Summary
Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.
Abstract
Drosophila melanogaster erkek embriyonik gonad, germ hücresi gelişimi, piRNA biyolojisi ve niş oluşumu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere gelişim biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için avantajlı bir modeldir. Burada, in vivo canlı görüntülemenin oldukça etkisiz olduğu bir dönemde gonad ex vivo'yu canlı olarak görüntülemek için bir diseksiyon tekniği sunuyoruz. Bu protokol, embriyoların bir görüntüleme kabına nasıl aktarılacağını, uygun şekilde evrelenmiş erkek embriyoların nasıl seçileceğini ve yapısal bütünlüğünü korurken gonadın çevresindeki dokudan nasıl diseke edileceğini özetlemektedir. Diseksiyonu takiben, gonadlar dinamik hücresel süreçleri görselleştirmek için konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. Diseksiyon prosedürü kesin zamanlama ve el becerisi gerektirir, ancak yaygın hataların nasıl önleneceği ve bu zorlukların nasıl üstesinden gelineceği konusunda fikir veriyoruz. Bildiğimiz kadarıyla bu, Drosophila embriyonik gonad için ilk diseksiyon protokolüdür ve aksi takdirde erişilemeyen bir zaman penceresinde canlı görüntülemeye izin verecektir. Bu teknik, doğal gonadal ortamlarında hücrelerin içinde veya arasında meydana gelen dinamik süreçleri incelemek için farmakolojik veya hücre tipine özgü transgenik manipülasyonlarla birleştirilebilir.
Introduction
Drosophila melanogaster testis, birçok dinamik hücresel süreci anlamamız için bir paradigma olarak hizmet etmiştir. Bu modelin çalışmaları, kök hücre bölünme regülasyonu 1,2,3, germ hücresi gelişimi 4,5, piRNA biyolojisi 6,7,8 ve niş-kök hücre sinyal olayları9,10,11,12,13'e ışık tutmuştur. Bu model avantajlıdır çünkü genetik olarak izlenebilir 14,15'tir ve kök hücreleri doğal ortamlarında yaşayabileceğimiz birkaç yerden biridir 3,16,17,18. Bununla birlikte, bu modelin canlı görüntülemesi yetişkin doku ve erken embriyonik aşamalarla sınırlandırılmıştır, bu da geç embriyodaki gonadal dinamikler hakkındaki bilgimizde bir boşluk bırakarak, nişin ilk oluştuğu ve işlev görmeye başladığı kesin aşamadır.
Geç evre embriyonik gonad, anteriordaki somatik niş hücrelerden ve daha arka bölgeler boyunca somatik gonadal hücreler tarafından ensiklopedik germ hücrelerinden oluşan bir küredir19. Bu organ, erken embriyonik Aşama 17 17,20,21'e kadar in vivo olarak canlı olarak görüntülenebilir. Büyük ölçekli kas kasılmalarının başlaması nedeniyle daha fazla görüntüleme engellenir. Bu kasılmalar o kadar şiddetlidir ki, gonadı görüntüleme çerçevesinin dışına iter ve bu tür hareketler görüntüleme yazılımı ile düzeltilemez. Laboratuvarımız, canlı görüntüleme için bu zor dönemde meydana gelen niş oluşum mekanizmalarını ortaya çıkarmakla ilgilenmektedir. Bu nedenle, embriyonik Aşama 16'dan başlayarak gonadın canlı görüntüsüne ex vivo bir yaklaşım ürettik ve gonad gelişiminin bu önemli döneminde hücre dinamiklerinin incelenmesini kolaylaştırdık. Laboratuvarımızdan önceki çalışmalar, bu ex vivo görüntülemenin in vivo gonad gelişimi17'yi sadık bir şekilde özetlediğini göstermektedir. Bu teknik, Drosophila embriyonik gonadı için türünün ilk ve tek örneğidir.
Burada, geç embriyonik evrelerde gonadın ex vivo canlı görüntülenmesi için gerekli diseksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, farmakolojik tedavilerle veya gonad içindeki spesifik hücre soylarının transgenik manipülasyonu ile birleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, kök hücre niş oluşumunun adımlarını başarıyla görüntüledik17. Bu görüntüleme yaklaşımı, kök hücre biyolojisi alanı için etkilidir, çünkü niş oluşumunun ilk aşamalarının doğal ortamında gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayacaktır15,17. Bu yöntem kök hücre biyolojisi alanı için faydalı olsa da, hücresel yeniden düzenlemeler 22,hücre yapışması 2,12,23 ve hücre göçü 23 dahil olmak üzere bu gelişimsel zaman noktasında gonadda meydana gelen dinamik süreçleri görselleştirmek için de uygulanabilir. Bu diseksiyon protokolü böylece birçok temel hücre biyolojik süreci hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Diseksiyondan bir gün önce hazırlık
- Elektrolitik olarak bir tungsten iğnesini24 keskinleştirin, böylece elde edilen çap yaklaşık 0.03 mm olur. Verilen voltajı yaklaşık 14 V'a ayarlayın ve 3,3 M NaOH kullanın. Keskinleştirme 1 veya 2 dakikadan fazla sürmemelidir.
DİKKAT: NaOH oldukça aşındırıcıdır ve ciltle temas ettiğinde yanıklara neden olur. Kullanırken eldiven ve gözlük takın ve bir duman başlığının içinde çalışın.
NOT: Kullandıktan sonra, NaOH'yi bir polipropilen Falcon tüpünde saklayın. - Hazırlanan görüntüleme ortamını yapın. 15 mL'lik bir konik tüpte, 4.25 mL Schneider ortamını 750 μL Fetal Sığır Serumu (FBS,% 15 nihai konsantrasyon) ve 27.5 μL Penisilin-Streptomisin (0.05 U / μL Penisilin, 0.05 μg / μL nihai konsantrasyon) ile birleştirin. Hazırlanan bu görüntüleme ortamını 4 °C'de saklayın.
- Heptan-tutkal çözeltisi yapın. Yaklaşık 20 cm çift taraflı bantla doldurulmuş 20 mL sızdırmaz şişeye yaklaşık 0,5 mL heptan ekleyin. Bir nutatörde yaklaşık bir saat boyunca sallayın veya su ve gliserol arasında bir tutarlılık elde edilene kadar bir pipet ucuyla karıştırın. Bu çözünmüş tutkal çözeltisi, heptan buharlaşmadan önce birkaç gün sürecektir. Çözeltiyi tazelemek için, ilave bir 0,5 mL heptan ve kaya ekleyin.
NOT: Etkili bir heptan-yapıştırıcı çözeltisi, çeşitli heptan-bant oranları ve ayrıca değişen sallanma / karıştırma süreleri kullanılarak hazırlanabilir. Yukarıdaki spesifikasyonlar sadece böyle bir yeterli çözeltinin hazırlanması veya tazelenmesi için önerilerdir.
