Summary
여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.
Abstract
Drosophila melanogaster male embryonic gonad는 생식 세포 발달, piRNA 생물학 및 틈새 형성을 포함하되 이에 국한되지 않는 발달 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 유리한 모델입니다. 여기에서, 우리는 생체 내 라이브 이미징이 매우 비효율적 인 기간 동안 생식선 ex vivo 영상을 생중계하는 해부 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 배아를 이미징 접시로 옮기고, 적절하게 준비된 수컷 배아를 선택하고, 구조적 무결성을 유지하면서 주변 조직에서 생식선을 해부하는 방법을 설명합니다. 해부 후, 생식선은 공초점 현미경을 사용하여 이미징되어 동적 세포 과정을 시각화 할 수 있습니다. 해부 절차는 정확한 타이밍과 손재주가 필요하지만 일반적인 실수를 예방하는 방법과 이러한 문제를 극복하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리가 아는 한, 이것은 초파리 배아 생식선에 대한 첫 번째 해부 프로토콜이며, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 시간 동안 라이브 이미징을 허용합니다. 이 기술은 약리학적 또는 세포형 특이적 트랜스제닉 조작과 결합하여 그들의 자연적인 생식선 환경에서 세포 내 또는 세포 사이에서 발생하는 임의의 동적 과정을 연구할 수 있다.
Introduction
Drosophila melanogaster 고환은 많은 역동적 인 세포 과정에 대한 우리의 이해를위한 패러다임으로 사용되었습니다. 이 모델에 대한 연구는 줄기 세포 분열 조절 1,2,3, 생식 세포 발달4,5, piRNA 생물학 6,7,8 및 틈새 줄기 세포 신호 전달 사건9,10,11,12,13에 대해 밝혀 냈습니다. 이 모델은 유전적으로 견인성이 있고 14,15 이고 자연 환경3,16,17,18에서 줄기 세포를 생생하게 볼 수 있는 몇 안되는 곳 중 하나이기 때문에 유리하다. 그러나이 모델의 라이브 이미징은 성인 조직과 초기 배아 단계로 제한되어 틈새 시장이 처음 형성되고 기능하기 시작하는 정확한 단계 인 후기 배아의 생식선 역학에 대한 지식에 틈을 남겼습니다.
후기 단계의 배아 생식선은 구형으로, 전방의 체세포 틈새 세포와 더 많은 후부 영역에 걸쳐 체세포 생식선 세포에 의해 경화 된 생식 세포(19)로 구성됩니다. 이러한 장기는 초기 배아 단계 1717,20,21까지 생체내에서 생포상화될 수 있다. 추가 이미징은 대규모 근육 수축의 시작으로 인해 예방됩니다. 이러한 수축은 너무 심해서 이미징 프레임에서 생식선을 밀어 내며 이미징 소프트웨어로는 이러한 움직임을 수정할 수 없습니다. 우리 실험실은 라이브 이미징을위한이 애매한 기간 동안 발생하는 틈새 형성의 메커니즘을 공개하는 데 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 배아 단계 16에서 시작하는 생식선을 살아있는 이미지화하기 위한 생체외 접근법을 생성하여, 생식선 발달의 이 중요한 기간 동안 세포 역학에 대한 연구를 용이하게 하였다. 우리 실험실의 이전 연구는이 생체 외 영상이 생체 내 생식선 발달17을 충실하게 되풀이한다는 것을 보여줍니다. 이 기술은 초파리 배아 생식선에 대한 최초이자 유일한 종류입니다.
여기에서, 우리는 후기 배아 단계 동안 생식선의 생체외 생생 영상화에 필요한 해부 프로토콜을 제시한다. 이러한 프로토콜은 약리학적 치료, 또는 생식선 내 특정 세포 계보의 형질전환 조작과 조합될 수 있다. 이 기술을 사용하여, 우리는 줄기 세포 틈새 형성17의 단계를 성공적으로 이미지화했습니다. 따라서이 이미징 접근법은 자연 환경15,17 내에서 실시간으로 틈새 형성의 초기 단계를 시각화 할 수 있기 때문에 줄기 세포 생물학 분야에 도움이됩니다. 이 방법은 줄기 세포 생물학 분야에 유익하지만, 세포 재배열 22, 세포 부착2,12,23 및 세포 이동 23을 포함하여이 발달 시점 동안 생식선에서 발생하는 임의의 동적 과정을 시각화하는 데 추가로 적용 가능합니다. 따라서 이 해부 프로토콜은 많은 근본적인 세포 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것이다.
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Protocol
1. 전일 해부 준비
- 생성된 직경이 대략 0.03 mm가 되도록 텅스텐 바늘(24 )을 전해적으로 날카롭게 한다. 공급되는 전압을 약 14V로 조정하고 3.3M NaOH를 사용합니다. 선명하게하는 데는 1 ~ 2 분을 넘지 않아야합니다.
주의: NaOH는 부식성이 강하며 피부에 닿으면 화상을 입을 수 있습니다. 취급하는 동안 장갑과 고글을 착용하고 흄 후드 내부에서 작업하십시오.
참고: 사용 후 NaOH를 폴리프로필렌 팔콘 튜브에 보관하십시오. - 준비된 이미징 미디어를 만듭니다. 15mL 원뿔형 튜브에서 슈나이더 배지 4.25mL를 750μL의 태아 소 혈청(FBS, 최종 농도 15%)과 페니실린-스트렙토마이신 27.5μL(페니실린 0.05U/μL, 최종 농도 0.05μg/μL)와 결합합니다. 이렇게 제조된 이미징 배지를 4°C에서 보관한다.
- 헵탄 접착제 용액을 만드십시오. 약 0.5 mL 헵탄을 약 20 cm 양면 테이프로 채워진 20 mL 밀봉가능한 바이알에 첨가한다. 약 한 시간 동안 너트 테이터에 올려 놓거나 물과 글리세롤 사이의 일관성이 달성 될 때까지 피펫 팁으로 저어줍니다. 용해 된 접착제의이 용액은 헵탄이 증발하기 전에 며칠 동안 지속됩니다. 용액을 신선하게하려면 0.5 mL의 헵탄을 추가로 넣고 흔들어줍니다.
참고 : 효과적인 헵탄 접착제 용액은 테이프에 대한 헵탄의 다양한 비율뿐만 아니라 흔들림 / 교반의 다양한 기간을 사용하여 준비 할 수 있습니다. 위의 사양은 그러한 적절한 솔루션 중 하나를 준비하거나 신선하게하기위한 제안 일뿐입니다.
