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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Ein Mausmodell zur Untersuchung der Rolle krebsassoziierter Fibroblasten beim Tumorwachstum

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Ein Protokoll zur Co-Injektion von Krebszellen und Fibroblasten und zur Überwachung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit wird bereitgestellt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die molekularen Grundlagen für die Rolle von Fibroblasten als Regulatoren des Tumorwachstums zu verstehen.

Abstract

Krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) können eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum spielen, indem sie eine tumorfördernde Mikroumgebung schaffen. Modelle zur Untersuchung der Rolle von CAFs in der Tumormikroumgebung können hilfreich sein, um die funktionelle Bedeutung von Fibroblasten, Fibroblasten aus verschiedenen Geweben und spezifischen genetischen Faktoren in Fibroblasten zu verstehen. Mausmodelle sind unerlässlich, um die Faktoren zu verstehen, die zum Tumorwachstum und zur Tumorprogression in einem In-vivo-Kontext beitragen. Hier wird ein Protokoll bereitgestellt, bei dem Krebszellen mit Fibroblasten gemischt und in Mäuse eingeführt werden, um Tumore zu entwickeln. Die Tumorgrößen im Zeitverlauf und die endgültigen Tumorgewichte werden bestimmt und zwischen den Gruppen verglichen. Das beschriebene Protokoll kann einen besseren Einblick in die funktionelle Rolle von CAFs beim Tumorwachstum und -fortschreiten geben.

Introduction

Innerhalb der Tumormikroumgebung ist einer der prominentesten Zelltypen der krebsassoziierte Fibroblast (CAF)1. Diese karzinomassoziierten Fibroblasten können eine tumorsuppressive Rolle spielen 2,3. Zum Beispiel sezernieren S100A-exprimierende Fibroblasten Kollagene, die Karzinogene einkapseln und vor Karzinombildung schützenkönnen 4. Darüber hinaus verursacht die Depletion von α-Smooth Muscle Actin (SMA)-positiven Myofibroblasten bei Bauchspeicheldrüsenkrebs eine Immunsuppression und beschleunigt das Fortschreiten von Bauchspeicheldrüsenkrebs2. CAFs können sich auch gemeinsam mit Krebszellen entwickeln und das Fortschreiten des Tumors fördern 5,6,7,8. Fibroblasten können extrazelluläre Matrixproteine synthetisieren und sezernieren, die eine tumorfördernde Umgebung schaffen8. Diese extrazellulären Matrixproteine können eine mechanische Versteifung des Gewebes verursachen, die mit einer Tumorprogressionverbunden ist 9,10. Die abgeschiedene extrazelluläre Matrix kann als physikalische Barriere wirken, die die Immuninfiltration hemmt11. Die Matrixablagerung durch CAFs wurde auch mit der Tumorinvasion in Verbindung gebracht, da gezeigt wurde, dass von CAFs erzeugtes Fibronektin die Tumorinvasion fördert12. CAFs fördern die Angiogenese und rekrutieren immunsuppressive Zellen in die Tumormikroumgebung, indem sie transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Interleukin-6 (IL-6) und CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) sezernieren13,14,15. Aufgrund ihrer zentralen Rolle bei der Förderung des Tumorwachstums sind krebsassoziierte Fibroblasten ein neues Ziel für die Krebstherapie 6,16,17,18.

Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zum Testen, wie Fibroblasten das Wachstum von Tumoren in einem etablierten und weit verbreiteten Mausmodell des Tumorwachstums beeinflussen. Um die Bedeutung von Fibroblasten in der Tumormikroumgebung zu verstehen, wurde das Standardprotokoll für die Einführung von Krebszellen in Mäuse zur Überwachung ihres Wachstums modifiziert, um Fibroblasten mit der Einführung von Krebszellen einzubeziehen. Die Krebszellen können subkutan oder intradermal eingeführt werden. Eine intradermale Einführung würde zu Tumoren führen, die von der Haut selbst ausgehen. Xenotransplantate, bei denen Krebszellen und Fibroblasten gemeinsam in Mäuse injiziert werden, stellen ein wichtiges methodisches Werkzeug dar, um die Rolle von Fibroblasten, Subpopulationen von Fibroblasten und Proteinfaktoren bei der Förderung des Krebswachstums zu analysieren 19,20,21. Ein detailliertes Protokoll für die Co-Injektion von Krebszellen und Fibroblasten in Mäuse wird bereitgestellt. Diese Methode kann verwendet werden, um das Vorhandensein oder Fehlen von Fibroblasten zu vergleichen, um Fibroblasten aus verschiedenen Quellen zu vergleichen20 oder um Fibroblasten mit und ohne Expression spezifischer Proteine19 zu vergleichen. Nachdem die Krebszellen und Fibroblasten eingeführt wurden, kann die Tumorgröße im Laufe der Zeit überwacht werden. Am Ende der Experimente können Tumore seziert und gewogen werden. Durch die Überwachung des Tumorwachstums im Laufe der Zeit kann die Bedeutung verschiedener Faktoren analysiert werden.

