Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En musemodel til at undersøge rollen som kræftassocierede fibroblaster i tumorvækst

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

En protokol til co-injicere kræftceller og fibroblaster og overvåge tumorvækst over tid er tilvejebragt. Denne protokol kan bruges til at forstå det molekylære grundlag for fibroblasternes rolle som regulatorer af tumorvækst.

Abstract

Kræftassocierede fibroblaster (CAF'er) kan spille en vigtig rolle i tumorvækst ved at skabe et tumorfremmende mikromiljø. Modeller til at studere CAFs rolle i tumormikromiljøet kan være nyttige til at forstå den funktionelle betydning af fibroblaster, fibroblaster fra forskellige væv og specifikke genetiske faktorer i fibroblaster. Musemodeller er afgørende for at forstå bidragyderne til tumorvækst og progression i en in vivo-sammenhæng. Her tilvejebringes en protokol, hvor kræftceller blandes med fibroblaster og indføres i mus for at udvikle tumorer. Tumorstørrelser over tid og endelige tumorvægte bestemmes og sammenlignes mellem grupper. Den beskrevne protokol kan give mere indsigt i CAF'ernes funktionelle rolle i tumorvækst og progression.

Introduction

Inden for tumormikromiljøet er en af de mest fremtrædende celletyper den kræftassocierede fibroblast (CAF)1. Disse carcinomassocierede fibroblaster kan spille en tumorundertrykkende rolle 2,3. For eksempel udskiller S100A-ekspressive fibroblaster kollagener, der kan indkapsle kræftfremkaldende stoffer og beskytte mod dannelse af karcinom4. Endvidere forårsager udtømning af α-glat muskelactin (SMA)-positive myofibroblaster i kræft i bugspytkirtlen immunsuppression og fremskynder progression af kræft i bugspytkirtlen2. CAF'er kan også udvikle sig sammen med kræftceller og fremme tumorprogression 5,6,7,8. Fibroblaster kan syntetisere og udskille ekstracellulære matrixproteiner, der skaber et tumorfremmende miljø8. Disse ekstracellulære matrixproteiner kan forårsage mekanisk afstivning af vævet, hvilket er forbundet med tumorprogression 9,10. Den deponerede ekstracellulære matrix kan fungere som en fysisk barriere, der hæmmer immuninfiltration11. Matrixaflejring af CAF'er har også været forbundet med tumorinvasion, da fibronectin genereret af CAF'er har vist sig at fremme tumorinvasion12. CAF'er fremmer angiogenese og rekrutterer immunosuppressive celler til tumormikromiljøet ved at udskille transformerende vækstfaktor-β (TGF-β), vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) og CXC-kemokinligand 12 (CXCL12) 13,14,15. På grund af deres centrale rolle i at fremme tumorvækst er kræftassocierede fibroblaster et voksende mål for kræftbehandling 6,16,17,18.

Protokollen nedenfor beskriver en metode til at teste, hvordan fibroblaster påvirker væksten af tumorer i en veletableret og udbredt musemodel for tumorvækst. For at forstå vigtigheden af fibroblaster i tumormikromiljøet blev standardprotokollen for introduktion af kræftceller i mus for at overvåge deres vækst ændret til at omfatte fibroblaster med kræftcelleintroduktionen. Kræftcellerne kan indføres subkutant eller intradermalt. Intradermal introduktion ville resultere i tumorer, der opstår fra selve huden. Xenotransplantater, hvor kræftceller og fibroblaster injiceres sammen i mus, repræsenterer et vigtigt metodologisk værktøj til at dissekere rollen som fibroblaster, subpopulationer af fibroblaster og proteinfaktorer i evnen til at fremme kræftvækst 19,20,21. En detaljeret protokol for samtidig injektion af kræftceller og fibroblaster i mus er tilvejebragt. Denne metode kan bruges til at sammenligne tilstedeværelsen eller fraværet af fibroblaster, til at sammenligne fibroblaster fra forskellige kilder20 eller til at sammenligne fibroblaster med og uden ekspression af specifikke proteiner19. Efter kræftceller og fibroblaster er introduceret, tumor størrelse kan overvåges over tid. Ved afslutningen af forsøgene kan tumorer dissekeres og vejes. Ved at overvåge tumorvækst over tid kan betydningen af forskellige faktorer dissekeres.

Der er mulige alternative tilgange til at studere fibroblasternes rolle i tumorvækst. Som et eksempel er der Cre-loxed-baserede modeller, der giver mulighed for vævsspecifik knockout af gener med drivere udtrykt fortrinsvis i fibroblaster. Sådanne tilgange giver også muligheder for at undersøge rollen som specifikke gener og veje i fibroblaster til tumorprogression. Sammenlignet med Cre-lox-baserede tilgange ville den leverede protokol repræsentere en signifikant hurtigere tilgang til overvågning af fibroblasters rolle, fordi tumorvækst ville blive overvåget over blot et par uger. Den leverede tilgang er også betydeligt billigere, fordi den ikke kræver generering og opbevaring af kolonier af genetisk manipulerede mus. Den medfølgende protokol kan bruges til hurtigt at teste effekten af knockdown af forskellige gener ved hjælp af shRNA'er i stedet for at skulle udvikle musekolonier. Den leverede tilgang er også mere fleksibel, fordi den vil give mulighed for en sammenligning af forskellige antal fibroblaster, forskellige forhold mellem kræftceller og fibroblaster, knockdown af forskellige gener og endda sammenligning af fibroblaster fra forskellige vævssteder eller arter. En Cre-lox-tilgang ville have den fordel, at fibroblasterne er til stede i musene i en mere fysiologisk sammenhæng.