2. 배아 채취—해부 전 15~17시간
- 신선한 효모 페이스트를 사과 주스 한천 플레이트(25)에 첨가하십시오. 작은 구멍26으로 천공 된 빈 음식 병에 성인 파리 (10 일 미만)를 추가하여 배아 수집 케이지를 설정하십시오. 효모화된 한천 플레이트를 사용하여 수집 케이지를 캡핑하고, 병에 테이핑하고, 플레이트 측과 함께 케이지를 25°C 어두운 인큐베이터에서 1시간 동안 아래로 놓는다.
참고 : 파리는 생식선을 형광으로 표시하는 이식 유전자를 발현해야합니다 (예 : six4-eGFP : : Moesin20)는 배아의 해부가 입체 형광 현미경으로 발생하기 때문입니다. 생식선을 표시하는 데 사용되는 유전자형 목록은 자료 표를 참조하십시오. - 인큐베이터에서 케이지를 제거하고 첫 번째 컬렉션을 버리십시오. 갓 효모 한천 접시로 교체하고 케이지를 2 시간 동안 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
참고 : 첫 번째 배아 수집은 수정 된 배아의 암컷을 지우고 배아를 발달시키는 데 사용되어 단단히 정해진 두 번째 배아 수집을 달성합니다. - 케이지에서 한천 플레이트를 꺼내 밀봉 가능한 플라스틱 용기 내부의 촉촉한 종이 타월에 효모가 묻은 쪽을 위쪽으로 향하게하십시오. 이 습한 챔버를 25 °C 인큐베이터에 두어 배아를 14.5 시간 동안 숙성시킵니다 (최종 나이, 알을 낳은 후 14.5-16.5 시간).
참고: 2.4단계를 시작하기 직전에 3.1단계와 3.2단계를 완료하십시오. - 인큐베이터에서 한천 플레이트를 제거하고 분출 병을 사용하여 한천 플레이트에 충분한 물을 첨가하여 페인트 브러시로 가볍게 양치하여 효모 페이스트를 용해시킵니다. 배아를 헹구고 효모를 계량 보트 안에 앉아있는 작은 메쉬 스크린 바구니에 녹입니다. 대부분의 효모 페이스트가 메쉬를 통해 여과 될 때까지 물 분출 병으로 바구니를 헹구십시오.
- 계량 보트에서 물을 제거하고 바구니를 다시 안에 넣으십시오. 배아를 50 % 표백제 용액에 담그고 분출 병을 사용하여 배아를 Dechorionate하십시오. 표백제 용액의 깊이는 3-5mm이어야합니다. 배아를 표백제에 잠기고 ~ 2 분 동안 가끔 소용돌이치게하십시오.
주의: 표백제는 부식성이 있으며 눈과 호흡기를 자극하거나 손상시킬 수 있습니다. 표백제를 다루는 동안 장갑과 고글을 착용하십시오.
참고: 이 시간 동안 3.3단계를 가능한 한 많이 완료하십시오. 데코리오네이션 진행은 바스켓을 스테레오 현미경 아래에 놓고 등쪽 부속기가 없는지 확인하여 확인할 수 있습니다. 필요한 경우 배아를 표백제 용액에 추가 시간 동안 잠급니다. - 표백제를 버리고 바구니 안의 배아를 분출 병의 물로 철저히 헹구십시오 (~ 3 초 동안 메쉬 바구니를 종이 타월로 얼룩지게하고 2-3 번 반복하십시오).
3. 해부 당일 준비
- 30 μL 인슐린 (10 mg/mL)을 1.5 mL 에펜도르프 튜브 (0.2 mg/mL 최종 농도)에서 준비된 이미징 배지 (단계 1.2 참조)에 첨가하십시오. 잘 섞어서 튜브를 벤치 탑에 두어 실온과 평형을 유지하십시오.
- 접착제로 코팅 된 커버 슬립 스트립을 준비하십시오.
- 다이아몬드 팁이 달린 나이프를 사용하여 22mm x 22mm 커버슬립을 동일한 크기의 네 개의 스트립으로 자릅니다(그림 1A).
- 포셉을 사용하여 스트립 하나를 집어 들고 총 약 30μL의 헵탄 접착제 용액을 스트립의 양쪽에 퍼뜨립니다(그림 1B). 접착제 잔류 물의 균일 한 층을 얻으려면 헵탄이 증발하는 동안 스트립을 다양한 각도로 기울이십시오.
- 접착제로 덮인 스트립을 커버 슬립 박스의 빈 슬롯에 보관하십시오. 끈적임을 유지하려면 스트립을 기울어지지만 똑바로 세운 위치에 놓고 상자 가장자리에 기대어 상자 표면과의 접촉을 최소화합니다(그림 1C). 공기 중의 미립자가 접착제를 코팅하지 않고 끈적 거림을 줄이도록 상자를 닫으십시오.
- 벤치 탑에 다음 품목을 놓습니다 : 6 인치 유리 파스퇴르 피펫, 현미경 슬라이드, 적절한 피펫 팁이있는 P200 및 P1000 피펫만, 링거 용액27 (NaOH로 pH가 7.3으로 조정됨) 및 밝혀지지 않은 Poly-D-Lysine 코팅 35mm 이미징 디쉬.
- 메쉬 스크린 바구니에서 배아를 500-750 μL 헵탄으로 채워진 작은 시계 유리로 옮깁니다.
- 바구니의 측면과 바닥을 블롯하여 티슈 닦아내기로 말립니다. 헵탄에 페인트 브러시를 적시고 페인트 브러시를 배아에 닿은 다음 (소수성 비텔린 막은 강모에 달라 붙어야합니다), 페인트 브러시를 시계 유리의 헵탄에 다시 담그십시오 (배아는 바닥에 가라 앉아야합니다).
참고 : 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행해야합니다. 배아는 20 초 이상 공기에 노출되어서는 안됩니다.
- 바구니의 측면과 바닥을 블롯하여 티슈 닦아내기로 말립니다. 헵탄에 페인트 브러시를 적시고 페인트 브러시를 배아에 닿은 다음 (소수성 비텔린 막은 강모에 달라 붙어야합니다), 페인트 브러시를 시계 유리의 헵탄에 다시 담그십시오 (배아는 바닥에 가라 앉아야합니다).