Es gibt mögliche alternative Ansätze, um die Rolle von Fibroblasten beim Tumorwachstum zu untersuchen. Als Beispiel gibt es Cre-loxed-basierte Modelle, die einen gewebespezifischen Knockout von Genen mit Treibern ermöglichen, die bevorzugt in Fibroblasten exprimiert werden. Solche Ansätze bieten auch die Möglichkeit, die Rolle spezifischer Gene und Signalwege in Fibroblasten für die Tumorprogression zu untersuchen. Im Vergleich zu Cre-lox-basierten Ansätzen würde das bereitgestellte Protokoll einen deutlich schnelleren Ansatz zur Überwachung der Rolle von Fibroblasten darstellen, da das Tumorwachstum über nur wenige Wochen überwacht würde. Der bereitgestellte Ansatz ist auch deutlich kostengünstiger, da keine Kolonien gentechnisch veränderter Mäuse erzeugt und untergebracht werden müssen. Das bereitgestellte Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung des Knockdowns verschiedener Gene mithilfe von shRNAs schnell zu testen, anstatt Mauskolonien entwickeln zu müssen. Der bereitgestellte Ansatz ist auch flexibler, da er einen Vergleich einer unterschiedlichen Anzahl von Fibroblasten, unterschiedlichen Verhältnissen von Krebszellen und Fibroblasten, einen Knockdown verschiedener Gene und sogar einen Vergleich von Fibroblasten aus verschiedenen Gewebestellen oder Spezies ermöglichen würde. Ein Cre-lox-Ansatz hätte den Vorteil, dass die Fibroblasten in den Mäusen in einem physiologischeren Kontext vorhanden sind.

Das hier berichtete Protokoll wäre wertvoll für Wissenschaftler, die die Auswirkungen von Fibroblasten auf das Tumorwachstum schnell und kostengünstig überwachen wollen. Dieses Protokoll ist besonders wertvoll für Wissenschaftler, die verschiedene Untergruppen von Fibroblasten oder Fibroblasten aus verschiedenen Quellen auf das Tumorwachstum untersuchen. Wenn es wichtig ist, dass die Tumorinitiierung in einem physiologischen Kontext erfolgt, sollten gentechnisch veränderte Mausmodelle in Betracht gezogen werden.

Es gibt mehrere mögliche Ansätze für die Durchführung dieser Experimente. Immunkompetente Mäuse können als Wirte verwendet werden, was die Untersuchung von Fibroblasten-Immunzell-Interaktionen ermöglichen würde. Für immunkompetente Mausmodelle müssen Mauskrebszellen und embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus injiziert werden. Die Verwendung von MEFs ermöglicht es dem Forscher auch, die breite Palette von Knockout-Mausstämmen zu nutzen, um das Vorhandensein oder Fehlen eines interessierenden Gens zu testen. Alternativ können immundefiziente Mäuse verwendet werden, um die Rolle menschlicher Fibroblasten bei der Förderung des Wachstums von Tumoren bei Mäusen zu testen, die von menschlichen Krebszellen stammen. Die Einführung der Krebszellen kann subkutan oder orthotopisch erfolgen. Beim Melanom kann, wie unten beschrieben, das Tumor-Fibroblasten-Gemisch intradermal injiziert werden, um eine orthotope Injektion durchzuführen, die die Stelle in der Haut, an der sich ein Melanom entwickeln würde, genauer simuliert.

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Protocol

Alle beschriebenen Experimente wurden vom Animal Care Committee der University of California, Los Angeles, genehmigt.

HINWEIS: Wählen Sie Krebszellen und Fibroblasten aus, die den Wirtsmäusen für den Mausstamm entsprechen. Wählen Sie Krebszellen und Fibroblasten aus, die dem Geschlecht der Wirtsmaus entsprechen. Holen Sie sich Mäuse aus Zuchtkolonien oder kaufen Sie sie von seriösen Anbietern. Führen Sie Tumore in Mäuse ein, die ~ 8-10 Wochen alt sind. Mäuse mit Fell befinden sich in der Telogen- oder Ruhephase des Haarfollikelzyklus. Planen Sie ein Verhältnis von 0,5 zu 3 Fibroblasten zur Krebszelle ein.

1. Bestimmen Sie die geeignete Anzahl von Mäusen, die für Experimente verwendet werden sollen

  1. Führen Sie vor der Durchführung der Studien eine Power-Analyse durch, um die geeignete Anzahl von Mäusen zu bestimmen, die für die Studien verwendet werden sollen. Verwenden Sie die folgende Formel, um den Stichprobenumfang für ein Experiment mit der angegebenen Trennschärfe zu bestimmen:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Wenn α das gewählte Signifikanzniveau ist (normalerweise 0,05), dann ist 1-α/2 = 0,975 und Z = 1,960.
    β ist die Leistung und wenn 80% Leistung gewünscht wird, dann Z = 0,84.

    ES, die Effektstärke = \μ1-μ 0\/σ
    wobei μ 0 der Mittelwert unter Hypothese H0, μ 1 der Mittelwert unter Hypothese H1 und σ die Standardabweichung des interessierenden Ergebnisses22 ist.
    ANMERKUNG: Weitere Informationen zur Berechnung des Stichprobenumfangs finden Sieunter 22.