2. Embriyo toplama – diseksiyondan 15-17 saat önce
- Bir elma suyu agar tabağı25'e taze maya ezmesi ekleyin. Küçük deliklerle delikli boş bir gıda şişesine yetişkin sinekler (10 günden az) ekleyerek bir embriyo toplama kafesi kurun26. Mayalı agar plakasını kullanarak toplama kafesini kapatın, şişeye bantlayın ve kafesi plaka tarafı aşağı olacak şekilde 25 ° C'lik karanlık bir inkübatöre 1 saat boyunca yerleştirin.
NOT: Sinekler, gonadı floresan olarak işaretleyecek bir transgeni ifade etmelidir, örneğin, six4-eGFP::Moesin20, çünkü embriyoların diseksiyonu stereo-floresan mikroskop altında gerçekleşecektir. Gonadı işaretlemek için kullanılan genotiplerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakınız. - Kafesi inkübatörden çıkarın ve bu ilk koleksiyonu atın. Taze mayalanmış bir agar plakası ile değiştirin ve kafesi 2 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
NOT: İlk embriyo koleksiyonu, döllenmiş, gelişmekte olan embriyoların dişilerini temizlemek, sıkı bir şekilde zamanlanmış ikinci bir embriyo koleksiyonu elde etmek için kullanılır. - Agar plakasını kafesten çıkarın ve (mayalı tarafı yukarı bakacak şekilde) kapatılabilir plastik bir kabın içindeki nemli bir kağıt havluya yerleştirin. Embriyoları 14.5 saat yaşlandırmak için bu nemli odayı 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin (son yaşlar, yumurtlamadan sonra 14.5-16.5 saat).
NOT: Adım 2.4'e başlamadan hemen önce, adım 3.1 ve 3.2'yi tamamlayın. - Agar plakasını inkübatörden çıkarın ve bir fışkırtma şişesi kullanarak, bir boya fırçasıyla hafifçe fırçalayarak maya macununu çözmek için agar plakasına yeterli su ekleyin. Embriyoları ve çözünmüş mayayı bir tartım teknesinin içinde oturan küçük bir ağ elek sepetinde durulayın. Sepette, çoğu maya macunu ağdan süzülene kadar su fışkırtma şişesiyle durulayın.
- Tartım teknesindeki suyu çıkarın ve sepeti tekrar içine yerleştirin. Embriyoları, bir fışkırtma şişesi kullanarak% 50'lik bir ağartıcı çözeltisine batırarak dekoryonlayın. Ağartıcı çözeltisi 3-5 mm derinliğe sahip olmalıdır. Embriyoları ara sıra dönerek ~ 2 dakika boyunca çamaşır suyuna batırılmış halde tutun.
DİKKAT: Çamaşır suyu aşındırıcıdır ve gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir veya zarar verebilir. Çamaşır suyunu kullanırken eldiven ve gözlük takın.
NOT: Bu süre zarfında, adım 3.3'ü mümkün olduğunca tamamlayın. Dekoryonasyon ilerlemesi, sepeti stereo mikroskop altına yerleştirerek ve dorsal uzantıların yokluğunu kontrol ederek kontrol edilebilir. Gerekirse embriyoları ek süre için ağartıcı çözeltisine batırın. - Ağartıcıyı atın ve sepetin içindeki embriyoları bir fışkırtma şişesinden suyla iyice durulayın (~ 3 s için, ağ sepetini kağıt havlularla lekeleyin; 2-3 kez tekrarlayın).
3. Diseksiyon hazırlık günü
- 1.5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne (0.2 mg/mL nihai konsantrasyon) 1.500 μL hazırlanmış görüntüleme ortamına (bkz. adım 1.2) 30 μL insülin (10 mg/mL) ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığına dengelemek için tüpü tezgahın üzerinde bırakın.
- Tutkalla kaplanmış kapak kayma şeritleri hazırlayın.
- 22 mm x 22 mm'lik bir kapak kaymasını eşit büyüklükte dört şerit halinde kesmek için elmas uçlu bir bıçak kullanın (Şekil 1A).
- Bir şeridi almak için forseps kullanın ve şeridin her iki tarafına toplam yaklaşık 30 μL heptan-yapıştırıcı çözeltisi yayın (Şekil 1B). Eşit bir tutkal kalıntısı tabakası elde etmek için, heptan buharlaşırken şeridi çeşitli açılarda eğin.
- Tutkal kaplı şeridi bir kapaklı kutunun boş bir yuvasında saklayın; yapışkanlığını korumak için, şeridi eğimli, ancak dik bir konumda, kutu yüzeyleriyle teması en aza indirmek için kutunun kenarlarına yaslanmış olarak yerleştirin (Şekil 1C). Kutuyu kapatın, böylece havadaki partiküller yapıştırıcıyı kaplamaz ve yapışkanlığını azaltır.
- Tezgahın üstüne şu öğeleri yerleştirin: 6 inç cam Pasteur pipet, mikroskop slaytı, uygun pipet uçlarına sahip bir P200 ve bir P1000 pipetçi, Ringer çözeltisi27 (NaOH ile pH 7,3'e ayarlanır) ve açık, Poli-D-Lizin kaplı 35 mm görüntüleme kabı.
- Embriyoları ağ elek sepetinden 500-750 μL heptan ile doldurulmuş küçük bir saat camına aktarın.
- Sepetin kenarlarını ve altını bir mendil mendiliyle kurulayın. Hepattaki bir boya fırçasını nemlendirin, boya fırçasını embriyolara dokunun (hidrofobik vitelin zar kıllara yapışmalıdır) ve boya fırçasını saat camındaki heptana geri daldırın (embriyolar dibe batmalıdır).
NOT: Embriyoların kurumasını önlemek için sonraki adımlar mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir. Embriyolar 20 saniyeden fazla havaya maruz bırakılmamalıdır.
- Sepetin kenarlarını ve altını bir mendil mendiliyle kurulayın. Hepattaki bir boya fırçasını nemlendirin, boya fırçasını embriyolara dokunun (hidrofobik vitelin zar kıllara yapışmalıdır) ve boya fırçasını saat camındaki heptana geri daldırın (embriyolar dibe batmalıdır).
- Embriyoları bir Pasteur pipeti kullanarak mikroskop slaytına aktarın (Şekil 1D). Embriyoları yavaşça pipete çekin ve pipetin dar kısmıyla sınırlayın. Pipet embriyoları yavaşça slaytın üzerine dökülür, böylece kızağa akmadan önce pipetin ucunun hemen içinde toplanırlar. Bir mendil mendilinin köşesini ince bir uca çevirin ve heptanı slayttaki embriyolardan uzaklaştırın. Daha küçük bir alanı toplayacak ve kaplayacaklar, böylece bir sonraki adımda tutkal kaplı bir şeritte yakalanmalarını kolaylaştıracaklar.
