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Bioengineering

ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/61879
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

ここでは、分化前のヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、および内皮細胞からなる3D自己組織化心臓ミクロ組織アレイを生成するための使いやすい方法論について説明する。心臓ミクロ組織を生成するためにこのユーザーフレンドリーで低細胞を必要とする技術は、疾患モデリングおよび医薬品開発の初期段階に実装することができる。

Abstract

人工多能性幹細胞(iPSC)からのヒト心筋細胞(CM)、心臓線維芽細胞(CF)、および内皮細胞(EC)の生成は、組織発達および疾患を駆動する異なる心血管細胞型間の複雑な相互作用を研究するユニークな機会を提供してきた。心臓組織モデルの分野では、いくつかの洗練された三次元(3D)アプローチが、誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)を使用して、細胞外マトリックスと架橋剤の組み合わせで生理学的関連性と天然組織環境を模倣します。しかし、これらのシステムは、微細加工の専門知識なしで製造するのが複雑であり、自己組み立てに数週間かかります。最も重要なのは、これらのシステムの多くは、ヒト心臓の非筋細胞の60%以上を占める血管細胞および心臓線維芽細胞を欠いている。ここでは、心臓ミクロ組織を作製するためのiPSCsからの3つの心臓細胞型すべての導出について説明する。この容易なレプリカ成形技術により、標準的なマルチウェル細胞培養プレートで数週間心臓微小組織培養が可能になります。このプラットフォームは、初期播種密度に基づいてマイクロ組織サイズをユーザー定義で制御でき、観察可能な心臓マイクロ組織収縮を達成するために自己組織化に3日未満かかります。さらに、心臓ミクロ組織は、フローサイトメトリーおよび単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)の使用により、単一細胞尋問のための高い細胞生存率を維持しながら容易に消化することができる。心臓ミクロ組織のこの in vitro モデルは、創薬および疾患モデリングにおける検証研究の加速に役立つと想定しています。

Introduction

心臓血管研究の分野における創薬と疾患モデリングは、臨床的に関連するサンプルの不足と不十分なトランスレーショナルツール1のために、いくつかの課題に直面しています。高度に複雑な前臨床モデルまたは過度に単純化されたインビトロ単一細胞モデルは、再現可能な方法で病態生理学的状態を示さない。したがって、いくつかの小型化された組織工学プラットフォームは、ハイスループットな方法での適用の容易さと組織機能の忠実な反復との間のバランスを達成することを目標に、ギャップを埋めるのを助けるために進化してきました2,3。人工多能性幹細胞(iPSC)技術の出現により、組織工学ツールを心血管疾患状態の有無にかかわらず患者固有の細胞に適用して、研究上の質問に答えることができます4,5,6。心臓組織に類似した細胞組成を有するこのような組織操作モデルは、1つまたは複数の細胞型の挙動における病理学的変化によって誘発される心毒性および機能障害について試験するための医薬品開発努力において利用され得る。

ヒトiPSCに由来する自己組織化ミクロ組織またはオルガノイドは、 インビボ対応 物と機能的類似性を示す小型組織様集合体である三次元(3D)構造である。iPS細胞の指向性分化または胚様体の形成を介して その場で オルガノイドを形成できるいくつかの異なるアプローチがある4。得られたオルガノイドは、有機生成を駆動する形態形成過程を研究するために不可欠なツールである。しかし、さまざまな細胞集団の存在と自己組織化の違いは、異なるオルガノイド間の転帰のばらつきにつながる可能性があります5。あるいは、局所的な細胞間相互作用を研究するために組織特異的細胞型を有するミクロ組織に自己組織化される前分化細胞は、優れたモデルであり、自己組織化成分を単離することが実行可能である。特にヒト心臓研究において、細胞が異なる患者系統または市販の供給源に由来する場合、多細胞成分を有する3D心臓微小組織の開発は困難であることが証明されている。

生理学的に関連性のある個別化されたin vitroモデルにおける細胞挙動の機構的理解を改善するためには、理想的には、すべての構成細胞型が同じ患者系統に由来するべきである。ヒトの心臓の文脈では、真に代表的な心臓in vitroモデルは、優勢な細胞型、すなわち心筋細胞(CM)、内皮細胞(EC)、および心臓線維芽細胞(CF)間のクロストークを捉えるだろう6,7。心筋の忠実な反復には、生物物理学的伸張と電気生理学的刺激だけでなく、ECやCFなどの細胞型をサポートすることから生じる細胞間シグナル伝達も必要です8。CFは、細胞外マトリックスの合成および組織構造の維持に関与している。病理学的状態では、CFは線維症を誘発し、CMs9の電気伝導を変化させることができる。同様に、ECはパラクリンシグナル伝達と重要な代謝要求の供給を通じてCMの収縮特性を調節することができます10。したがって、生理学的に関連するハイスループット実験を実施できるように、3つの主要な細胞型すべてで構成されるヒト心臓ミクロ組織が必要である。

ここでは、ヒトiPSC由来心筋細胞(iPSC-CM)、iPSC由来内皮細胞(iPSC-EC)、iPSC由来心臓線維芽細胞(iPSC-CF)の誘導による心臓微細組織の作製におけるボトムアップアプローチと、均一な心臓微小組織アレイにおけるそれらの3D培養について述べる。自発的に鼓動する心臓ミクロ組織を生成するこの容易な方法は、心臓生理機能の機能的および機構的理解のための疾患モデリングおよび薬物の迅速な試験に利用することができる。さらに、このような多細胞心臓マイクロ組織プラットフォームは、慢性または急性の培養条件下で経時的に心臓病の進行をエミュレートするために、ゲノム編集技術によって利用され得る。