2. Erzeugen Sie Krebszellen für die Injektion

  1. Bestimmen Sie die relevante Wachstumsrate mit der folgenden Gleichung:
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    HINWEIS: Ein Beispiel für Zellen, die sich innerhalb von 24 Stunden verdoppeln, wird gezeigt
    Verdopplungszeit = ln(2)/Wachstumsrate
    24 Stunden = ln(2)/Wachstumsrate
    24 * Wachstumsrate = .693
    Wachstumsrate = .693/24= .028875
  2. Bestimmen Sie die Anzahl der zu beschichtenden Krebszellen und die Zeit, die die Zellen vor der Injektion wachsen müssen.
    HINWEIS: Für jeden gebildeten Tumor werden 0,25-1 Million Krebszellen injiziert.
  3. Berechnen Sie die Anzahl der Tage, die erforderlich sind, um eine ausreichende Anzahl von Zellen gemäß der Gleichung zu generieren
    N(t)=N(0)egr*t
    wobei N(t) die Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt t, N(0) die Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt 0, gr die Wachstumsrate und t die Zeit ist.
    HINWEIS: Ein Beispiel für diese Berechnungen für das Wachstum von 500.000 Zellen, um 10bis 6 Zellen in jedem von 12 Tumoren zu erzeugen. Basierend auf diesen Berechnungen reichen 5 Tage aus, um die erforderliche Anzahl von Zellen zu züchten:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500.000e(gr*t)
    12 x 106=500.000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0.028875x
    3,178 = 0,028875x
    X = 110 Stunden = 4,59 Tage
    Planen Sie zusätzliche Zeit für die Befestigung der Zellen an der Platte und für die Zellen, die während der Entnahme verloren gehen.
  4. Plattenkrebszellen.
    HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe und Laborkittel, wenn Sie mit kultivierten Zellen arbeiten.
    HINWEIS: Führen Sie Zellmanipulationen in einer Laminar-Flow-Haube durch, um das Eindringen von Mikroben aus der Luft in die Proben zu minimieren. Behandeln Sie die Gewebekulturhaube vor Gebrauch mit ultraviolettem Licht. Verwenden Sie eine sterile Technik und nur sterile Zellkultur-Kunststoffe und Verbrauchsmaterialien wie mit Gewebekulturen behandelte Platten, Pipetten und konische Röhrchen.
    1. Berechnen Sie die richtige Anzahl und Größe der Gewebekulturplatten basierend auf der Anzahl der Zellen in der Durchstechflasche und der gewünschten Zellkonzentration nach der Beschichtung.
    2. Beschriften Sie Gewebekulturplatten.
    3. Bereiten Sie ein Wasserbad mit Wasser bei 37 °C vor.
    4. Das Medium in konische Röhrchen aliquotieren und bei 37 °C in ein Wasserbad stellen. Viele Krebszellen können in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) gezüchtet werden, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.
    5. Entfernen Sie die erforderliche Anzahl von Durchstechflaschen mit gefrorenen Zellen aus dem Flüssigstickstoff-Gefrierschrank.
      HINWEIS: Verwenden Sie Gefrierhandschuhe, wenn Sie Zellen in einem Gefrierschrank mit flüssigem Stickstoff handhaben.
    6. Tauen Sie die Zellfläschchen im Wasserbad unter leichtem Schütteln schnell auf.
      HINWEIS: Fügen Sie den Handschuhen beim Umgang mit Fläschchen Ethanol hinzu, um die Sterilität zu erhalten.
    7. Pipettieren Sie die Zellen mit steriler Technik in einer Gewebekulturhaube in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das 10 ml DMEM + 10% FBS enthält.
    8. Zentrifugieren Sie die Zellmischung bei 180 x g für 5 Minuten.
    9. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer sterilen Absaugung oder einer sterilen 10-ml-Pipette.
    10. Resuspendieren Sie die Zellen im Pellet vorsichtig in 1 ml DMEM + 10% FBS.
    11. Die resuspendierten Zellen werden auf eine markierte Gewebekulturplatte mit einem sterilen p1000 gesetzt.
    12. Unter Verwendung steriler 10-ml-Pipetten Pipetenmedium mit Serum in Gewebekulturplatten geben.
    13. Gewebekulturplatten in einem Gewebekulturinkubator bei 37 °C mit 5% CO2 inkubieren.
  5. Erweitern Sie Krebszellen, um genügend Krebszellen für die Injektion zu erzeugen.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Zellen mit Lichtmikroskopie auf Konfluenz. Trypsinisieren Sie alle zwei bis drei Tage oder nach Bedarf, um zu verhindern, dass die Zellen eine 100%ige Konfluenz erreichen. Wenn eine große Anzahl von Zellen benötigt wird, verwenden Sie Hyperflaschen (Table of Materials), um eine große Anzahl von Zellen platz- und mitteleffizient zu züchten. Befolgen Sie jedes Mal, wenn die Zellen passieren müssen, dieses Verfahren:
    1. Entfernen Sie das Medium mit steriler Absaugung oder einer sterilen 10-ml-Pipette von der Platte.
    2. Waschen Sie die Platte vorsichtig, indem Sie sie auf warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pipettieren. Entfernen Sie dann das PBS mit steriler Absaugung oder einer Pipette.
    3. 5 mL 1x Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS für eine 10 cm große Platte auf die Zellen pießen und 5 Minuten bei 37 °C inkubieren.
    4. Entfernen Sie die Zellen mit leichtem Klopfen von der Platte, um die Zellen von der Platte zu entfernen.
    5. Sammeln Sie die Zellen mit einer sterilen 10-ml-Pipette in DMEM mit 10% FBS-Serum in konischen Röhrchen.
    6. Zentrifugieren Sie konische Röhrchen bei 180 x g für 5 Minuten.
    7. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn abgießen. Das Zellpellet sollte sichtbar sein. Beobachten Sie es, um sicherzustellen, dass es in der Röhre bleibt.
    8. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen, indem Sie 1 ml DMEM + 10% FBS hinzufügen und vorsichtig auf und ab pipettieren.
    9. Aliquote resuspendierte Zellen auf neue Gewebekulturplatten geeigneter Größe mit DMEM + 10% FBS (10 ml Medium sind für eine 10 cm Gewebekulturplatte geeignet).