- Forsepsle, tutkal kaplı bir şerit alın ve embriyolara hafifçe dokunun (Şekil 1E). Şeridi görüntüleme kabına, embriyoyu yana doğru ve Poli-D-Lizin kaplı merkezin hemen dışına yerleştirin. Yerine sabitlendiğinden emin olmak için forseps kullanarak şeridi tabağa bastırın. Çanağı hemen 2–3,5 mL Ringer çözeltisi ile doldurun; kurumasını önlemek için embriyoları önce suya batırın (Şekil 1F).
4. Diseksiyon
NOT: Bu adımlar stereo-floresan mikroskop altında gerçekleştirilmelidir.
- 10-15 embriyoyu devitellinize edin.
NOT: Bu, yeni başlayanlar için iki embriyodan, uzmanlar için on beş embriyoya kadar değişebilir.- Bağırsak morfolojisine göre Evre 16 embriyolarını seçin (Şekil 2). Bu aşamada, embriyolar dört yığılmış bağırsak segmenti oluşturan üç bağırsak daralmasına sahiptir (Şekil 2 B, B'). Devitelinizasyona başlamak için, seçilen embriyoyu bir uçta, tercihen ön tarafta, tungsten iğnesi ile delin. Embriyo vitelin zarından dışarı çıkabilir, ancak değilse, zarı embriyodan soyun.
NOT: Diseksiyon için çok genç olan embriyolar bölgeselleşmemiş bağırsaklara sahiptir (Şekil 2C). Evre 17 embriyolarının diseksiyonu mümkündür, ancak Aşama 16 embriyolarının diseksiyonundan daha zordur, çünkü kütikül bu aşamada gelişmeye başlamaktadır. Erken Evre 17 embriyoları, birbirlerine göre kaydırılmış dört bağırsak segmenti ile birlikte bulunur (Şekil 2 D, D'). - İğneyi embriyo boyunca gonadlardan uzak bir bölgeye bağlayın. Kancalı embriyoyu çanağın Polilizin kaplı bölgesine aktarın (buradan itibaren basitçe "kapak kayması" olarak adlandırılır) ve yapışana kadar tabana doğru sürükleyin. Bu adımları tekrarlayın ve devitelinize embriyoları Polilizin kaplı kapak kaymasının üst kısmı boyunca üst üste yerleştirin (Şekil 3A), daha fazla diseksiyon için aşağıda bol miktarda alan bırakın.
NOT: Gonadlar, kullanılan spesifik işaretleyiciye ve transgen kopya numarasına bağlı olarak parlak bir şekilde flüoresan olması gereken küçük küresel hücre agregaları olarak görünür. Bu aşamada, gonadlar lateral olarak A5 segmentinde, anteriordan embriyo uzunluğunun yaklaşık% 70-80'inde bulunur. Diseksiyon protokolü boyunca, doku iğneye yapışabilir. Enkazın iğnesinden kurtulmak için, Ringer çözeltisinin yüzeyinin hemen üzerine kaldırın. Devitellinizasyon, gonad uygun mümkün olduğunca az bozulduğu sürece düzensiz olabilir.
- Bağırsak morfolojisine göre Evre 16 embriyolarını seçin (Şekil 2). Bu aşamada, embriyolar dört yığılmış bağırsak segmenti oluşturan üç bağırsak daralmasına sahiptir (Şekil 2 B, B'). Devitelinizasyona başlamak için, seçilen embriyoyu bir uçta, tercihen ön tarafta, tungsten iğnesi ile delin. Embriyo vitelin zarından dışarı çıkabilir, ancak değilse, zarı embriyodan soyun.
- Gonadları embriyodan çıkarıp kabın üzerine yerleştirin (Şekil 3C,D).
- İlk olarak, embriyoyu içini açığa çıkarmak için törpülayın (Şekil 3C). Embriyoyu merkezinden dilimleyin, iğneyi arkadan, gonadlar arasında hareket ettirin. Bazı iç dokuları kızdırın, çünkü bu yemeğe dış kütikülden çok daha iyi yapışacaktır. Dokunun yapışkanlığı, bir sonraki manipülasyonların gonadı ortaya çıkarmasını ve kapak kaymasına yapışmasını sağlayacaktır.
NOT: Doku çanağa yapışmıyorsa, kaplanmış kapak kaymasının kirlenmemiş bir bölgesine koaksiyel hale getirmeyi deneyin; kapak kaymasının dış bölgeleri özellikle yapışkan olacaktır. Adım 4.1.2'de belirtildiği gibi, diseksiyon manipülasyonlarının, gonadlar zarar görmediği sürece, parçalanmış bir embriyo karkası ile sonuçlanması önemli değildir. - İğneyi, gonad da dahil olmak üzere bir doku parçası kalan karkastan ayrılana kadar bir gonadın etrafında dilimlemek için kullanın. İğne ile, bu dokuyu taze bir kaplanmış örtü kayması bölgesine çekin ve tabağa yapışana kadar tabana doğru koaksiyel hale getirin.
NOT: En iyi görüntüleme, gonadın kendisinin üstteki doku yoluyla dolaylı olarak bağlanması yerine, doğrudan kapak kaymasına bağlandığı durumlarda elde edilecektir. Bu nedenle, doku karkastan uzağa yönlendirildikçe, gonadın yabancı doku yerine önce kapak kaymasına dokunmasını sağlayın. - Yapışkan dokuyu iğne ile gonaddan nazikçe sürükleyerek gonaddan mümkün olduğunca fazla çevre dokusunu çıkarın (Şekil 3D). Gonada doğrudan dokunmaktan kaçının, bu da ona zarar verir (Şekil 4E). Gondanın çanağa yeterince yapışmasını sağlamak için, iğneyi gonadın etrafında yumuşak bir dairesel hareketle hareket ettirin - eğer hareket ederse, iğneyi kalan yapışkan dokuya dokunun ve gonadı taze bir yapışkan örtü kayması bölgesine yönlendirin. Gonadın tespit edilebilir bir hareketi kalmayana kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Embriyo karkasına geri dönün ve ikinci gonadı diseke edin. Bu işlemi mümkün olduğunca çok sayıda embriyo üzerinde tekrarlayın, ancak 25 dakikayı geçmeyin. Doku canlılığı, ~ 40-45 dakikadan fazla bir süre sonra Ringer'ın çözeltisinde tehlikeye girecektir.