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Protocol

培地、試薬、培養プレート調製

  1. 細胞培養用の細胞洗浄溶液:カルシウムまたはマグネシウムを含まない1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはハンクス平衡塩溶液(HBSS)を使用する。
  2. 心筋細胞分化培地
    1. 500 mLの心筋細胞基礎培地(RPMI 1640)に10 mLサプリメント(50x B27 + インスリン)を加えて分化培地#1を調製する。
    2. 500 mLの心筋細胞基礎培地(RPMI 1640)に10 mLサプリメント(50x B27マイナスインスリン)を加えて分化培地#2を調製する。
    3. 500mLの心筋細胞基礎培地(RPMI 1640)にサプリメント(50x B27プラスインスリン)を加えて精製培地#3を調製し、グルコースを差し引いた。
  3. 内皮増殖培地および磁気活性化細胞選別(MACS)試薬
    1. 市販の内皮細胞増殖用培地サプリメントキットを用いて内皮増殖用培地(EGM)を調製する。
    2. ウシ血清アルブミン(BSA)原液をリンス液で1:20に希釈して細胞分離選別緩衝液を調製する。
  4. 心線維芽細胞分化培地:線維芽細胞基礎培地(DMEM-高グルコース)と無血清線維芽細胞生命因子キットを用いて心臓線維芽細胞分化培地を調製する。
  5. 心臓微小組織作製および維持培地:サプリメント(50x B27プラスインスリン)およびEGMを含む心筋細胞基礎培地(RPMI 1640)を含む濾過培地を70/30v/v%比で調製する。
  6. 低分子および成長因子ストックソリューション
    1. 3つの細胞型すべての分化のために、GSK3-β阻害剤 CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル)の200μLアリコートを調製する);Wnt阻害剤 IWR-1-エンド (4-(1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロ-1,3-ジオキソ-4,7-メタノ-2H-イソインドール-2-イル)-N-8-キノリニル-ベンズアミド;および形質転換成長因子β(TGF-β)阻害剤 SB431542 (4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンザミド)をジメチルスルホキシド(DMSO)中10mM濃度で投与した。
    2. ヒトiPSC-EC分化のために、超高純度蒸留水中の0.1%(w/v)BSA中に、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(20μg/mL)、血管内皮増殖因子165(VEGF165;50μg/mL)、および骨形成タンパク質4(BMP4;20μg/mL)の100μLアリコートを調製する。アリコートを-20°Cで保管する。長期保存の場合、アリコートは-80°Cで最大1年間保存できます。
  7. iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFのメンテナンス用プレコーティングプレート。
    1. 成長因子還元(GFR)基底膜マトリックス培地をDMEM/F12で1:200の比率で希釈することにより、iPSC-CM再めっき用の基底膜マトリックス培地コーティング6ウェルプレートを調製する。希釈した基底膜マトリックス培地2mLを6ウェルプレートの各ウェルに加え、少なくとも2〜4時間セットしたままにする。
    2. 6ウェルプレートまたは10cm皿をゼラチンでプレコートする。2%ゼラチン溶液を37°Cのウォーターバス中で液化し、必要に応じてPBS中の濾過した0.2%(v/v)ゼラチンを適量に調製する。使用前に、培養プレートを0.2%ゼラチン10 mLで37°Cで少なくとも30分間コーティングする。
      注:ゼラチンプレートは、MACSの後のiPSC-CFとiPSC-ECの両方に使用できます。
  8. マイクロ組織カビの作製:乾燥した100mLガラス瓶にPBS中の2%低融点アガロース溶液を調製する。使用前にアガロースを121°C、15psiで20分間滅菌する。この流延用シリコーンマイクロモールドを121°Cでオートクレーブし、15psiで15分間処理した。
  9. 消化、免疫染色、フローサイトメトリーのためのソリューション
    1. 微小組織消化のために、PBS中のディスパーゼI(1U/mL)およびリベラーゼ(3U/mL)の酵素消化緩衝液を調製する。この溶液を氷の上に保管してください。
    2. 細胞および微小組織の両方の固定には、4.2%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む氷冷市販の固定試薬を使用してください。
    3. 透過処理のためにPBS中に0.25%Triton X-100を、洗浄のために0.1%Tween-20を準備する。溶液は室温で保存することができる。
    4. 蛍光活性化細胞選別(FACS)分析のために、FACS緩衝液[PBSまたはHBSSと2%ウシ胎児血清(FBS)]を調製し、4°Cで保存する。
    5. 免疫染色のために、PBS中に2%の正常なヤギ/ロバ/ウサギ血清を調製する。抗体が産生された宿主に基づいて血清種を選択する。

2. 心臓分化と浄化

注:すべてのiPS細胞は、心筋細胞分化の前に〜75%〜80%のコンフルエンシーに維持されるべきである。このプロトコールに使用されたiPSは、スタンフォード心臓血管研究所(SCVI)バイオバンクで実施されたセンダイウイルスリプログラミングを使用して末梢血単核球(PBMC)から誘導された。

  1. 分化に先立ち、継代までのiPSCコロニーを培養する(P20)。
  2. 6ウェルプレートからiPSC培養液を取り出し、2mL PBSで細胞を1回洗浄した。
  3. 0日目に、各ウェルにCHIRを有する分化培地#1(6μM最終)を2mL添加することによって中内胚葉誘導を開始する。最終濃度は、異なるiPSCラインに対して6〜9μMの間で変化し得る。したがって、最適な心臓中胚葉誘導を同定するために、6ウェルプレート上で異なるCHIR濃度を試験することが推奨される。
  4. 2日目に、各ウェル内の新鮮な2mL培地#1と交換することによって細胞を回収する。
  5. 3日目に、各ウェルの培地をWnt阻害剤IWR-1-endo(5μM)を有する2mL分化培地#1と交換し、心臓系統仕様を誘導した。
  6. 5日目に、各ウェル内の培地を新鮮な2mL培地#1に交換することによって細胞を回収する。
  7. 7日目に、各ウェルの培地#2を2mL培地に交換する。心筋細胞の自発的な鼓動は、早くも8〜9日目に観察され得る。一部の系統では、拍動細胞は11日目まで現れることがあります。
  8. 分化培養物の精製のために、10日目に各ウェル中のグルコース培地#3を2mLから除いたものと交換する。
  9. 13日目に、各ウェルにグルコースを加えた培地#2で2mLの培地を交換して細胞を回収した。
  10. 16日目に、各ウェルに2mLの培地#3を用いて第2ラウンドの精製を行う。
  11. 19日目にグルコース培地#2を加えた2mLで細胞を回収する。
  12. 20日目に、ウェルを1mLのPBSで1回洗浄し、1mLの10xトリプシンを用いて37°Cで6分間細胞を解離させた。 インキュベーション後、細胞をウェル表面から15秒未満で単一細胞に持ち上げ、等量の培地#2で15mL円錐管に添加して酵素を中和する。細胞懸濁液を270 x gで3分間遠心分離 する。
  13. 細胞ペレットを3mL培地#3に再懸濁する。細胞をカウントし、適切な量の培地#3を加えて、新しい基底膜マトリックス培地コーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに合計〜300万個の細胞をプレート化する。再めっき後2日目に、培地を新鮮な2mL培地#2と交換し、凍結または将来の実験のために心筋細胞のトリプシン処理まで1日おきに2mL培地#2を補充する。

3. 内皮細胞分化とMACS

  1. 75%〜80%のiPSCコンフルエントで、プレートをPBS、1ウェルあたり2mLで洗浄する。
  2. 分化培地#1を6 μM CHIRで2 mLの分化培地と交換することにより、0日目に分化を開始する。
  3. 2日目に、培地を2 μM CHIRを有する2 mLの分化培地#1と交換する。
  4. 4日目に、培地を、20 ng bFGF-2、50 ng VEGF165、および20 ng BMP4を添加した2 mLのEGMと交換する。
  5. 6日目から10日目まで2日ごとに成長因子を添加した2mLのEGMで培地を交換してください。TGFβ阻害剤(SB431542)を8μM濃度で添加することは、内皮拡張を促進し、他の間葉起源細胞型の分化を抑制するために任意である。
  6. 12日目に、各ウェルを1mLのPBSでリンスし、続いて6ウェルプレートの各ウェルに1mLの10xトリプシンを用いて37°Cで8分間細胞解離することによって、MACSのステップを開始する。
  7. 50mL円錐管に等量のEGM培地を調製し、解離酵素を中和する。50 mL円錐管上に40 μmの細胞ストレーナーを置き、解離した細胞懸濁液をストレーナーに通す。2 ~ 3 個の解離ウェルごとにフィルターを変更します。
  8. 血球計数器または自動細胞カウンターを使用して0.4%トリパンブルーを使用して全生細胞を列挙する。
  9. 細胞懸濁液を300 x g でペレット化し、4°Cに設定した予備冷却遠心分離機で5分間反応させた。
  10. 上清を捨て、ステップ3.8の総カウントに基づいて適切な量の選別バッファーに細胞ペレットを再懸濁する。
    注: 全細胞 107 個あたり 80 μL の選別バッファーを追加します。
  11. 磁気ビーズ標識のために、107 細胞あたり20μLのFcRブロッキング試薬を添加し、5分間インキュベートする。
  12. 107細胞あたり20μLのCD144またはCD31マイクロビーズを加え、よく混合する。細胞懸濁液を暗所で4°Cで15分間インキュベートする。
  13. 20mLの選別バッファーを加えて標識細胞を洗浄し、4°Cに設定した予備冷却遠心分離機で細胞300 x g を5分間ペレット化する。
  14. 細胞ペレットを3mLの選別バッファーに再懸濁し、氷上に放置する。
  15. セパレーターノッチにカラムを配置して磁気分離カラムを作製する。
  16. 3 mL の選別バッファーですすぎでカラムを平衡化し、その流れを廃円錐管に集めます。
  17. すすぎバッファーが流れたら、細胞懸濁液を徹底的に再懸濁して凝集塊を壊し、細胞懸濁液をカラムに塗布します。
  18. 細胞懸濁液が流れた後、カラムを3mLの選別バッファーで3回洗浄し、標識されていない細胞を除去します。
  19. カラムを分離器から取り出し、CD144+/CD31+ 細胞溶出用の 15 mL 円錐管に入れます。
  20. 5 mL の選別バッファーをカラムに加え、磁気標識された細胞をプランジャーで直ちにフラッシュします。
  21. 血球計数計または自動細胞カウンターを使用して0.4%トリパンブルーを使用して生細胞数を決定します。
  22. 細胞懸濁液を300 x g で3分間予冷遠心分離機で遠心分離する。
  23. ステップ3.21の総カウントに基づいて、細胞ペレットを5〜8μMのTGFβ阻害剤(SB431542)で適切な量のEGMに再懸濁する。
  24. この継代0(P0)細胞を適切な細胞密度(4 x 104 cells/cm2)でプレコーティングされた0.2%ゼラチンプレート上にプレートします。
  25. P0およびP1については、TGFβ阻害剤と共に2日ごとに新鮮なEGMを培地に補充し続ける。P2から、細胞はTGFβ阻害剤を含まない内皮増殖培地中で培養することができる。

4. 心臓線維芽細胞分化

  1. iPSCが90%〜95%コンフルエントになるようにします。各ウェルを1mL PBSで洗浄する。
  2. 分化培地#1に2 mLを11 μM CHIRとともに加えることにより、0日目に分化を開始する。高感度iPSCラインの場合、濃度は9~10μMの間で変化し得る。
  3. 1日目に,お皿を観察します。〜30%〜40%の細胞がプレートに接着した状態で有意な細胞死を観察することは正常である。
  4. 3日目に、5μM IWR-1-endoを含む分化培地#1に2mLを加え、心臓前駆細胞の拡大を促進する。
  5. 4日目に、培地を2mLの心臓線維芽細胞分化培地と交換する。16日目まで2日ごとに新鮮な培地と交換してください。
  6. 18日目に、6ウェルプレートの各ウェルに1mLの10xトリプシンを用いて、37°Cで10分間細胞を剥離した。
  7. 細胞層を十分に破壊し、5%FBSを添加した等量のDMEM/F12培地を含む50mL円錐管内の70μmセルストレーナーに細胞懸濁液を通す。
  8. 血球計数計または自動細胞カウンターを使用して0.4%トリパンブルーを使用して生細胞数を決定します。
  9. 細胞懸濁液を300 x g で5分間遠心分離し、ペレットを得た。
  10. 最初の再めっきでは、細胞ペレットを適量の分化培地に再懸濁し、細胞密度(6 x 104 cells/cm2)で0.2%ゼラチンコーティングプレート上に90%コンフルエントになるまでプレートします。
  11. プレートを分割し、ゼラチンコーティングプレート上の10%血清を含む通常のDMEM/F12で心臓線維芽細胞を維持する。

5. 心臓微小組織カビの鋳造と細胞播種

  1. アガロースを100mLガラス瓶に入れた電子レンジで沸騰するまで溶かします。アガロースボトルをスプレーし、バイオセーフティキャビネットに入れます。アガロースを約3分間冷却します。
  2. 9 x 9アレイのシリコーンマイクロモールドに溶融アガロース700 μLのピペット。ピペッティング中に気泡を発生させないでください。
  3. 予め冷却された氷のブロックに金型を慎重に置き、アガロースのゲル化を加速します。
  4. アガロースがゲル化したら、半透明になることを確認します。マイクロモールドの縁の周りを慎重に曲げて、アガロースのレプリカを緩めます。次いで、レプリカを四方から静かに剥離し、アガロースレプリカをシリコーンマイクロモールドから剥離する。
  5. 81個の円形凹部(直径800μm;深さ800μm)を含むアガロースマイクロ組織トレイを滅菌12ウェルプレートに移す。
  6. 2mLのPBSをアガロースマイクロティッシュトレイに加え、顕微鏡下で捕捉された気泡または不規則な形状のウェルがないか検査する。
  7. アガローストレイを2mLの70%エタノールに一晩浸漬し、続いてバイオセーフティキャビネット内で1時間UV処理を行った。
  8. 使用前に、70%エタノールを除去し、蒸留水で2回洗浄し、2mLのPBSで最終洗浄した。
  9. iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFをトリプシン処理、中和、およびカウントし、細胞懸濁液を氷上に置きます。
  10. PBSをウェルおよび細胞播種チャンバーから、凹部に触れることなく慎重に取り外す。
  11. 新しいチューブに、iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFをそれぞれ7:2:1の比率で混合し、最終細胞密度を106 細胞/mLに達成します。細胞密度が高いほど、ミクロ組織が大きくなります。
    注: 2 x 106 セル/mL を超えないようにしてください。
  12. 200μLの細胞懸濁液を播種チャンバーに滴下して慎重に加える。
  13. 細胞をCO2 インキュベーター内で37°Cで2時間沈降させる。
  14. アガロースモールドを囲む微細組織作製培地を加えて、内部チャンバーの表面を覆うだけです。
  15. 24時間後、細胞は自己集合し、円形の凹部で有意にコンパクトになる。メンテナンスのために2日ごとに新鮮な培地と交換してください。

6. 免疫染色のための細胞および心臓微小組織の固定および透過処理

  1. 個々の細胞タイプごとに、基底膜マトリックス培地またはゼラチンコーティングチャンバースライド(約2.5-3 x 105 細胞/mL)上で細胞を別々に培養する。心臓ミクロ組織は、円形の凹部から静かに洗い流すことによって、15mLの円錐形のチューブに集めることができる。
  2. 培地を吸引し、細胞または微小組織を1mLのPBSですすいでください。その後、4.2% PFAを含む固定緩衝液でチャンバースライドを20分間、ミクロ組織を室温で1時間固定する。
  3. PFAを吸引し、15mL円錐管にチャンバースライド用に5〜7分間、微小組織用に20分間、透過処理溶液(PBS中の0.25%Triton X-100)1mLを加える。
    注:このステップ以降、サンプルはベンチトップのロッキングプラットフォーム上で静かに揺らすことができます。
  4. 透過処理液を吸引し、2〜3mLのPBSで1回すすいでください。
  5. 細胞を500~1,000 μLのブロッキング溶液(2%~5%正常ヤギ血清またはロバ血清)とともにチャンバースライドで少なくとも1時間、微小組織で3~4時間インキュベートします。
  6. 細胞または心臓ミクロ組織を、試料を覆うのに十分なブロッキング溶液中に調製した結合抗体と共にインキュベートする。抗心臓トロポニン-T(cTnT2)(1:50)、抗CD31(1:75)、および抗DDR2/ビメンチン(1:50)とともにチャンバースライドで1時間、心臓ミクロ組織については4°Cで一晩インキュベートする。
  7. チャンバースライドを500 μL 0.1% Tween-20で3回、各洗浄とPBSによる最終洗浄の間に5分間洗浄する。
  8. 心臓ミクロ組織については、2mLの0.1%Tween-20で5回洗浄し、各洗浄の間に20分間の持続時間を設けた。最終洗浄ステップをさらに20分間実行します。
  9. 共焦点顕微鏡検査の前に、細胞またはミクロ組織を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(1μg/mL)とともにインキュベートする。
  10. 心臓ミクロ組織の場合は、35mmのガラス底皿に慎重に移し、PBSを加えてマイクロ組織を沈めます。
  11. 3Dイメージングでは、マイクロ組織の20倍または40倍の油浸対物ゲインセンターフォーカスを使用し、各蛍光色素分子の露光パラメータを調整します。
  12. Zスタックを取得するには、スライス間隔5~10μmで合計撮影深度100~200μmのライブモードで最初と最後の座標を設定します。