Protokollen rapporteret her ville være værdifuld for forskere, der søger at overvåge virkningerne af fibroblaster på tumorvækst hurtigt og omkostningseffektivt. Denne protokol er især værdifuld for forskere, der undersøger forskellige undergrupper af fibroblaster eller fibroblaster fra forskellige kilder på tumorvækst på tumorvækst. Hvis det er vigtigt, at tumorinitiering sker i en fysiologisk sammenhæng, bør genetisk manipulerede musemodeller overvejes.

Der er flere mulige tilgange til at udføre disse eksperimenter. Immunkompetente mus kan bruges som værter, hvilket ville muliggøre undersøgelse af fibroblast-immuncelleinteraktioner. For immunkompetente musemodeller skal musekræftceller og museembryonale fibroblaster (MEF'er) injiceres. Brugen af MEF'er giver også efterforskeren mulighed for at drage fordel af den brede vifte af knockout-musestammer til at teste tilstedeværelsen eller fraværet af et gen af interesse. Alternativt kan immun-mangelfulde mus bruges til at teste rollen som humane fibroblaster i at fremme væksten af tumorer i mus, der stammer fra humane kræftceller. Introduktion af kræftcellerne kan udføres subkutant eller ortopisk. For melanom, som beskrevet nedenfor, kan tumor-fibroblastblandingen injiceres intradermalt til ortopisk injektion, der nærmere simulerer det sted i huden, hvor et melanom ville udvikle sig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle beskrevne forsøg blev godkendt af Animal Care Committee ved University of California, Los Angeles.

BEMÆRK: Vælg kræftceller og fibroblaster, der matcher værtsmusene for musestamme. Vælg kræftceller og fibroblaster, der matcher værtsmusens køn. Få mus fra avlskolonier eller køb dem fra velrenommerede leverandører. Indfør tumorer i mus, der er ~ 8-10 uger gamle. Mus med pels vil være i telogen eller hvilefasen af hårsækkecyklussen. Planlæg for et forhold på 0,5 til 3 fibroblaster til kræftcelle.

1. Bestem det passende antal mus, der skal bruges til forsøg

  1. Før du udfører undersøgelserne, skal du udføre en effektanalyse for at bestemme det passende antal mus, der skal bruges til undersøgelserne. Brug følgende formel til at bestemme stikprøvestørrelsen for et eksperiment med den angivne effekt:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Hvis α er det valgte signifikansniveau (normalt 0,05), så 1-α/2 = 0,975 og Z = 1,960.
    β er effekten, og hvis der ønskes 80% effekt, så Z = 0,84.

    ES, effektstørrelsen = \μ1-μ 0\/σ
    hvor μ 0 er middelværdien under hypotese H0, μ 1 er gennemsnittet under hypotese H1, og σ er standardafvigelsen for resultatet af interesse22.
    BEMÆRK: Flere oplysninger om beregning af stikprøvestørrelse findes22.