- İlk olarak, embriyoyu içini açığa çıkarmak için törpülayın (Şekil 3C). Embriyoyu merkezinden dilimleyin, iğneyi arkadan, gonadlar arasında hareket ettirin. Bazı iç dokuları kızdırın, çünkü bu yemeğe dış kütikülden çok daha iyi yapışacaktır. Dokunun yapışkanlığı, bir sonraki manipülasyonların gonadı ortaya çıkarmasını ve kapak kaymasına yapışmasını sağlayacaktır.
- Diseksiyonlar tamamlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yönünü kaydetmek üzere görüntüleme kabının dış kenarına kayıt işaretleri eklemek için silinmez bir işaretleyici kullanın.
- Tutkal kaplı şeridi tabaktan çıkarın.
- Bir çift forsederin alt çatalını şeridin altına yavaşça yerleştirin, yapışmış gonadların bozulmasını en aza indirmek için Zil çözeltisinin mümkün olduğunca az dökülmesiyle çanaktan kurtarmak için şeridi yavaşça yukarı doğru eğin ve yavaşça yukarı doğru eğin.
NOT: Şerit, disseke edilmiş gonadlardan uzağa eğilmelidir.
- Bir çift forsederin alt çatalını şeridin altına yavaşça yerleştirin, yapışmış gonadların bozulmasını en aza indirmek için Zil çözeltisinin mümkün olduğunca az dökülmesiyle çanaktan kurtarmak için şeridi yavaşça yukarı doğru eğin ve yavaşça yukarı doğru eğin.
- Çanağı, Ringer çözeltisinin dökülmesini önleyecek şekilde yavaşça görüntüleme mikroskobuna taşıyın.
5. Görüntüleme
- Görüntüleme kabını, tabağı diseksiyon sırasında olduğu gibi yaklaşık yönde yerleştirmek için işaret işaretlerini kullanarak sahne tutucusuna yerleştirin. Parlak alan mikroskobu ve düşük güçlü (~ 10x) bir hedef kullanarak, kapak kaymasına yapışmış herhangi bir doku parçasını tanımlayın ve odaklayın. Floresanı ortaya çıkarmak için göz merceği ayarlarını değiştirin ve dürbün göz merceklerini kullanarak, görüntüleme yazılımı içindeki her bir gonadın konumunu işaretleyerek çanağı sistematik olarak tarayın (bkz.
NOT: Konumları işaretlemeden önce gonadların görüş alanında ortalandığından emin olun. - Tüm sahne tutucu tertibatını, görüntüleme kabı tutucusunda olacak şekilde yavaşça çıkarın ve tertibatı çalışma tezgahına yerleştirin.
- Ringer çözeltisini insülin içeren hazırlanmış görüntüleme ortamıyla değiştirin (bkz. adım 1.2 ve 3.1).
- Tüm Ringer solüsyonunu görüntüleme kabının iç üst çıkıntısından çıkarmak için bir P1000 kullanın (Ringer'ları merkezi kapak kayma bölgesinden pipet yapmayın). Ardından, bir P200'e geçin ve ucunu merkezi bölgede kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirin. 50-100 μL Ringer'ı dikkatlice çıkarın; çözümün tamamını ÇIKARMAYIN.
- ~200 μL görüntüleme ortamı hazırlayın ve P200 ucunu kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirerek yavaşça bu görüntüleme ortamını ekleyin. Ardından, kalan görüntüleme ortamını (~ 1.300 μL) üst çıkıntının en dış kenarından başlayarak çanağa ekleyin. Pipetleme sırasında, sıvının orta kubbesine doğru ilerleyin ve sonunda pipet ucunu her ikisinin de üzerinden fırçalayarak ikisini birleştirin. Kapağı tabağın üzerine yerleştirin.
NOT: Görüntüleme ortamı, buharlaşmayı önlemek için çanağın tüm iç çapını yaklaşık 2 mm derinlikte kapsamalıdır (Şekil 4D).
- Mikroskobu daha yüksek bir güç hedefine (63x, 1.2 NA) geçirin, kullanılan hedefe göre uygun daldırma sıvısını uygulayın (hedefin gerektirdiği daldırma sıvısı tipi ve kırılma indisi) ve ardından sahne tutucu tertibatını değiştirin. Görüntüleme kabının dibine yapıştırılmış dokuya odaklanmak için parlak alan mikroskobu kullanın.
NOT: Aşama hareket ettirilmemişse, hedef odaklandıktan sonra son gonad görünmelidir. - İşaretli her gonad pozisyonunda adım adım ilerleyin ve bu pozisyonu gerektiği gibi ayarlayın. Görüntü netliğine, gonad cinsiyetine vb. bağlı olarak hangi gonadların görüntüleneceğini seçin. Görüntüleme ayarlarını özelleştirin (çok kanallı, pozlama süreleri, lazer yoğunlukları, Z serisi artışlar, uygun aralıklarla hızlandırılmış çekim vb.). Görüntülemeye başlayın.
NOT: Erkek gonadlar, hem bir nişin hem de gonadın karşı ucunda, erkeğe özgü somatik gonadal öncüller (msSGP'ler) adı verilen küçük, oldukça dairesel somatik hücrelerden oluşan bir kümenin varlığı ile tanımlanabilir. Six4-eGFP::moesin floresan işaretleyici kullanılırsa, niş hücreler gonaddaki en parlak ikinci hücrelerdir, en parlak olanı msSGP'lerdir. Bu aşamada, dişi gonadların ne bir nişi ne de msSGP'leri vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Görüntüleme kabının hazırlanışını Şekil 1'de, "Diseksiyon günü hazırlığı" nda açıklandığı gibi gösteriyoruz. Bu yöntemler nihayetinde, geçici olarak çanağın dibine sabitlenen ve Ringer'ın çözeltisine batırılmış bir kapak kayma şeridine yapıştırılmış iyi nemlendirilmiş embriyolarla sonuçlanmalıdır (Şekil 1F). Elmas uçlu bir bıçak, 22 x 22 mm'lik bir kapak kaymasını üç ila dört küçük şerit halinde temiz bir şekilde dilimlemeyi sağlar (Şekil 1A). Bu şeritleri forseps ile tutarken, bu şeritleri kaplamak için yeterli heptan tutkalı aktarmak için bir pipet kullanıyoruz, bu da onlara yapışkan, dokulu bir yüzey veriyor (Şekil 1B). Kaplanmış şeritler, yapışkan yüzeyleri 2 saate kadar temiz tutmak için boş bir kapak kayma kutusunda kolayca saklanır (Şekil 1C). Bu kaplanmış şeritler yapıldıktan sonra, amaç embriyoları şeridin uzun kenarına yakın bir agrega halinde şerite yapıştırmaktır (Şekil 1E). İlk önce birkaç embriyoyu saat camından temiz bir cam slayta aktarmak ve kurutmak gerekir (Şekil 1D). Daha sonra, kaplanmış şeridi embriyolara nazikçe dokunmak için forseps kullanın, böylece yapışırlar (Şekil 1E). Daha sonra şeridi hemen embriyolar yukarı bakacak şekilde diseksiyon kabının dibine bastırır ve embriyoları Ringer çözeltisi ile kaplarız (Şekil 1F). Bu hedefe ulaşılırsa, embriyoları geleneksel bir parlak alan stereomikroskopu altında görüntülemek, vitelin zarlarında tamamen hidratlanmış, sağlıklı embriyoları ortaya çıkaracaktır (Şekil 1G). Bunun yerine, bu embriyoların şeride aktarılması ve çözelti ile kaplanması işlemi yaklaşık 30 saniyeden fazla sürerse, embriyolar dehidrate olur ve sarkık hale gelir (Şekil 1G'). Sarkık embriyolar sağlıklı değildir ve diseksiyonu inanılmaz derecede zordur, bu nedenle bu işlem sırasında verimli bir şekilde çalışmak hayati önem taşır.
Şekil 1: Diseksiyondan önce embriyoların montajı ve nemlendirilmesi. (A-F) Embriyoları tutkal kaplı bir örtü şeridine yapıştırma ve şeridi bir görüntüleme kabına sabitleme adımları. (A) Bir şerit oluşturmak için elmas uçlu bıçakla (ok ucu ile gösterilen bıçak) bir kez puanlanan kapak kayması. (B) Bir çift forseps ile tutulan kopmuş kapak kayma şeridine heptan yapıştırıcı uygulanması. (C) Bir kapak kapağı kutusunda kuruyan dört tutkal kaplı şerit. (D–E) Oklar embriyoları işaret eder. (D) Hepatan içinde toplanan ve mikroskop slaytının kenarına atılan dekoriyonlu embriyolar. Fazla heptan kimwipe ile çıkarıldı. (E) Embriyolar takılı tutkal kaplı şerit. (F) Çanağın diseksiyondan hemen önceki son kurulumu. Ringer çözeltisinin sığ katmanına (ok ucu) ve şeridin (ok) iç diseksiyon çemberinin üzerine yerleştirilmesine dikkat edin. (G–G') Embriyolar çanaktaki şeride yapıştı. (G) Düzgün hidratlanmış, bulanık embriyolar. (G') Uzun süreli hava maruziyeti nedeniyle susuz kalmış embriyolar, çökmüş vitelin membranları ile belirgindir. Yıldız işaretleri sarkık embriyoları gösterir. Ölçek çubukları 0,5 mm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bir embriyoyu stereo-floresan mikroskop altında görüntülemek, GFP kanalında otomatik olarak flüoresan olan bağırsağın net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar. Bağırsak morfolojisi, diseksiyon için embriyo seçerken embriyonik yaş için bir vekil görevi görür. Kapak kayması şeridine yapıştırılan embriyolar yaşa göre biraz değişeceğinden, çeşitli bağırsak morfolojileri dizisi sunacaklardır (Şekil 2A). Canlı görüntü gonad niş morfogenezi için, erken Evre 16 embriyolarını disseke ediyoruz. Bu embriyolar, düz bir sıra halinde istiflenmiş dört bölgeselleşmiş bağırsak bölümü sunar (Şekil 2B', noktalı çizgiler). Genç embriyolar kese benzeri, bölgeselleşmemiş bir bağırsak sunarlar (Şekil 2C) ve gonadlarının etrafında sağlam organın verimli bir şekilde kültürlenmesine izin vermek için henüz yeterli hücre dışı matris (ECM) yoktur. Niş sıkıştırmaya başlamış olan yaşlı embriyolar, eşit olarak istiflenmemiş ve bunun yerine birbirlerine göre kaydırılmış dört bağırsak bölgesi sunar (Şekil 2D', noktalı çizgiler). Bu embriyolar daha kalın kütiküllere sahiptir, bu da diseksiyon işlemini daha zor hale getirir.
Şekil 2: Gonad diseksiyonu için uygun yaştaki embriyoların seçilmesi. Embriyolar, diseksiyondan önce tutkal kaplı bir örtü parçasına yapıştırıldı. Embriyolar, gonad ve yağ vücut hücrelerini işaretleyen six4-eGFP::moesin (yeşil) eksprese eder. Bağırsakların otomatik olarak yeşil renkte floresan olduğunu unutmayın. Oklar, her panelde görülebilen erkek gonadları (parlak floresan msSGP'lerin varlığıyla ayırt edilir) gösterir. Ölçek çubukları 0.25 mm. (A) Çeşitli aşamalardaki embriyoları gösterir. (B–D) Görüntünün merkezinde, ön sola ve sırt yukarı doğru yönlendirilmiş farklı aşamalardaki embriyolar. (B) Diseksiyon için uygun şekilde yaşlandırılmış erken evre 16 embriyosu. (B') Dört yığılmış bağırsak bölgesi noktalı beyaz çizgilerle gösterilir. (C) Diseksiyon için çok genç olan bir Aşama 15 embriyosu (alt embriyo). Gonadın hemen önündeki floresan bağırsak kesesinin henüz ayrı bölgelere sahip olmadığını unutmayın. (D) Gelişmekte olan kütikül nedeniyle diseke edilmesi zor olan geç bir Evre 16 embriyosu. Dört bağırsak bölgesinin, bağırsak döngüsüne hazırlık olarak birbirine göre dönmeye başladığını unutmayın. (D') Dört bağırsak bölgesi ana hatlarıyla belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Gonadda silinmez bir floresan belirteci ifade eden embriyoların diseksiyonu önemlidir ve bu belirteç stereo-floresan mikroskop altında görülebilmelidir. Burada, diseksiyon sırasında görselleştirme için gonadı işaretlemek için six4-eGFP::moesin20 kullanmayı seçtik (Şekil 2 ve Şekil 3, oklar).
Gonad diseksiyon işlemini Şekil 3'te gösteriyoruz. Polilizin kaplı çanak üzerinde uygun şekilde evrelenmiş embriyoların diseksiyonu, gonadların bu embriyolardan temiz izolasyonunu sağlar (Şekil 3D). Devitelinize edilen embriyolar yemeğe yapışır ve diseksiyondan önce uygun bir sıra halinde düzenlenebilir (Şekil 3A). Embriyo devitelinizasyonu ve polilizine transfer, dokunun embriyo gövdesinin sınırlarından ekstrüde edilebileceği kesin olmayan bir süreçtir (bkz. Embriyo 1 ve Embriyo 2 arasındaki doku parçası ve karıştırılmış Embriyo 4; Şekil 3A). Bu kesinsizlik, gonadlar zarar görmeden kaldığı sürece önemli değildir. Standart bir stereo-floresan mikroskop, devitelinize embriyo gövdesi içindeki gonadın tanımlanmasını sağlar (Şekil 3B, ok). Keskin bir diseksiyon iğnesi ile yapılan ilk birkaç manipülasyon, gonadları embriyo karkasından ayırmalıdır, ancak bazı oto-floresan dokular yapışmış kalacaktır (Şekil 3C). Ek manipülasyonlar, doğrudan kaplanmış çanağa yapışan izole gonadlarla sonuçlanır (Şekil 3D).