- 배아를 파스퇴르 피펫을 사용하여 현미경 슬라이드 상으로 옮깁니다(그림 1D). 배아를 피펫에 천천히 넣고 피펫의 좁은 부분으로 제한하십시오. 피펫 배아를 슬라이드에 천천히 올려 놓으면 슬라이드로 흘러 들어가기 전에 피펫 끝 바로 안쪽에 응집됩니다. 조직의 모서리를 닦아내고 미세한 팁으로 닦아내고 슬라이드의 배아에서 헵탄을 떼어냅니다. 그들은 더 작은 영역을 집계하고 덮을 것이므로 다음 단계에서 접착제로 덮인 스트립에서 쉽게 캡처 할 수 있습니다.
- 포셉으로 접착제로 덮인 스트립을 집어 들고 배아에 부드럽게 만집니다 (그림 1E). 스트립을 이미징 접시, 배아 사이드 업 및 Poly-D-Lysine 코팅 센터 바로 바깥에 놓습니다. 포셉을 사용하여 접시에 스트립을 눌러 제자리에 고정되도록하십시오. 즉시 접시에 2-3.5 mL 링거의 용액을 넘치게하십시오. 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 배아를 먼저 잠수시킵니다 (그림 1F).
4. 해부
참고: 이러한 단계는 스테레오 형광 현미경으로 수행해야 합니다.
- 10-15 개의 배아를 일탈시킵니다.
참고 : 이것은 초보자를위한 두 개의 배아에서 전문가를위한 열 다섯 개의 배아에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.- 장 형태학에 따라 16단계 배아를 선택합니다(그림 2). 이 단계에서 배아는 네 개의 누적 된 장 세그먼트를 만드는 세 가지 장 수축을 가지고 있습니다 (그림 2 B, B'). devitellinization을 시작하려면, 텅스텐 바늘로 한쪽 끝, 바람직하게는 앞쪽에 선택된 배아를 관통하십시오. 배아는 비텔린 막에서 튀어 나올 수 있지만, 그렇지 않은 경우 배아에서 막을 벗겨냅니다.
참고: 해부하기에는 너무 어린 배아는 비지역화된 내장을 가지고 있습니다(그림 2C). 17 단계 배아의 해부는이 단계에서 큐티클이 발달하기 시작하기 때문에 16 단계 배아의 해부보다 더 어렵습니다. 초기 단계 17 배아는 서로 상대적으로 이동되는 네 개의 장 세그먼트와 함께 존재합니다 (그림 2 D, D'). - 생식선에서 멀리 떨어진 지역의 배아를 통해 바늘을 걸으십시오. 후크 된 배아를 접시의 폴리 라이신 코팅 영역 (여기서부터 단순히 "커버 슬립"이라고 함)으로 옮기고 부착 될 때까지 바닥에 드래그하십시오. 이 단계를 반복하고, 폴리라이신 코팅 커버 슬립(그림 3A)의 상단을 따라 파괴된 배아를 연속적으로 배열하고, 추가 해부를 위해 아래에 충분한 공간을 남겨 둡니다.
참고 : 생식선은 사용 된 특정 마커와 전이유전자 사본 수에 따라 밝게 형광을 띄어야하는 세포의 작은 구형 응집체로 나타납니다. 이 단계에서 생식선은 A5 세그먼트에 측면으로 위치하며 앞쪽에서 배아 길이의 약 70 % -80 %에 위치합니다. 해부 프로토콜 전반에 걸쳐, 조직은 바늘에 달라 붙을 수 있습니다. 파편의 바늘을 제거하려면 링거 용액의 표면 바로 위에 올려 놓습니다. Devitellinization은 적절한 생식선이 가능한 한 적게 방해받는 한 깔끔하지 않을 수 있습니다.
- 장 형태학에 따라 16단계 배아를 선택합니다(그림 2). 이 단계에서 배아는 네 개의 누적 된 장 세그먼트를 만드는 세 가지 장 수축을 가지고 있습니다 (그림 2 B, B'). devitellinization을 시작하려면, 텅스텐 바늘로 한쪽 끝, 바람직하게는 앞쪽에 선택된 배아를 관통하십시오. 배아는 비텔린 막에서 튀어 나올 수 있지만, 그렇지 않은 경우 배아에서 막을 벗겨냅니다.
- 생식선을 배아에서 꺼내 접시 위에 올려 놓습니다 (그림 3C, D).
- 먼저, 배아를 파일럿하여 그 내부를 노출시킨다(도 3C). 배아를 중심에서 슬라이스하여 바늘을 후방으로, 생식선 사이로 움직입니다. 외부 큐티클보다 접시에 훨씬 잘 달라 붙을 것이므로 내부 조직을 놀리십시오. 조직의 끈적 거림은 다음 조작이 생식선을 드러내고 커버 슬립에 부착 할 수있게합니다.
참고 : 조직이 접시에 달라 붙지 않으면 코팅 된 커버 슬립의 오염되지 않은 영역에 동축하십시오. 커버 슬립의 외부 영역은 특히 끈적 끈적합니다. 단계 4.1.2에서 언급했듯이, 해부 조작이 생식선이 상처가없는 한 맹글링 된 배아 시체를 초래하는지 여부는 중요하지 않습니다. - 바늘을 사용하여 생식선을 포함한 조직 조각이 나머지 시체에서 분리 될 때까지 생식선 주위를 슬라이스하십시오. 바늘로이 조직을 코팅 된 커버 슬립의 신선한 부위에 당기고 접시에 부착 될 때까지 바닥에 대고 동축하십시오.
참고 : 생식선 자체가 덮여있는 조직을 통한 간접적 인 부착보다는 덮개 슬립에 직접 부착되는 경우에 가장 적합한 이미징이 달성됩니다. 따라서 조직이 시체에서 멀어지면서 생식선이 외부 조직보다는 덮개 슬립을 먼저 만지도록 시도하십시오. - 바늘로 생식선으로부터 부착 조직을 부드럽게 드래그하여 가능한 한 많은 주변 조직을 생식선으로부터 제거한다(그림 3D). 생식선을 직접 만져서 손상되지 않도록 하십시오(그림 4E). 생식선이 접시에 충분히 부착되도록 하려면 바늘을 생식선 주위의 부드러운 원형 운동으로 움직입니다 - 움직이면 바늘을 나머지 부착 조직에 대고 고나드를 끈적 끈적한 덮개 슬립의 신선한 영역으로 향하게하십시오. 생식선의 감지 가능한 움직임이 없을 때까지이 과정을 반복하십시오.