3. Erzeugen Sie Fibroblasten für die Injektion

HINWEIS: Primäre Fibroblasten werden nach zu vielen Verdopplungen/Passagen seneszieren. Es ist wichtig, primäre Fibroblasten nach einer begrenzten Anzahl von Passagen oder Verdopplungen zu verwenden. Verfolgen Sie die Anzahl der Passagen oder Verdoppelungen, die die Fibroblasten aus der Maus oder der menschlichen Haut gewachsen sind. Verwenden Sie Fibroblasten mit weniger als 15 Passagen für primäre menschliche dermale Fibroblasten. Verwenden Sie Fibroblasten mit weniger als 9 Durchgängen für embryonale Fibroblasten der Maus. Fibroblasten werden verändert, wenn sie konfluent werden. Trypsinisieren Sie die Fibroblasten, wenn sie zu etwa 90% konfluent sind. Fibroblasten haben unterschiedliche Eigenschaften, je nachdem, wie sie kultiviert werden. Viele Wissenschaftler befürworten die Kultivierung auf physiologisch relevanteren Substraten als Gewebekulturplatten, wie z. B. 3D-Kollagenmatrizen, die gewebeähnliche Umgebungen effektiver erfassen23,24,25.

  1. Verwenden Sie die Gleichung in Abschnitt 2.1, um die Wachstumsrate für die Fibroblastenzellen zu bestimmen.
  2. Verwenden Sie die Gleichung in Abschnitt 2.2, um die Anzahl der Tage zu bestimmen, die für die Expansion der Fibroblasten erforderlich sind.
  3. Die Fibroblasten werden wie in Abschnitt 2.3 beschrieben am entsprechenden Tag mit dem geeigneten Medium beschichtet, um sicherzustellen, dass Krebszellen und Fibroblasten noch am selben Tag zur Injektion bereit sind.
  4. Expandieren Sie die Fibroblasten in dem geeigneten Medium, um eine ausreichende Anzahl von Fibroblasten zu erzeugen, die nach den in Abschnitt 2.4 beschriebenen Verfahren benötigt werden.

4. Mäuse rasieren, um Mäuse für die Injektion vorzubereiten

HINWEIS: Tragen Sie Laborkittel, Haarnetze, Überschuhe und Handschuhe, wenn Sie mit Mäusen arbeiten.

  1. Ein bis zwei Tage vor der Injektion werden die Mäuse gemäß den Regeln des Institutional Animal Care Committee betäubt. Wenn Sie Isofluran zur Anästhesie verwenden, verwenden Sie eine Mischung aus Isofluran und O2. Legen Sie die Mäuse in eine Anästhesiekammer und führen Sie ein Isofluran (5%) / O2 -Gemisch ein, um eine Anästhesie einzuleiten. Setzen Sie dann den Nasenkegel auf das anästhesierte Tier, um die chirurgische Anästhesieebene mit einem konstanten Fluss von Isofluran (2%)/O2 -Gemisch aufrechtzuerhalten.
  2. Überprüfen Sie die Tiere, um sicherzustellen, dass sie sich in der entsprechenden Anästhesieebene befinden, indem Sie den Zeh der Maus einklemmen und bestätigen, dass sich die Maus nicht bewegt.
  3. Entfernen Sie mit einer Tierschere mit chirurgischer Klinge #40 vorsichtig das Fell an den entsprechenden Positionen an den Flanken der Mäuse, indem Sie die Tierschere mehrmals über die Haut führen, bis das Fell entfernt ist.
  4. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie sich von der Anästhesie erholt haben.

5. Bereiten Sie Krebszellen und Fibroblasten für die Injektion vor

HINWEIS: Krebszellen und Fibroblasten sollten so schnell wie möglich nach der Entnahme injiziert werden, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten. Ernten Sie am Morgen der Injektion die Krebszellen und Fibroblasten getrennt von den Gewebekulturplatten. Führen Sie für jeden Zellentyp die folgenden Schritte aus:

  1. Entnehmen Sie das Medium von der Gewebekulturplatte durch leichtes steriles Absaugen oder durch Abpipettieren des Mediums.
  2. Pipettieren Sie vorsichtig mit 5 ml PBS, ohne die Zellen zu stören. Schwenken Sie das PBS. Saugen Sie den PBS vorsichtig mit einem Saugen oder einer Pipette vom PBS ab.
  3. 5 ml Trypsin-EDTA in PBS werden vorsichtig auf die Zellschicht pipettiert und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert.
  4. Entfernen Sie die Zellen mit leichtem Klopfen von der Platte, um die Zellen zu entfernen. Die Zellen werden mehrmals mit einer 10-ml-Pipette pipettiert und in ein konisches Röhrchen überführt, das DMEM mit 10% FBS enthält.
  5. Zentrifugieren Sie die konischen Röhrchen bei 180 x g für 5 Minuten.
  6. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig abgießen und das Zellpellet zurückhalten. Waschen Sie das Zellpellet zweimal mit PBS. Pipetieren Sie jedes Mal 10 ml PBS auf die Zellen. Vorsichtig mit einer p1000-Pipette mischen.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen wie in Schritt 5.5. Entfernen Sie den PBS vorsichtig mit einer Pipette und wiederholen Sie den Vorgang.
  8. Resuspendieren Sie die gewaschenen, pelletierten Zellen in 1 ml PBS mit einem p1000.
  9. Reinigen Sie einen Objektträger mit Alkohol und trocknen Sie ihn ab.
  10. 100 μl der Zellmischung werden in ein Röhrchen pipettiert und 400 μl 0,4 % Trypanblau zugegeben, um eine endgültige Trypanblaukonzentration von 0,32 % zu erhalten.
  11. Füllen Sie vorsichtig die Kammern eines Glashämozytometers unter dem Deckglas, indem Sie die Zellmischung pipettieren, bis die Kammer voll ist.
  12. Fokussieren Sie mit einem Mikroskop auf die Gitterlinien eines 10-fachen Objektivs.
  13. Zählen Sie die lebenden, ungefärbten Zellen und blauen Zellen in einem Satz von 16 Quadraten.
  14. Zählen Sie alle 4 Sätze mit 16 Feldern.
  15. Berechnen Sie den Durchschnitt der Zellzahl für die klaren und blauen Felder aus den 4 Sätzen von 16 Quadraten und multiplizieren Sie sie mit 10.000. Multiplizieren Sie mit 5, um die 1:5-Verdünnung des Trypanblaus zu korrigieren.
  16. Die endgültigen Zählungen sind die Konzentration in Zellen/ml für die lebensfähigen und toten Zellen. Multiplizieren Sie mit dem Volumen, um die Gesamtzahl der Krebszellen und Fibroblasten zu bestimmen. Bestätigen Sie, dass der Anteil der lebensfähigen Zellen >80% beträgt.
  17. Vergewissern Sie sich, dass für alle geplanten Injektionen eine ausreichende Anzahl von Melanomzellen und Fibroblasten vorhanden ist, wobei von einem Probenverlust von mindestens 20% während der Injektionen ausgegangen wird.
  18. Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein neues konisches Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation (180 x g für 5 Minuten).
  19. Entfernen Sie den Überstand mit einer 10 ml Pipette.
  20. Resuspendieren Sie das Pellet in der erforderlichen Konzentration in der entsprechenden Menge an PBS der US-Pharmakopöe (USP) (50 μl pro Tumor für die intradermale Injektion und 100 μl pro Tumor für die subkutane Injektion).

6. Injizieren Sie Krebszellen und Fibroblasten in Mäuse

HINWEIS: Wenn dies vom institutionellen Tierpflegeausschuss genehmigt wurde, injizieren Sie zwei Tumore in jede Maus, einen an jeder Flanke. Randomisieren Sie, welche Maus welche Injektion auf der rechten und linken Flanke erhält. Abhängig von der Anzahl der Mäuse, die injiziert werden sollen, betäuben Sie die Mäuse und injizieren Sie Krebszellen und Fibroblasten in Chargen in die Mäuse.

  1. Zur subkutanen Injektion von Krebszellen
    1. Mäuse wie in Abschnitt 4.1 beschrieben betäuben.
    2. Wischen Sie die rasierte Haut mit Alkoholtupfern ab.
    3. Füllen Sie eine sterile Spritze mit dem gewünschten Volumen an Zellen oder Zellmischung und verschließen Sie die Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Schnippen Sie die Spritze nach Bedarf, um Blasen zu entfernen. Sobald die Zellen in die Spritze eingeführt wurden, halten Sie die Zellen in den Spritzen gut gemischt, indem Sie die Spritzen kontinuierlich umdrehen, um ein Verklumpen zu verhindern.
    4. Führen Sie die Nadel in den subkutanen Bereich an der Flanke der Maus ein und injizieren Sie die Zellen vorsichtig in die Maus. Verwenden Sie 100 μl Zellsuspension pro Tumor für die subkutane Injektion (die Verwendung eines Volumens von mehr als 100 μl pro Injektion wird nicht empfohlen).
    5. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie sich von der Anästhesie erholt haben. Stellen Sie den Mäusen bei Bedarf zusätzliche Isoliermaterialien wie Hütten und/oder Heizkissen zur Verfügung, damit sich die Mäuse vollständig erholen können.
  2. Für intradermale Injektionen von Krebszellen
    1. Mäuse wie in Abschnitt 4.1 beschrieben betäuben.
    2. Wischen Sie die rasierte Haut mit Alkoholtupfern ab.
    3. Füllen Sie eine sterile Spritze mit dem gewünschten Volumen an Zellen oder Zellmischung und verschließen Sie die Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Schnippen Sie die Spritze nach Bedarf, um Blasen zu entfernen. Sobald die Zellen in die Spritze eingeführt wurden, halten Sie die Zellen in den Spritzen gut gemischt, indem Sie die Spritzen kontinuierlich umdrehen, um ein Verklumpen zu verhindern.
    4. Führen Sie eine 27-Gauge-Nadel in den intradermalen Bereich der Haut an der Flanke der Maus ein und injizieren Sie die Zellen vorsichtig in den intradermalen Bereich der Maus. Verwenden Sie 50 μl Zellsuspension pro Tumor für die intradermale Injektion (die Verwendung eines Volumens von mehr als 50 μl pro Injektion wird nicht empfohlen).
    5. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie sich von der Anästhesie erholt haben. Wenn es Anzeichen dafür gibt, dass die Mäuse in Not sind, wenden Sie sich an einen Tierarzt. Stellen Sie den Mäusen bei Bedarf zusätzliche Isoliermaterialien wie Hütten und/oder Heizkissen zur Verfügung, damit sich die Mäuse vollständig erholen können.

7. Überwachen Sie Mäuse während des Tumorwachstums

  1. Überwachen Sie die Mäuse täglich auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden (gebeugte Haltung, Krümmen, Lautäußerung, Strecken entlang des Käfigs, Drücken des Bauches auf den Boden des Käfigbodens oder Widerwillen, sich im Käfig zu bewegen) oder Abszessbildung. Wenn es Anzeichen dafür gibt, dass die Mäuse in Not sind, wenden Sie sich an einen Tierarzt.
  2. Sobald sich Tumore gebildet haben, messen Sie das Tumorvolumen etwa alle zwei bis drei Tage. Messen Sie die Tumorlänge (die längste Seite) und die Breite (senkrecht zur Länge) mit Messschiebern.
    HINWEIS: Es empfiehlt sich, dass dieselbe Person diese Messungen während des gesamten Experiments durchführt, um die Variabilität der Daten zu verringern. Für Messungen werden Mäuse wie in Abschnitt 4.1 beschrieben betäubt
  3. Berechnen Sie das Tumorvolumen mit der Formel Volumen = 0,5 x (Länge x Breite2).

8. Tumore ernten und Tumorgewichte messen

  1. Euthanasieren Sie Mäuse, wenn das Tumorwachstum einen experimentellen Endpunkt erreicht, der von der Institution Committee on Animal Care festgelegt wurde. Legen Sie Mäuse in eine Kammer und euthanasieren Sie sie mit langsamer (20-30% pro Minute) Verdrängung der Kammerluft mit komprimiertem CO2 für eine Minute nach Beendigung der Atmung.
  2. Führen Sie eine Zervixluxation bei den Mäusen durch. Halten Sie das Nagetier auf einer festen, ebenen Oberfläche fest. Legen Sie einen stabilen Stift oder einen anderen Gegenstand gegen den Nacken an der Schädelbasis. Drücken Sie schnell nach vorne und unten, wobei das Objekt den Kopf festhält, während Sie mit der Hand, die die Basis des Schwanzes hält, nach hinten ziehen. Bestätigen Sie mit Palpation, dass das Rückenmark durchtrennt ist.
    HINWEIS: Die Zervixluxation sollte von erfahrenem Laborpersonal durchgeführt werden.
  3. Bestätigen Sie für jede Maus im Experiment, dass die Maus nicht mehr lebt, indem Sie überprüfen, ob keine Atmung, kein Herzschlag und keine Reaktion auf ein Zehenkneifen vorhanden sind.
  4. Entfernen Sie mit einem sterilen Skalpell und einer chirurgischen Schere den gesamten Tumor von der Maus. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere Nicht-Tumorgewebe vom Tumor ab.
  5. Wiegen Sie den Tumor auf einer Analysewaage und notieren Sie das Tumorgewicht.

9. Statistische Analyse von Tumorvolumina und Tumorgewichten

  1. Vergleichen Sie die Tumorvolumina im Zeitverlauf in jeder Gruppe mit einer Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (ANOVA). Führen Sie eine gepaarte Analyse durch, wenn zwei Tumore pro Maus injiziert wurden.
  2. Vergleichen Sie die Tumorgewichte zwischen den Gruppen mit ANOVA unter Verwendung eines zweiseitigen Tests. Mit dem Post-hoc-Test von Tukey kann dann festgestellt werden, welche Gruppen sich signifikant voneinander unterscheiden. Führen Sie eine gepaarte Analyse durch, wenn zwei Tumore pro Maus injiziert wurden.

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Representative Results

A2058 humane Melanomzellen und primäre humane dermale Fibroblasten wurden unter sterilen Bedingungen kultiviert. Die Zellen wurden gesammelt und dreimal mit PBS gewaschen. Immundefiziente Mäuse (NU/J - Foxn1 nude strain) wurden subkutan an einer Flanke mit 0,25 Millionen A2058 Melanomzellen allein injiziert. Auf der anderen Flanke wurde Mäusen eine Mischung aus 0,25 Millionen A2058-Melanomzellen und 0,75 Millionen Fibroblasten injiziert. Zellen wurden in 12 immundefiziente Mäuse injiziert. Injektionen in die linke und rechte Flanke wurden randomisiert. Die Tumorvolumina wurden an den Tagen 12, 14, 16, 19 und 21 Tage nach der Injektion überwacht (Abbildung 1A). Nach der Euthanasie wurden Tumore herausgeschnitten, abgebildet (Abbildung 1B) und gewogen (Abbildung 1C). Das Vorhandensein der Fibroblasten führt zu deutlich größeren Tumoren.

Figure 1
Abbildung 1: Vergleich des Melanomwachstums in Gegenwart und Abwesenheit von co-injizierten Fibroblasten. Melanomzellen wurden in Nacktmäuse entweder mit oder ohne primäre Hautfibroblasten eingeführt. (A) Darstellung des Tumorvolumens über die Zeit für Melanome mit und ohne co-injizierte Fibroblasten. Das Volumen wurde als 0,5 * Länge * Breite2 berechnet. Die mittleren Volumina und der Standardfehler des Mittelwerts (REM) werden aufgetragen. Zur Bestimmung der Signifikanz wurde eine ANOVA durchgeführt. (B) Bilder von herausgeschnittenen Tumoren. (C) Endgewichte der Tumore am Ende des Experiments am Tag 21. Mittelgewichte und REM werden aufgetragen. Ein ungepaarter, zweiseitiger t-Test wurde verwendet, um die endgültigen Gewichte zu vergleichen. * steht für p < 0,05, *** für p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

In dem Experiment in Abbildung 1 führte die gleichzeitige Einführung menschlicher dermaler Fibroblasten mit menschlichen A2058-Melanomzellen zu größeren Tumoren als bei der Einführung der Melanomzellen ohne co-injizierte Fibroblasten. Dieser Unterschied konnte anhand des Tumorvolumens und des Tumorgewichts leicht festgestellt werden. Die Ergebnisse stimmen mit mehreren Berichten überein, dass krebsassoziierte Fibroblasten das Tumorwachstum fördern können 5,6,7,8. Neben den hier diskutierten Endpunkten wie Tumorvolumen und Tumorgewicht können auch weitere Endpunkte überwacht werden. Zusätzliche Analysen sind ebenfalls möglich. Zum Beispiel können die Tumore, die sich entwickeln, zur Fixierung in Formalin gesammelt, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin für die Histologie analysiert werden. Alternativ können die entwickelten Tumoren zu einer optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT) gesammelt werden, um sie mit Immunfluoreszenz für bestimmte Proteine weiter zu analysieren.

Eine wichtige Einschränkung dieser Experimente besteht darin, dass die Fibroblasten, die zusammen mit den Krebszellen injiziert werden, nach einigen Zellteilungen absterben oder absterben können. Alternativ können co-injizierte Fibroblasten vom Tumor wegwandern, in diesem Fall können sie das Tumorwachstum nicht beeinflussen. Wenn die Fibroblasten absterben, absterben oder vom Tumor wegwandern, werden sie mit der Zeit weniger häufig und die Wirkung der gemeinsam eingeführten Fibroblasten wird für das Tumorwachstum weniger wichtig. In der Tat wird erwartet, dass die eingeführten Krebszellen zusätzliche Fibroblasten aus dem Wirt rekrutieren. Bei Experimenten, bei denen ein bestimmtes Gen in den eingeführten Fibroblasten abgeschaltet oder ausgeschaltet wird, wird erwartet, dass die Rekrutierung von Wirtsfibroblasten, die das kodierte Protein exprimieren, im Laufe der Zeit jeden beobachteten Phänotyp reduziert. Um das Vorhandensein der eingeführten Fibroblasten zu überwachen, können die Fibroblasten gentechnisch so verändert werden, dass sie ein fluoreszierendes Protein wie GFP26,27 exprimieren. Wenn die Fibroblasten GFP exprimieren, kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die Anzahl der Fibroblasten zu überwachen, die an verschiedenen Tagen nach ihrer Einführung im Tumor vorhanden sind. Alternativ kann das Luciferase-Enzym in die Fibroblasten eingeführt werden, und die Biolumineszenz-Bildgebung kann verwendet werden, um die Menge der Fibroblasten in den Mäusen im Laufe der Zeit zu überwachen. Wenn die Fibroblasten schnell aus der Mikroumgebung des Tumors eliminiert werden, würden gentechnisch veränderte Mausmodelle von Cre-lox dieses Problem angehen und die beschriebenen Studien ergänzen.

Wenn die Experimente durchgeführt werden, indem menschliche Krebszellen und Fibroblasten in Nacktmäuse eingeführt werden, wird erwartet, dass das eingeschränkte Immunsystem einen signifikanten Einfluss auf die Ergebnisse hat. Athymische Nacktmäuse (NU/J) haben keine T-Zellen und daher keine zellvermittelte Immunität. Sie haben auch einen partiellen Defekt in der B-Zell-Entwicklung. Die zellvermittelte Immunität, d.h. das Abtöten von Zellen durch aktivierte CD8+ T-Zellen, kann eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung des Tumorwachstums spielen28,29. In neueren Studien wurde über das Zusammenspiel zwischen krebsassoziierten Fibroblasten und CD8+ T-Zellen berichtet30,31,32. Die Einführung von Mauskrebszellen und Mausfibroblasten in Mäuse mit einem Immunsystem kann als alternativer Ansatz angesehen werden, der dieses Problem angehen würde.

Ein weiterer alternativer Ansatz ist die Verwendung gentechnisch veränderter Mausmodelle, in denen das Cre-lox-System verwendet wird, um den Gehalt oder die Aktivität bestimmter Proteine in Wirtsfibroblasten zu modulieren. Ein solcher Ansatz ist die Verwendung von mit Fibroblasten angereicherten Cre-lox-Modellen mit Treibern wie FSP1, Col1a1, Col1a2 oder PDGFRa33,34,35. Mit einem Cre/lox-Rekombinase-Modell gäbe es keine Bedenken, dass die injizierten Fibroblasten absterben oder vom Tumor wegwandern.

Es gibt einige Schritte im Protokoll, die für den Erfolg entscheidend sind. Das Wachstum der Fibroblasten ist ein wichtiger Teil des Protokolls und wird wahrscheinlich wesentlich zum Ergebnis beitragen. Primäre Fibroblasten werden leicht seneszieren, und die Passage oder Verdopplung muss sorgfältig überwacht werden, um sicherzustellen, dass sich die Fibroblasten in der exponentiellen Wachstumsphase befinden und nicht senesziert sind. Es wird erwartet, dass seneszente Fibroblasten hohe Konzentrationen von Zytokinen absondern, die einen dramatischen Einfluss auf das Tumorwachstum haben können36,37,38. Es ist daher von großer Bedeutung, dass die Passagennummer sorgfältig dokumentiert wird und dass die injizierten Fibroblasten nicht seneszent sind, es sei denn, das Protokoll erfordert eine Analyse seneszenter Fibroblasten.

Wenn Fibroblasten konfluent werden, ist zu erwarten, dass sie eine große Anzahl von Veränderungen erfahren, von denen einige wahrscheinlich rückgängig gemacht werden, wenn sie wieder in den Zellzyklus eintreten 39,40,41,42,43,44. Es ist wichtig, die Fibroblasten in einem proliferativen Zustand zu halten und sie zu teilen, wenn sie zu 90% konfluent sind, um sicherzustellen, dass die Studien so konsistent wie möglich sind. Die Kultivierung von Fibroblasten auf Gewebekulturplatten wirkt sich wahrscheinlich auch auf ihr Verhalten aus, und Alternativen wie 3D-Kollagenmatrizen sollten in Betracht gezogen werden23,24,25. Fibroblasten, die in 3D-Matrizen kultiviert werden, zeigen wesentlich andere Migrationsmuster als Fibroblasten, die auf 2D-Oberflächen 45,46,47,48,49 gezüchtet werden, was wahrscheinlich ihre tumorfördernde Kapazität beeinträchtigen würde, wenn sie in Tumore eingeführt werden, wo die Fibroblasten eine aktive Rolle bei der Etablierung der extrazellulären Matrix-Mikroumgebung des Tumors spielen50.

Die Injektion von Melanomzellen in die Maus durch intradermale Injektion kann zu einem reproduzierbareren Tumorwachstum führen als subkutane Injektionen. Dies ist ein kniffliger Schritt, da in der intradermalen Region nur sehr wenig Platz vorhanden ist. Es ist wichtig, die Nadel sorgfältig zu positionieren. Wenn intradermale Injektionen durchgeführt werden, werden nur 50 μl Lösung injiziert. Selbst für erfahrene Forscher können diese Injektionen undicht werden. Es ist wichtig zu beachten, ob jede Injektion ausgelaufen ist, damit sie, wenn sich kein Tumor bildet, aus der endgültigen Analyse eliminiert werden kann.

Die Vorbereitung von Spritzen für die Injektion ist ein weiterer wichtiger Schritt. Es ist wichtig, alle Blasen aus der Spritze zu entfernen, was ein Schnippen der Spritze erfordern kann, um die Blasen zu entfernen. Wichtig ist auch, dass die Zellen nicht verklumpen. Drehen Sie die Spritzen wiederholt um, um ein Verklumpen zu vermeiden.

Ein weiterer kniffliger Aspekt dieser Experimente ist, dass die Messung des Tumorvolumens von Person zu Person unterschiedlich sein kann. Um die Variabilität der Tumorvolumenmessungen zu begrenzen, ist es hilfreich, einem einzelnen Labormitglied die Verantwortung für die Durchführung aller Tumorvolumenmessungen bei allen Mäusen und zu allen Zeitpunkten während eines Experiments zuzuweisen.

Es ist vorzuziehen, Mäusen nach Möglichkeit Krebszellen des gleichen Geschlechts wie die Wirtsmaus zu injizieren. Es ist möglich, beide Geschlechter zu verwenden und das Geschlecht als Variable in ANOVA-Modelle einzubeziehen, um zu bestimmen, ob das Geschlecht die Tumorgröße im Laufe der Zeit beeinflusst.

Das Verständnis der Tumormikroumgebung ist unerlässlich, um einen Einblick in die Tumorentstehung zu erhalten. Das Protokoll kann eine Grundlage für das Verständnis der Rolle von Fibroblasten, verschiedenen Arten von Fibroblasten und verschiedenen Signalwegen innerhalb von Fibroblasten bieten, die das Tumorwachstum beeinflussen können. Die Ergebnisse dieser Experimente könnten neue therapeutische Ziele identifizieren, die verhindern, dass Fibroblasten das Tumorwachstum fördern18.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei allen Mitgliedern des Coller-Labors für ihren hilfreichen Input. H.A.C. war der Milton E. Cassel-Stipendiat der Rita Allen Foundation. Wir würdigen NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, das Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, das Koordinierungskomitee für Krebsforschung der Universität von Kalifornien, den Metabolismus Theme Award der David Geffen School of Medicine, das Clinical Translational Science Institute und das Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovationspreise des Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills und Ha Gaba), eine Auszeichnung des UCLA SPORE in Prostatakrebs (National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Preisnummer P50CA092131), ein Innovationspreis des Broad Stem Cell Center, des Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, das Tumorzellbiologie-Trainingsprogramm (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), das Dermatologie-T32-Programm an der UCLA AR071307 und das UCLA-Trainingsprogramm für Muskelzellbiologie, Pathophysiologie und Therapeutika T32 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

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Ein Mausmodell zur Untersuchung der Rolle krebsassoziierter Fibroblasten beim Tumorwachstum
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