגנזה של גונד נגישות כעת עם התקדמות זו. שאלות אלה כוללות את המורכבויות של חלוקות תאים, שינויים ציטוסקטליים ואירועי אינטרקלציה של תאים השולטים על היווצרות נישה של תאי גזע וגונדוגנזה. אף אחד מהאירועים הללו אינו ניתן לזיהוי בתמונות הסטילס של תהליכים אלה שנרכשו באמצעות טכניקת תיקון וכתם. באופן כללי, שיטה זו פותחת את האפשרות לחקור את הדינמיקה ב-Drosophila gonad העוברי המאוחר, ולפריצת דרך כזו יש השלכות חזקות על התקדמותם של מספר עצום של תחומים ביולוגיים, כולל ביולוגיה של נישה של תאי גזע, ביולוגיה של פירנ"א ואורגנוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ללינדזי ו. פלשארט וג'סטין סוי על תרומתם המשמעותית לפיתוח המוקדם של פרוטוקול זה. המחברים מודים לקהילת הזבובים על נדיבותם עם ריאגנטים, ובמיוחד לרות להמן ובנג'מין לין על מתנתם בשורה מס'5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' לפני פרסומה. במחקר זה נעשה שימוש במניות שהתקבלו ממרכז המניות של בלומינגטון דרוזופילה (NIH P40OD018537). עבודה זו נתמכה על ידי NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 ו- R35GM136270 (S.D) וכן מענקי הכשרה T32GM007229 (B.W.) ו- F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
