Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En musemodell for å undersøke rollen som kreftassosierte fibroblaster i tumorvekst

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

En protokoll for å injisere kreftceller og fibroblaster og overvåke tumorvekst over tid er gitt. Denne protokollen kan brukes til å forstå det molekylære grunnlaget for rollen som fibroblaster som regulatorer av tumorvekst.

Abstract

Kreftassosierte fibroblaster (CAF) kan spille en viktig rolle i tumorvekst ved å skape et tumorfremmende mikromiljø. Modeller for å studere rollen til CAF i tumormikromiljøet kan være nyttige for å forstå den funksjonelle betydningen av fibroblaster, fibroblaster fra forskjellige vev og spesifikke genetiske faktorer i fibroblaster. Musemodeller er avgjørende for å forstå bidragsyterne til tumorvekst og progresjon i en in vivo sammenheng. Her er det gitt en protokoll der kreftceller blandes med fibroblaster og introduseres i mus for å utvikle svulster. Tumorstørrelser over tid og endelige tumorvekter bestemmes og sammenlignes mellom grupper. Den beskrevne protokollen kan gi mer innsikt i den funksjonelle rollen til CAFs i tumorvekst og progresjon.

Introduction

Innenfor tumormikromiljøet er en av de mest fremtredende celletypene kreftassosiert fibroblast (CAF)1. Disse karsinomassosierte fibroblastene kan spille en tumorundertrykkende rolle 2,3. For eksempel utskiller S100A-uttrykkende fibroblaster kollagener som kan kapsle inn kreftfremkallende stoffer og beskytte mot karsinomdannelse4. Videre forårsaker uttømming av α-glatt muskelaktin (SMA)-positive myofibroblaster i kreft i bukspyttkjertelen immunosuppresjon og akselererer progresjon av kreft i bukspyttkjertelen2. CAF kan også utvikle seg sammen med kreftceller og fremme tumorprogresjon 5,6,7,8. Fibroblaster kan syntetisere og utskille ekstracellulære matriksproteiner som skaper et tumorfremmende miljø8. Disse ekstracellulære matriksproteinene kan forårsake mekanisk avstivning av vevet, som er forbundet med tumorprogresjon 9,10. Den avsatte ekstracellulære matriksen kan fungere som en fysisk barriere som hemmer immuninfiltrasjon11. Matriksavsetning av CAF har også vært assosiert med tumorinvasjon, da fibronektin generert av CAF har vist seg å fremme tumorinvasjon12. CAF fremmer angiogenese og rekrutterer immunsuppressive celler til tumormikromiljøet ved å utskille transformerende vekstfaktor-β (TGF-β), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) og CXC-kjemokinligand 12 (CXCL12) 13,14,15. På grunn av deres sentrale rolle i å fremme tumorvekst, er kreftassosierte fibroblaster et fremvoksende mål for kreftbehandling 6,16,17,18.

Protokollen nedenfor beskriver en metode for å teste hvordan fibroblaster påvirker veksten av svulster i en veletablert og mye brukt musemodell av tumorvekst. For å forstå betydningen av fibroblaster i tumormikromiljøet ble standardprotokollen for innføring av kreftceller i mus for å overvåke veksten modifisert for å inkludere fibroblaster med kreftcelleinnføringen. Kreftcellene kan innføres subkutant eller intradermalt. Intradermal introduksjon vil resultere i svulster som oppstår fra selve huden. Xenotransplantater der kreftceller og fibroblaster injiseres samtidig i mus, representerer et viktig metodologisk verktøy for å dissekere rollen til fibroblaster, subpopulasjoner av fibroblaster og proteinfaktorer i evnen til å fremme kreftvekst 19,20,21. En detaljert protokoll for samtidig injeksjon av kreftceller og fibroblaster i mus er gitt. Denne metoden kan brukes til å sammenligne tilstedeværelsen eller fraværet av fibroblaster, for å sammenligne fibroblaster fra forskjellige kilder20, eller for å sammenligne fibroblaster med og uten uttrykk for spesifikke proteiner19. Etter at kreftcellene og fibroblastene er introdusert, kan tumorstørrelsen overvåkes over tid. På slutten av forsøkene kan svulster dissekeres og veies. Ved å overvåke tumorvekst over tid, kan betydningen av ulike faktorer dissekeres.

Det finnes mulige alternative tilnærminger for å studere rollen som fibroblaster i tumorvekst. Som et eksempel er det Cre-loxed-baserte modeller som sørger for vevsspesifikk knockout av gener med drivere uttrykt fortrinnsvis i fibroblaster. Slike tilnærminger gir også muligheter til å undersøke rollen som spesifikke gener og veier i fibroblaster for tumorprogresjon. Sammenlignet med Cre-lox-baserte tilnærminger, vil protokollen som tilbys representere en betydelig raskere tilnærming til overvåking av rollen til fibroblaster fordi tumorvekst vil bli overvåket i løpet av bare noen få uker. Den medfølgende tilnærmingen er også betydelig billigere fordi den ikke krever generering og oppbevaring av kolonier av genetisk utviklede mus. Protokollen som tilbys kan brukes til raskt å teste effekten av knockdown av forskjellige gener ved hjelp av shRNA i stedet for å måtte utvikle musekolonier. Den medfølgende tilnærmingen er også mer fleksibel fordi den vil tillate en sammenligning av forskjellige antall fibroblaster, forskjellige forhold mellom kreftceller og fibroblaster, knockdown av forskjellige gener og til og med sammenligning av fibroblaster fra forskjellige vevssteder eller arter. En Cre-lox tilnærming ville ha fordelen at fibroblastene er tilstede i musene i en mer fysiologisk sammenheng.

Protokollen rapportert her vil være verdifull for forskere som søker å overvåke effekten av fibroblaster på tumorvekst raskt og kostnadseffektivt. Denne protokollen er spesielt verdifull for forskere som undersøker forskjellige undergrupper av fibroblaster eller fibroblaster fra forskjellige kilder på tumorvekst på tumorvekst. Hvis det er viktig at tumorinitiering skjer i en fysiologisk sammenheng, bør genetisk konstruerte musemodeller vurderes.

Det er flere mulige tilnærminger for å utføre disse eksperimentene. Immunkompetente mus kan brukes som verter, noe som vil tillate undersøkelse av fibroblast-immuncelleinteraksjoner. For immunkompetente musemodeller må musekreftceller og museembryonale fibroblaster (MEF) injiseres. Bruken av MEF-er gjør det også mulig for etterforskeren å dra nytte av det brede spekteret av knockout-musestammer for å teste tilstedeværelsen eller fraværet av et gen av interesse. Alternativt kan immundefekte mus brukes til å teste rollen som humane fibroblaster i å fremme veksten av svulster hos mus som er avledet fra humane kreftceller. Innføring av kreftcellene kan utføres subkutant eller ortopisk. For melanom, som beskrevet nedenfor, kan tumor-fibroblastblandingen injiseres intradermalt for ortotopisk injeksjon som nærmere simulerer stedet i huden der et melanom vil utvikle seg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de beskrevne forsøkene ble godkjent av Animal Care Committee ved University of California, Los Angeles.

MERK: Velg kreftceller og fibroblaster som samsvarer med vertsmusene for musestamme. Velg kreftceller og fibroblaster som samsvarer med vertsmusens kjønn. Få mus fra avlskolonier eller kjøp dem fra anerkjente leverandører. Introduser svulster i mus som er ~ 8-10 ukers alder. Mus med pels vil være i telogen eller hvilefasen av hårsekksyklusen. Planlegg for et forhold på 0,5 til 3 fibroblaster til kreftcelle.

1. Bestem riktig antall mus som skal brukes til eksperimentering

  1. Før du utfører studiene, utfør en effektanalyse for å bestemme riktig antall mus som skal brukes til studiene. Bruk følgende formel til å bestemme prøvestørrelsen for et eksperiment med angitt potens:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Hvis α er det valgte signifikansnivået (vanligvis 0,05), er 1-α/2 = 0,975 og Z = 1,960.
    β er kraften, og hvis 80% effekt er ønsket, så Z = 0,84.

    ES, effektstørrelsen = \μ1-μ 0\/σ
    der μ 0 er gjennomsnittet under hypotese H0, μ 1 er gjennomsnittet under hypotese H1, og σ er standardavviket for utfallet av interesse22.
    MERK: Mer informasjon om beregning av prøvestørrelse finner du22.

