Summary
Här beskriver vi en lättanvänd metodik för att generera 3D självmonterade hjärt microtissue matriser bestående av fördifferentierade mänskliga-inducerad pluripotenta stamcell-härledda cardiomyocytes, hjärt fibroblaster och endotel celler. Denna användarvänliga och låga cell som kräver teknik för att generera hjärtmikrotissuer kan implementeras för sjukdomsmodellering och tidiga stadier av läkemedelsutveckling.
Abstract
Generering av mänskliga kardiomyocyter (CMs), hjärtfibblaster (CFs) och endotelceller (ECs) från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har gett en unik möjlighet att studera det komplexa samspelet mellan olika kardiovaskulära celltyper som driver vävnadsutveckling och sjukdom. Inom området hjärt vävnad modeller, flera sofistikerade tredimensionella (3D) metoder använda inducerad pluripotent stamcell-härledda cardiomyocytes (iPSC-CMs) för att efterlikna fysiologisk relevans och inhemska vävnad miljö med en kombination av extracellulära matriser och crosslinkers. Dessa system är dock komplexa att tillverka utan mikrotillverkningsexpertis och kräver flera veckor för att självmontera. Viktigast av allt saknar många av dessa system kärlceller och hjärtfibblaster som utgör över 60% av nonmyocyterna i det mänskliga hjärtat. Här beskriver vi härledning av alla tre hjärt cell typer från iPSCs att tillverka hjärt microtissues. Denna fakila replika formning teknik tillåter hjärt microtissue kultur i standard multi-well cell kultur plattor i flera veckor. Plattformen tillåter användardefinierad kontroll över mikrotissuestorlekar baserat på initial sådddensitet och kräver mindre än 3 dagar för självmontering för att uppnå observerbara hjärtmikrotissukontraktioner. Dessutom kan hjärtmikrotissuerna lätt smältas samtidigt som hög cellviabilitet för encellsförhör upprätthålls med hjälp av flödescytometri och encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq). Vi föreställer oss att denna in vitro-modell av hjärtmikrotissuer kommer att bidra till att påskynda valideringsstudier inom läkemedelsupptäckt och sjukdomsmodellering.
Introduction
Läkemedelsupptäckt och sjukdomsmodellering inom kardiovaskulär forskning står inför flera utmaningar på grund av brist på kliniskt relevanta prover och otillräckliga translationella verktyg1. Mycket komplexa prekliniska modeller eller alltför förenklade in vitro encelliga modeller uppvisar inte patofysiologiska villkor på ett reproducerbart sätt. Därför har flera miniatyriserade vävnadskonstruerade plattformar utvecklats för att hjälpa till att överbrygga klyftan, med målet att uppnå en balans mellan enkel applicering på ett sätt med hög genomströmning och trogen rekapitulering av vävnadsfunktionen2,3. Med tillkomsten av inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) kan vävnadsteknikverktyg tillämpas på patientspecifika celler med eller utan underliggande kardiovaskulärt tillstånd för att svara på forskningsfrågor4,5,6. Sådana vävnad konstruerade modeller med cellulär sammansättning som liknar hjärtvävnaden kan användas i läkemedelsutvecklingsinsatser för att testa för kardiotoxicitet och dysfunktion inducerad av patologiska förändringar i beteendet hos en eller flera celltyper.
Självmonterade mikrotissuer eller organoider som härrör från mänskliga iPSCs är tredimensionella (3D) strukturer som är miniatyrvävnadsliknande sammansättningar som uppvisar funktionella likheter med deras in vivo-motsvarigheter. Det finns flera olika tillvägagångssätt som tillåter bildandet av organoider in situ via riktad differentiering av iPSCs eller genom bildandet av embryoidkroppar4. De resulterande organoiderna är ett oumbärligt verktyg för att studera morfogenetiska processer som driver organogenes. Förekomsten av en mängd olika cellpopulationer och skillnader i självorganisering kan dock leda till variationer i resultaten mellan olika organoider5. Alternativt är fördifferentierade celler som är självmonterade i mikrotissuer med vävnadsspecifika celltyper för att studera lokala cell-cellinteraktioner utmärkta modeller, där det är möjligt att isolera de självmonterade komponenterna. Särskilt inom mänsklig hjärtforskning har utvecklingen av 3D-hjärtmikrotissuer med multicellulära komponenter visat sig vara utmanande när celler härrör från olika patientlinjer eller kommersiella källor.
För att förbättra vår mekanistiska förståelse av cellbeteenden i en fysiologiskt relevant, personlig, in vitro-modell, bör helst alla komponentcelltyper härledas från samma patientlinje. I samband med ett mänskligt hjärta skulle en verkligt representativ hjärt in vitro-modell fånga korstalken bland dominerande celltyper, nämligen kardiomyocyter (CMs), endotelceller (ECs) och hjärtfibriller (CFs)6,7. Den trogna rekapitulationen av ett myokardi kräver inte bara biofysisk sträckning och elektrofysiologisk stimulering, utan även cellcellssignalering som uppstår från stödjande celltyper som ECs och CFs8. CFs är involverade i syntesen av extracellulär matris och upprätthållande vävnad struktur; och i ett patologiskt tillstånd kan CFs inducera fibros och ändra elektrisk ledning i CMs9. På samma sätt kan ECs reglera kontraktila egenskaper hos CMs genom parakrina signalering och leverera viktiga metaboliska krav10. Därför finns det ett behov av mänskliga hjärtmikrotissuer som består av alla tre huvudcelltyper för att tillåta fysiologiskt relevanta experiment med hög genomströmning.
Här beskriver vi en bottom-up strategi i tillverkning av hjärt microtissues genom härledning av mänskliga iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs), iPSC-härledda endotel celler (iPSC-ECs) och iPSC-härledda hjärt fibroblaster (iPSC-CFs) och deras 3D-kultur i enhetliga hjärt microtissue matriser. Denna enkla metod för att generera spontant slå hjärtmikrotissues kan användas för sjukdomsmodellering och snabb testning av läkemedel för funktionell och mekanistisk förståelse av hjärtfysiologi. Dessutom kan sådana multicellulära hjärtmikrotissueplattformar utnyttjas med genomredigeringstekniker för att efterlikna hjärtsjukdomsprogression över tid under kroniska eller akuta odlingsförhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medium, reagens, odlingsplatta beredning
- Celltvättlösning för cellodling: Använd 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller Näsdukar balanserad saltlösning (HBSS) utan kalcium eller magnesium.
- Differentieringsmedium för kardiomyocyt
- Förbered differentiering Medium #1 genom att tillsätta 10 ml tillägg (50x B27 plus insulin) till 500 mL kardiomyocyt basalmedium (RPMI 1640).
- Förbered differentiering Medium #2 genom att tillsätta 10 ml tillägg (50x B27 minus insulin) till 500 mL kardiomyocyt basalmedium (RPMI 1640).
- Förbered rening Medium #3 genom att tillsätta tillägg (50x B27 plus insulin) till 500 mL kardiomyocyt basalmedium (RPMI 1640) minus glukos.
- Endoteltillväxtmedier och MACS-reagenser (Magnetic-activated cell sorting)
- Förbered endotel tillväxt medium (EGM) med kommersiellt tillgängliga endotel cell tillväxt medium tillägg kit.
- Förbered cellseparationssorteringsbuffertlösningen genom att späda ut BSA-stamlösningen (Bovin serum albumin) till 1:20 med sköljlösning.
- Hjärtfibblast differentiering medium: Förbered hjärt fibroblast differentiering medium med fibroblast basal medium (DMEM-hög glukos) och Serum-Free Fibroblast Life Factors kit.
- Hjärtmikrotissue tillverknings- och underhållsmedium: Förbered filtrerat medium med kardiomyocyt basalmedium (RPMI 1640) med tillägg (50x B27 plus insulin) och EXTRAM i förhållandet 70/30 v/v%.
- Små molekyl- och tillväxtfaktorlagerlösningar
- För differentiering av alla tre celltyperna, förbered 200 μL alikvoter av GSK3-beta-hämmaren CHIR 99021 (6-[2-[4-(2,4-Diklorfenyl)-5-(5-metyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]amino]amino]-3-pyridinkarbonitril); Wnt-hämmare IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; och transformerande tillväxtfaktor beta (TGF-β) hämmare SB431542 (4-[4-(1,3-Bensodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamid) vid 10 mM koncentration i dimetylsulfoxid (DMSO).
- För differentiering av humant iPSC-EC, bered 100 μL alikvoter med grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) (20 μg/ml), vaskulär endoteltillväxtfaktor 165 (VEGF165; 50 μg/ml) och benmorfogenetiskt protein 4 (BMP4; 20 μg/mL) i 0,1% (w/v) BSA. Förvara alikvoterna vid -20 °C; För långtidsförvaring kan alikvoter lagras vid -80 °C i upp till 1 år.
- Förbeläggningsplattor för underhåll av iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs.
- Förbered källarmembranmatris mediumbelagda 6-brunnsplattor för iPSC-CM-omplätering genom att späda tillväxtfaktorreducerat (GFR) källarmembranmatrismedium i DMEM / F12 i ett 1:200-förhållande. Tillsätt 2 ml utspädd källarmembranmatrismedium till varje brunn på 6-brunnsplattan och låt den ställas in i minst 2 till 4 timmar.
- Förlacka 6-brunnsplatta eller 10 cm maträtt med gelatin. Flytande 2% gelatinlösning i ett vattenbad vid 37 °C och bered filtrerat 0,2% (v/v) gelatin i PBS i lämplig volym efter behov. Täck odlingsplattan med 10 ml 0,2% gelatin i minst 30 min vid 37 °C före användning.
OBS: Gelatinplattor kan användas för både iPSC-CFs och iPSC-ECs efter MACS.
- Tillverkning av mikrotissueformar: Förbered 2% låg smältande agaroslösning i PBS i en torr 100 ml glasflaska. Sterilisera agaros vid 121 °C, 15 psi i 20 minuter före användning. Autoklavera gjut silikonmikroformarna vid 121 °C, 15 psi i 15 min.
- Lösningar för matsmältning, immunstainering och flödescytometri
- För microtissue matsmältning, förbereda en enzym matsmältningsbuffert av Dispase I (1 U/mL) och Liberase (3 U/mL) i PBS. Håll lösningen på is.
- För både cell- och mikrotissuefixering, använd iskallt kommersiellt tillgängligt fixeringsreagens som innehåller 4,2% paraformaldehyd (PFA).
- Förbered 0,25% Triton X-100 i PBS för permeabilisering och 0,1% Tween-20 för tvättar. Lösningen kan förvaras i rumstemperatur.
- För fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analyser, förbered FACS-buffert [PBS eller HBSS med 2% fetalt bovinserum (FBS)] och förvara vid 4 °C.
- För immunstaining, förbered 2% normalt get-/åsna-/kaninserum i PBS. Välj serumart baserat på värden där antikropparna höjdes.
2. Hjärtdifferentiering och rening
OBS: Alla iPSCs bör bibehållas vid ~ 75% till 80% confluency före kardiomyocyt differentiering. IPSCs som används för detta protokoll härleddes från perifera blod mononukleära celler (PBMCs) med Sendai virus omprogrammeras utförs vid Stanford Cardiovascular Institute (SCVI) Biobank.
- Före differentiering, kultur iPSC kolonier upp till passage (P20).
- Ta bort iPSC-odlingsmediet från 6-brunnsplattan och tvätta cellerna en gång med 2 ml PBS.
- På dag 0, börja mesendoderm induktion genom att lägga till 2 ml differentiering Medium #1 med CHIR (6 μM final) i varje brunn. Den slutliga koncentrationen kan variera mellan 6 och 9 μM för olika iPSC-linjer. Därför rekommenderas att testa olika CHIR koncentrationer på en 6-väl platta för att identifiera optimal hjärt mesoderm induktion.
- På dag 2, återställ cellerna genom att ersätta med färsk 2 ml Medium #1 i varje brunn.
- På dag 3, ersätt medium i varje brunn med 2 ml differentiering Medium #1 med Wnt inhibitor IWR-1-endo (5 μM) för att inducera hjärt-härstamningsspecifikation.
- På dag 5, återställ cellerna genom att ersätta medium med färsk 2 ml Medium # 1 i varje brunn.
- På dag 7, ersätt medium med 2 mL Medium #2 i varje brunn. Spontan misshandel av kardiomyocyter kan observeras redan dag 8-9. För vissa linjer kan slå celler visas så sent som dag 11.
- För rening av differentieringskulturen, ersätt med 2 ml minus glukos Medium #3 i varje brunn på dag 10.
- På dag 13, återställa cellerna genom att ändra mediet med 2 ml plus glukos Medium # 2 i varje brunn.
- På dag 16, utför andra omgången rening med 2 ml Medium #3 i varje brunn.
- Återställ cellerna på dag 19 med 2 ml plus glukos Medium #2.
- På dag 20 tvättar du brunnarna en gång med 1 ml PBS och separerar cellerna med 1 mL 10x Trypsin i 6 min vid 37 °C. Efter inkubation lyfts cellerna från brunnsytan i enstaka celler i mindre än 15 s och tillsätts till 15 ml koniskt rör med samma volym medium #2 för att neutralisera enzymet. Centrifugera cellfjädringen i 3 min vid 270 x g.
- Återanvänd cellpelleten i 3 ml Medium #3. Räkna cellerna och tillsätt lämplig volym medium #3 för att plätera totalt ~ 3 miljoner celler i varje brunn i en ny källarmembranmatris mediumbelagd 6-brunnsplatta. På den andra dagen efter omplätering, byt ut mediet med färskt 2 ml Medium #2 och fyll på med 2 ml Medium #2 varannan dag tills man provar kardiomyocyter för frysning eller framtida experiment.
3. Endotelcellsdifferentiering och MACS
- Vid 75% till 80% iPSC-sammanflöde, tvätta plattan med PBS, 2 ml per brunn.
- Börja differentiering på dag 0 genom att ersätta med 2 ml differentiering Medium #1 med 6 μM CHIR.
- På dag 2, ersätt mediet med 2 ml differentiering Medium #1 med 2 μM CHIR.
- På dag 4, ersätt mediet med 2 ml extra bolagsstämma kompletterat med 20 ng bFGF-2, 50 ng VEGF165 och 20 ng BMP4.
- Ändra mediet med 2 ml extra bolagsstämma kompletterat med tillväxtfaktorer varannan dag från dag 6 till dag 10. Tillsats av TGFβ-hämmare (SB431542) vid 8 μM-koncentration är valfritt för att främja endotelexpansion och undertrycka differentiering av andra mesenkymala ursprung celltyper.
- På dag 12, börja steg för MACS genom att skölja varje brunn med 1 mL PBS följt av celldissociation med 1 ml 10x Trypsin i varje brunn på en 6-brunnsplatta i 8 min vid 37 °C.
- Förbered en lika stor mängd extra bolagsstämma i ett koniskt rör på 50 ml för att neutralisera dissociationsenzymet. Placera en 40 μm cellsil på det koniska röret på 50 ml och passera den dissocierade cellupphängningen genom silen. Byt filter för varje 2 till 3 dissocierade brunnar.
- Räkna upp de totala livskraftiga cellerna med 0,4% Trypan blue med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
- Pellet cellupphängningen vid 300 x g i 5 min i en förkyld centrifug som är inställd på 4 °C.
- Kassera supernatanten och återanvänd cellpelleten i lämplig sorteringsbuffert baserat på det totala antalet i steg 3.8.
OBS: Tillsätt 80 μL sorteringsbuffert per 107 celler totalt. - För magnetisk pärlmärkning, tillsätt 20 μL FcR-blockerande reagens per 107 celler och inkubera i 5 min.
- Tillsätt 20 μL CD144 eller CD31 Mikrober per 107 celler och blanda väl. Inkubera cellfjädringen i mörker vid 4 °C i 15 minuter.
- Tillsätt 20 ml sorteringsbuffert för att tvätta de märkta cellerna och pellet cellerna 300 x g i 5 minuter i en förkyld centrifug som är inställd på 4 °C.
- Återanvänd cellpelleten i 3 ml sorteringsbuffert och lämna den på is.
- Förbered en magnetisk separationskolonn genom att placera kolonnen i separatorskårans skåra.
- Balansera kolonnen genom att skölja med 3 ml sorteringsbuffert och samla upp flödet i ett koniskt avfallsrör.
- När sköljbufferten strömmar igenom, återanvänd cellupphängningen noggrant för att bryta eventuella klumpar och applicera cellupphängningen på kolonnen.
- När cellupphängningen har flödat igenom, tvätta kolonnen med 3 ml sorteringsbuffert tre gånger för att ta bort omärkta celler.
- Ta bort kolonnen från separatorn och placera den i ett koniskt rör på 15 mL för CD144+/CD31+ cell elution.
- Tillsätt 5 ml sorteringsbuffert på kolonnen och spola omedelbart de magnetiskt märkta cellerna med kolven.
- Bestäm det livskraftiga cellnumret med hjälp av 0,4% Trypan blå med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
- Centrifugera cellfjädringen i en förkyld centrifug vid 300 x g i 3 min.
- Återanvänd cellpelleten i lämplig volym av extra bolagsstämma med 5-8 μM TGFβ-hämmare (SB431542) baserat på det totala antalet i steg 3,21.
- Plätera denna passage 0 (P0) celler med en lämplig celltäthet (4 x 104 celler/cm2) på en förbelagd 0,2% gelatinplatta.
- För P0 och P1, fortsätt att fylla på mediet med färsk extra bolagsstämma varannan dag med TGFβ-hämmare. Från P2 kan celler odlas i endoteltillväxtmedium utan TGFβ-hämmare.
4. Hjärtfibblast differentiering
- Tillåt iPSCs att bli 90% till 95% sammanflöde; tvätta varje brunn med 1 ml PBS.
- Börja differentiering på dag 0 genom att lägga till 2 ml differentiering Medium #1 med 11 μM CHIR. För känsliga iPSC-linjer kan koncentrationen variera mellan 9-10 μM.
- Observera plattan på dag 1. Det är normalt att observera betydande celldöd med ~ 30% till 40% celler som fästs på plattan.
- På dag 3, lägg till 2 ml differentiering Medium #1 med 5 μM IWR-1-endo för att främja expansion av hjärtprogenitorer.
- På dag 4, ersätt mediet med 2 ml hjärtfibblast differentieringsmedium. Byt ut med färskt medium varannan dag till dag 16.
- På dag 18 lossar du cellerna med 1 ml 10x Trypsin i varje brunn på en 6-brunnsplatta i 10 min vid 37 °C.
- Stör cellskiktet noggrant och passera cellupphängningen genom en 70 μm cellsil i ett koniskt rör på 50 ml som innehåller lika stor volym DMEM/F12-medium kompletterat med 5% FBS.
- Bestäm det livskraftiga cellnumret med hjälp av 0,4% Trypan blå med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
- Centrifugera cellfjädringen vid 300 x g i 5 minuter för att erhålla en pellet.
- För den första omplätering, återanvända cellpelleten i en lämplig volym differentieringsmedium och platta vid en celltäthet (6 x 104 celler/cm2) på en 0,2% gelatinbelagd platta tills 90% sammanflöde.
- Dela plattan och behåll hjärtfibblaster i vanliga DMEM/F12 med 10% serum på gelatinbelagda plattor.
5. Gjutning av hjärtmikrotissuformar och cellsådd
- Smält agaroset i en mikrovågsugn i en 100 ml glasflaska tills den kokar. Spraya agarosflaskan och placera den i biosäkerhetsskåpet. Låt agarosen svalna i ~ 3 min.
- Pipett 700 μL smält agaros i en mikroform i silikon på 9 x 9 array. Undvik att generera bubblor vid pipettering.
- Placera försiktigt formen på ett förkylt isblock för att påskynda agarosgelering.
- Se till att agaroset är gelerat blir det genomskinligt. Böj försiktigt runt kanterna på mikroformen för att lossa agarosrepliken. Skala sedan försiktigt replikan från alla sidor för att lossa agarosrepliken från silikonmikroformen.
- Överför agaros microtissue-brickan som innehåller 81 cirkulära urtag (800 μm diameter; 800 μm djup) till en steril 12-välplatta.
- Tillsätt 2 ml PBS till agaros microtissue-brickan och inspektera under mikroskopet för eventuella fångade bubblor eller oregelbundna formade brunnar.
- Sänk ner agarosbrickan i 2 ml 70% etanol över natten, följt av UV-behandling i biosäkerhetsskåpet i 1 h.
- Innan användning, ta bort 70% etanol och tvätta två gånger med destillerat vatten och en slutlig tvätt med 2 ml PBS.
- Prova, neutralisera och räkna iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs och placera cellupphängningarna på is.
- Ta försiktigt bort PBS från brunnen och cellsåddkammaren utan att röra urtagen.
- Blanda iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs i 7:2:1-förhållande i ett nytt rör för att uppnå en slutlig celltäthet på 106 celler/ml. Högre celltätheter kommer att resultera i större mikrotissuer.
OBS: Överskrid inte 2 x 106 celler/ml. - Tillsätt försiktigt 200 μL av cellfjädringen droppvis i såddkammaren.
- Låt cellerna sätta sig vid 37 °C i en CO2-inkubator i 2 timmar.
- Tillsätt microtissue tillverkningsmedium som omger agarosformen för att bara täcka ytan på den inre kammaren.
- Efter 24 timmar självmonterar cellerna och komprimeras avsevärt i de cirkulära urtagen. Byt ut med färskt medium varannan dag för underhåll.
6. Fixering och permeabilisering av celler och hjärtmikrotissuer för immunstainering
- För varje enskild celltyp, odla cellerna separat på källarmembranmatrismedium eller gelatinbelagda kammarrutschbanor (cirka 2,5-3 x 105 celler/ml). Hjärtmikrotissuer kan samlas i 15 ml koniskt rör genom att försiktigt spola ut dem ur de cirkulära urtagen.
- Aspirera mediet och skölj cellerna eller mikrotissuerna med 1 ml PBS; därefter fixera med fixeringsbufferten som innehåller 4,2% PFA i 20 min för kammarrutschbanorna och 1 h för mikrotissuer vid rumstemperatur.
- Aspirera PFA och tillsätt 1 mL permeabiliserande lösning (0,25% Triton X-100 i PBS) i 5 till 7 min för kammarrutschbanor och 20 min för mikrotissuer i 15 ml koniskt rör.
OBS: Från och med detta steg kan proverna försiktigt gungas på en gungplattform på bänkskivan. - Aspirera den permeabiliserande lösningen och skölj en gång med 2 till 3 ml PBS.
- Inkubera cellerna med 500-1 000 μL blockeringslösning (2% till 5% normalt getserum eller åsneserum) i minst 1 h för kammarrutschbanorna och 3 till 4 timmar för mikrotissuerna.
- Inkubera cellerna eller hjärtmikrotissuerna med konjugerade antikroppar som beretts i blockeringslösningen som är tillräckliga för att täcka provet. Inkubera med anti-hjärt Troponin-T (cTnT2) (1:50), anti-CD31 (1:75) och anti-DDR2/Vimentin (1:50) för 1 h för kammarrutschbanorna och över natten vid 4 °C för hjärtmikrotissuer.
- Tvätta kammarrutschbanorna tre gånger med 500 μL 0,1% Interpolering-20 i 5 min mellan varje tvätt och en slutlig tvätt med PBS.
- För hjärtmikrotissuerna, tvätta med 2 ml 0,1% Interpolering-20 fem gånger med 20 min varaktighet mellan varje tvätt. Utför ett sista tvättsteg i ytterligare 20 min.
- Inkubera cellerna eller mikrotissuerna med 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) (1 μg/ml) före konfokal mikroskopi.
- För hjärtmikrotissuer, överför försiktigt till en 35 mm glasbottenskål och tillsätt PBS för att sänka mikrotissuerna.
- För 3D-avbildning, med hjälp av ett 20x eller 40x oljesänkning mål få centrum fokus för microtissue och justera exponeringsparametrar för varje fluorofor.
- För att erhålla en Z-stack, ställ in första och sista koordinaterna i Live-läge med ett totalt bilddjup på 100-200 μm med 5-10 μm skivintervall.
7. Matsmältning av hjärtmikrotissuer och beredning av celler för flödescytometri
- För att smälta mikrotissuer, spola försiktigt mikrotisuterna med Medium # 1 ur de cirkulära urtagen med en bredhålig 1 mL pipettspets i ett 15 ml koniskt rör.
- Låt mikrotissuerna sätta sig och aspirera mediet noggrant och skölj cellerna eller mikrotissuerna med 1 ml PBS och tillsätt 200-300 μL enzymrötningsbuffert i 20 min vid 37 °C. Blanda mikrotisuterna försiktigt i 1 min vid 10 min och inkubera igen vid 37 °C under resten av tiden.
- Efter inkubation, använd en vanlig 1 mL pipettspets för att blanda mikrotissuerna kraftigt för att få en grumlig cellupphängning.
- När mikrotisuterna är tillräckligt smälta i enstaka celler neutraliserar du omedelbart cell suspensionen med 5 ml medium som innehåller 5% FBS och spänner cellupphängningen genom en 40 μm cellsil. Räkna det totala antalet celler och centrifugera encellsupphängningen vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återanvända 1 x 105-1 x 106 celler i 100 μL annexinbindande buffert med FITC Annexin V och 100 μg/mL propidiumjodid (PI) eller To-Pro3-uteslutningsfärg i 10 minuter på is.
- Efter inkubation tillsätt 300 μL av annexinbindningsbufferten till cellfjädringen och överför till ett rundbotten FACS-rör för flödescytometrianalys. Använd rätt lasrar och emissionsfilter för de utvalda fluoroforerna.
- För kvantifiering av cellytans markörer med hjälp av fasta celler, utför fixering och permeabilisering av cellpelleten enligt beskrivningen i steg 6.2 och 6.3.
- Skölj cellpelleten efter permeabilisering och inkubera cellerna med respektive konjugerade antikroppar i 1 h. Tvätta cellpelleten i 4 ml FACS-buffert (2% FBS i PBS) och centrifugera vid 300 x g i 3 min. Upprepa tvättsteget två gånger.
- Återanvänd cellerna i 200-300 μL FACS buffert för flödescytometrianalys.
- Justera de främre och sidospridande egenskaperna med ett oförberedt prov och överväg att använda en isotypkontroll för varje fluorofor för att justera laserspänningarna. Samla in minst 20 000 händelser för dataanalys.
8. Utföra sammandragningsanalyser av spontant slå hjärtmikrotissuer
- Spela in videor av hjärtmikrotissues för att fånga minst tre slag. Ställ in inspelningsupplösningen på minst 1 280 x 720 pixlar med bildhastighet >30 bildrutor per sekund och spara videon i . AVI-format.
- Kör MotionGUI-skriptet11 i en MATLAB-miljö för att starta användargränssnittet.
- Hitta . AVI-filplats i mappen för att läsa in videon. Ange sedan bildhastigheten med vilken videon fångades på inmatningspanelen.
- På den avancerade inmatningspanelen kan en pixelstorlek anges baserat på upplösningen och upptagningsförstoringen.
- En lämplig makroblock pixelstorlek kan anges (standard 16) och en detekterbar pixelrörelse beroende på styrkan av microtissue-sammandragning.
- När du har justerat parametrarna klickar du på Hämta rörelsevektorer för att påbörja analysen.
- Välj en region av intresse med alternativknappen Välj AOI för att utesluta områden som omger den enda mikrotissuken i det cirkulära urtaget.
- Använd funktionen Map Time Ave för att generera en genomsnittlig sammandragningsvärmekarta baserad på rörelse som detekteras på X- och Y-axlar.
- För toppspårningsdata använder du funktionen Hämta kontraktionsdata för att automatiskt mäta sammandragnings- och avslappningstopparna.
- I händelse av ett lågt signal-till-brus-förhållande, applicera en topphöjd och avståndströskel för att korrekt kommentera den maximala sammandragningshastigheten (blå punkt) och maximal avslappningshastighet (röd triangel).
- När du har ställt in rätt tröskelvärden väljer du Analysera toppar för att erhålla sammandragnings- och avslappningsvärden med takthastighet och taktintervall.
- Få mätningar från minst 25 enskilda mikrotissuer för statistiska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Immunostaining och flöde cytometri karakterisering av iPSC-härledda CMs, ECs och CFs
För att generera hjärtmikrotissuer som består av iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs, är alla tre celltyper differentierade och karakteriseras individuellt. In vitro-differentiering av iPSC till iPSC-CMs har förbättrats under de senaste åren. Avkastningen och renheten hos iPSC-CMs skiljer sig dock från linje till linje. Det nuvarande protokollet ger över 75% rena iPSC-CMs som spontant börjar slå runt dag 9 (figur 1A). Ytterligare reningssteg från dag 9 till dag 14 kan förbättra iPSC-CM renhet till över 80% som tidigare beskrivits12. På samma sätt kan hög renhet iPSC-ECs genereras med hjälp av tidigare publicerade protokoll13,14 som inkluderar tillsats av flera vaskulär tillväxtfaktorer som polariserar endotel stamceller som härrör från mesoderm runt dag 4-5 (figur 1B) för att bilda fenotypiskt väldefinierade iPSC-ECs. iPSC-CFs är en mycket heterogen population baserat på deras plats och kännetecknas baserat på deras morfologi och uttryck av extracellulära matrisproteiner. Här, med hjälp av publicerade protokoll15,16,17 med modifieringar, erhålls mänskliga iPSC-CFs från hjärt mesoderm stamceller (figur 1C).
Bild 1: Tidslinje för differentiering. Övergripande schematiska (A) iPSC-CM, (B) iPSC-EC och (C) iPSC-CF differentiering tidslinje med representativa fas kontrast bilder av celler efter differentiering och rening steg. Skalningslist = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Renheten hos iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs fastställdes genom immunostaining och flöde cytometri med cTnT2, trombocyt endotelcell vidhäftning molekyl (PECAM1/CD31) respektive vimentin (VIM), (figur 2A). Kvantitativ analys visade en renad population som innehåller över 90% cTnT2 celler på dag 20. iPSC-ECs erhålls dag 12 efter MACS med CD31 pärlor identifierades med immunostaining mot PECAM1/CD31 endotel cell yta markören. MACS gav mycket rena endotel celler som framgår av över 95% CD31 + celler vid P0. Det måste dock noteras att renheten hos endotelceller minskade med högre passagenummer på grund av avdifferentiering. På samma sätt visade flödescytometrianalyser på dag 20 att över 95% iPSC-CFs uttryckte fibroblastmarkören VIM (figur 2B).
Figur 2: Immunofluorescens och flödescytometrikarakterisering. (A) [Vänster till höger panel] iPSC-CMs på dag 25 färgade med cTnT2 (cyan), iPSC-ECs färgade med PECAM1/CD31 (grön), iPSC-CFs färgade med VIM (röd) och kärnor färgade med DAPI (blå). Skala stapel = 50 μm. (B) [Vänster till höger panel] Flöde cytometri kvantifiering visade en hög procent renhet av iPSC-CMs (91,8%), iPSC-ECs (98,1%), och iPSC-CFs (96,7%) efter differentiering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tillverkning av hjärtmikrotissuekulturer och storleksanalyser
Encelliga suspensioner av iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs blandades i förhållandet 7:2:1 och delades försiktigt ut i cellsåddkammaren i den steriliserade agaros replika mögel (figur 3A,B). Cellerna satte sig enhetligt inuti de cirkulära urtagen i 2 h. Runt dag 3 organiserar de självmonterade cellerna i enhetlig storlek som spontant slår hjärtmikrotissues (figur 3C). Matriser av olika storlekar mikrotissues kan tillverkas genom att justera den slutliga celltätheten (figur 3D, E). Hjärtmikrotissuer tillverkade med en slutlig celltäthet på 1 x 106 celler/ml är ~300-350 μm i diameter, 2 x 106 celler/ml är ~600 μm i diameter och 4 x 106 celler/ml är över 800 μm i diameter. Microtissue enhet erhölls med en cell densitet av 1 x 106 celler/mL, som vanligtvis används för experiment. Dessa mikrotissue kulturer kan upprätthållas i kultur i upp till 6 veckor.
Bild 3: Replika gjutteknik för att generera multicellulära hjärtmikrotissuer. (A) Replika gjutna agarose microwell brickor av (B) iPSC-CM, iPSC-EC och iPSC-CF blandningar fångas inuti mikrobrunnarna för självmontering. Skalstång 500 = μm. (C) Mikrograf som visar komprimering av hjärtmikrotissuer dag 3. Skalstapel = 500 μm. (D) Hjärtmikrotissustorlek som bildas visar ett linjärt samband med initial såddtäthet, med högre celltätheter som resulterar i större mikrotissuer. (E) En representativ figur som visar de självmonterade hjärtmikrotissuerna i mikrobrunnsmatrisen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Immunostaining och livskraft efter enzymatisk matsmältning
Immunofluoreescence färgning av dag 12 post-fabrication med antikroppar mot cTnT2 för iPSC-CMs, CD31 för iPSC-ECs och DDR2 för iPSC-CFs visade en unik cell distribution i hjärt microtissues. iPSC-CMs, den tyngsta av alla tre celltyperna, ockuperade mitten, medan iPSC-ECs varvas i hela mikrotissuerna, och iPSC-CFs observerades för att främst uppta periferin (figur 4A). Kort och snabb matsmältning av de mikrotissues som uppnås med Dispase I och Liberase TL resulterade i övergripande mycket livskraftig cellproportion (figur 4B, topppanel) med mindre än 5% apoptotiska celler efter 2 veckor i kultur. Detta följdes av en kort 1 h exponering av hjärtmikrotissues till en hög koncentration (5 μM) av Doxorubicin, ett kemoterapeutiskt läkemedel som är känt för att inducera dosberoende kardiotoxicitet (figur 4B, nedre panelen).
Figur 4: Immunstaining av hjärtmikrotissuer och bedömning av cellviabilitet. (A) Konfokal z-stack bilder av mänskliga hjärtmikrotissu färgade för iPSC-CMs (cTnT2), iPSC-ECs (CD31), iPSC-CFs (DDR2) och kärnor färgade med (DAPI). Skalstång = 200 μm. (B) Flödescytometridiagram av hjärtmikrotissues enzymatiskt smält till encellsfjädring och färgade med Annexin V (apoptotisk markör) och döda celluteslutningsfärg (To-Pro3). Smält encellsfjädring visade en hög cellviabilitet (91%) med <5% apoptotisk cellpopulation (övre panel), jämfört med encells suspension behandlad med en apoptos-inducerande kemoterapeutiskt läkemedel, Doxorubicin, för 1 h vid 5 μM koncentration (nedre panelen). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Beräkningskontraktilitetsanalys
Contractility analyser av enskilda hjärtmikrotissuer kan utföras med hjälp av ett MATLAB-baserat bildanalysverktyg. Videoinspelningar av spontant slå hjärt microtissues erhölls vid 30 fps för analys. Som beskrivits tidigare11 använder blockmatchningsmetoden rörelsespårningsalgoritm för att fånga rörelser av ett block med pixlar för de totala bildrutor som förvärvats som en tidsserie av rörelsevektorer. Mikrotissuernas kontraktilitet och vektorernas rörelse genererar en pseudovärmekarta som illustrerar genomsnittlig eller genomsnittlig sammandragningsprofil över mikrotissuue (figur 5A). Hjärtmikrotissuernas kontraktila rörelse genererar positiva toppar som mäts som sammandragningshastighet (blå cirkel), avslappningshastighet (röd triangel) och takthastighet, varav den sista beräknas som tiden mellan två sammandragningscykler (figur 5B). Dessutom förändras inte hjärtmikrotissuernas kontraktilitet signifikant under 4 veckor i kulturen (figur 5C).
Figur 5: Sammandragningsanalys av hjärtmikrotissuer. (A) Faskontrastbild och sammandragningskarta över hjärtmikrotissuer 1 vecka efter tillverkning. Skalstång = 200 μm. (B) Hjärtmikrotissuer visar regelbundna sammandragnings- och avslappningsprofiler och slaghastigheter. Tabellen visar representativa värden för takthastighet, maximal sammandragning och avslappningshastigheter. C) Långsiktig kultur av hjärtmikrotissuer i upp till 4 veckor påverkar inte kontraktilitetsparametrarna i någon större utsträckning (n = 20/grupp). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att generera hjärtmikrotissuer från fördifferentierade iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs, är det viktigt att få en mycket ren kultur för bättre kontroll av cellnummer efter kontakt-hämmad cellkomprimering inom hjärtmikrotissuerna. Nyligen, Giacomelli et. al.18 har visat tillverkning av hjärtmikrotissuer med hjälp av iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs. Hjärtmikrotissuer som genereras med den beskrivna metoden består av ~5 000 celler (70% iPSC-CMs, 15% iPSC-ECs och 15% iPSC-CFs). I denna metod var både kardiomyocyter och endotel celler co-differentierade följt av separation av endotel stamceller med CD34 + markör. Det nuvarande protokollet som beskrivs här består av 12 000 celler (70% iPSC-CMs, 20% iPSC-ECs och 10% iPSC-CFs) per mikrotissue, vilket ger högre cellnummer per konstruktion för nedströms encellsanalyser. Dessutom, eftersom alla tre celltyperna differentieras separat finns det begränsad heterogenitet i cellpopulationer som är unik för att förstå cellspecifika svar på behandlingar.
För kardiomyocyt differentiering har vi och andra tidigare visat härledning av rena kardiomyocyter med hjälp av kemiskt definierade odlingsförhållanden12,19,20. Kortfattat börjar differentiering med mesendoderm induktion, följt av modulering av Wnt/β-catenin signalering som främjar hjärt härstamning specifikation. Ytterligare rening av kardiomyocyterna i ett glukosfattigt medium gör det möjligt att eliminera icke-kardiomyocyter. Här är det viktigt att notera att långvarig odling i reningsmedium kan hämma kvaliteten på kardiomyocyter. Ett nyligen publicerat protokoll visar proliferative kapacitet av tidiga kardiomyocyter kan utnyttjas för att erhålla ett stort antal celler. Expansionen av mänskliga iPSC-CMs induceras med återinförande av CHIR, en potent mitogen under den tidiga proliferative fas21. Även om den exakta molekylära mekanismen fortfarande är okänd, kan denna teknik avsevärt förbättra iPSC-CM avkastning med tiofaldigt eller hundrafaldigt. För att förbättra återgivningen av iPSC-CMs för sjukdomsmodellering kan de dessutom odlas i ett mognadsmedium för att förbättra elektrofysiologisk, mekanisk och strukturell mognad22. En grundlig översikt över iPSC-CM mognadstekniker ses över någon annanstans23.
Vaskulär endotelceller har genererats från pluripotenta stamceller med olika reningsvariabel effektivitet13,24,25. Det nuvarande protokollet ger hög differentieringseffektivitet och val av fenotypiskt stabila iPSC-ECs med MACS26. Differentieringsmetoden för att generera funktionella hjärt fibroblaster följer modulering av Wnt utbildningsavsnittet och fibroblast tillväxtfaktor (FGF) signalering att generera iPSC-CFs17. In vivo CFs härstammar från epicardium, endocardium och neurala vapen föregångare16,27,28,29. Här genereras CF-härstamningen från engagerade mesodermala hjärtprogenitorer utan att generera epicardial celler som en mellanliggande. Sammantaget tar de protokoll som beskrivs här för att generera iPSC-CMs, iPSC-ECs och iPSC-CFs hänsyn till hur lätt reproducerbarhet och hög renhet baserat på fenotypiska egenskaper. För att få högkvalitativa mikrotissuer är det viktigt att få >90% renhet för varje enskild celltyp. Högre renhet i cellulär fenotyp kommer också att säkerställa detektion av förändringar i cellulär bana på grund av olika behandlingar.
Efter framgångsrik härledning av alla tre celltyperna dispenseras cellerna försiktigt in i agarossåddkammaren för att möjliggöra sedimentering av cellerna i de cirkulära urtagen. Kritiska parametrar inkluderar att uppnå homogen encellig suspension och förhindra cellaggregat eller klumpar som kan orsaka variationer i storleksfördelningen av hjärtmikrotissuerna. Ur ett övergripande strukturperspektiv begränsas 3D-konstruktioner ofta genom diffusion av näringsämnen, och när celltätheten ökar ökar också storleken och tjockleken på konstruktionerna linjärt. Vävnadskonstruerade konstruktioner i form av sfäriska strukturer har en enhetlig näringsförbrukningshastighet på grund av isotropisk diffusivitet och fast avstånd från kärnan till ytan30,31. Den slutliga storleken på mikrotissuen dikterar koncentrationsgradienten av näringsämnen och syrediffusion till mitten. I ett statiskt odlingssystem kan konstruktioner över 350-400 μm leda till en nekrotisk cellkärna när den odlas under längre tidsperioder. Därför bör man noga överväga såddtätheten. En begränsning av hjärt microtissue modell är att det inte tillåter kardiomyocyt justering erbjuds av metoder som innebär geometrisk inneslutning av enskilda celler. Kvantifiering av parametrar som sarkomerjustering eller längd är därför begränsad på grund av slumpmässig flerdimensionell cellulär sammansättning. Trots begränsningen möjliggör tekniken snabb dosberoende bedömning av läkemedels- eller småmolekyltoxiciteter på kardiovaskulära celler32. I en ny studie använde vi 3D mikrotissues bestående av iPSC-CMs för att modellera sekundära järn överbelastning-inducerad kardiomyopati, och vi observerade en betydande minskning av microtissue storlek på grund av att en hög koncentration av järn behandling33.
När det gäller immunstaining, till skillnad från 2D-kulturer, är längre permeabilisering och primär antikropp inkubationstid nödvändig för att möjliggöra diffusion av antikroppar i hela mikrotissuerna. Inkubationstiden för adekvat antikroppsinträngning kan kräva ytterligare optimering för mikrotissuer större än ~400 μm i diameter. En annan viktig aspekt är det längre blockerande steget med serumproteiner för att minska bakgrundfluorescens till följd av icke-specifik bindning. Vanligtvis föredras ett blockerande serum som innehåller höga IgG-nivåer, såsom get- eller åsneserum. För att upprätthålla hjärtmikrotissuernas strukturella integritet har vi inte undersökt proteiner som är involverade i specifika cell-cellinteraktioner och deras underhåll under kulturperioden. För cellulär fenotypning måste mikrotissuerna smältas under en kort tidsperiod för att säkerställa hög cellviabilitet och bevarande av målextraformiga antigener. En kombination av enzymatisk matsmältning och mekanisk störning med en bredborr pipettspets möjliggör en effektiv och mild behandling av mikrotissuerna under matsmältningsprocessen. Högkvalitativa livskraftiga enstaka celler som erhålls genom detta snabba matsmältningsprotokoll kan användas för att klargöra komplexa biologiska cell-cellinteraktioner med hjälp av scRNA-seq34,35,36.
Förutom morfologiska och strukturella karakterisering är det viktigt att bedöma funktionella egenskaper hos hjärtmikrotissuerna för att bedöma effekten, toxiciteten och sjukdomstillståndet hos vävnadsenheten in vitro. Kvantitativ analys av vävnadskontraktion är en relevant parameter för att bedöma hjärtfunktionen. Flera icke-invasiva videomikroskopitekniker i kombination med rörelsespårningsalgoritmer har möjliggjort realtidsövervakning med ett robust mått på hjärtvävnadskontraktion kopplad till fenotypiska egenskaper. För att kvantifiera förändringarna i fenotyp kan hjärtmikrotissuerna bibehållas in vitro i upp till 4 veckor utan signifikanta förändringar i kontraktilparametrar. De flesta mjukvarualgoritmer arbetar med principerna för optisk flöde och vektormappning, som läggs ovanpå fångade serier av videoramar11,37,38. Den optiska flödesanalysen kan leda till detektion av artefakter. Användaren bör därför undvika eller minimera oavsiktliga omgivande störningar som kan leda till provrörelser eller vibrationer som överförs till mikroskopets stadium. Det bör noteras att kontraktilitetsanalyserna inte får upptäcka passiva spänningar eller belastningseffekter på grund av mikrotissues suspenderad form, i motsats till mikrotissuer som bildas mellan flexibla stolpar med fördefinierad styvhet. I båda fallen är det dock viktigt att notera att sammandragningsprofilerna för konstruerade hjärtmuskelvävnader inte uppnår sammandragningskrafter som genereras på organnivå. De främsta fördelarna med bildbaserade analyser är att de är icke-destruktiva och möjliggör mätning av akut och kronisk läkemedelsexponering utan omfattande kalibrering. Dessa verktyg kan tillämpas över en mängd olika 2D- och 3D-plattformar för att mäta förändringar i hjärtkontraktilitet på grund av behandlingar eller underliggande genetiska sjukdomar och för att utvärdera vävnadsmognadsstrategier. Framtida undersökning av denna microtissue modell kan innebära att kombinera elektrofysiologiska mätningar som gör det möjligt samtidig registrering av kalcium- eller spänningskänsliga färgämnen för att erhålla flera oberoende inspelningar av varje microtissue i en matris på ett hög genomströmning sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.C.W. är medgrundare av Khloris Biosciences men har inga konkurrerande intressen, eftersom det arbete som presenteras här är helt oberoende. De andra författarna rapporterar inga konflikter.
Acknowledgments
Vi tackar dr Amanda Chase för hennes hjälpsamma feedback på manuskriptet. Finansieringsstöd tillhandahölls av tobaksrelaterat sjukdomsforskningsprogram (TRDRP) vid University of California, T29FT0380 (D.T.) och 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) och 17MERIT33610009 (J.C.W.); och Nationella hälsoinstitut (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 och NIH UH3 TR002588 (J.C.W).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 3D micro-molds | Microtissues | 12-81 format | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| AutoMACS Rinsing Solution | Thermo Fisher Scientific | NC9104697 | |
| B27 Supplement minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B27 Supplement plus Insulin | Life Technologies | 17504-044 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Cardiac Troponin T Antibody | Miltenyi | 130-120-403 | |
| CD144 (VE-Cadherin) MicroBeads | Miltenyi | 130-097-857 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi | 130-110-670 | |
| CD31 Microbeads | Miltenyi | 130-091-935 | |
| CHIR-99021 | Selleckchem | S2924 | |
| DDR2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-81707 | |
| Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI | Thermo Fisher Scientific | V13242 | |
| Dispase I | Millipore Sigma | 4942086001 | |
| DMEM, high glucose (4.5g/L) no glutamine medium | 11960044 | ||
| DMEM/F-12 basal medium | Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| EGM2 BulletKit | Lonza | CC-3124 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| FibroLife Serum-Free Fibroblast LifeFactors Kit | LifeLIne Cell Technology | LS-1010 | |
| Glucose free RPMI medium | Life Technologies | 11879-020 | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Human FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | 13256029 | |
| Human VEGF-165 | PeproTech | 100-20 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| Liberase TL | Millipore Sigma | 5401020001 | |
| LS Sorting Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS BSA Stock solution | Miltenyi | 130-091-376 | |
| MACS Rinsing Buffer | Miltenyi | 130-091-222 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi | 130-042-302 | |
| RPMI medium | Life Technologies | 11835055 | |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | |
| TO-PRO 3 | Thermo Fisher Scientific | R37170 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100-100ML | |
| TrypLE Select 10X | Thermo Fisher Scientific | red | |
| Vimentin Alexa Fluor® 488-conjugated Antibody | R&D Systems | IC2105G |
References
- Neofytou, E., O'Brien, C. G., Couture, L. A., Wu, J. C. Hurdles to clinical translation of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 125 (7), 2551-2557 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 156166 (2018).
- Yin, X., Mead, B. E., Safaee, H., Langer, R., Karp, J. M., Levy, O.
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Kurokawa, Y. K., George, S. C. Tissue engineering the cardiac microenvironment: Multicellular microphysiological systems for drug screening. Advances in Drug Delivery Reviews. 96, 225-233 (2016).
- Cartledge, J. E., et al. Functional crosstalk between cardiac fibroblasts and adult cardiomyocytes by soluble mediators. Cardiovascular Research. 105 (3), 260-270 (2015).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac non-myocyte cells show enhanced pharmacological function suggestive of contractile maturity in stem cell derived cardiomyocyte microtissues. Toxicology Science. 152 (1), 99-112 (2016).
- Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Developmental Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Brutsaert, D. L. Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity. Physiological Reviews. 83 (1), 59-115 (2003).
- Huebsch, N., et al. Automated video-based analysis of contractility and calcium flux in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured over different spatial scales. Tissue Engineering Part C Methods. 21 (5), 467-479 (2015).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Gu, M., et al. Pravastatin reverses obesity-induced dysfunction of induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells via a nitric oxide-dependent mechanism. European Heart Journal. 36 (13), 806-816 (2015).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Zhang, H., Shen, M., Wu, J. C. Generation of quiescent cardiac fibroblasts derived from human induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. , Springer. New York. 1-7 (2020).
- Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circulation Research. 125 (5), 552-566 (2019).
- Zhang, J., et al. Functional cardiac fibroblasts derived from human pluripotent stem cells via second heart field progenitors. Nature Communications. 10 (1), 2238-2315 (2019).
- Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3d cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
- Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87 (1), 1-15 (2015).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: Advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Development. 20 (10), 1701-1710 (2011).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Report. 3 (5), 804-816 (2014).
- Gu, M. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial cells. Current Protocols in Human Genetics. 98 (1), 64 (2018).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139 (12), 2139-2149 (2012).
- Wessels, A., et al. Epicardially derived fibroblasts preferentially contribute to the parietal leaflets of the atrioventricular valves in the murine heart. Development Biology. 366 (2), 111-124 (2012).
- Ali, S. R., et al. Developmental heterogeneity of cardiac fibroblasts does not predict pathological proliferation and activation. Circulation Research. 115 (7), 625-635 (2014).
- McMurtrey, R. J. Analytic and numerical models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C Methods. (3), 221-249 (2015).
- Thomas, D., O'Brien, T., Pandit, A. Toward customized extracellular niche engineering: progress in cell-entrapment technologies. Advanced Materials. 30 (1), 1703948 (2018).
- Thomas, D., Shenoy, S., Sayed, N. Building Multi-dimensional induced pluripotent stem cells-based model platforms to assess cardiotoxicity in cancer therapies. Front Pharmacol. 12, 39 (2021).
- Rhee, J. -W., et al. Modeling secondary iron overload cardiomyopathy with human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (2), 107886 (2020).
- Paik, D. T., Cho, S., Tian, L., Chang, H. Y., Wu, J. C. Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease, and medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (8), 457-473 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 108 (2018).
- Lau, E., Paik, D. T., Wu, J. C. Systems-wide approaches in induced pluripotent stem cell models. Annual Reviews in Pathology. 14 (1), 395-419 (2019).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Report. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. Musclemotion: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