- 배아 시체로 돌아가서 두 번째 생식선을 해부하십시오. 가능한 한 많은 배아에서이 과정을 반복하지만 25 분을 초과하지 마십시오. 조직 생존력은 ~ 40-45 분 이상 후에 링거의 솔루션에서 손상 될 것입니다.
- 먼저, 배아를 파일럿하여 그 내부를 노출시킨다(도 3C). 배아를 중심에서 슬라이스하여 바늘을 후방으로, 생식선 사이로 움직입니다. 외부 큐티클보다 접시에 훨씬 잘 달라 붙을 것이므로 내부 조직을 놀리십시오. 조직의 끈적 거림은 다음 조작이 생식선을 드러내고 커버 슬립에 부착 할 수있게합니다.
- 해부가 완료되면 지울 수없는 마커를 사용하여 이미징 접시의 바깥 쪽 테두리에 등록 마크를 추가하여 해부 중 방향을 기록하십시오.
- 접시에서 접착제로 코팅 된 스트립을 제거하십시오.
- 스트립 아래에 포셉 한 쌍의 바닥 단자를 부드럽게 삽입하고 걸쇠를 천천히 위쪽으로 기울여 링거 용액의 슬로싱을 최대한 줄이면서 접시에서 꺼내어 부착 된 생식선의 방해를 최소화하십시오.
참고 : 스트립은 해부 된 생식선에서 멀리 기울여야합니다.
- 스트립 아래에 포셉 한 쌍의 바닥 단자를 부드럽게 삽입하고 걸쇠를 천천히 위쪽으로 기울여 링거 용액의 슬로싱을 최대한 줄이면서 접시에서 꺼내어 부착 된 생식선의 방해를 최소화하십시오.
- 링거 용액의 슬로싱을 피하는 방식으로 접시를 이미징 현미경으로 부드럽게 운반하십시오.
5. 이미징
- 이미징 접시를 무대 홀더에 놓고 등록 마크를 사용하여 접시를 해부 중과 같이 대략적인 방향으로 놓습니다. 밝은 필드 현미경과 저전력 (~ 10x) 목표를 사용하여 커버 슬립에 부착 된 조직 조각을 식별하고 초점을 맞 춥니 다. 아이피스 설정을 전환하여 형광을 드러내고, 쌍안경 접안 렌즈를 사용하여 접시를 체계적으로 스캔하여 이미징 소프트웨어 내에서 각 생식선의 위치를 표시합니다( 자료 표 참조).
참고: 위치를 표시하기 전에 생식선이 시야각에 집중되어 있는지 확인하십시오. - 이미징 접시를 홀더에 넣고 전체 스테이지 홀더 어셈블리를 조심스럽게 분리하고 어셈블리를 작업대에 놓습니다.
- 링거의 용액을 인슐린을 함유한 준비된 이미징 배지로 교체하십시오 (단계 1.2 및 3.1 참조).
- P1000을 사용하여 이미징 접시의 내부 상단 선반에서 모든 링거 용액을 제거합니다(중앙 커버 슬립 영역에서 링거를 피펫하지 마십시오). 그런 다음 P200으로 전환하고 팁을 중앙 영역의 나머지 링거 표면 바로 아래에 놓습니다. 조심스럽게 링거 50-100 μL를 제거하십시오. 전체 솔루션을 제거하지 마십시오.
- ~200μL의 이미징 미디어를 뽑아서 P200 팁을 나머지 링거의 표면 바로 아래에 다시 놓고 천천히 이 이미징 미디어를 추가합니다. 다음으로, 나머지 이미징 매체 (~ 1,300 μL)를 상단 선반의 최외곽 테두리에서 시작하여 접시에 추가하십시오. 피펫팅하는 동안 유체의 중앙 돔쪽으로 이동하고 결국 두 가지를 가로 질러 피펫 팁을 브러시하여 두 가지를 병합합니다. 뚜껑을 접시에 올려 놓습니다.
참고: 이미징 미디어는 증발을 방지하기 위해 접시의 전체 내부 직경(약 2mm 깊이)을 덮어야 합니다(그림 4D).
- 현미경을 더 높은 동력 목표 (63x, 1.2 NA)로 전환하고 사용 된 목표 (목표에 필요한 침지 유체 유형 및 굴절률)에 따라 적절한 침지 유체를 적용한 다음 스테이지 홀더 어셈블리를 교체하십시오. 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미징 접시의 바닥에 부착 된 조직에 초점을 맞 춥니 다.
참고 : 무대가 움직이지 않았다면, 목표가 집중되면 마지막 생식선이 보입니다. - 표시된 각 생식선 위치를 단계별로 실행하고 필요에 따라 해당 위치를 조정하십시오. 이미지 선명도, 생식선 섹스 등을 기반으로 이미지 할 생식선을 선택하십시오. 이미징 설정(다중 채널, 노출 시간, 레이저 강도, Z 시리즈 증분, 적절한 간격의 타임랩스 등)을 사용자 지정합니다. 이미징을 시작합니다.
참고 : 남성 생식선은 틈새 시장과 생식선의 반대쪽 끝, 남성 특이적 체세포 생식선 전구체 (msSGPs)라고 불리는 작고 매우 원형의 체세포 클러스터의 존재로 식별 할 수 있습니다. six4-eGFP::moesin 형광 마커가 사용되는 경우, 틈새 세포는 생식선에서 두 번째로 밝은 세포이며, 가장 밝은 것은 msSGP입니다. 이 단계에서 여성 생식선에는 틈새 시장이나 msSGP가 없습니다.