2. Generer kræftceller til injektion

  1. Bestem den relevante væksthastighed med følgende ligning:
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    BEMÆRK: Der vises et eksempel på celler, der fordobles på 24 timer
    Fordoblingstid = ln(2)/vækstrate
    24 timer = ln(2)/vækstrate
    24*vækstrate = .693
    Vækstrate = .693/24= .028875
  2. Bestem antallet af kræftceller, der skal plades, og hvor lang tid cellerne skal dyrkes før injektion.
    BEMÆRK: 0,25-1 million kræftceller injiceres for hver dannet tumor.
  3. Beregn det antal dage, der kræves for at generere et tilstrækkeligt antal celler i henhold til ligningen
    N(t)=N(0)egr*t
    hvor N(t) er antallet af celler på tidspunktet t, N(0) er antallet af celler på tidspunktet 0, gr er væksthastigheden, og t er tiden.
    BEMÆRK: Et eksempel på disse beregninger for dyrkning af 500.000 celler til at generere 106 celler i hver af 12 tumorer. Baseret på disse beregninger er 5 dage tilstrækkelige til at vokse det nødvendige antal celler:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500.000e(gr*t)
    12 x 106=500.000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0,028875x
    3,178=0,028875x
    X=110 timer= 4,59 dage
    Giv cellerne ekstra tid til at sætte sig fast på pladen og til celler, der går tabt under indsamlingen.
  4. Plade kræftceller.
    BEMÆRK: Brug handsker og laboratoriefrakker, når du arbejder med dyrkede celler.
    BEMÆRK: Udfør cellemanipulationer i en laminær strømningshætte for at minimere indførelsen af mikrober fra luften ind i prøverne. Behandl vævskulturhætten med ultraviolet lys før brug. Brug steril teknik og kun sterile cellekulturplastvarer og forbrugsvarer såsom vævskulturbehandlede plader, pipetter og koniske rør.
    1. Beregn det korrekte antal og størrelsen af vævskulturplader baseret på antallet af celler i hætteglasset og den ønskede cellekoncentration, når de er belagt.
    2. Mærk vævskulturplader.
    3. Forbered et vandbad med vand ved 37 °C.
    4. Alikvote medium i koniske rør og anbringes i vandbad ved 37 °C. Mange kræftceller kan dyrkes i Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).
    5. Fjern det nødvendige antal hætteglas med frosne celler fra fryseren med flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Brug frysehandsker ved håndtering af celler i en flydende nitrogenfryser.
    6. Optø hurtigt cellehætteglassene i vandbadet, mens du ryster forsigtigt.
      BEMÆRK: Tilsæt ethanol til handsker, mens du håndterer hætteglas for at opretholde sterilitet.
    7. Brug steril teknik i en vævskulturhætte til at pipet cellerne ind i et 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml DMEM + 10% FBS.
    8. Centrifuger celleblandingen ved 180 x g i 5 minutter.
    9. Supernatanten fjernes forsigtigt med sterilt sug eller en steril 10 ml pipet.
    10. Resuspender forsigtigt cellerne i pelleten til 1 ml DMEM + 10% FBS.
    11. Pipet de resuspenderede celler på en mærket vævskulturplade med en steril p1000.
    12. Brug sterile 10 ml pipetter til pipetmedium med serum i vævskulturplader.
    13. Vævskulturplader inkuberes i en vævskulturkuvøse ved 37 °C med 5 % CO2.
  5. Udvid kræftceller for at generere tilstrækkelige kræftceller til injektion.
    BEMÆRK: Overvåg celler med lysmikroskopi for sammenløb. Trypsinize hver anden til tre dage eller efter behov for at forhindre cellerne i at nå 100% sammenløb. Hvis der kræves et stort antal celler, skal du bruge hyperkolber (materialetabel) til at dyrke et stort antal celler på en rum- og mellemeffektiv måde. Hver gang cellerne skal passeres, skal du følge denne procedure:
    1. Fjern mediet fra pladen med sterilt sug eller en steril 10 ml pipet.
    2. Pladen vaskes forsigtigt ved pipettering på varmt fosfatbufret saltvand (PBS). Fjern derefter PBS med sterilt sug eller en pipet.
    3. Der pipetteres 5 ml trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i PBS til en 10 cm plade på cellerne og inkuberes i 5 minutter ved 37 °C.
    4. Fjern celler fra pladen med blide tryk for at løsne cellerne fra pladen.
    5. Brug en steril 10 ml pipat til at samle cellerne i DMEM med 10% FBS serum i koniske rør.
    6. Centrifuger koniske rør ved 180 x g i 5 minutter.
    7. Supernatanten fjernes ved at hælde den af. Cellepillen skal være synlig. Se det for at sikre, at det forbliver i røret.
    8. Resuspender de pelleterede celler ved at tilsætte 1 ml DMEM + 10% FBS og pipettere forsigtigt op og ned.
    9. Alikvote resuspenderede celler på nye vævskulturplader af passende størrelse med DMEM + 10% FBS (10 ml medier er egnet til en 10 cm vævskulturplade).

3. Generer fibroblaster til injektion

BEMÆRK: Primære fibroblaster vil senescere efter for mange fordoblinger / passager. Det er vigtigt at bruge primære fibroblaster efter et begrænset antal passager eller fordoblinger. Hold styr på antallet af passager eller fordoblinger, som fibroblasterne er vokset fra musen eller menneskets hud. Brug fibroblaster med færre end 15 passager til primære humane dermale fibroblaster. Brug fibroblaster med færre end 9 passager til mus embryonale fibroblaster. Fibroblaster ændres, når de bliver sammenflydende. Trypsinize fibroblaster, når de er ca. 90% sammenflydende. Fibroblaster vil have forskellige egenskaber afhængigt af, hvordan de dyrkes. Mange forskere fremmer dyrkning på mere fysiologisk relevante substrater end vævskulturplader såsom 3D-kollagenmatricer, der mere effektivt fanger vævslignende miljøer23,24,25.

  1. Brug ligningen i afsnit 2.1 til at bestemme væksthastigheden for fibroblastcellerne.
  2. Brug ligningen i afsnit 2.2 til at bestemme antallet af dage, der kræves for at udvide fibroblasterne.
  3. Fibroblasterne behandles som beskrevet i pkt. 2.3 med det passende substrat på den relevante dag for at sikre, at kræftceller og fibroblaster er klar til injektion samme dag.
  4. Fibroblasterne udvides i det passende medium for at generere et tilstrækkeligt antal fibroblaster, der er nødvendige efter procedurerne beskrevet i pkt. 2.4.

4. Barber mus for at klargøre mus til injektion

BEMÆRK: Brug laboratoriefrakker, hårnet, skoovertræk og handsker, når du arbejder med mus.