7. 心臓ミクロ組織の消化とフローサイトメトリーのための細胞の調製

  1. ミクロ組織を消化するには、ワイドボア 1 mL ピペットチップを使用して、Medium #1 のマイクロ組織を円形の凹部から 15 mL の円錐形チューブに静かに洗い流します。
  2. 微小組織が沈降して培地を注意深く吸引し、細胞または微小組織を1mLのPBSですすぎ、200〜300μLの酵素消化緩衝液を37°Cで20分間加える。 10分間で、微小組織を1分間穏やかに混合し、残りの時間、37°Cで再度インキュベートする。
  3. インキュベーション後、通常の1mLピペットチップを使用して微小組織を激しく混合し、濁った細胞懸濁液を得た。
  4. マイクロ組織が単一細胞に十分に消化されたら、直ちに5%FBSを含む5mLの培地で細胞懸濁液を中和し、40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を緊張させる。細胞の総数をカウントし、単一細胞懸濁液を300 x g で4°Cで5分間遠心分離した。
  5. 上清を吸引し、1 x 105-1 x 106 細胞をFITC Annexin Vおよび100 μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)またはTo-Pro3死細胞排除色素と共に100 μLのアネキシン結合バッファーに氷上で10分間再懸濁する。
  6. インキュベーション後、300 μLのアネキシン結合緩衝液を細胞懸濁液に加え、フローサイトメトリー分析のために丸底FACSチューブに移す。選択した蛍光色素には、正しいレーザーと発光フィルターを使用してください。
  7. 固定細胞を用いた細胞表面マーカーの定量のために、ステップ6.2および6.3に記載されるように細胞ペレットの固定および透過処理を行う。
  8. 透過処理後、細胞ペレットをすすぎ、細胞をそれぞれの結合抗体と共に1時間インキュベートする。細胞ペレットを4 mL FACS緩衝液(PBS中の2% FBS)で洗浄し、300 x g で3分間遠心分離する。洗浄ステップを 2 回繰り返します。
  9. フローサイトメトリー分析のために細胞を200~300 μL FACSバッファーに再懸濁する。
  10. 染色されていないサンプルで順方向散乱特性と側面散乱特性を調整し、各蛍光色素分子にアイソタイプコントロールを使用してレーザー電圧を調整することを検討してください。データ分析のために少なくとも 20,000 個のイベントを収集します。

8. 自発的に鼓動する心臓微小組織の収縮解析

  1. 心臓ミクロ組織のビデオを録画して、少なくとも3つのビートをキャプチャします。録画解像度をフレームレート >30 フレーム/秒) で少なくとも 1280 x 720 ピクセルに設定し、 にビデオを保存します。AVI形式。
  2. MATLAB環境でMotionGUIスクリプト11 を実行して、ユーザーインターフェイスを起動します。
  3. を見つけます。ビデオをロードするためのフォルダ内のAVIファイルの場所。次に、ビデオがキャプチャされたフレームレートを入力パネルに入力します。
  4. 高度な入力パネルでは、解像度とキャプチャ倍率に基づいてピクセルサイズを指定できます。
  5. 適切なマクロブロックピクセルサイズ(デフォルトは16)を指定し、ミクロ組織収縮の強さに応じて検出可能なピクセル運動をすることができる。
  6. パラメータを調整したら、[ 動きベクトルの取得] をクリックして解析を開始します。
  7. 「 AOI を選択」 ラジオボタンで関心のある領域を選択し、円形のくぼみ内の単一のマイクロ組織を囲む領域を除外します。
  8. 関数 Map Time Ave を使用して、X 軸と Y 軸で検出された動きに基づいて平均収縮ヒートマップを生成します。
  9. ピークトレースデータの場合は、収縮 データの取得 関数を使用して、収縮ピークと緩和ピークを自動的に測定します。
  10. 信号対雑音比が低い場合は、ピーク高さと距離のしきい値を適用して、最大収縮速度(青い点)と最大緩和速度(赤い三角形)に正しく注釈を付けます。
  11. 正しいしきい値を設定した後、[ ピークを分析] を選択して、ビート レートとビート間隔で収縮と緩和の値を取得します。
  12. 統計分析のために、少なくとも25個の個々の微小組織から測定値を取得します。

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Representative Results

iPSC由来のCM、EC、CFの免疫染色およびフローサイトメトリー特性評価
iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFからなる心臓ミクロ組織を生成するために、3つの細胞型すべてを分化させ、個々に特徴付ける。iPSCからiPSC-CMへのインビトロ分化は、過去数年間で改善されています。ただし、iPSC-CMの収率と純度はラインごとに異なります。現在のプロトコルでは、純度75%を超えるiPSC-CMが生成され、9日目頃に自発的にビートを開始します(図1A)。9日目から14日目までのさらなる精製ステップは、前述のようにiPSC-CM純度を80%以上に改善することができる12。同様に、高純度のiPSC-ECは、表現型的に明確に定義されたiPSC-ECを形成するために、4〜5日目(図1B)頃に中胚葉から生じる内皮前駆細胞を分極させるいくつかの血管成長因子の添加を含む、以前に公開されたプロトコル13,14を使用して生成することができる。iPSC-CFは、その位置に基づいて高度に異種の集団であり、その形態および細胞外マトリックスタンパク質の発現に基づいて特徴付けられる。ここで、公開されたプロトコール15、16、17を改変して用いて、ヒトiPSC-CFは心臓中胚葉前駆細胞から取得される(図1C)。

Figure 1
図1:差別化のタイムライン (A)iPSC-CM、(B)iPSC-EC、および(C)iPSC-CF分化タイムラインの全体図を、分化および精製ステップ後の細胞の代表的な位相差画像とともに示す。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFの純度は、それぞれcTnT2、血小板内皮細胞接着分子(PECAM1/CD31)およびビメンチン(VIM)を用いた免疫染色およびフローサイトメトリーによって決定された(図2A)。定量分析は、20日目に90%以上のcTnT2細胞を含む精製集団を示した。MACS後12日目に得られたiPSC-ECをCD31ビーズを用いて、PECAM1/CD31内皮細胞表面マーカーに対する免疫染色で同定した。MACSは、P0における95%以上のCD31+細胞によって証明されるように、高純度の内皮細胞を産生した。しかしながら、内皮細胞の純度は脱分化のためにより高い継代数とともに減少したことに留意しなければならない。同様に、20日目にフローサイトメトリー分析により、95%以上のiPSC-CFが線維芽細胞マーカーVIMを発現していることが明らかになった(図2B)。

Figure 2
(A)[左から右パネルへ]cTnT2で染色した25日目のiPSC-CM(シアン)、PECAM1/CD31で染色したiPSC-EC(緑)、VIM(赤)で染色したiPSC-CF、DAPIで染色した核(青)。スケールバー = 50 μm. (B) [左から右パネル] フローサイトメトリー定量では、分化後、iPSC-CM(91.8%)、iPSC-EC(98.1%)、およびiPSC-CF(96.7%)の純度が高いことが示されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

心臓微細組織培養物の作製とサイズ解析
iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFの単一細胞懸濁液を7:2:1の比率で混合し、滅菌アガロースレプリカモールドの細胞播種チャンバーに慎重に分注した(図3A、B)。細胞は2時間で円形の凹部内に均一に沈降した。3日目頃、自己組織化細胞は、自発的に鼓動する心臓ミクロ組織に均一なサイズに組織化する(図3C)。異なるサイズの微小組織のアレイは、最終的な細胞密度を調整することによって作製することができる(図3D、E)。最終細胞密度が1 x 106細胞/mLで作製された心臓微小組織は、直径が約300〜350μm、直径が約600μm、直径が約600μm、直径が4 x 106細胞/mLを超える。微小組織アセンブリは、実験に典型的に使用される1 x 106細胞/mLの細胞密度で得られた。これらの微小組織培養物は、培養中に最大6週間維持することができる。

Figure 3
図3:多細胞心臓ミクロ組織を生成するためのレプリカ成形技術。 (A)(B)自己組織化のためにマイクロウェルの内部に捕捉されたiPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CF混合物のレプリカ成形アガロースマイクロウェルトレイ。(C)3日目における心臓ミクロ組織の圧密化を示す顕微鏡写真。(D)形成された心臓ミクロ組織サイズは、初期播種密度との線形関係を示し、細胞密度が高いほど微細組織が大きくなる。(e)マイクロウェルアレイにおける自己組織化心臓ミクロ組織を示す代表的な図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

酵素消化後の免疫染色と生存率
iPSC-CMに対するcTnT2、iPSC-ECに対するCD31、およびiPSC-CFに対するDDR2に対する抗体を用いた作製後12日目の免疫蛍光染色は、心臓ミクロ組織におけるユニークな細胞分布を明らかにした。3つの細胞型の中で最も重いiPSC-CMが中心を占めていたのに対し、iPSC-ECはミクロ組織全体に散在しており、iPSC-CFが主に周辺を占めていることが観察された(図4A)。Dispase IおよびLiberase TLを使用して達成された微小組織の短時間および迅速な消化は、培養2週間後に5%未満のアポトーシス細胞を有する全体的な高度に生存可能な細胞比率(図4B、トップパネル)をもたらした。これに続いて、用量依存性心毒性を誘導することが知られている化学療法薬であるドキソルビシンの高濃度(5μM)への心臓ミクロ組織の短時間の1時間曝露が続いた(図4B、下部パネル)。

Figure 4
図4:心臓ミクロ組織の免疫染色および細胞生存率の評価。 (A)iPSC-CM(cTnT2)、iPSC-EC(CD31)、iPSC-CF(DDR2)、および核(DAPI)で染色されたヒト心臓ミクロ組織の共焦点zスタック画像。(B)単一細胞懸濁液に酵素的に消化し、アネキシンV(アポトーシスマーカー)および死細胞排除色素(To−Pro3)で染色した心臓微小組織のフローサイトメトリープロット。消化された単一細胞懸濁液は、5μM濃度で1時間処理した単一細胞懸濁液と比較して、<5%のアポトーシス細胞集団(上部パネル)で高い細胞生存率(91%)を示した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

計算収縮性解析
個々の心臓ミクロ組織の収縮性解析は、MATLABベースの画像解析ツールの助けを借りて実行できます。自発的に鼓動する心臓ミクロ組織のビデオ記録を、分析のために30fpsで得た。前述のように11、ブロックマッチング方式は、動きベクトルの時系列として取得された全フレームに対する画素のブロックの動きをキャプチャするために、動き追跡アルゴリズムを採用する。ミクロ組織の収縮性とベクターの動きは、ミクロ組織全体の平均または平均収縮プロファイルを示す擬似ヒートマップを生成します(図5A)。心臓ミクロ組織の収縮運動は、収縮速度(青い丸)、緩和速度(赤い三角形)、および拍動速度として測定される正のピークを生成し、最後のものは2つの収縮サイクル間の時間として計算される(図5B)。さらに、心臓ミクロ組織の収縮性は、培養において4週間にわたって有意に変化しない(図5C)。

Figure 5
図5:心臓微小組織の収縮解析(A)作製後1週間の心臓微小組織の位相差画像及び収縮マップ。(B)心臓ミクロ組織は、規則的な収縮および弛緩プロファイルおよび拍動速度を示す。表は、拍動速度、最大収縮速度、および緩和速度の代表的な値を示す。(c)心臓ミクロ組織の4週間までの長期培養は、収縮性パラメータに有意に影響しない(n = 20/群)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

分化前のiPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFから心臓ミクロ組織を生成するためには、心臓ミクロ組織内での接触阻害細胞圧縮後の細胞数をよりよく制御するために、高純度の培養物を得ることが不可欠である。最近、ジャコメッリら。al.18 は、iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFを用いた心臓微小組織の作製を実証している。記載された方法を用いて生成された心臓微小組織は、〜5,000個の細胞(70%のiPSC-CM、15%のiPSC-EC、および15%のiPSC-CF)からなる。この方法では、心筋細胞と内皮細胞の両方を共分化させ、続いてCD34+マーカーを用いて内皮前駆細胞を分離した。ここで説明する現在のプロトコルは、マイクロ組織あたり12,000個の細胞(70%のiPSC-CM、20%のiPSC-EC、および10%のiPSC-CF)で構成されており、下流の単一細胞分析ではコンストラクトあたりの細胞数が多くなります。さらに、3つの細胞型すべてが別々に分化しているため、細胞集団には限られた不均一性があり、これは治療に対する細胞特異的応答を理解することに特有である。

心筋細胞分化に関して、我々と他の人々は、化学的に定義された培養条件を用いて純粋な心筋細胞の誘導を以前に実証した12、19、20。簡単に言えば、分化は中内胚葉誘導から始まり、心臓系統仕様を促進するWnt/β-カテニンシグナル伝達の調節が続く。グルコース欠乏培地中での心筋細胞のさらなる精製は、非心筋細胞の排除を可能にする。ここで、精製培地での培養の長期化は心筋細胞の品質を妨げる可能性があることに注意することが重要です。最近発表されたプロトコルは、初期段階の心筋細胞の増殖能力を利用して多数の細胞を得ることができることを示している。ヒトiPSC-CMの拡大は、初期の増殖期に強力なマイトジェンであるCHIRを再導入することで誘導されます21。正確な分子機構はまだ不明ですが、この技術はiPSC-CM収率を10倍または100倍に大幅に改善することができます。さらに、疾患モデリングのためのiPSC-CMの忠実度を向上させるために、成熟培地で培養して、電気生理学的、機械的、および構造的成熟を高めることができます22。iPSC-CM成熟技術の徹底的な概要は、他の場所でレビューされています23。

血管内皮細胞は、異なる精製可変効率を有する多能性幹細胞から生成されている13、24、25。現在のプロトコルは、高い分化効率と、MACS26による表現型的に安定したiPSC-ECの選択を提供します。機能的な心臓線維芽細胞を生成するための分化方法論は、iPSC-CFs17を生成するためのWnt経路および線維芽細胞増殖因子(FGF)シグナル伝達の調節に従う。インビボでCFは、心外膜、心内膜、および神経堤の前駆細胞に由来する16,27,28,29。ここで、CF系統は、中間体として心外膜細胞を生成することなくコミットされた中胚葉系心臓前駆細胞から生成される。全体として、iPSC-CM、iPSC-EC、およびiPSC-CFを生成するためにここで説明するプロトコルは、表現型特性に基づく再現性の容易さと高純度を考慮に入れています。高品質の微小組織を得るためには、個々の細胞型ごとに>90%の純度を得ることが重要です。細胞表現型におけるより高い純度はまた、異なる処置による細胞軌道の変化の検出を確実にするであろう。

3つの細胞タイプすべての導出が成功した後、細胞をアガロース播種チャンバに慎重に分注し、円形凹部内の細胞の沈降を可能にする。重要なパラメータには、均質な単一細胞懸濁液を達成すること、および心臓ミクロ組織のサイズ分布の変動を引き起こす可能性のある細胞凝集塊または凝集塊を防止することが含まれる。全体的な構造の観点から見ると、3D構築物は栄養素の拡散によって制限されることが多く、細胞密度が増加するにつれて、構築物のサイズおよび厚さも直線的に増加する。球状構造の形態の組織工学的構築物は、等方性拡散度およびコアから表面への固定距離30、31のために均一な栄養素消費速度を有する。微小組織の最終的なサイズは、栄養素の濃度勾配および中心への酸素拡散を決定する。静置培養システムでは、350〜400μmを超える構築物は、長期間にわたって培養すると壊死性細胞コアにつながる可能性がある。したがって、播種密度を慎重に考慮する必要があります。心臓微小組織モデルの限界は、単一細胞の幾何学的閉じ込めを伴う方法論によって提供される心筋細胞アライメントを可能にしないことである。したがって、筋節アライメントや長さなどのパラメータの定量化は、ランダムな多次元細胞集合のために制限されたままである。制限にもかかわらず、この技術は、心血管細胞上の薬物または小分子毒性の迅速な用量依存的評価を可能にする32。最近の研究では、iPSC-CMからなる3Dミクロ組織を用いて二次性鉄過負荷誘発性心筋症をモデル化し、高濃度の鉄処理による微小組織サイズの大幅な減少を観察しました33。