Şekil 3: Diseksiyon işlemi. (A–D) Diseksiyon protokolünde sıralı aşamalarda six4-eGFP::moesin (yeşil) eksprese eden embriyolar. (A) Çanağın polilizin kaplı diseksiyon bölgesine transfer edilen dört devitelinize embriyo. Embriyoların, çanakta ardışık aşağı doğru diseksiyonları kolaylaştırmak için düzgün bir sıra halinde nasıl hizalandığına dikkat edin. Embriyo 1 ve 2 arasındaki küçük doku parçası, el devitelinizasyonu sırasında ekstrüde edilen Embriyo 2'den bağırsağın bir parçasıdır. (B) Yıldız işareti ile gösterilen (A)'dan embriyonun daha yüksek büyütme görünümü. (C) Orta hattan aşağıya filetolanmış bir embriyonun kalan karkası. Ok ucu, embriyonik dokulara hala yoğun bir şekilde gömülü olan tıkalı bir gonadı gösterir. (D) Tamamen disseke edilmiş bir gonad. Gonadın yakınında sadece minimal yabancı doku (ok ucu) kaldığına dikkat edin. Oklar erkek gonadlara işaret eder. Ölçek çubukları 0,25 mm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Gonadlar diseke edildikten sonra, Ringer'ın solüsyonu görüntüleme ortamı ile değiştirilebilir ve görüntü kültürlü gonadlar doğrudan diseksiyon için kullanılan aynı kapta kullanılabilir. Dönen disk konfokal mikroskop kullanıyoruz. Konfokal mikroskop üzerinde izole edilmiş bir gonadın parlak alan görselleştirmesi, görüntüleme sırasında gonadın bütünlüğünü koruyan ECM olan gonad çevresini çevreleyen karanlık bir gölgeyi (Şekil 4A-B, oklar) ortaya çıkarır. Somatik gonadal hücrelerde GFP etiketli F-aktini eksprese eden sağlıklı, iyi kültürlenmiş bir gonad örneği20 ve tüm çekirdekleri görselleştirmek için RFP etiketli bir histon belirtecisunuyoruz 28 (Şekil 4C-C'). Bu embriyodaki tüm hücreler RFP histon belirtecini eksprese ettiğinden, hem gonadal hücreler hem de diğer yapışkan doku hücreleri kırmızı emisyonu görüntülerken gözlenir. Gonadın sınırlarını gonad'a özgü GFP belirtecini kullanarak ayırt ediyoruz (Şekil 4C', anahat). Bu kültürlü gonadın sağlıklı olduğu açıktır, çünkü gonad sınırı pürüzsüz ve yuvarlaktır (Şekil 4 C', anahat) ve gonadal hücreler çekirdekler boyunca eşit RFP histon floresan seviyelerine sahiptir (Şekil 4 C', ok). Bunun yerine, görüntüleme sırasında gonadlar yeterince hidratlanmazsa, gonad dokusu büzülürken çekirdekler ve six4-eGFP::moesin floresansı noktasal hale gelebilir (Şekil 4D, ok). Ayrıca, diseksiyon sırasında gonad ECM aşırı hasar görürse, gonad sınırı, gonadın sınırları dışında gonada özgü hücrelerin (Şekil 4E, yıldız işaretleri) varlığı ile açıkça görülen gonad sınırı tehlikeye girer (Şekil 4E, ok).
Şekil 4: Canlı görüntüleme sırasında sağlıklı gonadların yerini belirleme. (A) Kapak kaymasına yapışmış iki disseke gonadın düşük ve (B) yüksek büyütmeli parlak alan görünümleri. (C–C') Sağlıklı bir gonadda niş sıkıştırmanın ex vivo görüntülenmesinden bir film karesi. Somatik gonadal hücreler altı4-eGFP::moesin (yeşil) eksprese eder ve tüm hücreler His2Av-mRFP'yi (kırmızı) eksprese eder. (C') Beyaz noktalı bir çizgi ile işaretlenmiş gonad sınırı. Gonad sınırının dışında görülebilen His2Av-mRFP, muhtemelen disseke gonada hala bağlı olan yağ gövdesidir. Ok, gonadın sağlıklı olduğunu gösteren düzgün His2Av-mRFP sinyaline sahip bir germ hücresi çekirdeğine işaret eder. (D–E) Exvivo diseksiyon protokolünün temsili olumsuz sonuçları. (D) Ortam buharlaşması nedeniyle gonadın susuz kaldığı bir görüntüleme oturumundan bir çerçeve. His2Av-mRFP yoğuşmaları (ok) ve gonad sınırı boyunca altı4-eGFP::moesin süreksiz noktaları olarak piknotik çekirdeklere dikkat edin. (E) Diseksiyon sırasında hücre dışı matriksin tehlikeye girdiği Ex vivo görüntüleme çerçevesi. Bazı germ hücrelerinin (yıldız işaretleri) gonad sınırından (ok) çıktığını unutmayın. Germ hücreleri nos-lifeact::tddomates (macenta) ve altı 4-eGFP::moesin (yeşil) ile somatik gonadal hücreler ile etiketlenir. Ölçek çubukları 20 μm'yi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Gonadlar, bu ex vivo görüntüleme yöntemi kullanılarak yaklaşık 5 saat boyunca kültürlenebilir ve geç embriyonik gonad gelişiminde meydana gelen dinamik morfogenez olaylarının görüntü elde edilmesini sağlar. Laboratuvarımızda bu protokolü, oluşturan kök hücre nişi17'nin sıkıştırılmasını görüntülemek için başarıyla kullandık (Şekil 5). Sıkıştırmadan önce, niş, gonad anteriorda (Şekil 5A, yeşil), nos-lifeact::tdtomato29 ile etiketlenmiş germline hücrelerle çevrili gevşek bir somatik hücre toplamıdır (bkz. Bu niş agrega başlangıçta düzensiz bir sınırla kendini gösterir (Şekil 5A', noktalı çizgi). Görüntüleme boyunca, niş agregası daha pürüzsüz sınırlar kazanırken, bireysel niş hücrelerin konumlarını yeniden düzenlediklerini gözlemliyoruz. Bu hücresel yeniden düzenlemeler aynı zamanda niş alanda bir azalmaya neden olur (Şekil 5C). Hücre yeniden düzenlemeleri ve gelişimin bu aşamasıyla eşzamanlı olarak meydana gelen komşu germ hücresi bölünmeleri hakkındaki gözlemlerimiz, niş sıkıştırmanın altında yatan mekanizmaları anlamamızı sağladı17. Bu protokol böylece, hücre yeniden düzenlemelerini, şekil değişikliklerini, bölünmeleri ve diğer hücresel olayları, geç evre gonadlarda morfogenetik olayları analiz etmek için gereken çözünürlükle görselleştirme yeteneği sağlar.