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Representative Results
우리는 "해부 준비의 날"에 설명 된 바와 같이 그림 1의 이미징 접시의 준비를 보여줍니다. 이러한 방법은 궁극적으로 덮개 슬립 스트립에 잘 수화 된 배아를 발생시켜야하며, 이는 일시적으로 접시의 바닥에 고정되고 링거 용액에 잠겨 있습니다 (그림 1F). 다이아몬드 팁 나이프를 사용하면 22mm x 22mm 커버 슬립을 서너 개의 작은 스트립으로 깨끗하게 슬라이스할 수 있습니다(그림 1A). 이러한 스트립을 포셉으로 처리하는 동안 피펫을 사용하여 이러한 스트립을 코팅하기에 충분한 헵탄 접착제를 전달하여 접착제와 질감이 있는 표면을 제공합니다(그림 1B). 코팅된 스트립은 빈 커버 슬립 박스에 쉽게 보관하여 접착제 표면을 최대 2시간 동안 깨끗하게 유지합니다(그림 1C). 이러한 코팅 스트립이 만들어지면 목표는 배아를 스트립의 긴 가장자리 근처의 집합체로 스트립에 부착시키는 것입니다 (그림 1E). 먼저 시계 유리에서 깨끗한 유리 슬라이드로 배아 몇 개를 옮기고 말려야합니다 (그림 1D). 그런 다음 포셉을 사용하여 코팅 된 스트립을 배아에 부드럽게 만져서 배아가 부착되도록하십시오 (그림 1E). 그런 다음 즉시 스트립을 해부 접시의 바닥으로 눌러 배아가 위를 향하게하고 배아를 링거의 용액으로 덮습니다 (그림 1F). 이 목표가 충족되면 전통적인 밝은 장 입체 현미경으로 배아를 보면 비텔린 멤브레인 내에서 완전히 수화되고 건강한 배아가 나타납니다 (그림 1G). 대신, 이러한 배아를 스트립으로 옮기고 용액으로 덮는 과정이 약 30 초 이상 걸리면 배아가 탈수되어 이완됩니다 (그림 1G'). Flaccid 배아는 건강하지 않으며 해부하기가 엄청나게 어렵 기 때문에이 과정에서 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다.
그림 1: 해부 전에 배아를 장착하고 수분을 공급합니다. (A–F) 접착제 코팅 커버슬립 스트립에 배아를 부착하고, 스트립을 이미징 접시에 고정시키는 단계. (A) 커버슬립은 다이아몬드 팁이 달린 나이프(화살촉으로 표시된 칼)로 한 번 득점하여 스트립을 만듭니다. (B) 한 쌍의 포셉으로 유지되는 절단된 커버슬립 스트립에 헵탄 접착제를 도포한다. (C) 커버슬립 박스에서 건조되는 네 개의 접착제 코팅 스트립. (D-E) 화살표는 배아를 가리 킵니다. (D) 헵탄에서 수집되어 현미경 슬라이드의 가장자리로 배출 된 데코리온화 된 배아. 과도한 헵탄을 킴와이프로 제거하였다. (E) 배아가 부착 된 접착제 코팅 스트립. (F) 해부 직전의 접시의 최종 설정. 링거 용액의 얕은 층 (화살촉)과 내부 해부 원 위의 스트립 (화살표)의 배치에 유의하십시오. (G-G') 배아는 접시의 스트립에 부착되었습니다. (G) 적절하게 수화된, turgid 배아. (G') 장기간의 공기 노출로 인해 탈수 된 배아, 붕괴 된 vitelline 막에 의해 분명합니다. 별표는 이완성 배아를 나타냅니다. 배율 막대는 0.5mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
입체 형광 현미경으로 배아를 보는 것은 GFP 채널에서 자동 형광을 띠는 내장을 명확하게 시각화 할 수 있습니다. 장 형태학은 해부 할 배아를 선택할 때 배아 연령의 대리 역할을합니다. 커버 슬립 스트립에 부착 된 배아는 나이에 따라 약간 다르기 때문에 다양한 장내 형태를 나타냅니다 (그림 2A). 살아있는 이미지 생식선 틈새 형태 형성을 위해, 우리는 초기 단계 16 배아를 해부합니다. 이 배아는 짝수 행으로 쌓여있는 네 개의 지역화 된 장 절편을 나타냅니다 (그림 2B', 점선). 더 어린 배아는 주머니와 같은, 비지역화된 내장을 존재하며(도 2C), 그들의 생식선 주위에 아직 충분한 세포외 매트릭스(ECM)를 갖지 못하여 무손상 장기의 효율적인 배양을 허용한다. 이미 틈새 다짐이 시작된 오래된 배아는 균등하게 쌓이지 않고 대신 서로 상대적으로 이동되는 네 개의 장 영역을 나타냅니다 (그림 2D', 점선). 이 배아는 더 두꺼운 큐티클을 가지고있어 해부 과정이 더 어려워집니다.
그림 2 : 생식선 해부를 위해 적절하게 노화 된 배아 선택. 배아는 해부 전에 접착제로 코팅 된 커버 슬립에 부착되었습니다. 배아는 six4-eGFP::moesin (녹색)을 발현하며, 이는 생식선과 지방 신체 세포를 표시합니다. 장내 자동 형광체는 녹색으로 나타납니다. 화살표는 각 패널에서 볼 수있는 남성 생식선 (밝게 형광을 띠는 msSGP의 존재로 식별됨)을 나타냅니다. 스케일 바는 0.25 mm를 나타냅니다. (A) 다양한 단계의 배아. (B–D) 이미지의 중앙에있는 뚜렷한 단계의 배아, 왼쪽과 등쪽 위로 앞쪽으로 향하게합니다. (B) 해부를 위해 적절하게 숙성되는 초기 단계 16 배아. (B') 네 개의 누적된 장 영역은 점선으로 표시된 흰색 선으로 표시됩니다. (C) 해부하기에는 너무 어린 15 단계 배아 (낮은 배아). 생식선 바로 앞쪽에 있는 형광 장낭에는 아직 분리된 영역이 없다는 점에 유의하십시오. (D) 큐티클 발달로 인해 해부하기 어려운 16기 후반 배아. 네 개의 장 영역은 장 반복에 대비하여 서로 상대적으로 회전하기 시작했습니다. (D') 네 개의 내장 영역이 윤곽이 그려져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생식선에서 지울 수없는 형광 마커를 발현하는 배아를 해부하는 것이 중요하며,이 마커는 입체 형광 현미경으로 볼 수 있어야합니다. 여기에서는 해부 중 시각화를 위해 gonad (그림 2 및 그림 3, 화살표)를 표시하기 위해 six4-eGFP::moesin20을 사용하기로 결정했습니다.
우리는 그림 3에서 생식선 해부 과정을 설명합니다. 폴리라이신이 코팅된 접시에서 적절하게 단계화된 배아를 해부하면 이들 배아로부터 생식선을 깨끗하게 분리할 수 있습니다(그림 3D). 파괴 된 배아는 접시에 부착 될 것이며, 해부 전에 편리한 행으로 배열 될 수 있습니다 (그림 3A). 배아 탈각화 및 폴리라이신으로의 전달은 조직이 배아 신체의 경계로부터 압출될 수 있도록 부정확한 과정이다(배아 1과 배아 2 사이의 조직 조각 참조, 및 맹글링된 배아 4; 도 3A). 이 부정확성은 생식선이 상처가없는 한 중요하지 않습니다. 표준 입체 형광 현미경은 파괴된 배아 몸체 내의 생식선의 식별을 가능하게 한다(도 3B, 화살표). 날카로운 해부 바늘을 사용한 처음 몇 번의 조작은 배아 시체에서 생식선을 분리해야하지만 일부 자동 형광 조직은 부착 된 상태로 유지됩니다 (그림 3C). 추가 조작으로 인해 코팅 된 접시에 직접 부착되는 고립 된 생식선이 생성됩니다 (그림 3D).
그림 3: 해부 과정. (A–D) 해부 프로토콜의 순차적 단계에서 six4-eGFP::moesin (녹색)을 발현하는 배아. (A) 접시의 폴리라이신 코팅 해부 영역으로 옮겨진 네 개의 탈색된 배아. 배아가 접시에서 연속적인 하향 해부를 용이하게하기 위해 깔끔한 행에 어떻게 정렬되어 있는지 주목하십시오. 배아 1과 2 사이의 작은 조직 조각은 배아 2의 내장의 일부이며, 손 변형 중에 압출됩니다. (B) 별표로 표시된 (A)로부터의 배아의 더 높은 배율도. (C) 중간선 아래로 필렛된 배아의 나머지 시체. 화살촉은 여전히 배아 조직에 심하게 묻혀있는 폐색 된 생식선을 나타냅니다. (D) 완전히 해부된 생식선. 최소한의 외래 조직 (화살촉) 만 생식선 근처에 남아 있습니다. 화살표는 남성 생식선을 가리 킵니다. 배율 막대는 0.25mm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생식선이 해부되면 링거의 솔루션을 이미징 미디어로 대체 할 수 있으며 해부에 사용 된 것과 동일한 접시에서 직접 생식선을 이미지화 할 수 있습니다. 우리는 회전하는 디스크 공초점 현미경을 사용합니다. 공초점 현미경에서 격리된 생식선의 브라이트필드 시각화는 고나드 주변을 둘러싸고 있는 어두운 그림자(그림 4A-B, 화살표)를 보여 주며, 이는 이미징 중에 생식선의 무결성을 유지하는 ECM입니다. 우리는 체세포 성선 세포20에서 GFP 표지 된 F-actin을 발현하는 건강하고 잘 배양 된 생식선과 모든 핵28을 시각화하는 RFP 표지 히스톤 마커의 예를 제시합니다 (그림 4C-C'). 이 배아의 모든 세포는 RFP 히스톤 마커를 발현하기 때문에, 생식선 세포 및 다른 부착 조직의 세포는 적색 방출을 보면서 관찰된다. 우리는 생식선 특이적 GFP 마커를 사용하여 생식선의 경계를 식별합니다 (그림 4C', 개요). 생식선 경계가 매끄럽고 둥글기 때문에(그림 4 C', 개요), 생식선 세포가 핵 전체에 걸쳐 RFP 히스톤 형광의 균일한 수준을 갖기 때문에 이러한 배양된 생식선이 건강하다는 것이 명백하다(도 4C', 화살표). 대신, 영상화 중에 생식선이 충분히 수화되지 않으면, 핵 및 six4-eGFP::moesin 형광은 생식선 조직이 파편화됨에 따라 펑크가 될 수 있습니다 (그림 4D, 화살표). 또한, 해부 중에 생식선 ECM이 과도하게 손상되면, 생식선 경계가 손상되며, 이는 생식선의 경계 밖에 있는 생식선 특이적 세포(도 4E, 별표)의 존재에 의해 명백하다(도 4E, 화살표).
그림 4: 라이브 이미징 중 건강한 생식선 찾기 (A) 커버슬립에 부착된 두 개의 해부된 생식선의 낮은 배율 및 (B) 높은 배율의 밝은 필드 뷰. (C-C') 건강한 생식선에서 틈새 다짐의 생체 외 영상에서 하나의 영화 프레임. 체세포 생식선 세포는 six4-eGFP::moesin (녹색)을 발현하고, 모든 세포는 His2Av-mRFP (적색)를 발현한다. (C') 흰색 점선으로 표시된 고나드 경계. 생식선 경계 밖에서 보이는 His2Av-mRFP는 해부된 생식선에 여전히 부착되어 있는 지방체일 가능성이 높다. 화살표는 균일 한 His2Av-mRFP 신호를 가진 생식 세포 핵을 가리키며, 이는 생식선이 건강하다는 것을 나타냅니다. (D-E) 생체외 해부 프로토콜의 대표적인 음성 결과. (d) 매체 증발로 인해 생식선이 탈수된 이미징 세션으로부터의 프레임. His2Av-mRFP가 응축 (화살표)하고 생식선 경계를 따라 six4-eGFP ::moesin의 불연속 반점과 같은 pyknotic 핵에 유의하십시오. (e) 해부 동안 세포외 매트릭스가 손상되는 생체외 영상화 프레임. 일부 생식 세포 (별표)는 생식선 경계 (화살표)를 빠져 나옵니다. 생식 세포는 nos-lifeact::tdtomato (자홍색)와 six4-eGFP : : moesin (녹색)이있는 체세포 생식선 세포로 분류됩니다. 스케일 바는 20 μm를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생식선은 이러한 생체외 영상화 방법을 사용하여 약 5시간 동안 배양될 수 있으며, 후기 배아 생식선 발달에서 발생하는 동적 형태형성 사건의 이미지 획득을 가능하게 한다. 우리 실험실에서, 우리는이 프로토콜을 성공적으로 사용하여 형성 줄기 세포 틈새 시장17의 압축을 이미지화했습니다 (그림 5). 압축하기 전에, 틈새 시장은 생식선 전방 (그림 5A, 녹색)에서 체세포의 느슨한 응집체이며, nos-lifeact::tdtomato29 (재료 표 참조)로 표지 된 생식선 세포로 둘러싸여 있으며, 그 첫 번째 계층은 생식계열 줄기 세포 (그림 5A, 마젠타)입니다. 이 틈새 시장 집계는 처음에는 불규칙한 경계를 나타냅니다 (그림 5A', 점선). 이미징 과정에서 우리는 틈새 시장이 더 부드러운 경계를 획득하는 동안 개별 틈새 세포가 위치를 재배치하는 것을 관찰합니다. 이러한 세포 재배열은 또한 틈새 영역의 감소를 초래한다 (그림 5C). 세포 재배열 및 이 발달 단계와 동시에 발생하는 이웃 생식 세포 분열에 대한 우리의 관찰은 틈새 다짐17의 기초가되는 메커니즘에 대한 우리의 이해를 알렸다. 따라서 이 프로토콜은 후기 단계 생식선에서 형태형성 사건을 분석하는 데 필요한 해상도로 세포 재배열, 형태 변화, 분열 및 기타 세포 사건을 시각화할 수 있는 능력을 제공한다.
그림 5 : 틈새 압축을 겪고있는 생체외 배양 생식선. 이미징 시리즈의 스틸은 초기 16 단계 배아에서 생식선 해부 직후에 획득했습니다. (A–C) 생식 세포 (마젠타)는 nos-lifeact::tdtomato 및 체세포 생식선 세포 (녹색)에 의해 표지됩니다 six4-eGFP ::moesin. 틈새 시장 (점선 흰색 선)은 A'-C'에 요약되어 있습니다. 스케일 바는 10 μm를 보여줍니다. 앞쪽은 왼쪽에, 후방은 오른쪽에 있습니다. (A) 이미징 시리즈의 첫 번째 시점 (t = 0 분)에서 틈새 세포는 생식선 앞쪽에서 조립을 마쳤으며 압축의 초기 단계에 있습니다. (B) 이미징 시리즈와 압축 과정 (t = 1 h 48 분)을 통과하는 중간에 틈새 시장이 순환하기 시작했지만 가장자리는 불규칙하게 유지됩니다. (C) 이미징 시리즈 (t = 4 h 21 분)의 끝 근처에, 틈새 시장은 매우 매끄럽고 원형 경계를 가지고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생식선 형성 동안, 배아 생식선, 특히 남성 생식선(15) 내의 줄기 세포 틈새는 급속한 형태 학적 변화를 겪습니다. 이러한 역동적 인 변화의 기초가되는 발달 메커니즘은 라이브 이미징 기술을 통해 가장 잘 이해됩니다. 그러나, 배아 단계 17에서, 생식선의 생체내 영상화는 대규모 근육 수축(17)의 시작에 의해 불가능하게 된다. 이 프로토콜을 통해 우리는 성공적인 대안을 제공합니다 : 생식선을 생체 외 라이브 이미징을위한 이미징 접시에 직접 해부합니다. 이 프로토콜은 후기 단계 배아 생식선의 라이브 이미징을 달성하는 데 사용할 수있는 유일한 방법을 제시합니다.
프로토콜의 중요한 단계는 손재주와 타이밍에 중점을두고 실행되어야합니다. 해부 전에, 배아의 신속한 부착은 배아가 탈수되지 않고 건강하고 turgid를 유지하도록하는 것이 가장 중요하며, 이는 탈종 및 해부를 용이하게합니다. 해부 중에는 섬세하고 정확한 조작만으로 수행되는 생식선 세포 외 매트릭스의 붕괴를 피하는 것이 중요합니다. 이러한 손재주를 사용하면 생식선이 이미징 접시와 직접 접촉하여 커버 슬립을 통해 직접 명확한 이미징이 가능합니다. 해부 후, 링거의 용액은 생식선 이탈을 방지하기 위해 피펫으로 부드러운 흡입 및 배출만을 사용하여 이미징 매체로 전환해야합니다. 마지막으로, 전체 해부 시간을 25 분으로 제한하는 것이 중요합니다. 이것은 해부 동안 링거의 용액에 소요되는 시간과 공초점에서 조직의 위치가 무독성 노출로 제한되도록합니다. 연습이 증가하면 해부 속도가 향상되고 해부 순서의 개인화가 이루어질 것입니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 약 1 주일의 정규 연습 후에 충분한 해부를 달성 할 수 있으며, 약 1 개월 안에 해부의 완전한 숙달이 가능합니다. 학습을 쉽게하려면 전체 프로토콜을 실행하기 전에 개별 단계를 연습하는 것이 좋습니다.
해부에 사용되는 배아의 유전자형부터 시작하여이 프로토콜과 관련된 문제를 개선하는 여러 가지 모범 사례가 있습니다. 생식선을 표시하는 데 사용되는 이식 유전자의 여러 사본을 통합하면 생식선이 더 밝아지므로 시각화하고 해부하기가 더 쉬워집니다. 해부 자체는 날카로운 바늘로 가장 잘 작동하지만, 이미징 접시의 바닥에 구부러지고 외부 조직에 부담이되기 때문에 지나치게 날카롭게해서는 안됩니다. 슈나이더의 이미징 매체는 녹색 방출 스펙트럼에서 자동 형광을 띠기 때문에 매체가 추가되면 GFP로 표시된 생식선을 찾기가 어렵습니다. 따라서 공초점 이미징 소프트웨어를 사용하여 생식선이 링거의 솔루션에있는 동안 생식선의 위치를 표시하는 것이 중요합니다. 공초점에서 생식선을 찾는 것이 여전히 어렵다면, 다음 해부 후에 해부 현미경에서 접시에서 생식선의 상대적 위치에 대한 이미지를 스케치하거나 찍는 것이 좋습니다. 그런 다음 접시 외부를 표시하여 해부 중에 방향을 표시하고 공초점 현미경으로 전환 할 때이 방향을 일치시킵니다. 일단 공초점에 위치하면, 생식선이 파괴되거나 엉망이 된 것처럼 보이면, 다음 해부에서 생식선을 둘러싼 더 많은 부착 조직을 남겨 두십시오. 반대로, 생식선이 존재하지만 모든 평면에 걸쳐 흐릿하게 보이면 커버 슬립과 생식선 사이에 조직이 생길 가능성이 높으며 향후 해부는 부착 조직으로부터 생식선을 더 잘 분리하기 위해 노력해야합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 이러한 관행을 채택하면이 프로토콜의 학습과 실행이 촉진되었습니다.
이 프로토콜을 형성하는 동안 우리는 적용 할 수있는 몇 가지 변경 사항을 확인했습니다. 틈새 다짐 연구를 위해, 우리는 16 단계에서 배아를 해부하는 것을 목표로합니다. 이 단계에서 배아는 아직 상당한 양의 큐티클을 개발하지 않았으며 폴리 라이신 코팅 접시에 쉽게 달라 붙습니다. 그러나, 이 기술은 오래된 배아를 첫 번째 절개를 위해 폴리라이신 코팅 영역의 내벽에 고집함으로써 큐티클로 해부하도록 변형될 수 있다. 내부 조직이 노출되면 배아 시체가 폴리 라이신에 달라 붙고 해부가 정상적으로 진행될 수 있습니다. 배아 연령에 대한 조정 외에도, 우리는 동일한 접시에서 여러 유전자형을 해부하기 위해이 기술을 성공적으로 조정했습니다. 예를 들어, 동형접합성 돌연변이체는 밸런서 염색체 상의 변형-YFP와 같은 쉽게 식별가능한 마커의 사용에 의해 형제 이형접합체로부터 분리될 수 있다. 탈형 후, 배아는 마커의 유무에 따라 커버 슬립의 양쪽으로 옮겨야합니다. 해부술은 프로토콜에 설명 된대로 접시에서 아래쪽으로 진행되어야하며, 다른 유전자형의 분리를 유지하기 위해 특별한주의를 기울여야합니다. 또한이 프로토콜은 슈나이더 이외의 배양 배지를 사용하도록 잠재적으로 수정 될 수 있지만 Shields 및 Sang M3 Insect Media에 대한 피상적 인 조사는 생존 할 수없는 생식선 (데이터는 표시되지 않음)을 산출했습니다. 또한이 프로토콜은 단순히 약물을 이미징 매체와 결합하여 약리학 적 조작과 잘 어울립니다. 이미징의 5 시간 기간 동안, 약물의 재 첨가는 효과적인 농도를 유지하기 위해 필요할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 남성 생식선에 특유한 현상 인 틈새 다짐을 시각화하려는 의도로 개발되었지만 이론적으로이 프로토콜은 틈새 시장과 msSGP가 부족한 생식선을 해부하고 이미징함으로써 개발 중인 난소를 생생하게 이미지화하기 위해 구현 될 수도 있습니다.
이 기술과 관련된 한계는 배양 시간의 길이, 및 배양물의 생체외 성질과 관련된다. 중간 단계 초파리 달걀 챔버(30)의 경우와 같이, 배양된 생식선은 생체외 라이브 이미징의 약 5시간 후에 죽기 시작하며, 이는 조직 완전성의 손실에 의해 입증된다(핵은 pyknotic 되고 세포막은 shrivel이 된다). 따라서 수컷 생식선에서 나중 단계 사건을 탐구하고 싶다면 여기에 제시된 프로토콜을 수정하여 1st instar 또는 오래된 유충의 생식선을 해부하고 여기에 제시된 것과 유사한 조건하에있는 사람들을 이미지화해야합니다. 그러나 개선 된 배양 조건이 개발되면 다섯 시간이 지난 생체 외 라이브 이미징의 가능성을 배제하지는 않지만 배아 내에서 생식선 발달에 기계적 단서가 필요한 경우 한계가있을 수 있습니다. 아마도이 기술의 가장 심각한 단점은 고유 한 생체 외 특성 때문일 것입니다. 생체외에서 배양될 때, 세포는 생체내 생물학(31)을 대표하지 않는 부자연스러운 잠재력을 가질 수 있다. 추가적으로, 배지 함량 및 매트릭스 강성을 포함하는 배양 환경의 미묘함은 세포 거동(32)에 대해 과감한 영향을 미칠 수 있다. 이러한 민감성을 염두에두고, 배양 조건이 생체 생물학을 정확하게 반영하는지 확인하는 것이 중요합니다. 우리는 생체 내 틈새 시장 개발 및 신호 전달이 생체 외 17에서 되풀이된다는 것을 증명하기위한 조치를 취했습니다. 간단히 말해서, 우리는 틈새 세포 운명이 유지되고 틈새 세포의 수가 Fasciclin-III 및 E-cadherin 마커를 사용하여 변경되지 않는다는 것을 확인했습니다. 또한, STAT 신호 전달이 존재하고 생식계열 줄기 세포가 직교로 분열하여 틈새 기능이 유지된다는 것을 암시합니다. 그러나 우리는 관련 생체 생물학이 생식선 내의 다른 비 틈새 조직에서 손상되지 않은 상태로 유지된다는 것을 확인하지 못했습니다. 이러한 다른 조직에 대한 미래의 생체외 조사는 이것이 실제로 사실인지 확인하기 위한 포괄적인 분석을 포함해야 한다.
이 프로토콜로 취할 수있는 미래의 방향에는 이미징 접시 내에 장벽을 통합하는 것이 포함되어있어 하나의 해부 세션에는 대조군과 약물 치료 그룹이 모두 포함될 수 있습니다. 이러한 향상은 기술적 반복실험 사이의 오류를 최소화하여 과학적 엄격성을 향상시킬 수 있습니다.
이 프로토콜에 대한 다른 진정한 대안은 없으며, 이는 배아 발달 후반에이 기관의 살아있는 사건을 조사 할 수있는 유일한 방법이기 때문입니다. 따라서 생식선 형태 형성에 관한 이전에는 대답 할 수 없었던 질문이 이제는 이러한 발전으로 접근 할 수 있습니다. 이러한 질문에는 세포 분열의 복잡성, 세포 골격 변화 및 줄기 세포 틈새 형성 및 생식선 형성을 지배하는 세포 간 교차 사건이 포함됩니다. 이러한 이벤트 중 어느 것도 수정 및 얼룩 기술을 사용하여 획득 한 이러한 프로세스의 정지 이미지에서 감지 할 수 없습니다. 전반적으로,이 방법은 후기 배아 초파리 생식선의 역학을 조사 할 가능성을 열어주고, 그러한 돌파구는 줄기 세포 틈새 생물학, piRNA 생물학 및 유기 발생을 포함한 무수한 생물학적 분야의 발전에 강한 영향을 미칩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로토콜의 초기 개발에 상당한 기여를 한 Lindsey W. Plasschaert와 Justin Sui에게 감사드립니다. 저자들은 시약에 대한 관대함에 대한 비행 공동체, 특히 루스 레만과 벤자민 린에게 출판 전에 nos5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' 라인을 선물한 것에 대해 감사하고 있습니다. Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537)로부터 얻은 주식을 본 연구에 사용하였다. 이 작업은 NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 및 R35GM136270 (S.D)뿐만 아니라 교육 보조금 T32GM007229 (B.W.) 및 F32GM125123 (L.A.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
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