免疫染色に関しては、2D培養物とは異なり、より長い透過処理および一次抗体インキュベーション持続時間が、微小組織全体にわたる抗体の拡散を可能にするために必要である。適切な抗体浸透のためのインキュベーション時間は、直径が〜400μmを超える微小組織に対してさらなる最適化を必要とする可能性がある。もう1つの重要な側面は、非特異的結合から生じるバックグラウンド蛍光を低減するための血清タンパク質によるより長いブロッキングステップである。典型的には、ヤギまたはロバ血清などの高いIgGレベルを含むブロッキング血清が好ましい。心臓ミクロ組織の構造的完全性を維持するために、我々は特定の細胞間相互作用に関与するタンパク質および培養期間にわたるそれらの維持について調査していない。細胞表現型決定のためには、高い細胞生存率および標的細胞外抗原の保存を確実にするために、微小組織を短期間で消化しなければならない。酵素消化と機械的破壊をワイドボアピペットチップと組み合わせることで、消化プロセス中に微小組織を効率的かつ軽度に処理できます。この迅速な消化プロトコルによって得られた高品質の生存可能な単一細胞は、scRNA-seq34,35,36の助けを借りて複雑な生物学的細胞間相互作用を解明するために使用することができる。

形態学的および構造的特徴付けに加えて、インビトロでの組織アセンブリの有効性、毒性、および疾患状態を評価するために、心臓ミクロ組織の機能的特性を評価することが重要である。組織収縮の定量的分析は、心機能を評価するための関連パラメータである。モーショントラッキングアルゴリズムと組み合わせたいくつかの非侵襲的ビデオ顕微鏡技術は、表現型特性に関連する心臓組織収縮の堅牢な測定によるリアルタイムモニタリングを可能にしました。表現型の変化を定量化するために、心臓ミクロ組織は、収縮パラメータの有意な変化なしに、最大4週間インビトロで維持することができる。ほとんどのソフトウェアアルゴリズムは、キャプチャされた一連のビデオフレームに重ね合わされる光フローとベクトルマッピングの原理に基づいて動作します11,37,38。オプティカルフロー解析は、アーチファクトの検出につながる可能性があります。したがって、ユーザーは、サンプルの動きや顕微鏡のステージに伝達される振動につながる可能性のある不注意な周囲の外乱を回避または最小限に抑える必要があります。収縮性解析では、事前に定義された剛性の柔軟な支柱間に形成された微小組織とは対照的に、微小組織の浮遊形態による受動張力または荷重効果を検出できない可能性があることに注意する必要があります。しかし、どちらの場合も、操作された心筋組織の収縮プロファイルは、臓器レベルで生成された収縮力を達成しないことに注意することが重要です。画像ベースのアッセイの主な利点は、非破壊的であり、広範な較正なしで急性および慢性の薬物曝露の測定を可能にすることです。これらのツールは、さまざまな2Dおよび3Dプラットフォームに適用して、治療または根底にある遺伝性疾患による心臓収縮性の変化を測定し、組織成熟戦略を評価することができます。このマイクロ組織モデルの将来の調査には、カルシウムまたは電圧感受性色素の同時記録を可能にする電気生理学的測定を組み合わせて、アレイ内の各マイクロ組織の複数の独立した記録をハイスループットな方法で取得することが含まれる可能性がある。

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Disclosures

J.C.W.はKhloris Biosciencesの共同設立者ですが、ここで紹介した研究は完全に独立しているため、競合する利害関係はありません。他の著者は競合を報告していません。

Acknowledgments

アマンダ・チェイス博士の原稿に関する有益なフィードバックに感謝します。資金援助は、カリフォルニア大学T29FT0380(D.T.)および27IR-0012(J.C.W.)のタバコ関連疾患研究プログラム(TRDRP)によって提供された。米国心臓協会20POST35210896(香港)および17MERIT33610009(J.C.W.);国立衛生研究所(NIH)R01 HL126527、R01 HL123968、R01 HL150693、 R01 HL141851、およびNIH UH3 TR002588(J.C.W)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Fisher Scientific 08-772-29
3D micro-molds Microtissues 12-81 format
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
AutoMACS Rinsing Solution Thermo Fisher Scientific NC9104697
B27 Supplement minus Insulin Life Technologies A1895601
B27 Supplement plus Insulin Life Technologies 17504-044
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Cardiac Troponin T Antibody Miltenyi 130-120-403
CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads Miltenyi 130-097-857
CD31 Antibody Miltenyi 130-110-670
CD31 Microbeads Miltenyi 130-091-935
CHIR-99021 Selleckchem S2924
DDR2 Santa Cruz Biotechnology sc-81707
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI Thermo Fisher Scientific V13242
Dispase I Millipore Sigma 4942086001
DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium 11960044
DMEM/F-12 basal medium Gibco 11320033
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
EGM2 BulletKit Lonza CC-3124
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit LifeLIne Cell Technology LS-1010
Glucose free RPMI medium Life Technologies 11879-020
Goat serum Life Technologies 16210-064
Human FGF-basic Thermo Fisher Scientific 13256029
Human VEGF-165 PeproTech 100-20
IWR-1-endo Selleckchem S7086
Liberase TL Millipore Sigma 5401020001
LS Sorting Columns Miltenyi 130-042-401
MACS BSA Stock solution Miltenyi 130-091-376
MACS Rinsing Buffer Miltenyi 130-091-222
MidiMACS Separator Miltenyi 130-042-302
RPMI medium Life Technologies 11835055
SB431542 Selleckchem S1067
TO-PRO 3 Thermo Fisher Scientific R37170
Triton X-100 Millipore Sigma X100-100ML
TrypLE Select 10X Thermo Fisher Scientific red
Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody R&D Systems IC2105G

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References

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生体工学、第169号、iPSC、心筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ミクロ組織、自己組織化
ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製
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Thomas, D., Kim, H., Lopez, N., Wu, J. C. Fabrication of 3D Cardiac Microtissue Arrays using Human iPSC-Derived Cardiomyocytes, Cardiac Fibroblasts, and Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (169), e61879, doi:10.3791/61879 (2021).

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