  1. En til to dage før injektion bedøves musene i overensstemmelse med reglerne fra Institutional Animal Care Committee. Hvis du bruger isofluran til anæstesi, skal du bruge en blanding af isofluran ogO2. Placer musene i et anæstesikammer og indfør en isofluran (5%) /O2-blanding for at inducere anæstesi. Placer derefter næsekeglen på det bedøvede dyr for at opretholde anæstesiens kirurgiske plan med en konstant strøm af isofluran (2%) /O2-blanding .
  2. Kontroller dyrene for at sikre, at de er i det passende kirurgiske anæstesiplan ved at klemme musens tå og bekræfte, at musen ikke bevæger sig.
  3. Brug en dyreklipper med kirurgisk blad #40 til forsigtigt at fjerne pelsen fra de passende positioner på musenes flanker ved at føre dyreklipperen over huden flere gange, indtil pelsen er fjernet.
  4. Overvåg musene, indtil de kommer sig efter anæstesi.

5. Forbered kræftceller og fibroblaster til injektion

BEMÆRK: Kræftceller og fibroblaster skal injiceres så hurtigt som muligt efter indsamling, helst inden for 30 minutter. Om morgenen for injektionen høstes kræftcellerne og fibroblasterne separat fra vævskulturplader. Udfør følgende trin for hver celletype:

  1. Substratet fjernes fra vævskulturpladen med let sterilt sugning eller ved pipettering af mediet.
  2. Afpipet forsigtigt 5 ml PBS uden at forstyrre cellerne. Hvirvl PBS. Smør forsigtigt PBS med sug eller pipet af PBS.
  3. 5 ml trypsin-EDTA i PBS pipetteres forsigtigt på cellelaget og inkuberes i 5 minutter ved 37 °C.
  4. Fjern celler fra pladen med blide tryk for at løsne cellerne. Pipettér cellerne flere gange med en 10 ml pipet og overfør cellerne til et konisk rør indeholdende DMEM med 10% FBS.
  5. De koniske rør centrifugeres ved 180 x g i 5 minutter.
  6. Supernatanten fjernes forsigtigt ved at hælde den forsigtigt af, idet cellepillen bevares. Cellepillen vaskes to gange med PBS. Hver gang pipetteres 10 ml PBS på cellerne. Bland forsigtigt med en p1000 pipør.
  7. Centrifuger cellerne som i trin 5.5. Fjern forsigtigt PBS med en pipette og gentag.
  8. Resuspender de vaskede, pelleterede celler i 1 ml PBS med en p1000.
  9. Rengør et hæmocytometerglas med alkohol og tør.
  10. Der pipetteres 100 μL af celleblandingen i et rør, og der tilsættes 400 μL 0,4% trypanblåt for en endelig Trypanblåt koncentration på 0,32%.
  11. Fyld forsigtigt kamrene i et glashæmoocytometer under dækslet ved at pipettere celleblandingen, indtil kammeret er fuldt.
  12. Brug et mikroskop til at fokusere på gitterlinjerne i et 10x mål.
  13. Tæl de levende, ubejdsede celler og blå celler i ét sæt med 16 firkanter.
  14. Tæl alle 4 sæt af 16 firkanter.
  15. Gennemsnit celletallet for de klare og blå celler fra de 4 sæt af 16 kvadrater og gang med 10.000. Multiplicer med 5 for at korrigere for 1:5 fortynding fra Trypan blå.
  16. De endelige tællinger er koncentrationen i celler/ml for de levedygtige og døde celler. Multiplicer med volumenet for at bestemme det samlede antal kræftceller og fibroblaster. Bekræft, at den brøkdel af celler, der er levedygtige, er >80%.
  17. Bekræft, at der er et tilstrækkeligt antal melanomceller og fibroblaster til alle de planlagte injektioner, forudsat mindst 20% tab af prøve under injektionerne.
  18. Overfør det nødvendige antal celler til et nyt konisk rør og pellet cellerne ved centrifugering (180 x g i 5 minutter).
  19. Supernatanten fjernes med en 10 ml pipet.
  20. Resuspender pellet i den krævede koncentration i den passende mængde United States Pharmacopeia (USP) GRADE PBS (50 μL pr. tumor til intradermal injektion og 100 μL pr. tumor til subkutan injektion).

6. Injicer kræftceller og fibroblaster i mus

BEMÆRK: Hvis det godkendes af den institutionelle dyreplejekomité, injiceres to tumorer i hver mus, en på hver flanke. Randomiser hvilken mus der vil modtage hvilken injektion på højre og venstre flanke. Afhængigt af antallet af mus, der skal injiceres, bedøves musene og injiceres kræftceller og fibroblaster i musene i batches.