Şekil 5: Niş sıkıştırma geçiren ex vivo kültürlü bir gonad. Bir görüntüleme serisinden elde edilen fotoğraflar, erken Evre 16 embriyolarından gonadların diseksiyonunu takiben hemen elde edildi. (A–C) Germ hücreleri (macenta) nos-lifeact::tddomates ve somatik gonadal hücreler (yeşil) six4-eGFP::moesin ile etiketlenir. Niş (noktalı beyaz çizgi) A'-C' de özetlenmiştir. Ölçek çubukları 10 μm'yi gösterir. Anterior solda, posterior sağdadır. (A) Görüntüleme serisindeki ilk zaman noktasında (t = 0 dakika), niş hücreler gonad ön tarafında toplanmayı bitirmiştir ve sıkıştırmanın erken bir aşamasındadır. (B) Görüntüleme serisinin ve sıkıştırma işleminin ortasında (t = 1 saat 48 dakika), niş daireselleşmeye başlamıştır, ancak kenarı düzensiz kalır. (C) Görüntüleme serisinin sonuna yakın (t = 4 saat 21 dakika), niş oldukça düzleştirilmiş, dairesel bir sınıra sahiptir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gonadogenez sırasında, embriyonik gonad ve özellikle erkek gonad15 içindeki kök hücre nişi hızlı morfolojik değişikliklere uğrar. Bu dinamik değişikliklerin altında yatan gelişimsel mekanizmalar en iyi canlı görüntüleme teknikleriyle anlaşılır. Bununla birlikte, embriyonik Aşama 17'de, gonadın in vivo görüntülenmesi, büyük ölçekli kas kasılmalarının başlamasıyla imkansız hale getirilir17. Bu protokolle başarılı bir alternatif sunuyoruz: ex vivo canlı görüntüleme için gonadların doğrudan bir görüntüleme kabına diseksiyonu. Bu protokol, geç evre embriyonik gonadın canlı görüntülenmesini sağlamak için mevcut tek yöntemi sunar.
Protokolün kritik adımları, el becerisi ve zamanlamaya keskin bir şekilde odaklanarak yürütülmelidir. Diseksiyondan önce, embriyoların hızlı bir şekilde monte edilmesi, embriyoların dehidratasyon yapmamasını ve sağlıklı ve bulanık kalmasını sağlamak için çok önemlidir, bu da devitellinizasyonu ve diseksiyonu kolaylaştırır. Diseksiyon sırasında, sadece hassas ve hassas manipülasyonlar kullanılarak gerçekleştirilen gonadal hücre dışı matriksin bozulmasını önlemek hayati önem taşır. Bu el becerisinin kullanılması, gonadın görüntüleme kabı ile doğrudan temas halinde olmasını ve böylece doğrudan kapak kapağı üzerinden net görüntüleme yapılmasını sağlayacaktır. Diseksiyondan sonra, Ringer'ın çözeltisi, gonad yerinden çıkmasını önlemek için sadece nazik emme ve pipetle dışarı atılma kullanılarak görüntüleme ortamı için değiştirilmelidir. Son olarak, genel diseksiyon süresini 25 dakika ile sınırlamak önemlidir. Bu, diseksiyon sırasında Ringer'ın çözeltisinde harcanan zamanın miktarının ve dokunun konfokaldeki konumunun, toksik olmayan bir maruziyetle sınırlı olmasını sağlar. Artan uygulama ile diseksiyon hızı artacak ve diseksiyon sekansının kişiselleştirilmesi gerçekleşecektir. Deneyimlerimize göre, yaklaşık bir haftalık düzenli uygulamadan sonra, yaklaşık 1 ay içinde diseksiyonun tam ustalığı ile yeterli diseksiyon sağlanabilir. Öğrenmeyi kolaylaştırmak için, tüm protokolü uygulamadan önce bireysel adımları uygulamanızı öneririz.
Diseksiyon için kullanılan embriyoların genotipinden başlayarak, bu protokolle ilişkili zorlukları iyileştiren bir dizi en iyi uygulama vardır. Gonadı işaretlemek için kullanılan transgenin birden fazla kopyasının dahil edilmesi, gonadı daha parlak hale getirecek ve bu nedenle görselleştirilmesini ve parçalanmasını kolaylaştıracaktır. Diseksiyonun kendisi keskin bir iğne ile en iyi şekilde çalışır, ancak görüntüleme kabının dibine doğru büküleceği ve yabancı doku ile yükleneceği için aşırı keskinleştirilmemelidir. Schneider'ın görüntüleme medyası, yeşil emisyon spektrumunda otomatik floresan yapar, bu da medya eklendikten sonra GFP ile işaretlenmiş gonadların yerini bulmayı zorlaştırır. Bu nedenle, gonadların yerini hala Ringer'ın çözümündeyken işaretlemek için konfokal görüntüleme yazılımını kullanmak çok önemlidir. Gonadları konfokalde bulmak zor kalırsa, bir sonraki diseksiyondan sonra, hala diseksiyon mikroskobundayken çanaktaki gonadların göreceli konumlandırılmasının bir resmini çizmenizi veya çekmenizi öneririz. Ardından, diseksiyon sırasında yönünü belirtmek için çanağın dışını işaretleyin ve konfokal mikroskopa geçerken bu yönü eşleştirin. Konfokalde bulunduktan sonra, bir gonad bozulmuş veya sarsılmış görünüyorsa, bir sonraki diseksiyonda gonadı çevreleyen daha yapışkan doku bırakmayı deneyin. Aksine, eğer bir gonad mevcutsa ancak tüm düzlemlerde bulanık görünüyorsa, örtü kayması ile gonad arasında muhtemelen doku vardır ve gelecekteki diseksiyonlar gonadın yapışkan dokudan daha iyi izole edilmesi için çaba göstermelidir. Deneyimlerimize göre, bu uygulamaların benimsenmesi, bu protokolün öğrenilmesini ve yürütülmesini kolaylaştırmıştır.
Bu protokolün oluşturulması sırasında, uygulanabilecek birkaç değişiklik belirledik. Niş sıkıştırma çalışmaları için embriyoları Aşama 16'da diseke etmeyi hedefliyoruz. Bu aşamada, embriyo henüz önemli miktarda kütikül geliştirmemiştir ve polilizin kaplı kaba kolayca yapışır. Bununla birlikte, bu teknik, yaşlı embriyoları ilk insizyon için polilizin kaplı bölgenin iç duvarına yapıştırarak kütikül ile diseke etmek için modifiye edilebilir. İç dokular açığa çıktıktan sonra, embriyo karkası polilizine yapışır ve diseksiyon normal şekilde ilerleyebilir. Embriyo yaşına yönelik ayarlamalara ek olarak, bu tekniği aynı tabaktaki birden fazla genotipi incelemek için başarıyla ayarladık. Örneğin, homozigot mutantlar, dengeleyici kromozom üzerinde deforme olmuş -YFP gibi kolayca ayırt edilebilir bir belirteç kullanılarak kardeş heterozigotlardan ayrılabilir. Devitellinizasyondan sonra, embriyolar, belirtecin varlığına veya yokluğuna bağlı olarak kapak kaymasının her iki tarafına da transfer edilmelidir. Diseksiyon, protokolde açıklandığı gibi çanakta aşağı doğru ilerlemeli ve farklı genotiplerin ayrışmasını sağlamak için ekstra özen gösterilmelidir. Ayrıca, bu protokol potansiyel olarak Schneider'inki dışındaki kültür ortamını kullanacak şekilde değiştirilebilir, ancak Shields ve Sang M3 Böcek Ortamının yüzeysel bir araştırması sürdürülemez gonadlar verdi (veriler gösterilmedi). Ek olarak, bu protokol, ilacı görüntüleme ortamıyla birleştirerek farmakolojik manipülasyonlarla iyi bir şekilde eşleşir. 5 saatlik bir görüntüleme süresi boyunca, etkili bir konsantrasyonu korumak için ilacın yeniden eklenmesi gerekebilir. Son olarak, bu protokol, erkek gonadlara özgü bir fenomen olan niş sıkıştırmayı görselleştirmek amacıyla geliştirilmiş olsa da, teoride bu protokol, niş ve msSGP'lerden yoksun gonadları disseke ederek ve görüntüleyerek gelişmekte olan yumurtalıkları canlı olarak görüntülemek için de uygulanabilir.
Bu teknikle ilişkili sınırlamalar, kültürleme süresinin uzunluğu ve kültürün ex vivo doğası ile ilgilidir. Orta evre Drosophila yumurta odaları30'da olduğu gibi, kültürlü gonadlar, doku bütünlüğünün kaybıyla kanıtlanan yaklaşık 5 saatlik ex vivo canlı görüntülemeden sonra ölmeye başlar (çekirdekler piknotik hale gelir ve hücre zarları büzülür). Bu nedenle, eğer erkek gonaddaki sonraki aşamadaki olayları araştırmak istenirse, burada sunulan protokolde değişiklikler yaparak gonadların 1. instar veya daha yaşlı larvalardan incelenmesi ve daha sonra burada sunulanlara benzer koşullar altında görüntülenmesi gerekir. Bununla birlikte, gelişmiş kültür koşulları gelişirse beş saatten fazla süren ex vivo canlı görüntüleme olasılığını göz ardı etmiyoruz, ancak gonad gelişimi için embriyonun içinden mekanik ipuçları gerekliyse bir sınır olabilir. Tekniğin belki de en ciddi dezavantajı, doğal ex vivo doğasından kaynaklanmaktadır. Kültüre ex vivo olduğunda, hücreler in vivo biyoloji31'i temsil etmeyen doğal olmayan potansiyele sahip olabilirler. Ek olarak, medya içeriği ve matris sertliği de dahil olmak üzere kültürleme ortamlarının incelikleri, hücre davranışı üzerinde ciddi bir etkiye sahip olabilir32. Bu hassasiyet göz önünde bulundurulduğunda, kültürleme koşullarının in vivo biyolojiyi doğru bir şekilde yansıtmasını sağlamak hayati önem taşımaktadır. İn vivo niş gelişiminin ve sinyalizasyonun ex vivo17 özetlendiğini kanıtlamak için önlemler aldık. Kısaca, niş hücre kaderinin korunduğunu ve Fasciclin-III ve E-kadherin belirteçleri kullanılarak niş hücrelerin sayısının değişmediğini tespit ettik. Ayrıca, STAT sinyalizasyonu mevcuttur ve germline kök hücreleri ortogonal olarak bölünür, bu da niş işlevselliğin korunduğunu gösterir. Bununla birlikte, ilgili in vivo biyolojinin, gonad içindeki diğer niş olmayan dokularda bozulmadan kaldığını doğrulamadık. Bu diğer dokuların gelecekteki ex vivo araştırmaları, durumun gerçekten böyle olduğundan emin olmak için kapsamlı bir analiz içermelidir.
Bu protokolle alınabilecek gelecekteki bir yön, görüntüleme kabına bir bariyerin dahil edilmesini içerecektir, böylece bir diseksiyon seansı hem bir kontrol grubunu hem de bir ilaç tedavi grubunu içerebilir. Bu geliştirme, teknik kopyalar arasındaki hatanın en aza indirilmesine izin verecek ve böylece bilimsel titizliği artıracaktır.
Bu protokole başka gerçek bir alternatif yoktur, çünkü geç embriyonik gelişim sırasında bu organın canlı olaylarını incelemek için mevcut tek yöntem budur. Bu nedenle, gonad morfogenezi hakkında daha önce cevaplanamayan sorulara şimdi bu ilerlemeyle erişilebilir. Bu sorular, hücre bölünmelerinin inceliklerini, sitoiskelet değişikliklerini ve kök hücre niş oluşumunu ve gonadogenezi yöneten hücre interkalasyon olaylarını içerir. Bu olayların hiçbiri, bir sabitleme ve boyama tekniği kullanılarak elde edilen bu süreçlerin hareketsiz görüntülerinde tespit edilemez. Genel olarak, bu yöntem geç embriyonik Drosophila gonadındaki dinamikleri araştırma olasılığını ortaya çıkarır ve böyle bir atılım, kök hücre niş biyolojisi, piRNA biyolojisi ve organogenez de dahil olmak üzere sayısız biyolojik alanın ilerlemesi için güçlü etkilere sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Lindsey W. Plasschaert ve Justin Sui'ye bu protokolün erken gelişimine yaptıkları önemli katkılar için teşekkür ederiz. Yazarlar, sinek topluluğuna reaktiflerle cömertlikleri için ve özellikle Ruth Lehmann ve Benjamin Lin'e, yayınlanmadan önce no.5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' hattını hediye ettikleri için minnettardır. Bu çalışmada Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden (NIH P40OD018537) elde edilen stoklar kullanılmıştır. Bu çalışma NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 ve R35GM136270 (S.D) ve eğitim hibeleri T32GM007229 (B.W.) ve F32GM125123 (L.A.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
References
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer's solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