2. Generer kreftceller til injeksjon

  1. Bestem den relevante vekstraten med følgende ligning:
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    MERK: Et eksempel på celler som dobler i løpet av 24 timer vises
    Doblingstid = ln(2)/vekstrate
    24 timer = ln(2)/veksthastighet
    24*vekstrate = .693
    Vekstrate = .693/24= .028875
  2. Bestem antall kreftceller som skal platen og hvor lang tid cellene må dyrkes før injeksjon.
    MERK: 0,25-1 million kreftceller injiseres for hver svulst som dannes.
  3. Beregn antall dager som kreves for å generere et tilstrekkelig antall celler i henhold til ligningen
    N(t)=N(0)egr*t
    hvor N (t) er antall celler på tidspunkt t, N (0) er antall celler på tidspunkt 0, gr er veksthastigheten, og t er tiden.
    MERK: Et eksempel på disse beregningene for å vokse 500 000 celler for å generere 106 celler i hver av 12 svulster. Basert på disse beregningene er 5 dager tilstrekkelig til å vokse det nødvendige antall celler:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500 000e(gr*t)
    12 x 106=500 000e(.028875*t)
    24=E(.028875*x)
    ln(24)=0,028875x
    3,178=0,028875x
    X=110 timer= 4,59 dager
    Tillat ekstra tid for celler å feste til platen og for celler som går tapt under innsamling.
  4. Plate kreftceller.
    MERK: Bruk hansker og laboratoriefrakker når du arbeider med dyrkede celler.
    MERK: Utfør cellemanipulasjoner i en laminær strømningshette for å minimere innføringen av mikrober fra luften inn i prøvene. Behandle avtrekkshetten for vevskultur med ultrafiolett lys før bruk. Bruk steril teknikk og bare steril cellekultur, plastvarer og forbruksvarer som vevskulturbehandlede plater, pipetter og koniske rør.
    1. Beregn riktig antall og størrelse på vevskulturplater basert på antall celler i hetteglasset og ønsket cellekonsentrasjon når de er belagt.
    2. Merk vevskulturplater.
    3. Forbered et vannbad med vann ved 37 °C.
    4. Aliquot medium i kjegleformede rør og legges i et vannbad ved 37 °C. Mange kreftceller kan dyrkes i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS).
    5. Fjern det nødvendige antall hetteglass med frosne celler fra fryseren med flytende nitrogen.
      MERK: Bruk frysehansker ved håndtering av celler i fryser med flytende nitrogen.
    6. Tine celleflaskene raskt i vannbadet mens du rister forsiktig.
      MERK: Tilsett etanol i hanskene mens du håndterer hetteglass for å opprettholde steriliteten.
    7. Ved hjelp av steril teknikk i en vevskulturhette, rør cellene inn i et 15 ml konisk rør inneholdende 10 ml DMEM + 10% FBS.
    8. Sentrifuge celleblandingen ved 180 x g i 5 minutter.
    9. Fjern supernatanten forsiktig med sterilt sug eller en steril 10 ml pipet.
    10. Resuspender cellene i pelleten forsiktig i 1 ml DMEM + 10% FBS.
    11. Pipett de resuspenderte cellene på en merket vevskulturplate med en steril p1000.
    12. Bruk sterile 10 ml pipeter, pipetmedium med serum inn i vevskulturplater.
    13. Inkuber vevskulturplater i en vevskulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2.
  5. Utvid kreftceller for å generere tilstrekkelige kreftceller til injeksjon.
    MERK: Overvåk celler med lysmikroskopi for konfluens. Trypsinize hver to til tre dager eller etter behov for å hindre cellene fra å nå 100% sammenløp. Hvis et stort antall celler kreves, bruk hyperkolber (materialfortegnelse) for å dyrke et stort antall celler på en rom- og middels effektiv måte. Hver gang cellene må passeres, følg denne prosedyren:
    1. Fjern mediet fra platen med sterilt sug eller en steril 10 ml pipette.
    2. Vask platen forsiktig ved å pipettere på varmt fosfatbufret saltvann (PBS). Fjern deretter PBS med steril suging eller pipette.
    3. Pipet: 5 ml 1x trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) i PBS for en 10 cm plate på cellene og inkuber i 5 minutter ved 37 °C.
    4. Fjern celler fra platen med forsiktige kraner for å løsne cellene fra platen.
    5. Bruk en steril 10 ml pipet, samle cellene inn i DMEM med 10% FBS serum i koniske rør.
    6. Sentrifuge koniske rør ved 180 x g i 5 minutter.
    7. Fjern supernatanten ved å helle den av. Cellepelleten skal være synlig. Se på den for å sikre at den forblir i røret.
    8. Resuspender de pelleterte cellene ved å tilsette 1 ml DMEM + 10% FBS og pipettere forsiktig opp og ned.
    9. Aliquot resuspenderte celler på nye vevskulturplater av passende størrelse med DMEM + 10% FBS (10 ml media er egnet for en 10 cm vevskulturplate).

3. Generer fibroblaster til injeksjon

MERK: Primære fibroblaster vil senesce etter for mange doblinger / passasjer. Det er viktig å bruke primære fibroblaster etter et begrenset antall passasjer eller doblinger. Hold oversikt over antall passasjer eller doblinger som fibroblastene har vokst fra musen eller menneskelig hud. Bruk fibroblaster med færre enn 15 passasjer for primære humane dermale fibroblaster. Bruk fibroblaster med færre enn 9 passasjer for musembryonale fibroblaster. Fibroblaster endres når de blir sammenflytende. Trypsiniser fibroblastene når de er ca. 90% sammenflytende. Fibroblaster vil ha forskjellige egenskaper avhengig av hvordan de dyrkes. Mange forskere fremmer dyrking på mer fysiologisk relevante substrater enn vevskulturplater som 3D-kollagenmatriser som mer effektivt fanger vevslignende miljøer23,24,25.

  1. Bruk ligningen i avsnitt 2.1 for å bestemme veksthastigheten for fibroblastcellene.
  2. Bruk ligningen i seksjon 2.2 for å bestemme antall dager som kreves for å utvide fibroblastene.
  3. Plat fibroblastene som beskrevet i pkt. 2.3 ved bruk av egnet medium på riktig dag for å sikre at kreftceller og fibroblaster er klare til injeksjon samme dag.
  4. Utvid fibroblastene i egnet medium for å generere et tilstrekkelig antall fibroblaster som trengs i henhold til prosedyrene beskrevet i pkt. 2.4.

4. Barber mus for å forberede mus til injeksjon

MERK: Bruk laboratoriefrakker, hårnett, skodeksler og hansker når du arbeider med mus.

  1. En til to dager før injeksjon, i samsvar med reglene i Institutional Animal Care Committee, bedøve musene. Ved bruk av isofluran til anestesi, bruk en blanding av isofluran ogO2. Plasser musene i et anestesikammer og introduser en isofluran (5%) /O2-blanding for å indusere anestesi. Deretter plasserer du nesekeglen på det bedøvede dyret for å opprettholde anestesiplanet med en konstant strøm av isofluran (2%)/O2-blanding .
  2. Sjekk dyrene for å sikre at de er i riktig kirurgisk anestesiplan ved å klemme musens tå og bekrefte at musen ikke beveger seg.
  3. Bruk en dyreklipper med kirurgisk blad #40, fjern forsiktig pelsen fra de riktige posisjonene på flankene til musene ved å føre dyreklipperen over huden flere ganger til pelsen er fjernet.
  4. Overvåk musene til de gjenoppretter fra anestesi.

5. Forbered kreftceller og fibroblaster for injeksjon

MERK: Kreftceller og fibroblaster skal injiseres så snart som mulig etter innsamling, helst innen 30 minutter. På morgenen av injeksjonen, høst kreftcellene og fibroblastene separat fra vevskulturplater. Utfør følgende trinn for hver celletype:

  1. Fjern mediet fra vevskulturplaten med forsiktig sterilt sug eller ved pipettering av mediet.
  2. Piper forsiktig på 5 ml PBS uten å forstyrre cellene. Virvle PBS. Aspirer PBS forsiktig med sug eller pipe av PBS.
  3. Piper forsiktig 5 ml trypsin-EDTA i PBS på cellelaget og inkuber i 5 minutter ved 37 °C.
  4. Fjern celler fra platen med milde kraner for å løsne cellene. Pipett cellene flere ganger med en 10 ml pipet og overfør cellene til et konisk rør inneholdende DMEM med 10% FBS.
  5. Sentrifuge de koniske rørene ved 180 x g i 5 minutter.
  6. Fjern supernatanten ved å helle den forsiktig av og beholde cellepelleten. Vask cellepelleten to ganger med PBS. Hver gang piper du 10 ml PBS på cellene. Bland forsiktig med en p1000 pipet.
  7. Sentrifuger cellene som i trinn 5.5. Fjern PBS forsiktig med en pipette og gjenta.
  8. Resuspender de vaskede, pelleterte cellene i 1 ml PBS med en p1000.
  9. Rengjør et hemocytometer-lysbilde med alkohol og tørk.
  10. Pipet 100 μL av celleblandingen inn i et rør og tilsett 400 μL av 0,4% Trypan blå for en endelig Trypan blå konsentrasjon på 0,32%.
  11. Fyll forsiktig kamrene i et glasshemocytometer under dekselet ved å pipetere celleblandingen til kammeret er fullt.
  12. Bruk et mikroskop, fokuser på rutenettlinjene til et 10x-objektiv.
  13. Tell de levende, ufargede cellene og blå cellene i ett sett med 16 firkanter.
  14. Tell alle 4 sett med 16 ruter.
  15. Gjennomsnittlig antall celler for de klare og blå cellene fra de 4 settene med 16 firkanter og multipliser med 10.000. Multipliser med 5 for å korrigere for 1:5 fortynning fra Trypan blå.
  16. De endelige tellingene er konsentrasjonen i celler/ml for levedyktige og døde celler. Multipliser med volumet for å bestemme totalt antall kreftceller og fibroblaster. Bekreft at brøkdelen av celler som er levedyktige, er >80%.
  17. Bekreft at det er et tilstrekkelig antall melanomceller og fibroblaster for alle planlagte injeksjoner, forutsatt minst 20% tap av prøve under injeksjonene.
  18. Overfør det nødvendige antall celler til et nytt konisk rør og pellet cellene ved sentrifugering (180 x g i 5 minutter).
  19. Fjern supernatanten med en 10 ml pipette.
  20. Resuspender pelleten ved ønsket konsentrasjon i riktig mengde United States Pharmacopeia (USP) GRADE PBS (50 μL per svulst for intradermal injeksjon og 100 μL per svulst for subkutan injeksjon).

6. Injiser kreftceller og fibroblaster i mus

MERK: Hvis godkjent av den institusjonelle dyrepleiekomiteen, injiser to svulster i hver mus, en på hver flanke. Tilfeldig hvilken mus som skal få hvilken injeksjon på høyre og venstre flanke. Avhengig av antall mus som skal injiseres, bedøve musene og injisere kreftceller og fibroblaster i musene i grupper.

  1. For subkutan injeksjon av kreftceller
    1. Bedøv mus som beskrevet i pkt. 4.1.
    2. Tørk den barberte huden med spritservietter.
    3. Fyll en steril sprøyte med ønsket volum celler eller celleblanding og topp sprøyten med en 27 gauge nål.
      MERK: Pass på at det ikke er luftbobler. Knips sprøyten etter behov for å fjerne bobler. Når cellene har blitt introdusert i sprøyten, hold cellene i sprøytene godt blandet ved kontinuerlig å snu sprøytene for å forhindre klumping.
    4. Sett nålen inn i det subkutane området på musens flanke og injiser cellene forsiktig inn i musen. Bruk 100 μL cellesuspensjon per svulst til subkutan injeksjon(bruk av volum over 100 μL per injeksjon anbefales ikke).
    5. Overvåk musene til de gjenoppretter fra anestesi. Hvis nødvendig, gi musene ekstra isolerende materialer som hytter og / eller varmeputer for å hjelpe musene til å komme seg helt.
  2. For intradermale injeksjoner av kreftceller
    1. Bedøv mus som beskrevet i pkt. 4.1.
    2. Tørk den barberte huden med spritservietter.
    3. Fyll en steril sprøyte med ønsket volum celler eller celleblanding og topp sprøyten med en 27 gauge nål.
      MERK: Pass på at det ikke er luftbobler. Knips sprøyten etter behov for å fjerne bobler. Når cellene har blitt introdusert i sprøyten, hold cellene i sprøytene godt blandet ved kontinuerlig å snu sprøytene for å forhindre klumping.
    4. Sett en 27-gauge nål inn i det intradermale området av huden på musens flanke og injiser forsiktig cellene inn i den intradermale regionen i musen. Bruk 50μL cellesuspensjon per svulst for intradermal injeksjon (bruk av volum over 50 μL per injeksjon anbefales ikke).
    5. Overvåk musene til de gjenoppretter fra anestesi. Hvis det er tegn på at musene er i nød, kontakt en veterinær. Hvis nødvendig, gi musene ekstra isolerende materialer som hytter og / eller varmeputer for å hjelpe musene til å komme seg helt.

7. Overvåk mus under tumorvekst

  1. Overvåk mus daglig for tegn på smerte eller nød (hakket holdning, vridning, vokalisering, strekker seg ut langs buret, presser magen til bunnen av burgulvet eller motvilje mot å bevege seg rundt buret) eller abscessdannelse. Hvis det er tegn på at musene er i nød, kontakt en veterinær.
  2. Når svulster er dannet, måle tumorvolum omtrent hver to til tre dager. Mål tumorlengde (lengste side) og bredde (vinkelrett på lengden) med kalipere.
    MERK: Gode fremgangsmåter er at samme person utfører disse målingene gjennom hele eksperimentet for å redusere variasjonen i dataene. For målinger, bedøv mus som beskrevet i pkt. 4.1
  3. Beregn tumorvolum med formelen Volum = 0,5 x (Lengde x Bredde2).

8. Høst svulster og måle tumorvekter

  1. Avlive mus når tumorvekst når et eksperimentelt endepunkt etablert av institusjonskomiteen for dyrepleie. Plasser mus i et kammer og avlive dem med langsom (20-30% per minutt) forskyvning av kammerluft med komprimert CO2 i ett minutt etter at respirasjonen opphører.
  2. Utfør cervikal dislokasjon på musene. Hold gnageren fast på en fast, flat overflate. Plasser en solid penn eller en annen gjenstand mot baksiden av nakken ved foten av skallen. Skyv raskt fremover og ned med gjenstanden som holder hodet fast mens du trekker bakover med hånden som holder bunnen av halen. Bekreft med palpasjon at ryggmargen er kuttet.
    MERK: Cervical dislokasjon skal utføres av erfarent laboratoriepersonell.
  3. For hver mus i eksperimentet, bekreft at musen ikke lenger er i live ved å kontrollere at det ikke er pust, ingen hjerterytme og ingen respons på en tåklemme.
  4. Bruk en steril skalpell og kirurgisk saks, fjern hele svulsten fra musen. Med kirurgisk saks, trim ikke-tumorvev fra svulsten.
  5. Vei svulsten på en analytisk balanse og registrer tumorvekten.

9. Statistisk analyse av tumorvolum og tumorvekt

  1. Sammenlign tumorvolum over tid i hver gruppe med gjentatte variansanalyser (ANOVA). Utfør paranalyse hvis to svulster ble injisert per mus.
  2. Sammenlign tumorvekter mellom gruppene med ANOVA ved hjelp av en tosidig test. Tukeys post-hoc-test kan deretter brukes til å bestemme hvilke grupper som er vesentlig forskjellige fra hverandre. Utfør paranalyse hvis to svulster ble injisert per mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A2058 humane melanomceller og primære humane dermale fibroblaster ble dyrket under sterile forhold. Cellene ble samlet inn og vasket tre ganger med PBS. Immundefekte mus (NU/J - Foxn1 nakenstamme) ble injisert subkutant på en flanke med 0,25 millioner A2058 melanomceller alene. På den andre flanken ble mus injisert med en blanding av 0,25 millioner A2058 melanomceller og 0,75 millioner fibroblaster. Celler ble injisert i 12 immundefekte mus. Injeksjoner i venstre og høyre flanke ble randomisert. Tumorvolum ble overvåket dag 12, 14, 16, 19 og 21 dager etter injeksjon (figur 1A). Ved eutanasi ble svulster skåret ut, avbildet (figur 1B) og veid (figur 1C). Tilstedeværelsen av fibroblastene resulterer i betydelig større svulster.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning av melanomvekst ved tilstedeværelse og fravær av samtidig injiserte fibroblaster. Melanomceller ble introdusert i nakne mus enten med eller uten primære hudfibroblaster. (A) Plott av tumorvolum over tid for melanomer med og uten samtidig injiserte fibroblaster. Volumet ble beregnet som 0,5*lengde*bredde2. Middelvolum og standardfeil for gjennomsnittet (SEM) plottes. ANOVA ble utført for å fastslå signifikans. (B) Bilder av utskårne svulster. (C) Endelige vekter av svulster ved slutten av forsøket på dag 21. Gjennomsnittsvekter og SEM er plottet. En uparet, tosidig t-test ble brukt for å sammenligne endelige vekter. * indikerer p < 0,05, *** indikerer p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I forsøket i figur 1 resulterte samtidig introduksjon av humane dermale fibroblaster med humane A2058 melanomceller i større svulster enn når melanomcellene ble introdusert uten samtidig injiserte fibroblaster. Denne forskjellen kan lett oppdages basert på tumorvolum og tumorvekt. Resultatene stemmer overens med flere rapporter om at kreftassosierte fibroblaster kan fremme tumorvekst 5,6,7,8. I tillegg til endepunktene som diskuteres her, som tumorvolum og tumorvekt, kan ytterligere endepunkter også overvåkes. Ytterligere analyser er også mulig. For eksempel kan svulstene som utvikler seg samles inn i formalin for fiksering, parafininnebygd og analyseres med hematoksylin og eosin for histologi. Alternativt kan de utviklede svulstene samles inn i optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) for videre analyse med immunfluorescens for spesifikke proteiner.

En viktig begrensning av disse forsøkene er at fibroblastene som injiseres sammen med kreftcellene, kan føle eller dø etter noen få celledelinger. Alternativt kan co-injiserte fibroblaster migrere bort fra svulsten, i så fall kan de ikke påvirke tumorvekst. Hvis fibroblastene senesce, dø eller migrere bort fra svulsten, vil de bli mindre rikelig over tid, og effekten av de samintroduserte fibroblastene vil bli mindre viktig for tumorvekst. Faktisk forventes de introduserte kreftcellene å rekruttere flere fibroblaster fra verten. For eksperimenter der et spesifikt gen slås ned eller slås ut i de introduserte fibroblastene, vil rekruttering av vertsfibroblaster som uttrykker det kodede proteinet over tid forventes å redusere enhver fenotype som kan observeres. For å overvåke tilstedeværelsen av de introduserte fibroblastene, kan fibroblastene genetisk konstrueres for å uttrykke et fluorescerende protein som GFP26,27. Hvis fibroblastene uttrykker GFP, kan flowcytometri brukes til å overvåke antall fibroblaster som er tilstede i svulsten på forskjellige dager etter at de er introdusert. Som et alternativ kan luciferase-enzymet innføres i fibroblastene, og bioluminescensavbildning kan brukes til å overvåke mengden fibroblaster i musene over tid. Hvis fibroblastene raskt elimineres fra tumormikromiljøet, vil Cre-lox genetisk utviklede musemodeller adressere denne bekymringen og utfylle de beskrevne studiene.

Hvis forsøkene utføres ved å introdusere humane kreftceller og fibroblaster i nakne mus, forventes det begrensede immunforsvaret å ha en betydelig innvirkning på resultatene. Athymic nude mice (NU / J) mangler T-celler og mangler derfor cellemediert immunitet. De har også en delvis defekt i B-celleutvikling. Cellemediert immunitet, det vil si drap av celler via aktiverte CD8+ T-celler, kan spille en viktig rolle i undertrykkelsen av tumorvekst28,29. I nyere studier har samspill mellom kreftassosierte fibroblaster og CD8+ T-celler blitt rapportert30,31,32. Innføring av muskreftceller og musefibroblaster i mus med immunsystem kan betraktes som en alternativ tilnærming som vil løse dette problemet.

En annen alternativ tilnærming er å bruke genetisk konstruerte musemodeller der Cre-lox-systemet brukes til å modulere nivåene eller aktiviteten til spesifikke proteiner i vertsfibroblaster. En slik tilnærming er å bruke fibroblastberikede Cre-lox-modeller med drivere som FSP1, Col1a1, Col1a2 eller PDGFRa33,34,35. Med en Cre / lox rekombinasemodell ville det ikke være bekymring for at de injiserte fibroblastene vil dø eller migrere bort fra svulsten.

Det er noen få trinn i protokollen som er avgjørende for suksessen. Veksten av fibroblastene er en viktig del av protokollen og vil sannsynligvis bidra betydelig til utfallet. Primære fibroblaster senesce lett, og passasjen eller doblinger må overvåkes nøye for å sikre at fibroblastene er i eksponentiell vekstfase og ikke har senesced. Senescent fibroblaster forventes å utskille høye nivåer av cytokiner som kan ha en dramatisk effekt på tumorvekst36,37,38. Det er derfor av stor betydning at passasjenummer er nøye dokumentert og at fibroblastene som injiseres ikke er senescent med mindre protokollen krever analyse av senescent fibroblaster.

Når fibroblaster blir sammenflytende, kan de forventes å gjennomgå et stort antall endringer, hvorav noen sannsynligvis vil bli reversert når de går inn i cellesyklusen 39,40,41,42,43,44. Å opprettholde fibroblastene i en proliferativ tilstand og splitte dem når de er 90% sammenflytende er viktig for å sikre at studiene er så konsistente som mulig. Dyrking av fibroblaster på vevskulturplater påvirker sannsynligvis også deres oppførsel, og alternativer som 3D-kollagenmatriser bør vurderes23,24,25. Fibroblaster dyrket i 3D-matriser viser vesentlig forskjellige migrasjonsmønstre enn fibroblaster dyrket på 2D-overflater 45,46,47,48,49, noe som sannsynligvis vil påvirke deres tumorfremmende kapasitet når de introduseres i svulster, hvor fibroblastene vil spille en aktiv rolle i å etablere tumorens ekstracellulære matriksmikromiljø50.

Injisering av melanomceller i musen via intradermal injeksjon kan gi mer reproduserbar tumorvekst enn subkutane injeksjoner. Dette er et vanskelig skritt, da det er svært lite plass i den intradermale regionen. Det er viktig å plassere nålen forsiktig. Hvis intradermale injeksjoner utføres, injiseres bare 50 μL oppløsning. Selv for erfarne forskere kan disse injeksjonene lekke. Det er viktig å legge merke til om hver injeksjon lekket slik at hvis ingen svulst dannes, kan den elimineres fra den endelige analysen.

Klargjøring av sprøyter for injeksjon er et annet kritisk skritt. Det er viktig å fjerne alle boblene fra sprøyten, noe som kan kreve at sprøyten knipses for å eliminere boblene. Det er også viktig at cellene ikke klumper seg. Snu sprøytene gjentatte ganger for å forhindre klumping.

Et annet vanskelig aspekt ved disse eksperimentene er at måling av tumorvolum kan variere fra person til person. For å begrense variasjonen i tumorvolummålinger, er det nyttig å tildele et enkelt laboratoriemedlem ansvar for å ta alle tumorvolummålingene i alle mus og til enhver tid gjennom et eksperiment.

Det er å foretrekke å injisere mus med kreftceller fra samme kjønn som vertsmusen når det er mulig. Det er mulig å bruke begge kjønn og inkludere kjønn som variabel i ANOVA-modeller for å avgjøre om kjønn påvirker svulststørrelse over tid.

Forståelse av tumormikromiljøet er viktig for å få innsikt i tumorigenese. Protokollen kan gi grunnlag for å forstå rollen til fibroblaster, forskjellige typer fibroblaster og forskjellige veier innen fibroblaster som kan påvirke tumorvekst. Funn fra disse forsøkene kan identifisere nye terapeutiske mål som vil forhindre fibroblaster i å fremme tumorvekst18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke alle medlemmene av Coller-laboratoriet for nyttige innspill. H.A.C. var Milton E. Cassel-forsker ved Rita Allen Foundation. Vi anerkjenner NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, Clinical Translational Science Institute og Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovasjonspriser fra Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills og Ha Gaba), en pris fra UCLA SPORE i prostatakreft (National Cancer Institute of National Institutes of Health under prisnummer P50CA092131), en innovasjonspris fra Broad Stem Cell Center, Eli og Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research ved UCLA, Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), Dermatology T32-programmet ved UCLA AR071307, og UCLA Muscle Cell Biology, Pathophysiology and Therapeutics T32 Training Program 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
  2. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  3. Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  4. Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Cancer Research. 73 (9), 2770-2781 (2013).
  5. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  6. Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
  7. Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
  8. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  9. Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
  10. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
  11. Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
  12. Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
  13. Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
  14. Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
  15. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  16. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  17. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
  18. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  19. Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer Research. 65 (9), 3772-3780 (2005).
  20. Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
  21. Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
  22. Sullivan, L. M. Estimation from samples. Circulation. 114 (5), 445-449 (2006).
  23. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  24. Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
  25. Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
  26. Hoffman, R. M. Application of GFP imaging in cancer. Labortatory Investigation. 95 (4), 432-452 (2015).
  27. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  28. Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Research. 58 (16), 3491-3494 (1998).
  29. Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
  30. Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
  31. Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
  32. Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
  33. Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
  34. Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
  35. Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
  36. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  37. Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
  38. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  39. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
  40. Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
  41. Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
  42. Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
  43. Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
  44. Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
  45. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  46. Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
  47. Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
  48. Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
  49. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  50. Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).

Tags

Kreftforskning utgave 166 kreftassosierte fibroblaster xenograft melanom intradermal injeksjon ortotopisk tumormikromiljø
En musemodell for å undersøke rollen som kreftassosierte fibroblaster i tumorvekst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter