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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un modello murino per studiare il ruolo dei fibroblasti associati al cancro nella crescita tumorale

Published: December 22, 2020 doi: 10.3791/61883
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2,4, 1,2, 1,2,4
1Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Summary

Viene fornito un protocollo per co-iniettare cellule tumorali e fibroblasti e monitorare la crescita del tumore nel tempo. Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere le basi molecolari del ruolo dei fibroblasti come regolatori della crescita tumorale.

Abstract

I fibroblasti associati al cancro (CAF) possono svolgere un ruolo importante nella crescita del tumore creando un microambiente che promuove il tumore. I modelli per studiare il ruolo dei CAF nel microambiente tumorale possono essere utili per comprendere l'importanza funzionale dei fibroblasti, dei fibroblasti di diversi tessuti e di specifici fattori genetici nei fibroblasti. I modelli murini sono essenziali per comprendere i fattori che contribuiscono alla crescita e alla progressione del tumore in un contesto in vivo. Qui, viene fornito un protocollo in cui le cellule tumorali vengono mescolate con fibroblasti e introdotte nei topi per sviluppare tumori. Le dimensioni del tumore nel tempo e i pesi finali del tumore sono determinati e confrontati tra i gruppi. Il protocollo descritto può fornire maggiori informazioni sul ruolo funzionale dei CAF nella crescita e nella progressione del tumore.

Introduction

All'interno del microambiente tumorale, uno dei tipi di cellule più importanti è il fibroblasto associato al cancro (CAF)1. Questi fibroblasti associati al carcinoma possono svolgere un ruolo soppressivo del tumore 2,3. Ad esempio, i fibroblasti che esprimono S100A secernono collageni che possono incapsulare agenti cancerogeni e proteggere dalla formazione di carcinoma4. Inoltre, l'esaurimento dei miofibroblasti positivi all'actina α-liscia (SMA) nel cancro del pancreas provoca immunosoppressione e accelera la progressione del cancro del pancreas2. I CAF possono anche co-evolvere con le cellule tumorali e promuovere la progressione tumorale 5,6,7,8. I fibroblasti possono sintetizzare e secernere proteine della matrice extracellulare che creano un ambiente che promuove il tumore8. Queste proteine della matrice extracellulare possono causare irrigidimento meccanico del tessuto, che è associato alla progressione del tumore 9,10. La matrice extracellulare depositata può agire come una barriera fisica che inibisce l'infiltrazione immunitaria11. La deposizione di matrice da parte dei CAF è stata anche associata all'invasione tumorale poiché la fibronectina generata dai CAF ha dimostrato di promuovere l'invasione tumorale12. I CAF promuovono l'angiogenesi e reclutano cellule immunosoppressive nel microambiente tumorale secernendo il fattore di crescita trasformante β (TGF-β), il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), l'interleuchina-6 (IL-6) e il ligando CXC-chemochine 12 (CXCL12) 13,14,15. A causa del loro ruolo centrale nel promuovere la crescita tumorale, i fibroblasti associati al cancro sono un bersaglio emergente per la terapia anti-cancro 6,16,17,18.

Il protocollo seguente descrive un metodo per testare come i fibroblasti influenzano la crescita dei tumori in un modello murino di crescita tumorale ben consolidato e ampiamente utilizzato. Al fine di comprendere l'importanza dei fibroblasti nel microambiente tumorale, il protocollo standard per l'introduzione di cellule tumorali nei topi per monitorare la loro crescita è stato modificato per includere i fibroblasti con l'introduzione delle cellule tumorali. Le cellule tumorali possono essere introdotte per via sottocutanea o intradermica. L'introduzione intradermica provocherebbe tumori che derivano dalla pelle stessa. Gli xenotrapianti in cui cellule tumorali e fibroblasti vengono co-iniettati nei topi rappresentano un importante strumento metodologico per sezionare il ruolo dei fibroblasti, sottopopolazioni di fibroblasti e fattori proteici nella capacità di promuovere la crescita del cancro 19,20,21. Viene fornito un protocollo dettagliato per la co-iniezione di cellule tumorali e fibroblasti nei topi. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare la presenza o l'assenza di fibroblasti, per confrontare fibroblasti provenienti da fonti diverse20, o per confrontare fibroblasti con e senza espressione di proteine specifiche19. Dopo l'introduzione delle cellule tumorali e dei fibroblasti, la dimensione del tumore può essere monitorata nel tempo. Alla fine degli esperimenti, i tumori possono essere sezionati e pesati. Monitorando la crescita del tumore nel tempo, è possibile sezionare l'importanza di diversi fattori.

Esistono possibili approcci alternativi per studiare il ruolo dei fibroblasti nella crescita tumorale. Ad esempio, ci sono modelli basati su Cre-lox che prevedono il knockout tessuto-specifico di geni con driver espressi preferenzialmente nei fibroblasti. Tali approcci offrono anche l'opportunità di studiare il ruolo di geni e percorsi specifici nei fibroblasti per la progressione del tumore. Rispetto agli approcci basati su Cre-lox, il protocollo fornito rappresenterebbe un approccio significativamente più rapido al monitoraggio del ruolo dei fibroblasti perché la crescita del tumore verrebbe monitorata in poche settimane. L'approccio fornito è anche significativamente meno costoso perché non richiede la generazione e l'alloggiamento di colonie di topi geneticamente modificati. Il protocollo fornito può essere utilizzato per testare rapidamente l'effetto del knockdown di diversi geni utilizzando shRNA piuttosto che dover sviluppare colonie di topi. L'approccio fornito è anche più flessibile perché consentirebbe un confronto tra diversi numeri di fibroblasti, diversi rapporti di cellule tumorali e fibroblasti, abbattimento di geni diversi e persino confronto di fibroblasti da diversi siti o specie di tessuti. Un approccio Cre-lox avrebbe il vantaggio che i fibroblasti sono presenti all'interno dei topi in un contesto più fisiologico.

Il protocollo qui riportato sarebbe prezioso per gli scienziati che cercano di monitorare gli effetti dei fibroblasti sulla crescita del tumore in modo rapido ed economico. Questo protocollo è particolarmente prezioso per gli scienziati che studiano diversi sottoinsiemi di fibroblasti o fibroblasti da diverse fonti sulla crescita del tumore sulla crescita del tumore. Se è importante che l'inizio del tumore avvenga in un contesto fisiologico, dovrebbero essere presi in considerazione modelli murini geneticamente modificati.

Esistono diversi approcci possibili per eseguire questi esperimenti. I topi immunocompetenti possono essere utilizzati come ospiti, il che consentirebbe di studiare le interazioni fibroblasto-cellule immunitarie. Per i modelli murini immunocompetenti, devono essere iniettate cellule tumorali di topo e fibroblasti embrionali di topo (MEF). L'uso di MEF consente inoltre allo sperimentatore di sfruttare l'ampia gamma di ceppi murini knockout per testare la presenza o l'assenza di un gene di interesse. In alternativa, i topi immunodeficienti possono essere utilizzati per testare il ruolo dei fibroblasti umani nel promuovere la crescita dei tumori nei topi derivati da cellule tumorali umane. L'introduzione delle cellule tumorali può essere eseguita per via sottocutanea o ortotopica. Per il melanoma, come descritto di seguito, la miscela tumore-fibroblasto può essere iniettata per via intradermica per iniezione ortotopica che simula più da vicino la posizione all'interno della pelle in cui si svilupperebbe un melanoma.

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Protocol

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dall'Animal Care Committee dell'Università della California, Los Angeles.

NOTA: Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono ai topi ospiti per il ceppo di topo. Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono al sesso del topo ospite. Ottieni topi da colonie riproduttive o acquistali da fornitori affidabili. Introdurre tumori nei topi che sono ~ 8-10 settimane di età. I topi con pelliccia saranno nella fase telogen o di riposo del ciclo del follicolo pilifero. Piano per un rapporto di 0,5 a 3 fibroblasti per cellula tumorale.

1. Determinare il numero appropriato di topi da utilizzare per la sperimentazione

  1. Prima di eseguire gli studi, eseguire un'analisi della potenza per determinare il numero appropriato di topi da utilizzare per gli studi. Utilizzare la formula seguente per determinare la dimensione del campione per un esperimento con la potenza specificata:
    n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2
    Se α è il livello di significatività selezionato (di solito 0,05), allora 1-α/2 = 0,975 e Z = 1,960.
    β è la potenza e se si desidera l'80% di potenza, allora Z = 0,84.

    ES, dimensione dell'effetto = \μ1-μ 0\/σ
    dove μ 0 è la media sotto l'ipotesi H0, μ 1 è la media sotto l'ipotesi H1 e σ è la deviazione standard del risultato dell'interesse22.
    NOTA: ulteriori informazioni sul calcolo della dimensione del campione sono disponibili22.

2. Generare cellule tumorali per iniezione

  1. Determinare il tasso di crescita rilevante con la seguente equazione:
    Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t

    NOTA: viene mostrato un esempio per le celle che raddoppiano in 24 ore
    Tempo di raddoppio = ln(2)/tasso di crescita
    24 ore = LN(2)/tasso di crescita
    24*tasso di crescita = .693
    Tasso di crescita = .693/24= .028875
  2. Determinare il numero di cellule tumorali da placcare e la quantità di tempo in cui le cellule devono essere coltivate prima dell'iniezione.
    NOTA: 0,25-1 milione di cellule tumorali vengono iniettate per ogni tumore formato.
  3. Calcolare il numero di giorni necessari per generare un numero sufficiente di celle in base all'equazione
    N(t)=N(0)egr*t
    dove N(t) è il numero di celle al tempo t, N(0) è il numero di celle al tempo 0, gr è il tasso di crescita e t è il tempo.
    NOTA: Un esempio di questi calcoli per la crescita di 500.000 cellule per generare 106 cellule in ciascuno dei 12 tumori. Sulla base di questi calcoli, 5 giorni sono sufficienti per far crescere il numero necessario di cellule:
    N(t)=N(0)egr*t
    12 x 106 = 500.000e(gr*t)
    12 x 106=500.000e(.028875*t)
    24=e(.028875*x)
    ln(24)=0,028875x
    3,178=0,028875x
    X=110 ore= 4,59 giorni
    Concedere più tempo per le celle da attaccare alla piastra e per le celle che vengono perse durante la raccolta.
  4. Cellule tumorali a piastra.
    NOTA: Indossare guanti e camici da laboratorio quando si lavora con cellule in coltura.
    NOTA: Eseguire manipolazioni cellulari in una cappa a flusso laminare per ridurre al minimo l'introduzione di microbi dall'aria nei campioni. Trattare la cappa di coltura tissutale con luce ultravioletta prima dell'uso. Utilizzare la tecnica sterile e solo articoli di plastica e materiali di consumo per colture cellulari sterili come piastre trattate con colture tissutali, pipet e tubi conici.
    1. Calcolare il numero e la dimensione corretti delle piastre di coltura tissutale in base al numero di cellule nel flaconcino e alla concentrazione cellulare desiderata una volta placcate.
    2. Etichettare le piastre di coltura tissutale.
    3. Preparare un bagnomaria con acqua a 37 °C.
    4. Mezzo aliquota in tubi conici e posto a bagnomaria a 37 °C. Molte cellule tumorali possono essere coltivate nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS).
    5. Rimuovere il numero richiesto di flaconcini di celle congelate dal congelatore di azoto liquido.
      NOTA: Utilizzare guanti da congelatore quando si maneggiano le celle in un congelatore ad azoto liquido.
    6. Scongelare rapidamente le fiale di cellule a bagnomaria agitando delicatamente.
      NOTA: Aggiungere etanolo ai guanti mentre si maneggiano le fiale per mantenere la sterilità.
    7. Utilizzando la tecnica sterile in una cappa di coltura tissutale, pipetare le cellule in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di DMEM + 10% FBS.
    8. Centrifugare la miscela cellulare a 180 x g per 5 minuti.
    9. Rimuovere delicatamente il surnatante con aspirazione sterile o un pipet sterile da 10 ml.
    10. Risospendere delicatamente le cellule nel pellet in 1 mL di DMEM + 10% FBS.
    11. Pipet le cellule risospese su una piastra di coltura tissutale etichettata con un p1000 sterile.
    12. Utilizzando pipet sterili da 10 ml, mezzo pipetta con siero in piastre di coltura tissutale.
    13. Incubare piastre di coltura tissutale in un incubatore per colture tissutali a 37 °C con il 5% di CO2.
  5. Espandere le cellule tumorali per generare cellule tumorali sufficienti per l'iniezione.
    NOTA: monitorare le celle con microscopia ottica per la confluenza. Tripsinizzare ogni due o tre giorni o secondo necessità per evitare che le cellule raggiungano il 100% di confluenza. Se è necessario un gran numero di celle, utilizzare hyperflask (Table of Materials) per far crescere un gran numero di celle in modo spaziale e mediamente efficiente. Ogni volta che le celle devono essere passate, seguire questa procedura:
    1. Rimuovere il mezzo dalla piastra con aspirazione sterile o un pipet sterile da 10 ml.
    2. Lavare delicatamente la piastra mediante pipettaggio su soluzione salina tamponata fosfato caldo (PBS). Quindi rimuovere il PBS con aspirazione sterile o un pipet.
    3. Pipet 5 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS per una piastra di 10 cm sulle cellule e incubare per 5 minuti a 37 °C.
    4. Rimuovere le cellule dalla piastra con colpetti delicati per rimuovere le cellule dalla piastra.
    5. Utilizzando un pipet sterile da 10 ml, raccogliere le cellule in DMEM con siero FBS al 10% in provette coniche.
    6. Centrifugare i tubi conici a 180 x g per 5 minuti.
    7. Rimuovere il surnatante versandolo via. Il pellet cellulare dovrebbe essere visibile. Guardalo per assicurarti che rimanga nel tubo.
    8. Risospendere le celle pellettate aggiungendo 1 mL di DMEM + 10% FBS e pipettando su e giù delicatamente.
    9. Aliquot ha risospeso le cellule su nuove piastre di coltura tissutale della dimensione appropriata con DMEM + 10% FBS (10 ml di terreno sono adatti per una piastra di coltura tissutale da 10 cm).

3. Generare fibroblasti per iniezione

NOTA: I fibroblasti primari senesino dopo troppi raddoppi / passaggi. È importante utilizzare fibroblasti primari dopo un numero limitato di passaggi o raddoppi. Tieni traccia del numero di passaggi o raddoppi che i fibroblasti hanno cresciuto dal topo o dalla pelle umana. Utilizzare fibroblasti con meno di 15 passaggi per fibroblasti dermici umani primari. Utilizzare fibroblasti con meno di 9 passaggi per fibroblasti embrionali di topo. I fibroblasti sono alterati quando diventano confluenti. Tripsinizzare i fibroblasti quando sono circa il 90% confluenti. I fibroblasti avranno proprietà diverse a seconda di come vengono coltivati. Molti scienziati promuovono la coltura su substrati fisiologicamente più rilevanti rispetto alle piastre di coltura tissutale come le matrici di collagene 3D che catturano in modo più efficace ambienti simili ai tessuti23,24,25.

  1. Utilizzare l'equazione nella sezione 2.1 per determinare il tasso di crescita delle cellule dei fibroblasti.
  2. Utilizzare l'equazione nella sezione 2.2 per determinare il numero di giorni necessari per espandere i fibroblasti.
  3. Placcare i fibroblasti come descritto nel paragrafo 2.3 utilizzando il mezzo appropriato nel giorno appropriato per garantire che le cellule tumorali e i fibroblasti siano pronti per l'iniezione lo stesso giorno.
  4. Espandere i fibroblasti nel mezzo appropriato per generare un numero sufficiente di fibroblasti necessari seguendo le procedure descritte nel paragrafo 2.4.

4. Radere i topi per preparare i topi per l'iniezione

NOTA: Indossare camici da laboratorio, retine per capelli, copriscarpe e guanti quando si lavora con i topi.

  1. Uno o due giorni prima dell'iniezione, in conformità con le regole del Comitato istituzionale per la cura degli animali, anestetizzare i topi. Se si utilizza l'isoflurano per l'anestesia, utilizzare una miscela di isoflurano e O2. Mettere i topi in una camera di anestesia e introdurre una miscela di isoflurano (5%)/ O2 per indurre l'anestesia. Quindi, posizionare il cono nasale sull'animale anestetizzato per mantenere il piano chirurgico dell'anestesia con un flusso costante di miscela di isoflurano (2%)/O2 .
  2. Controllare gli animali per assicurarsi che siano nel piano chirurgico appropriato di anestesia pizzicando la punta del topo e confermando che il topo non si muove.
  3. Utilizzando un tagliacapelli con lama chirurgica #40, rimuovere delicatamente la pelliccia dalle posizioni appropriate sui fianchi dei topi passando il tagliacapelli sulla pelle più volte fino a quando la pelliccia non viene rimossa.
  4. Monitorare i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia.

5. Preparare le cellule tumorali e i fibroblasti per l'iniezione

NOTA: Le cellule tumorali e i fibroblasti devono essere iniettati il più presto possibile dopo la raccolta, preferibilmente entro 30 minuti. La mattina dell'iniezione, raccogliere le cellule tumorali e i fibroblasti separatamente dalle piastre di coltura tissutale. Per ogni tipo di cella eseguire la procedura seguente:

  1. Rimuovere il terreno dalla piastra di coltura tissutale con una delicata aspirazione sterile o mediante pipettaggio del mezzo.
  2. Pipettare delicatamente su 5 ml di PBS senza interrompere le cellule. Ruota il PBS. Aspirare delicatamente il PBS con aspirazione o pipettare il PBS.
  3. Versare delicatamente 5 mL di tripsina-EDTA in PBS sullo strato cellulare e incubare per 5 minuti a 37 °C.
  4. Rimuovere le cellule dalla piastra con colpetti delicati per rimuovere le cellule. Pipet le cellule più volte con un pipet da 10 mL e trasferire le cellule in un tubo conico contenente DMEM con FBS al 10%.
  5. Centrifugare i tubi conici a 180 x g per 5 minuti.
  6. Rimuovere il surnatante versandolo delicatamente, trattenendo il pellet cellulare. Lavare il pellet cellulare due volte con PBS. Ogni volta, pipettare 10 ml di PBS sulle cellule. Mescolare delicatamente con un pipet p1000.
  7. Centrifugare le cellule come al punto 5.5. Rimuovere delicatamente il PBS con una pipetta e ripetere.
  8. Risospendere le celle lavate e pellettate in 1 ml di PBS con un p1000.
  9. Pulire un vetrino emocitometrico con alcool e asciugare.
  10. Pipet 100 μL della miscela cellulare in un tubo e aggiungere 400 μL di 0,4% blu Trypan per una concentrazione finale di blu Trypan dello 0,32%.
  11. Riempire delicatamente le camere di un emocitometro in vetro sotto il vetrino di copertura pipettando la miscela cellulare fino a quando la camera è piena.
  12. Utilizzando un microscopio, concentrati sulle linee della griglia di un obiettivo 10x.
  13. Conta le celle vive, non colorate e le celle blu in una serie di 16 quadrati.
  14. Conta tutti e 4 i set di 16 quadrati.
  15. Calcola la media del conteggio delle celle chiare e blu dai 4 set di 16 quadrati e moltiplica per 10.000. Moltiplicare per 5 per correggere la diluizione 1:5 dal blu Trypan.
  16. I conteggi finali sono la concentrazione in cellule/ml per le cellule vitali e morte. Moltiplicare per il volume per determinare il numero totale di cellule tumorali e fibroblasti. Confermare che la frazione di cellule vitali è >80%.
  17. Confermare che ci sia un numero sufficiente di cellule di melanoma e fibroblasti per tutte le iniezioni pianificate, ipotizzando una perdita di almeno il 20% del campione durante le iniezioni.
  18. Trasferire il numero necessario di celle in un nuovo tubo conico e pellettare le celle mediante centrifugazione (180 x g per 5 minuti).
  19. Rimuovere il surnatante con un pipet da 10 ml.
  20. Risospendere il pellet alla concentrazione richiesta nella quantità appropriata di PBS di grado della Farmacopea degli Stati Uniti (USP) (50 μL per tumore per iniezione intradermica e 100 μL per tumore per iniezione sottocutanea).

6. Iniettare cellule tumorali e fibroblasti nei topi

NOTA: Se approvato dal Comitato istituzionale per la cura degli animali, iniettare due tumori in ciascun topo, uno su ciascun fianco. Randomizzare quale topo riceverà quale iniezione sui fianchi destro e sinistro. A seconda del numero di topi da iniettare, anestetizzare i topi e iniettare cellule tumorali e fibroblasti nei topi in lotti.

  1. Per iniezione sottocutanea di cellule tumorali
    1. Anestetizzare i topi come descritto nel paragrafo 4.1.
    2. Pulire la pelle rasata con tamponi imbevuti di alcool.
    3. Riempire una siringa sterile con il volume desiderato di cellule o miscela cellulare e tappare la siringa con un ago da 27 gauge.
      NOTA: assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Sfogliare la siringa secondo necessità per rimuovere le bolle. Una volta che le cellule sono state introdotte nella siringa, mantenere le cellule all'interno delle siringhe ben miscelate invertendo continuamente le siringhe per evitare l'aggregazione.
    4. Inserire l'ago nella regione sottocutanea sul fianco del topo e iniettare delicatamente le cellule nel topo. Utilizzare 100 μL di sospensione cellulare per tumore per iniezione sottocutanea (l'uso di volume superiore a 100 μL per iniezione non è raccomandato).
    5. Monitorare i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Se necessario, fornire ai topi materiali isolanti extra come capanne e / o termofori per aiutare i topi a riprendersi completamente.
  2. Per iniezioni intradermiche di cellule tumorali
    1. Anestetizzare i topi come descritto nel paragrafo 4.1.
    2. Pulire la pelle rasata con tamponi imbevuti di alcool.
    3. Riempire una siringa sterile con il volume desiderato di cellule o miscela cellulare e tappare la siringa con un ago da 27 gauge.
      NOTA: assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Sfogliare la siringa secondo necessità per rimuovere le bolle. Una volta che le cellule sono state introdotte nella siringa, mantenere le cellule all'interno delle siringhe ben miscelate invertendo continuamente le siringhe per evitare l'aggregazione.
    4. Inserire un ago di calibro 27 nella regione intradermica della pelle sul fianco del topo e iniettare delicatamente le cellule nella regione intradermica del topo. Utilizzare 50 μL di sospensione cellulare per tumore per iniezione intradermica (l'uso di volume superiore a 50 μL per iniezione non è raccomandato).
    5. Monitorare i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Se ci sono segni che i topi sono in difficoltà, consultare un veterinario. Se necessario, fornire ai topi materiali isolanti extra come capanne e / o termofori per aiutare i topi a riprendersi completamente.

7. Monitorare i topi durante la crescita del tumore

  1. Monitorare quotidianamente i topi per eventuali segni di dolore o angoscia (postura curva, contorcersi, vocalizzazione, allungarsi lungo la gabbia, premere l'addome sul fondo del pavimento della gabbia o riluttanza a muoversi intorno alla gabbia) o formazione di ascessi. Se ci sono segni che i topi sono in difficoltà, consultare un veterinario.
  2. Una volta formati i tumori, misurare il volume del tumore circa ogni due o tre giorni. Misurare la lunghezza del tumore (il lato più lungo) e la larghezza (perpendicolare alla lunghezza) con le pinze.
    NOTA: le procedure consigliate prevedono che la stessa persona esegua queste misurazioni durante l'esperimento per ridurre la variabilità dei dati. Per le misurazioni, anestetizzare i topi come descritto nel paragrafo 4.1
  3. Calcolare i volumi tumorali con la formula Volume = 0,5 x (Lunghezza x Larghezza2).

8. Raccogliere tumori e misurare i pesi tumorali

  1. Eutanasia dei topi quando la crescita tumorale raggiunge un endpoint sperimentale stabilito dal Comitato dell'istituzione per la cura degli animali. Metti i topi in una camera e eutanasiali con uno spostamento lento (20-30% al minuto) dell'aria della camera con CO2 compresso per un minuto dopo la cessazione della respirazione.
  2. Eseguire la dislocazione cervicale sui topi. Trattenere il roditore su una superficie solida e piana. Posizionare una penna robusta o un altro oggetto contro la parte posteriore del collo alla base del cranio. Spingere rapidamente in avanti e verso il basso con l'oggetto che trattiene la testa mentre si tira indietro con la mano che tiene la base della coda. Confermare con la palpazione che il midollo spinale è reciso.
    NOTA: La dislocazione cervicale deve essere eseguita da personale di laboratorio esperto.
  3. Per ogni topo nell'esperimento, confermare che il topo non è più vivo controllando che non ci sia respirazione, battito cardiaco e nessuna risposta a un pizzico del piede.
  4. Usando un bisturi sterile e forbici chirurgiche, asportare l'intero tumore dal topo. Con le forbici chirurgiche, tagliare il tessuto non tumorale dal tumore.
  5. Pesare il tumore su una bilancia analitica e registrare il peso del tumore.

9. Analisi statistica dei volumi e dei pesi tumorali

  1. Confrontare i volumi tumorali nel tempo in ciascun gruppo con l'analisi della varianza con misure ripetute (ANOVA). Eseguire analisi accoppiate se sono stati iniettati due tumori per topo.
  2. Confrontare i pesi tumorali tra i gruppi con ANOVA utilizzando un test a due code. Il test post-hoc di Tukey può quindi essere utilizzato per determinare quali gruppi sono significativamente diversi l'uno dall'altro. Eseguire analisi accoppiate se sono stati iniettati due tumori per topo.

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Representative Results

A2058 cellule di melanoma umano e fibroblasti dermici umani primari sono stati coltivati in condizioni sterili. Le cellule sono state raccolte e lavate tre volte con PBS. Topi immunodeficienti (NU/J - ceppo nudo Foxn1) sono stati iniettati per via sottocutanea su un fianco con 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 da sole. Sull'altro lato, ai topi è stata iniettata una miscela di 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 e 0,75 milioni di fibroblasti. Le cellule sono state iniettate in 12 topi immunodeficienti. Le iniezioni nei fianchi sinistro e destro sono state randomizzate. I volumi tumorali sono stati monitorati nei giorni 12, 14, 16, 19 e 21 giorni dopo l'iniezione (Figura 1A). Dopo l'eutanasia, i tumori sono stati asportati, ripresi (Figura 1B) e pesati (Figura 1C). La presenza dei fibroblasti provoca tumori significativamente più grandi.

Figure 1
Figura 1: Confronto della crescita del melanoma in presenza e assenza di fibroblasti co-iniettati. Le cellule di melanoma sono state introdotte in topi nudi con o senza fibroblasti cutanei primari. (A) Grafico del volume tumorale nel tempo per i melanomi con e senza fibroblasti co-iniettati. Il volume è stato calcolato come 0,5 * lunghezza * larghezza2. Vengono tracciati i volumi medi e l'errore standard della media (SEM). ANOVA è stato eseguito per determinare la significatività. (B) Immagini di tumori asportati. (C) Pesi finali dei tumori alla fine dell'esperimento il giorno 21. Vengono tracciati i pesi medi e il SEM. Un t-test a due code non accoppiato è stato utilizzato per confrontare i pesi finali. * indica p < 0,05, *** indica p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Nell'esperimento nella Figura 1, la co-introduzione di fibroblasti dermici umani con cellule di melanoma umano A2058 ha provocato tumori più grandi rispetto a quando le cellule di melanoma sono state introdotte senza fibroblasti co-iniettati. Questa differenza potrebbe essere facilmente rilevata in base al volume del tumore e al peso del tumore. I risultati sono coerenti con molteplici segnalazioni che i fibroblasti associati al cancro possono promuovere la crescita tumorale 5,6,7,8. Oltre agli endpoint discussi qui, come il volume e il peso del tumore, è possibile monitorare anche ulteriori endpoint. Sono possibili anche ulteriori analisi. Ad esempio, i tumori che si sviluppano possono essere raccolti in formalina per la fissazione, incorporati in paraffina e analizzati con ematossilina ed eosina per istologia. In alternativa, i tumori sviluppati possono essere raccolti in composti a temperatura di taglio ottimale (OCT) per ulteriori analisi con immunofluorescenza per proteine specifiche.

Una limitazione importante di questi esperimenti è che i fibroblasti che vengono co-iniettati con le cellule tumorali possono senesce o morire dopo alcune divisioni cellulari. In alternativa, i fibroblasti co-iniettati possono migrare lontano dal tumore, nel qual caso, potrebbero non influenzare la crescita del tumore. Se i fibroblasti senesce, muoiono o migrano lontano dal tumore, allora diventeranno meno abbondanti nel tempo e l'effetto dei fibroblasti co-introdotti diventerà meno importante per la crescita del tumore. Infatti, ci si aspetta che le cellule tumorali introdotte recludano ulteriori fibroblasti dall'ospite. Per gli esperimenti in cui un gene specifico viene abbattuto o eliminato nei fibroblasti introdotti, nel tempo, il reclutamento di fibroblasti ospiti che esprimono la proteina codificata dovrebbe ridurre qualsiasi fenotipo che potrebbe essere osservato. Per monitorare la presenza dei fibroblasti introdotti, i fibroblasti possono essere geneticamente modificati per esprimere una proteina fluorescente come GFP26,27. Se i fibroblasti esprimono GFP, la citometria a flusso può essere utilizzata per monitorare il numero di fibroblasti presenti all'interno del tumore in giorni diversi dopo la loro introduzione. In alternativa, l'enzima luciferasi può essere introdotto nei fibroblasti e l'imaging a bioluminescenza può essere utilizzato per monitorare la quantità di fibroblasti nei topi nel tempo. Se i fibroblasti vengono rapidamente eliminati dal microambiente tumorale, i modelli murini geneticamente modificati Cre-lox affronterebbero questa preoccupazione e completerebbero gli studi descritti.

Se gli esperimenti vengono eseguiti introducendo cellule tumorali umane e fibroblasti in topi nudi, allora il sistema immunitario limitato dovrebbe avere un impatto significativo sui risultati. I topi nudi atimici (NU / J) mancano di cellule T e quindi mancano di immunità cellulo-mediata. Hanno anche un difetto parziale nello sviluppo delle cellule B. L'immunità cellulo-mediata, cioè l'uccisione delle cellule attraverso le cellule T CD8+ attivate, può svolgere un ruolo importante nella soppressione della crescita tumorale28,29. In studi recenti, l'interazione tra fibroblasti associati al cancro e cellule T CD8 + è stata riportata30,31,32. L'introduzione di cellule tumorali di topo e fibroblasti di topo in topi con un sistema immunitario può essere considerata come un approccio alternativo che affronterebbe questo problema.

Un altro approccio alternativo è quello di utilizzare modelli murini geneticamente modificati in cui il sistema Cre-lox viene utilizzato per modulare i livelli o l'attività di proteine specifiche nei fibroblasti dell'ospite. Uno di questi approcci consiste nell'utilizzare modelli Cre-lox arricchiti con fibroblasti con driver come FSP1, Col1a1, Col1a2 o PDGFRa33,34,35. Con un modello di Cre/lox ricombinasi, non ci sarebbe preoccupazione che i fibroblasti iniettati moriranno o migreranno lontano dal tumore.

Ci sono alcuni passaggi nel protocollo fornito che sono fondamentali per il suo successo. La crescita dei fibroblasti è una parte importante del protocollo ed è probabile che contribuisca in modo significativo al risultato. I fibroblasti primari senescenti facilmente e il passaggio o i raddoppi devono essere attentamente monitorati per garantire che i fibroblasti siano nella fase di crescita esponenziale e non abbiano senescenti. Ci si aspetta che i fibroblasti senescenti secernano alti livelli di citochine che possono avere un effetto drammatico sulla crescita tumorale36,37,38. È quindi di grande importanza che il numero di passaggio sia accuratamente documentato e che i fibroblasti iniettati non siano senescenti a meno che il protocollo non richieda l'analisi dei fibroblasti senescenti.

Quando i fibroblasti diventano confluenti, ci si può aspettare che subiscano un gran numero di cambiamenti, alcuni dei quali saranno probabilmente invertiti quando rientreranno nel ciclo cellulare 39,40,41,42,43,44. Mantenere i fibroblasti in uno stato proliferativo e dividerli quando sono confluenti al 90% è importante per garantire che gli studi siano il più coerenti possibile. La coltura di fibroblasti su piastre di coltura tissutale probabilmente influisce anche sul loro comportamento e alternative come le matrici di collagene 3D dovrebbero essere considerate23,24,25. I fibroblasti coltivati in matrici 3D mostrano modelli di migrazione sostanzialmente diversi rispetto ai fibroblasti cresciuti su superfici 2D 45,46,47,48,49, che probabilmente influenzerebbero la loro capacità di promuovere il tumore quando introdotti nei tumori, dove i fibroblasti svolgeranno un ruolo attivo nello stabilire il microambiente della matrice extracellulare tumorale50.

L'iniezione di cellule di melanoma nel topo tramite iniezione intradermica può produrre una crescita tumorale più riproducibile rispetto alle iniezioni sottocutanee. Questo è un passaggio difficile in quanto c'è pochissimo spazio nella regione intradermica. È importante posizionare con attenzione l'ago. Se vengono eseguite iniezioni intradermiche, vengono iniettati solo 50 μL di soluzione. Anche per i ricercatori esperti, queste iniezioni possono perdere. È importante prendere nota se ogni iniezione è fuoriuscita in modo che, se non si forma alcun tumore, possa essere eliminato dall'analisi finale.

La preparazione delle siringhe per l'iniezione è un altro passo critico. È importante rimuovere tutte le bolle dalla siringa, che può richiedere di sfiorare la siringa per eliminare le bolle. È anche importante che le cellule non si aggreghino. Capovolgere ripetutamente le siringhe per evitare l'aggregazione.

Un altro aspetto difficile di questi esperimenti è che la misurazione del volume del tumore può essere variabile da persona a persona. Al fine di limitare la variabilità nelle misurazioni del volume del tumore, è utile assegnare a un singolo membro del laboratorio la responsabilità di eseguire tutte le misurazioni del volume tumorale in tutti i topi e in tutti i punti temporali durante un esperimento.

È preferibile iniettare topi con cellule tumorali dello stesso sesso del topo ospite quando possibile. È possibile utilizzare entrambi i sessi e includere il sesso come variabile nei modelli ANOVA per determinare se il sesso influisce sulle dimensioni del tumore nel tempo.

Comprendere il microambiente tumorale è essenziale per ottenere informazioni sulla tumorigenesi. Il protocollo può fornire una base per comprendere il ruolo dei fibroblasti, diversi tipi di fibroblasti e diversi percorsi all'interno dei fibroblasti che possono influenzare la crescita del tumore. I risultati di questi esperimenti possono identificare nuovi bersagli terapeutici che impediranno ai fibroblasti di promuovere la crescita del tumore18.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Coller per l'utile contributo. H.A.C. era lo studioso Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation. Riconosciamo NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, Clinical Translational Science Institute e Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovation Awards dal Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills e Ha Gaba), un premio dall'UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health con il numero di premio P50CA092131), un premio per l'innovazione dal Broad Stem Cell Center, l'Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research dell'UCLA, il Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), il Dermatology T32 Program presso UCLA AR071307 e l'UCLA Muscle Cell Biology, Pathophysiology and Therapeutics T32 Training Program 5 T32 AF 65972.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26G Needles Fisher Scientific 14-826-10
Alcohol swabs Fisher Scientific 326895
Animal clipper miniARCO with surgical blade #40 WAHL Professional 8787-450A
Athymic nude mice (NU/J) The Jackson labs 002019 These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.
Cancer cells ATCC ATCC® CRL-11147™ This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.
Cell Culture Multi Flasks Fisher Scientific 14-826-95
Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g Fisher Scientific 14-432-22
Countess Cell Counting Chamber Fisher Scientific C10228
Dulbecco's Modified Eagle Medium Fisher Scientific 11965-118
Fetal bovine serum Fisher Scientific MT35010CV
Fibroblasts  ATCC PCS-201-012 We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.
Isoflurane Henry Schein Animal Health NDC 11695-6776-2
PBS USP grade for injection into mice Fisher Scientific 50-751-7476
Sterile 10 ml serological pipet Celltreat 667210B
Sterile 5 ml serological pipet Celltreat 229005B
Sterile 50 ml centrifuge tubes Genesee Scientific 28-108
Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns Fisher Scientific 09-740-61A
Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA Fisher Scientific 15400054
Sterile tissue-culture grade PBS Fisher Scientific 50-751-7476
Sterle 25 ml serological pipet Celltreat 667225B
TC treated 100 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-202
TC treated 150 x 20 mm dishes Genesee Scientific 25-203
TC treated 60 x 15 mm dishes Genesee Scientific 25-260
Trypan blue Fisher Scientific C10228

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Ricerca sul cancro Numero 166 Fibroblasti associati al cancro xenotrapianto melanoma iniezione intradermica ortotopica microambiente tumorale
Un modello murino per studiare il ruolo dei fibroblasti associati al cancro nella crescita tumorale
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Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus,… More

Jelinek, D., Zhang, E. R., Ambrus, A., Haley, E., Guinn, E., Vo, A., Le, P., Kesaf, A. E., Nguyen, J., Guo, L., Frederick, D., Sun, Z., Guo, N., Sevier, P., Bilotta, E., Atai, K., Voisin, L., Coller, H. A. A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth. J. Vis. Exp. (166), e61883, doi:10.3791/61883 (2020).

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