  1. Til subkutan injektion af kræftceller
    1. Bedøv mus som beskrevet i pkt. 4.1.
    2. Tør den barberede hud af med alkoholservietter.
    3. Fyld en steril sprøjte med den ønskede mængde celler eller celleblanding, og hætte sprøjten med en 27-gauge nål.
      BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler til stede. Svip sprøjten efter behov for at fjerne bobler. Når cellerne er blevet indført i sprøjten, skal cellerne i sprøjterne blandes godt ved kontinuerligt at vende sprøjterne for at forhindre klumpning.
    4. Indsæt nålen i det subkutane område på musens flanke og injicer forsigtigt cellerne i musen. Brug 100 μL cellesuspension pr. tumor til subkutan injektion (brug af volumen mere end 100 μL pr. injektion anbefales ikke).
    5. Overvåg musene, indtil de kommer sig efter anæstesi. Hvis det er nødvendigt, skal du give musene ekstra isoleringsmaterialer som hytter og / eller varmepuder for at hjælpe musene med at komme sig helt.
  2. Til intradermale injektioner af kræftceller
    1. Bedøv mus som beskrevet i pkt. 4.1.
    2. Tør den barberede hud af med alkoholservietter.
    3. Fyld en steril sprøjte med den ønskede mængde celler eller celleblanding, og hætte sprøjten med en 27-gauge nål.
      BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler til stede. Svip sprøjten efter behov for at fjerne bobler. Når cellerne er blevet indført i sprøjten, skal cellerne i sprøjterne blandes godt ved kontinuerligt at vende sprøjterne for at forhindre klumpning.
    4. Indsæt en 27-gauge nål i det intradermale område af huden på musens flanke og injicer forsigtigt cellerne i det intradermale område i musen. Brug 50μL cellesuspension pr. tumor til intradermal injektion (brug af volumen mere end 50 μL pr. injektion anbefales ikke).
    5. Overvåg musene, indtil de kommer sig efter anæstesi. Hvis der er tegn på, at musene er i nød, skal du kontakte en dyrlæge. Hvis det er nødvendigt, skal du give musene ekstra isoleringsmaterialer som hytter og / eller varmepuder for at hjælpe musene med at komme sig helt.

7. Overvåg mus under tumorvækst

  1. Overvåg mus dagligt for tegn på smerte eller nød (krumbøjet kropsholdning, vridning, vokalisering, strækning langs buret, presser deres mave mod bunden af burgulvet eller modvilje mod at bevæge sig rundt i buret) eller abscessdannelse. Hvis der er tegn på, at musene er i nød, skal du kontakte en dyrlæge.
  2. Når tumorer er dannet, måle tumorvolumen ca hver anden til tre dage. Mål tumorlængde (den længste side) og bredde (vinkelret på længden) med kalibre.
    BEMÆRK: Bedste fremgangsmåder er, at den samme person udfører disse målinger under hele eksperimentet for at reducere variabiliteten i dataene. Til målinger bedøves mus som beskrevet i pkt. 4.1
  3. Beregn tumorvolumener med formlen Volumen = 0,5 x (Længde x Bredde2).

8. Høst tumorer og mål tumorvægte

  1. Aflive mus, når tumorvækst når et eksperimentelt endepunkt, der er fastlagt af institutionens udvalg for dyrepleje. Placer mus i et kammer og aflive dem med langsom (20-30% pr. Minut) forskydning af kammerluft med komprimeret CO2 i et minut efter ophør af åndedræt.
  2. Udfør cervikal dislokation på musene. Begræns gnaveren på en fast, flad overflade. Placer en robust pen eller en anden genstand mod bagsiden af nakken ved bunden af kraniet. Skub hurtigt fremad og ned med objektet, der fastholder hovedet, mens du trækker bagud med hånden, der holder bunden af halen. Bekræft med palpation, at rygmarven er afskåret.
    BEMÆRK: Cervikal dislokation bør udføres af erfarent laboratoriepersonale.
  3. For hver mus i eksperimentet skal du bekræfte, at musen ikke længere er i live ved at kontrollere, at der ikke er vejrtrækning, hjerteslag og ingen reaktion på en tåklemme.
  4. Brug en steril skalpel og kirurgisk saks til at udskille hele tumoren fra musen. Med kirurgisk saks skal du trimme ikke-tumorvæv fra tumoren.
  5. Væg tumoren på en analytisk vægt og registrer tumorvægten.

9. Statistisk analyse af tumorvolumener og tumorvægte

  1. Sammenlign tumorvolumener over tid i hver gruppe med gentagne målinger variansanalyse (ANOVA). Udfør parret analyse, hvis to tumorer blev injiceret pr. Mus.
  2. Sammenlign tumorvægte blandt grupperne med ANOVA ved hjælp af en tohalet test. Tukeys post-hoc test kan derefter bruges til at bestemme, hvilke grupper der er signifikant forskellige fra hinanden. Udfør parret analyse, hvis to tumorer blev injiceret pr. Mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A2058 humane melanomceller og primære humane dermale fibroblaster blev dyrket under sterile forhold. Celler blev opsamlet og vasket tre gange med PBS. Immunodeficiente mus (NU/J - Foxn1 nøgen stamme) blev injiceret subkutant på den ene flanke med 0,25 millioner A2058 melanomceller alene. På den anden flanke blev mus injiceret med en blanding af 0,25 millioner A2058 melanomceller og 0,75 millioner fibroblaster. Celler blev injiceret i 12 immundefekte mus. Injektioner i venstre og højre flanke blev randomiseret. Tumorvolumen blev overvåget på dag 12, 14, 16, 19 og 21 dage efter injektion (figur 1A). Ved eutanasi blev tumorer udskåret, afbildet (figur 1B) og vejet (figur 1C). Tilstedeværelsen af fibroblaster resulterer i signifikant større tumorer.

Figure 1
Figur 1: Sammenligning af melanomvækst i tilstedeværelse og fravær af co-injicerede fibroblaster. Melanomceller blev introduceret i nøgne mus enten med eller uden primære hudfibroblaster. (A) Plot af tumorvolumen over tid for melanomer med og uden co-injicerede fibroblaster. Volumen blev beregnet som 0,5*længde*bredde2. Middelmængder og standardfejl for middelværdien (SEM) afbildes. ANOVA blev udført for at bestemme signifikans. (B) Billeder af udskårne tumorer. (C) Endelige vægte af tumorer ved afslutningen af eksperimentet på dag 21. Gennemsnitsvægte og SEM afbildes. En uparret, to-halet t-test blev brugt til at sammenligne endelige vægte. * angiver p < 0,05, *** angiver p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I eksperimentet i figur 1 resulterede samtidig introduktion af humane dermale fibroblaster med humane A2058 melanomceller i større tumorer, end når melanomcellerne blev introduceret uden co-injicerede fibroblaster. Denne forskel kunne let påvises baseret på tumorvolumen og tumorvægt. Resultaterne er i overensstemmelse med flere rapporter om, at kræftassocierede fibroblaster kan fremme tumorvækst 5,6,7,8. Ud over de endepunkter, der diskuteres her, såsom tumorvolumen og tumorvægt, kan yderligere endepunkter også overvåges. Yderligere analyser er også mulige. For eksempel kan tumorerne, der udvikler sig, opsamles i formalin til fiksering, paraffinindlejret og analyseret med hæmatoxylin og eosin til histologi. Alternativt kan de udviklede tumorer opsamles i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) til yderligere analyse med immunofluorescens for specifikke proteiner.

En vigtig begrænsning af disse eksperimenter er, at fibroblasterne, der injiceres sammen med kræftcellerne, kan senescere eller dø efter nogle få celledelinger. Alternativt, co-injicerede fibroblaster kan migrere væk fra tumoren, i hvilket tilfælde, de kan ikke påvirke tumorvækst. Hvis fibroblasterne senescerer, dør eller migrerer væk fra tumoren, bliver de mindre rigelige over tid, og effekten af de co-introducerede fibroblaster bliver mindre vigtig for tumorvækst. Faktisk forventes de indførte kræftceller at rekruttere yderligere fibroblaster fra værten. For eksperimenter, hvor et specifikt gen er slået ned eller slået ud i de indførte fibroblaster, over tid, vil rekruttering af værtsfibroblaster, der udtrykker det kodede protein, forventes at reducere enhver fænotype, der kan observeres. For at overvåge tilstedeværelsen af de indførte fibroblaster kan fibroblasterne genetisk manipuleres til at udtrykke et fluorescerende protein såsom GFP26,27. Hvis fibroblasterne udtrykker GFP, kan flowcytometri bruges til at overvåge antallet af fibroblaster, der er til stede i tumoren på forskellige dage efter, at de er introduceret. Som et alternativ kan luciferaseenzymet introduceres i fibroblasterne, og bioluminescensbilleddannelse kan bruges til at overvåge mængden af fibroblaster i musene over tid. Hvis fibroblasterne hurtigt elimineres fra tumormikromiljøet, vil Cre-lox genetisk manipulerede musemodeller løse denne bekymring og supplere de beskrevne undersøgelser.

Hvis forsøgene udføres ved at indføre humane kræftceller og fibroblaster i nøgne mus, forventes det begrænsede immunsystem at have en betydelig indflydelse på resultaterne. Athymiske nøgenmus (NU / J) mangler T-celler og mangler derfor cellemedieret immunitet. De har også en delvis defekt i B-celleudvikling. Cellemedieret immunitet, det vil sige drab af celler via aktiverede CD8 + T-celler, kan spille en vigtig rolle i undertrykkelsen af tumorvækst28,29. I nyere undersøgelser er samspillet mellem kræftassocierede fibroblaster og CD8 + T-celler blevet rapporteret30,31,32. Introduktion af musekræftceller og musefibroblaster i mus med et immunsystem kan betragtes som en alternativ tilgang, der ville løse dette problem.

En anden alternativ tilgang er at bruge genetisk manipulerede musemodeller, hvor Cre-lox-systemet bruges til at modulere niveauerne eller aktiviteten af specifikke proteiner i værtsfibroblaster. En sådan tilgang er at bruge fibroblastberigede Cre-lox-modeller med drivere som FSP1, Col1a1, Col1a2 eller PDGFRa33,34,35. Med en Cre / lox rekombinasemodel ville der ikke være bekymring for, at de injicerede fibroblaster vil dø eller migrere væk fra tumoren.

Der er et par trin i protokollen, forudsat at de er kritiske for dens succes. Væksten af fibroblaster er en vigtig del af protokollen og vil sandsynligvis bidrage væsentligt til resultatet. Primære fibroblaster senescerer let, og passagen eller fordoblingerne skal overvåges nøje for at sikre, at fibroblasterne er i den eksponentielle vækstfase og ikke er senesceret. Senescerende fibroblaster forventes at udskille høje niveauer af cytokiner, der kan have en dramatisk effekt på tumorvækst36,37,38. Det er derfor af stor betydning, at passagenummeret er omhyggeligt dokumenteret, og at de fibroblaster, der injiceres, ikke er senescerende, medmindre protokollen kræver analyse af senescerende fibroblaster.

Når fibroblaster bliver sammenflydende, kan de forventes at gennemgå et stort antal ændringer, hvoraf nogle sandsynligvis vil blive vendt, når de genindtræder i cellecyklussen 39,40,41,42,43,44. Vedligeholdelse af fibroblasterne i en proliferativ tilstand og opdeling af dem, når de er 90% sammenflydende, er vigtigt for at sikre, at undersøgelserne er så konsistente som muligt. Dyrkning af fibroblaster på vævskulturplader påvirker sandsynligvis også deres adfærd, og alternativer såsom 3D-kollagenmatricer bør overvejes23,24,25. Fibroblaster dyrket i 3D-matricer viser væsentligt forskellige migrationsmønstre end fibroblaster dyrket på 2D-overflader 45,46,47,48,49, hvilket sandsynligvis vil påvirke deres tumorfremmende kapacitet, når de indføres i tumorer, hvor fibroblasterne vil spille en aktiv rolle i etableringen af tumorens ekstracellulære matrixmikromiljø50.

Injektion af melanomceller i musen via intradermal injektion kan give mere reproducerbar tumorvækst end subkutane injektioner. Dette er et vanskeligt skridt, da der er meget lidt plads i den intradermale region. Det er vigtigt at placere nålen forsigtigt. Hvis intradermale injektioner udføres, injiceres kun 50 μL opløsning. Selv for erfarne forskere kan disse injektioner lække. Det er vigtigt at være opmærksom på, om hver injektion lækkede, så hvis der ikke dannes tumor, kan den fjernes fra den endelige analyse.

Klargøring af sprøjter til injektion er et andet kritisk trin. Det er vigtigt at fjerne alle bobler fra sprøjten, hvilket kan kræve, at sprøjten knipses for at fjerne boblerne. Det er også vigtigt, at cellerne ikke klumper sammen. Vend sprøjterne gentagne gange for at forhindre sammenklumpning.

Et andet vanskeligt aspekt af disse eksperimenter er, at måling af tumorvolumen kan variere fra person til person. For at begrænse variabiliteten i tumorvolumenmålinger er det nyttigt at tildele et enkelt laboratoriemedlem ansvar for at tage alle tumorvolumenmålinger i alle mus og på alle tidspunkter i løbet af et eksperiment.

Det foretrækkes at injicere mus med kræftceller af samme køn som værtsmusen, når det er muligt. Det er muligt at bruge begge køn og inkludere køn som en variabel i ANOVA modeller for at afgøre, om køn påvirker tumorstørrelse over tid.

Forståelse af tumormikromiljøet er afgørende for at få indsigt i tumorgenese. Protokollen kan danne grundlag for at forstå fibroblasters rolle, forskellige typer fibroblaster og forskellige veje inden for fibroblaster, der kan påvirke tumorvækst. Resultater fra disse eksperimenter kan identificere nye terapeutiske mål, der forhindrer fibroblaster i at fremme tumorvækst18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke alle medlemmerne af Coller-laboratoriet for nyttige input. H.A.C. var Milton E. Cassel lærd af Rita Allen Foundation. Vi anerkender NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanom Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordination Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, Clinical Translational Science Institute og Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovationspriser fra Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills og Ha Gaba), en pris fra UCLA SPORE i prostatakræft (National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tildelingsnummer P50CA092131), en innovationspris fra Broad Stem Cell Center, Eli og Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research ved UCLA, Tumorcellebiologi træningsprogram (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), dermatologi T32-programmet ved UCLA AR071307 og UCLA muskelcellebiologi, patofysiologi og terapi T32 træningsprogram 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, T., et al. Cancer-associated fibroblasts: an emerging target of anti-cancer immunotherapy. Journal of Hematology and Oncololgy. 12 (1), 86 (2019).
  2. Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  3. Rhim, A. D., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  4. Zhang, J., et al. Fibroblast-specific protein 1/S100A4-positive cells prevent carcinoma through collagen production and encapsulation of carcinogens. Cancer Research. 73 (9), 2770-2781 (2013).
  5. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  6. Chen, X., Song, E. Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).
  7. Wang, W., et al. Crosstalk to stromal fibroblasts induces resistance of lung cancer to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. Clinical Cancer Research. 15 (21), 6630-6638 (2009).
  8. Hwang, R. F., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
  9. Tsujino, T., et al. Stromal myofibroblasts predict disease recurrence for colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 13 (7), 2082-2090 (2007).
  10. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nature Medicine. 22 (5), 497-505 (2016).
  11. Cukierman, E., Bassi, D. E. Physico-mechanical aspects of extracellular matrix influences on tumorigenic behaviors. Seminars in Cancer Biology. 20 (3), 139-145 (2010).
  12. Attieh, Y., et al. Cancer-associated fibroblasts lead tumor invasion through integrin-beta3-dependent fibronectin assembly. Journal of Cell Biology. 216 (11), 3509-3520 (2017).
  13. Ahmadzadeh, M., Rosenberg, S. A. TGF-beta 1 attenuates the acquisition and expression of effector function by tumor antigen-specific human memory CD8 T cells. Journal of Immunology. 174 (9), 5215-5223 (2005).
  14. Feig, C., et al. Targeting CXCL12 from FAP-expressing carcinoma-associated fibroblasts synergizes with anti-PD-L1 immunotherapy in pancreatic cancer. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 110 (50), 20212-20217 (2013).
  15. Kojima, Y., et al. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 107 (46), 20009-20014 (2010).
  16. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  17. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontiers in Immunology. 9, 414 (2018).
  18. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nature Reviews Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  19. Grum-Schwensen, B., et al. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mts1) gene. Cancer Research. 65 (9), 3772-3780 (2005).
  20. Kojima, M., et al. Human subperitoneal fibroblast and cancer cell interaction creates microenvironment that enhances tumor progression and metastasis. PLoS One. 9 (2), 88018 (2014).
  21. Noel, A., et al. Enhancement of tumorigenicity of human breast adenocarcinoma cells in nude mice by matrigel and fibroblasts. British Journal of Cancer. 68 (5), 909-915 (1993).
  22. Sullivan, L. M. Estimation from samples. Circulation. 114 (5), 445-449 (2006).
  23. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  24. Damianova, R., Stefanova, N., Cukierman, E., Momchilova, A., Pankov, R. Three-dimensional matrix induces sustained activation of ERK1/2 via Src/Ras/Raf signaling pathway. Cell Biology International. 32 (2), 229-234 (2008).
  25. Rhee, S. Fibroblasts in three dimensional matrices: cell migration and matrix remodeling. Experimental & Molecular Medicine. 41 (12), 858-865 (2009).
  26. Hoffman, R. M. Application of GFP imaging in cancer. Labortatory Investigation. 95 (4), 432-452 (2015).
  27. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
  28. Naito, Y., et al. CD8+ T cells infiltrated within cancer cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer. Cancer Research. 58 (16), 3491-3494 (1998).
  29. Fu, C., Jiang, A. Dendritic Cells and CD8 T Cell Immunity in Tumor Microenvironment. Frontiers Immunolofy. 9, 3059 (2018).
  30. Lakins, M. A., Ghorani, E., Munir, H., Martins, C. P., Shields, J. D. Cancer-associated fibroblasts induce antigen-specific deletion of CD8 (+) T Cells to protect tumour cells. Nature Communications. 9 (1), 948 (2018).
  31. Kato, T., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Affect Intratumoral CD8(+) and FoxP3(+) T Cells Via IL6 in the Tumor Microenvironment. Clinical Cancer Research. 24 (19), 4820-4833 (2018).
  32. Gorchs, L., et al. Human Pancreatic Carcinoma-Associated Fibroblasts Promote Expression of Co-inhibitory Markers on CD4(+) and CD8(+) T-Cells. Frontiers Immunology. 10, 847 (2019).
  33. Duscher, D., et al. Fibroblast-Specific Deletion of Hypoxia Inducible Factor-1 Critically Impairs Murine Cutaneous Neovascularization and Wound Healing. Plastic Reconstructive Surgery. 136 (5), 1004-1013 (2015).
  34. Zheng, B., Zhang, Z., Black, C. M., de Crombrugghe, B., Denton, C. P. Ligand-dependent genetic recombination in fibroblasts : a potentially powerful technique for investigating gene function in fibrosis. American Journal of Pathology. 160 (5), 1609-1617 (2002).
  35. Swonger, J. M., Liu, J. S., Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Genetic tools for identifying and manipulating fibroblasts in the mouse. Differentiation. 92 (3), 66-83 (2016).
  36. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Science, U S A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  37. Ortiz-Montero, P., Londono-Vallejo, A., Vernot, J. P. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line. Cell Communication and Signaling. 15 (1), 17 (2017).
  38. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  39. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biolofy. 4 (3), 83 (2006).
  40. Mitra, M., et al. Alternative polyadenylation factors link cell cycle to migration. Genome Biolofy. 19 (1), 176 (2018).
  41. Lemons, J. M., et al. Quiescent fibroblasts exhibit high metabolic activity. PLoS Biology. 8 (10), 1000514 (2010).
  42. Suh, E. J., et al. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biology. 13 (12), 121 (2012).
  43. Legesse-Miller, A., et al. Quiescent fibroblasts are protected from proteasome inhibition-mediated toxicity. Molecular Biology of the Cell. 23 (18), 3566-3581 (2012).
  44. Evertts, A. G., et al. H4K20 methylation regulates quiescence and chromatin compaction. Molecular Biology of the Cell. 24 (19), 3025-3037 (2013).
  45. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  46. Marinkovic, A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Matrices of physiologic stiffness potently inactivate idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 422-430 (2013).
  47. Tschumperlin, D. J. Fibroblasts and the ground they walk on. Physiology (Bethesda). 28 (6), 380-390 (2013).
  48. Tschumperlin, D. J., et al. Mechanotransduction through growth-factor shedding into the extracellular space. Nature. 429 (6987), 83-86 (2004).
  49. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
  50. Alexander, J., Cukierman, E. Stromal dynamic reciprocity in cancer: intricacies of fibroblastic-ECM interactions. Current Opinions in Cell Biology. 42, 80-93 (2016).

Tags

Kræftforskning udgave 166 Kræftassocierede fibroblaster xenograft melanom intradermal injektion ortopisk tumormikromiljø
En musemodel til at undersøge rollen som kræftassocierede fibroblaster i tumorvækst
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter