इन विट्रो ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विच्छेदित करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक सह-संस्कृति मॉडल

Summary

इम्यूनोथेरेपी और सिंगल-सेल जीनोमिक प्रोफाइलिंग के युग में, कैंसर जीव विज्ञान को एक उचित स्थानिक संदर्भ में ट्यूमर-प्रतिरक्षा इंटरफ़ेस की जांच के लिए नए इन विट्रो और कम्प्यूटेशनल टूल की आवश्यकता होती है। हम 2 डी और 3 डी सेटिंग्स में ट्यूमर-प्रतिरक्षा माइक्रोफ्लुइडिक सह-संस्कृतियों का फायदा उठाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो सेलुलर कार्यों की गतिशील, बहुपैरामीट्रिक निगरानी के साथ संगत हैं।

Abstract

जटिल रोग मॉडल अत्याधुनिक उपकरणों की मांग करते हैं जो शारीरिक और पैथोलॉजिकल रूप से प्रासंगिक, कार्रवाई योग्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने और अन्यथा अदृश्य प्रक्रियाओं का अनावरण करने में सक्षम हैं। विवो दृश्यों में बारीकी से नकल करने वाले उन्नत सेल परख खुद को कैंसर की प्रगति को प्रभावित करने वाले द्विदिश ट्यूमर-होस्ट इंटरप्ले की कल्पना और मापने के नए तरीकों के रूप में स्थापित कर रहे हैं। यहां हम प्राकृतिक और चिकित्सा-प्रेरित इम्यूनोसर्विलांस के तहत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) की जटिलता की नकल करते हुए, माइक्रोडिवाइसेस में अत्यधिक नियंत्रणीय 2 डी और 3 डी सह-संस्कृतियों को फिर से बनाने के लिए दो बहुमुखी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। खंड 1 में, उज्ज्वल क्षेत्र टाइम-लैप्स माइक्रोस्कोपी द्वारा अनुयायी ट्यूमर कोशिकाओं और फ्लोटिंग प्रतिरक्षा आबादी के बीच क्रॉसस्टॉक की निगरानी के लिए एक प्रयोगात्मक सेटिंग प्रदान की जाती है। एक अनुप्रयोग परिदृश्य के रूप में, हम कैंसर-विरोधी उपचारों के प्रभावों का विश्लेषण करते हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती और सक्रियण पर तथाकथित इम्युनोजेनिक कैंसर सेल डेथ इंड्यूसर। खंड 2 में, 3 डी ट्यूमर-प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट को प्रतिस्पर्धी लेआउट में इकट्ठा किया जाता है। संयोजन चिकित्सीय रणनीतियों का मूल्यांकन करने के लिए, 72 घंटे तक प्रतिदीप्ति स्नैपशॉट द्वारा विभेदक प्रतिरक्षा घुसपैठ की निगरानी की जाती है। दोनों सेटिंग्स में, छवि प्रसंस्करण चरणों को प्रतिरक्षा कोशिका मापदंडों (जैसे, प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन और इंटरैक्शन, चिकित्सीय एजेंटों की प्रतिक्रिया) की अधिकता निकालने के लिए चित्रित किया गया है। इन सरल और शक्तिशाली तरीकों को कैंसर, स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के उपप्रकारों की विषमता और प्लास्टिसिटी के साथ-साथ कैंसर के विकास के ड्राइवरों के रूप में उनकी पारस्परिक बातचीत को शामिल करने वाले टीएमई की जटिलता को अनुकरण करने के लिए आगे तैयार किया जा सकता है। लाइव-सेल उच्च-सामग्री इमेजिंग के साथ इन तेजी से विकसित प्रौद्योगिकियों के अनुपालन से बड़े सूचनात्मक डेटासेट की पीढ़ी हो सकती है, जिससे नई चुनौतियां सामने आ सकती हैं। दरअसल, त्रिकोण 'सह-संस्कृतियों / माइक्रोस्कोपी / उन्नत डेटा विश्लेषण' एक सटीक समस्या पैरामेट्राइजेशन की दिशा में मार्ग निर्धारित करता है जो तैयार किए गए चिकित्सीय प्रोटोकॉल की सहायता कर सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि उच्च-थ्रूपुट प्रसंस्करण के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता के साथ कैंसर-प्रतिरक्षा ऑन-ए-चिप का भविष्य का एकीकरण सटीक और व्यक्तिगत ऑन्कोलॉजी के लिए पूर्वानुमानित और प्रीक्लिनिकल टूल के रूप में क्षमताओं का लाभ उठाने में एक बड़ा कदम आगे बढ़ाएगा।

Introduction

प्रयोगात्मक विषयों के रूप में चिकित्सा की विभिन्न शाखाओं का विकास^{नियंत्रित परिस्थितियों} में सेल आबादी और अंग कार्यों में हेरफेर करने की क्षमता पर निर्भर करता है। इस तरह की क्षमता की जड़ें औसत दर्जे के मॉडल की उपलब्धता में हैं जो हमारे शरीर में होने वाली प्रक्रियाओं को पुन: व्यवस्थित करने में सक्षम हैं।

इम्यूनोथेरेपी और सिंगल-सेल जीनोमिक प्रोफाइलिंग 2 के युग में, कैंसर जीव विज्ञान को एक उचित स्थानिक संदर्भ ^2,3 में ट्यूमर-प्रतिरक्षा इंटरफ़ेस की जांच के लिए उभरते इन विट्रो और कम्प्यूटेशनल मॉडल का लाभ उठाने की आवश्यकता है।

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट⁴ (टीएमई) एक जटिल ऊतक है जहां कैंसर कोशिकाएं लगातार अन्य सेलुलर (प्रतिरक्षा, स्ट्रोमल और एंडोथेलियल कोशिकाओं) और गैर-सेलुलर (बाह्य मैट्रिक्स, ईसीएम) घटकों के साथ बातचीत और गतिशील रूप से सह-विकसित होती हैं। इस जटिल परिदृश्य की गतिशील प्रकृति यह निर्धारित करती है कि क्या प्रतिरक्षा कोशिकाएं घातक कोशिकाओं के दोस्त या दुश्मन के रूप में खेलती हैं, इस प्रकार रोग की प्रगति और चिकित्सा की प्रतिक्रिया दोनों को दृढ़ता से प्रभावित करती हैं। आजकल, ऑन्को-इम्यूनोलॉजिस्ट, जैव सूचना विज्ञानियों और सिस्टम जीवविज्ञान विशेषज्ञों के महान प्रयास कैंसर विषमता ^5,6 के नैदानिक महत्व को संबोधित करने के लिए एकत्रित हो रहे हैं, या तो अंतरिक्ष में (यानी, अलग-अलग ट्यूमर क्षेत्रों में) और समय (यानी, अलग-अलग ट्यूमर प्रगति चरणों में) ^5,6, और एकल-कोशिका स्तर पर कैंसर और प्रतिरक्षा कोशिका फेनोटाइप और कार्य को चिह्नित करने के लिए। इस तालमेल के एक उदाहरण के रूप में, उन्नत कंप्यूटर-दृष्टि तकनीकों का उपयोग अब नियमित रूप से हिस्टोलॉजिकल नमूनों ^7,8 में प्रतिरक्षा घुसपैठ के स्थानिक मानचित्रण के लिए किया जाता ^है।

प्रायोगिक मॉडल, ब्रिजिंग पशु अध्ययन और पारंपरिक इन विट्रो विधियों के मोर्चे पर, माइक्रोफ्लुइडिक्स और सह-संवर्धन तकनीकों में प्रगति माइक्रो-इंजीनियर सेलुलर मॉडल के विभिन्न वर्गों जैसे ऑर्गेनोइड्स, माइक्रो-फिजियोलॉजिकल सिस्टम ^9,10,11 (एमपीएस), और ऑर्गन-ऑन-चिप ^12,13,14 तक पहुंच प्रदान करती ^है। (ओओसी)। वे सेलुलर पारिस्थितिक तंत्र के 'बड़ी तस्वीर' दृश्य में ज़ूम करने और उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी¹⁵ और छवि प्रसंस्करण दृष्टिकोण का फायदा उठाते हुए माइक्रोएन्वायरमेंटल कारकों को नियंत्रित करने के लिए इन विट्रो क्षमता का विस्तार करने के लिए सामान्य विशेषता साझा करते हैं।

आजकल, अत्याधुनिक-एमपीएस और ओओसी प्रणालियों ने प्रतिरक्षात्मक पहलुओं को शामिल करना शुरू कर दिया है, जिसमें मौजूदा ऊतकों और सह-संस्कृतियों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विभिन्न उपप्रकारों को शामिल^{किया गया है}, ताकि भड़काऊ रोगों, घाव भरने, म्यूकोसल प्रतिरक्षा, और विषाक्त पदार्थों या दैनिक खाद्य उत्पादों की प्रतिक्रिया जैसी विभिन्न प्रक्रियाओं का पता लगाया जा सके और मापा जा सके। टीएमई-ऑन-ए-चिप मॉडल 10,11,12,13,14,15,16,17, जो पर्फ्यूजेबल माइक्रोवेसल्स ^18,19,20,21 के साथ भी एकीकृत हैं, सेल-प्रकार-निर्भर इंटरैक्शन, भौतिक और रासायनिक गड़बड़ी और साइटोटोक्सिक गतिविधि की जांच करने के लिए विकसित किए गए हैं। लिम्फोसाइट्स²² में घुसपैठ, साथ ही चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक इम्यूनोमॉड्यूलेटरी एजेंट²³।

यहां, हम 2 डी (अनुभाग 1) और 3 डी (धारा 2) सेटिंग्स¹⁶ में उन्नत ट्यूमर-प्रतिरक्षा माइक्रोफ्लुइडिक सह-संस्कृतियों का फायदा उठाने के लिए चिप्स में कोशिकाओं को लोड करने से लेकर छवि प्रसंस्करण उपकरण तक फैले बहुमुखी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो गतिशील, मल्टीपैरामीट्रिक²⁴ निगरानी और सेलुलर कार्यों के विज़ुअलाइज़ेशन के साथ संगत हैं। यह फिजी फ्रीवेयर सॉफ्टवेयर और इसके टूलबॉक्स^25,26 का लाभ उठाते हुए नमूना प्रबंधन और डेटा विश्लेषण दोनों में उपयोग और लचीलेपन की सहजता को बनाए रखते हुए हासिल किया जाता है।

खंड 1 में वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, अनुयायी कैंसर और फ्लोटिंग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के 2 डी सह-संस्कृतियों को करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इस मंच को आनुवंशिक उत्परिवर्तन²⁷ और / या इम्यूनोडेफिशिएंसी²⁸ की उपस्थिति में प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार के इन विट्रो माप के लिए मान्य किया गया था। यहां, हम ट्रैकमेट (फिजी सॉफ्टवेयर में लागू एक प्लगइन) पर आधारित अर्ध-स्वचालित विधि का फायदा उठाकर, टाइम-लैप्स उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्रैक करने के चरणों का वर्णन करते हैं। यह प्रक्रिया प्रतिरक्षा प्रवासन ²⁹ और प्रतिक्रिया (यानी, बातचीत के समय) के किनेमेटिक डिस्क्रिप्टर के निष्कर्षण को कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने में सक्षम बनाती है, जिनका इलाज इम्युनोजेनिक सेल डेथ इंड्यूसर²⁷ के साथ किया जाता है या नहीं।

महत्वपूर्ण रूप से समय-श्रृंखला छवियों से निकाले गए इन मापदंडों को उन्नत गणितीय मशीनरी के साथ संसाधित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की क्षमता के एक उदाहरण के रूप में, हमारे समूहों ने हाल ही में स्टोकेस्टिक प्रक्रियाओं और सांख्यिकीय यांत्रिकी से गणितीय तरीकों के आधार पर एक विश्लेषण प्रकाशित किया है ताकि सेलुलर नेटवर्क गुणों को मॉडल किया जा सके और प्रतिरक्षा सेल व्यवहार (यानी, पक्षपाती या असंबद्ध यादृच्छिक चलना, अत्यधिक या समन्वित गति^30,31) का एक परमेट्राइज्ड विवरण प्रदान किया जा ^सके।

दूसरे खंड में प्रदान की गई 3 डी सेटिंग, प्रतिस्पर्धी फैशन में सेल प्रकारों और दवाओं के विभिन्न संयोजनों के साथ दो जेल क्षेत्रों में एम्बेडेड अधिक जटिल इम्यूनोकॉम्पिटेंट टीएमई को फिर से बनाने के लिए एक सह-संस्कृति प्रोटोकॉल पर आधारित है। यहां, एंटीट्यूमर एजेंट संयोजनों का मूल्यांकन करने के लिए, मैट्रिगेल के भीतर उगाए गए मानव ए 375 एम मेलेनोमा कोशिकाओं में दाग वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ को मापने के लिए, अलग-अलग समय बिंदुओं पर छवि प्रसंस्करण चरणों का वर्णन किया^गया है। ए 375 एम लाइन, एक अत्यधिक मेटास्टैटिक फेनोटाइप की विशेषता वाली ए 375 पी व्युत्पन्न सेल लाइन को प्रतिरक्षा कोशिकाओं^की उपस्थिति में उनकी मेटास्टैटिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए चुना गया था।

वर्णित मॉडल पूरी तरह से विभिन्न सेल स्रोतों (मुराइन और मानव अमर या प्राथमिक सेल लाइनों, ऑर्गेनोइड्स, जेनोग्राफ्ट्स, दूसरों के बीच) के अनुरूप हो सकते हैं। हमारी प्रयोगशाला के हाल के अध्ययनों में, छवि विश्लेषण के साथ उच्च-सामग्री वीडियो माइक्रोस्कोपी के संयोजन से, प्रतिस्पर्धी 3 डी लेआउट को जांच करने के लिए लागू किया गया था: i) एक एंटी-ट्यूमरल (एंटीबॉडी-निर्भर सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी, एडीसीसी) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एचईआर 2 ⁺ स्तन कैंसर ऑन-चिप मॉडल³³ में ट्रास्टुज़ुमाब थेरेपी के प्रतिरोध में फाइब्रोब्लास्ट की भूमिका का विश्लेषण; ii) ट्यूमर की चोरी और टी कोशिकाओं की भर्ती के तंत्र में माइलॉयड^{कोशिकाओं} (यानी, कैंसर से जुड़े मैक्रोफेज) की कार्रवाई; iii) इम्यूनोथेरेप्यूटिक शासन की प्रभावकारिता, विशेष रूप से इंटरफेरॉन-α-वातानुकूलित डेंड्राइटिक कोशिकाओं (आईएफएन-डीसी) पर आधारित है, जो कोलेजन मैट्रिसेस में दवा-उपचारित बृहदान्त्र कैंसर कोशिकाओं के साथ खेती की जाती है, और कुशल गति और सफल फागोसाइटोसिस घटनाओं का मूल्यांकन करने के लिए^; iv) आईएल -33 उपचारित या अनुपचारित मेलेनोमा कोशिकाओं की ओर अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न ईोसिनोफिल^का केमोटैक्टिक प्रवास।

ये उन्नत मॉडल कैंसर मेटास्टेसिस और प्रतिरोध तंत्र में प्रतिरक्षा संदर्भ की भूमिका को समझने के लिए अवलोकन खिड़कियों के रूप में काम कर सकते हैं, लेकिन क्लीनिकों में निष्कर्षों का अनुवाद करने के प्रयासों की आवश्यकता होती^{है, जो} बुनियादी शोध के साथ अंतर को बंद करते हैं।

एक उभरते परिदृश्य के रूप में, अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक माइक्रोसिस्टम के उपयोग के साथ युग्मित स्वचालित उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी की शक्ति का उपयोग करना सैकड़ों, और यहां तक कि हजारों गीगाबाइट मल्टीपैरामीट्रिक डेटा की हैंडलिंग, प्रसंस्करण और व्याख्या के लिए नई संभावित चुनौतियां खोल रहा है, जिसे एकल प्रयोगात्मक अभियान से उत्पन्न किया जा सकता है। इसका तात्पर्य कृत्रिम बुद्धिमत्ता 38,39,40,41,42 (एआई) आधारित एल्गोरिदम के साथ ओओसी प्रयोगों का सीधा लिंक है, जो उन्नत स्वचालित विश्लेषण के लिए है, और सुविधाओं की पीढ़ी जो क्षितिज पर रोमांचक नए अनुप्रयोगों के साथ कैंसर-प्रतिरक्षा इंटरप्ले⁴³ के सिलिको मॉडल में फ़ीड कर सकती है, जैसे कि प्रेडिक्टिव ड्रग स्क्रीनिंग परख⁴⁴ का विकास।

प्रयासों का एक निरंतर विस्तारित प्रवाह संयुक्त रूप से एकल-सेल मल्टी-ओमिक्स रीडआउट के साथ बड़े पैमाने पर गड़बड़ी स्क्रीन को लागू करने के लिए रणनीतियों के अनुकूलन के साथ रोग मॉडल के डिजाइन पर केंद्रित है। यह निस्संदेह विकास में मदद करेगा और उम्मीद है, नैदानिक कार्यान्वयन, विधि मानकीकरण की एक उचित डिग्री के साथ, प्रतिरक्षा विकारों और कैंसर प्रसार तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक व्यवस्थित ऑन्को-इम्यूनोलॉजी-ऑन-ए-चिप दृष्टिकोण।

Protocol

1. अनुयायी और फ्लोटिंग कोशिकाओं के लिए चिप डिजाइन 2 डी सह-संस्कृतियां

नोट: 2 डी सह-संस्कृति लेआउट (चित्रा 1 ए-सी) को माइक्रोचैनल सरणियों के दो सेटों (500 x 12 x 10 μm³, L×W×H) द्वारा परस्पर जुड़े तीन कक्षों (100 μm उच्च) की विशेषता है। मध्यवर्ती कक्ष दो बंद डेड-एंड डिब्बों का निर्माण करता है जो लोडिंग चरण 2.5 के दौरान ट्यूमर साइट में बहने वाली फ्लोटिंग प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अवरुद्ध करते हैं। यह डिवाइस प्रकार एकल-कोशिका (या तो अनुयायी या फ्लोटिंग) गतिशीलता के वास्तविक समय द्वि-आयामी माप और सेल-सेल इंटरैक्शन^{16,27,28,30,31} के लिए उपयोगी है। एक विशिष्ट सेल माइग्रेशन अध्ययन (कई घंटों से कई दिनों तक आयोजित) छवि-प्रसंस्करण एल्गोरिदम⁴⁵ के साथ लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी को जोड़ता है, ताकि अधिग्रहित छवि अनुक्रमों को संख्यात्मक विशेषताओं में अनुवाद किया^जा सके। प्रवासी पैटर्न के आधार पर, कई बायोफिज़िकल संकेतकों का अनुमान लगाया जा सकता है, जैसे कि कोशिकाओं का विस्थापन और वेग, साथ ही प्रतिरक्षा कोशिका और लक्ष्य सेल इंटरैक्शन की अवधि²⁴।

1. कैंसर और पीबीएमसी कोशिकाओं की तैयारी
   1. कैंसर कोशिका संस्कृति
      नोट: एमडीए-एमबी -231 ट्रिपल-नेगेटिव [एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर)-, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर (पीआर)-, और मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (एचईआर 2)-] मानव स्तन एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं को नियमित रूप से रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 माध्यम में 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 आईयू एमएल ^-1 पेनिसिलिन जी सोडियम नमक और ¹⁰⁰ 1 0 0 1 लीटर सोडियम नमक के साथ पूरक किया जाता है। मानक संस्कृति स्थितियों के तहत (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂)।
      1. सेल कल्चर विकास को अनुकूलित करने के लिए, 12-से-15 एमएल विकास माध्यम में 1 × 10⁶ सेल एमएल -1 के घनत्व पर 75^{सेमी 2} फ्लास्क में ^{एमडीए-एमबी} -231 कोशिकाओं को प्लेट करें।
      2. जब कोशिकाएं संगम के 75-80% तक पहुंच जाती हैं, तो विकास माध्यम को त्याग दें, एफबीएस को पूरी तरह से हटाने के लिए कोशिकाओं को पूर्व-गर्म फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ धोएं, और फिर उन्हें पूर्व-गर्म ट्रिप्सिन (37 डिग्री सेल्सियस पर 1-से-2 मिनट) से अलग करें।
      3. ट्रिप्सिन एंजाइमेटिक गतिविधि को निष्क्रिय करने और अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए विकास माध्यम जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 1,100 x g पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को दो बार धोएं।
      4. ट्रिपैन ब्लू डाई बहिष्करण परीक्षण के माध्यम से सेल काउंटिंग स्लाइड में कोशिकाओं की गणना करें और फिर उन्हें या तो रखरखाव संस्कृति (पिघलने से 6 से अधिक मार्ग के लिए) या प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए पुन: स्थापित करें।
      5. माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों के लिए, बीज 1 × 3 एमएल विकास माध्यम में^6-वेल प्लेटों में 10 6 कोशिकाएं होती हैं और या तो नियंत्रण के रूप में 25 μM डॉक्सोर्यूबिसिन (DOXO) या DOXO विलायक (PBS) की समान मात्रा के साथ इलाज करती हैं।
      6. चार से 6 घंटे बाद, आरटी पर 1,100 x g पर 5 मिनट के लिए पूर्व-गर्म पीबीएस के साथ डॉक्सो-उपचारित कोशिकाओं को दो बार धोएं।
      7. ऊपर के रूप में DOXO-उपचारित और PBS-उपचारित नियंत्रण कोशिकाओं की गणना करें (चरण 1.1.1.5 देखें) और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) के साथ सह-संस्कृति सेट करें।
   2. पीबीएमसी अलगाव
      1. हेपरिनाइज्ड शीशियों में स्वस्थ स्वयंसेवकों से शिरापरक पूरे रक्त (लगभग 10 एमएल) एकत्र करें और ट्यूब को 2-से-4 बार⁴⁷ बार धीरे से मिलाएं।
      2. पीबीएस के साथ पतला रक्त 1: 1 और 50 एमएल ट्यूब में 10 एमएल घनत्व ढाल मध्यम लिम्फोप्रेप पर परत।
         नोट: रक्त और लिम्फोप्रेप को दो अलग-अलग परतें बनाने के लिए बहुत धीरे-धीरे और धीरे-धीरे परत करना सुनिश्चित करें।
      3. बिना ब्रेक के स्विंग-आउट बाल्टी में 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर 30 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज ट्यूब। चार अलग-अलग परतें बनेंगी: (i) शीर्ष पर प्लाज्मा, (ii) पीबीएमसी युक्त एक सफेद और बादल परत, (iii) लिम्फोप्रेप, और (iv) एरिथ्रोसाइट्स और ग्रैन्यूलोसाइट्स की एक गोली।
      4. 2 एमएल पिपेट के साथ धीरे-धीरे पीबीएमसी को एस्पिरेट करें और तुरंत गर्म विकास माध्यम (चरण 1.1.1 में उपयोग किया जाता है) में पुन: निलंबित करें और आरटी पर 1,100 x g पर 5 मिनट के लिए दो बार धोएं।
      5. ऊपर दिए गए पेलेट पीबीएमसी की गणना करें (चरण 1.1.1.5 देखें) और या तो प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए उपयोग करें या दीर्घकालिक भंडारण के लिए फ्रीज करें।
2. 2 डी चिप्स में कोशिकाओं को चढ़ाना
   नोट: PBMCs इस प्रोटोकॉल में दाग नहीं हैं। चिप पर विशिष्ट फेनोटाइप्स को चिह्नित करने के लिए, प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को इम्यूनोमैग्नेटिक बीड चयन द्वारा अलग किया जा सकता है, फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर्स के साथ सना हुआ, बिना लेबल वाले शेष अंश के साथ फिर से मिलाया जा सकता है, और इस प्रकार लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के साथ सामना किया जा सकता है, जैसा कि ऑन-चिप प्रयोगों में बताया गया है, जैसा कि वैचेली एट अल .²⁷ में वर्णित है, और रेसिओप्पी एट अल.34 में।
   1. सह-संस्कृति प्रयोगशुरू करने से पहले और अभिकर्मकों को जोड़ने की सुविधा के लिए, कुछ सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार द्वारा संग्रहीत चिप्स को सक्रिय करें। पीडीएमएस (पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन) सतहों को चढ़ाना चरणों तक हाइड्रोफिलिक रखने के लिए तुरंत जलाशयों को विआयनीकृत पानी या पीबीएस से भरें।
      नोट: पीडीएमएस आंतरिक रूप से हाइड्रोफोबिक है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोचैनलों में हवा के बुलबुले के संचालन और फंसाने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ सकता है। ऑक्सीजन प्लाज्मा सक्रियण के बारे में विवरण प्रदान करने वाली पूरक फ़ाइल में चरण 7 देखें।
   2. 20 मिनट के लिए यूवी कैबिनेट के तहत निष्फल करें, ताजा पीबीएस के साथ 2-3 बार धोएं, और फिर 1 घंटे के लिए संस्कृति मीडिया के साथ इनक्यूबेट करें। प्लेटिंग चरणों का प्रदर्शन करने तक इनक्यूबेटर में चिप्स रखें।
   3. सभी छह जलाशयों से अतिरिक्त मीडिया को हटा दें। मुख्य संस्कृति कक्षों से मीडिया को चूसने से बचने के लिए ध्यान रखें।
   4. धीरे-धीरे 1 × 10⁵ कैंसर कोशिकाओं को ऊपरी बाएं हाथ के जलाशय में और फिर निचले कुएं में 10-20 `L विकास माध्यम में पुन: निलंबित करें (चित्र 1A, जलाशय 1 और 2)। कोशिकाओं को ट्यूमर कक्ष में पालन करने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें। कुछ कोशिकाएं जलाशयों में बस जाएंगी और संलग्न होंगी।
      नोट: चैनल खोलने के बगल में सेलुलर निलंबन डालें। यह प्रक्रिया एमडीए-एमबी -231 कैंसर कोशिकाओं पर लागू होती है, अन्य लाइनों को सेल घनत्व अनुकूलन की आवश्यकता होगी। कैंसर सेल लगाव में सुधार करने के लिए, सतहों (जैसे, पॉली-एल-लाइसिन, फाइब्रोनेक्टिन) का एक कोटिंग कार्यात्मककरण किया जा सकता है। कृपया, चरण ^{16, 48,49,50} कोटिंग के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल देखें।
   5. दाईं ओर धीरे से पाइप 1 × 10⁶ पीबीएमसी 50 μL विकास माध्यम में कुओं 3 और 4 में पुन: निलंबित हो जाते हैं (चित्र 1A, जलाशय 3 और 4 देखें)।
      नोट: बहने के बाद, पीबीएमसी मध्यवर्ती कक्ष में एक "फ्रंट" बनाते हुए वितरित करेगा, जो प्रयोग के शुरुआती बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है।
   6. सभी छह जलाशयों को 100-150 μL तक के विकास माध्यम से भरें। एक माइक्रोस्कोप जांच के तहत कि कोशिकाओं ने संस्कृति डिब्बों में सही ढंग से वितरित किया है जैसा कि चित्र 1 डी-ई में दर्शाया गया है। अंतिम मात्रा जलाशयों के आकार के साथ भिन्न हो सकती है। सभी कुओं में समान होने के लिए वॉल्यूम समायोजित करें।
   7. टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग से पहले सिस्टम को स्थिर करने के लिए चिप्स को लगभग 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें। हर 3 दिनों में ताजा माध्यम जोड़ें, क्योंकि यह वाष्पीकरण नुकसान के अधीन हो सकता है।
      नोट: सिस्टम वातानुकूलित मीडिया से जीवित / मृत-सेल विश्लेषण और गतिशील मल्टीप्लेक्स साइटोकिन स्राव प्रोफाइलिंग दोनों के साथ संगत है। केमोकाइन विश्लेषण के लिए, प्रत्येक डिब्बे के दो जलाशयों से मीडिया एकत्र करके सुपरनैटेंट के 200-250 μL तक एलिकोट तक पहुंच योग्य हो सकता है। क्लासिकल एलिसा और ल्यूमिनेक्स साइटोकिन प्रोफाइलिंग परख के लिए लगभग 50 μL सुपरनैटेंट की आवश्यकता होती है। कृपया ओओसी मॉडल पर साइटोकिन प्रोफाइलिंग करने वाली अन्य प्रयोगशालाओं के अध्ययन के ^51,52 उदाहरण देखें।
3. बिना लेबल वाले कैंसर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का समय-चूक अधिग्रहण
   नोट: आमतौर पर, 3 चिप्स को एकल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर व्यवस्थित किया जाता है (2 डी चिप के लिए चित्रा 1 ए और 3 डी चिप के लिए चित्रा 4 बी देखें)। 4 स्लाइड आवंटित करने वाले चरण धारकों का उपयोग करके, प्रयोगात्मक स्थितियों के बड़े बैचों का विश्लेषण करने के लिए स्वचालित उच्च-सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी के लिए सह-संस्कृतियां उपयुक्त हो सकती हैं। चिप्स को उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए 1 मिमी या 170 माइक्रोन (प्लास्टिक या ग्लास कवरलिप्स, 6-वेल ऑप्टिकल बॉटम मल्टी-वेल) के बराबर मोटाई वाली स्लाइड्स पर आसानी से लगाया जा सकता है।
   1. एक इनक्यूबेशन सिस्टम से लैस वीडियो माइक्रोस्कोपी सेटअप के माध्यम से बिना लेबल वाली कोशिकाओं की उज्ज्वल-क्षेत्र छवि श्रृंखला रिकॉर्ड करें।
      नोट: यहां समय-श्रृंखला डेटासेट (समय विंडो: 48 घंटे, फ्रेम दर: 2 मिनट) को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया गया था, जो 4x उद्देश्य और CMOS 1.3M पिक्सेल से लैस था, जिसे मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में फिट करने के लिए अनुकूलित किया गया था।
   2. अधिग्रहण शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप को कम से कम 2 घंटे के लिए गर्म करें ताकि 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂ को बराबर किया जा सके।
   3. ट्यूमर और केंद्रीय डिब्बे के बीच माइक्रोचैनल सरणी को केंद्रित करके अवलोकन की खिड़की का चयन करें। यह प्रतिरक्षा घुसपैठ की गतिशीलता और उस क्षेत्र के भीतर बातचीत की कल्पना करने की अनुमति देता है जिसमें कैंसर कोशिकाओं को बीज दिया जाता है।
   4. कैंसर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रोशनी की तीव्रता और फोकस को समायोजित करें।
   5. टाइम-लैप्स अधिग्रहण शुरू करने के लिए, अध्ययन के तहत प्रयोग और सेल प्रकार के अनुसार फ्रेम दर और समय अवधि का अनुकूलन करें।
      नोट: एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) बनाए रखते हुए अत्यधिक फोटो-एक्सपोज़र से बचने के लिए इमेजिंग स्थितियों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। चूंकि प्रतिरक्षा कोशिकाएं बहुत गतिशील होती हैं, इसलिए ब्याज की गतिशील प्रक्रिया का पालन करने और^{आसान ट्रैकिंग} को सक्षम करने के लिए अधिग्रहण फ्रेम दर पर्याप्त रूप से उच्च होनी चाहिए। ट्रैकिंग एल्गोरिदम, परिणामी डेटासेट के आकार के साथ संगतता, और देखी गई कोशिकाओं की व्यवहार्यता, घनत्व और गतिशीलता के बीच एक समझौता किया जाना चाहिए।
   6. टाइम-लैप्स के अंत में, फ्रेम डेटासेट को 25 एफपीएस अनकंप्रेस्ड वीडियो फ़ाइल में बदलने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर के रूप में छवि अनुक्रम आयात और सहेजें फ़ंक्शन का उपयोग करें।
      नोट: जेनरेट की गई वीडियो फ़ाइल अब सेल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए तैयार है। यहां, आरजीबी (1280x1024 पिक्सेल) छवियों को 1.33 μm / पिक्सेल के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ एकत्र किया गया था। एक एकल क्षेत्र (एफओवी) के 24 घंटे की अवधि की फिल्म (3.5 जीबी स्टैक) में प्रत्येक स्थिति के लिए 720 फ्रेम होते हैं।
4. डेटा विश्लेषण: ट्रैकमेट द्वारा बिना लेबल वाले प्रतिरक्षा पटरियों का अर्ध-स्वचालित निष्कर्षण
   नोट: यहां, ट्रैकमेट का उपयोग करके 2 डी अनलेबल टाइम-लैप्स छवियों में प्रतिरक्षा गतिशीलता विश्लेषण किया जाता है⁵⁴इमेजजे सॉफ्टवेयर बंडल (https://imagej.nih.gov/ij/) में उपलब्ध एक ओपन-सोर्स टूलबॉक्स। स्वचालित एकल-कण ट्रैकिंग करने के लिए कई एल्गोरिदम प्रदान किए जाते हैं⁵⁵स्पॉट जैसी संरचनाओं का (एसपीटी)। उन्हें फ्लोरोसेंट छवियों पर कुशलतासे लागू किया गया है, जहां वस्तुएं उच्च एसएनआर (यानी, उप-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरोसेंट स्पॉट, लेबल ट्रैफ़िक पुटिकाओं, नाभिक) के साथ अंधेरे पृष्ठभूमि पर उज्ज्वल हैं।^{1,25,56,57,58}. एसपीटी मुख्य रूप से दो अनुक्रमिक चरणों पर आधारित है। सबसे पहले, वस्तुओं को कई फ्रेम (विभाजन) में पहचाने गए पदों के साथ स्थानीयकृत किया जाता है, जैसा कि स्कीमाइज़ किया गया हैचित्र 2. दूसरे चरण (कण लिंकिंग) में, पता लगाए गए धब्बे गति का अनुमान लगाने और ट्रैक के आकार में उनके प्रक्षेपपथ का पुनर्निर्माण करने के लिए लगातार फ्रेम पर जुड़े होते हैं ।चित्र 3). संख्यात्मक विशेषताओं की गणना समय के साथ प्रत्येक निकाले गए एक्स, वाई, जेड निर्देशांक सरणी से की जा सकती है। विस्तारित प्रलेखन में रिपोर्ट की गई है⁵⁴साथ ही ऑनलाइन (http://imagej.net/TrackMate), TrackMate ट्यूटोरियल के साथ शुरू करने के बाद। प्रक्रिया की सटीकता का तुरंत निरीक्षण किया जा सकता है, एक सहज ज्ञान युक्त ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (विज़ार्ड-जैसे जीयूआई) को संभालते हुए जो उपयोगकर्ताओं को हर कदम पर, सेटिंग्स को रीडजस्ट करने में सक्षम बनाता है। निम्नलिखित भाग संक्षेप में दर्शाता है कि छवि प्रसंस्करण और परिमाणीकरण चरणों के लिए ट्रैकमेट का उपयोग कैसे करें, दृश्य मान प्रकाश छवियों पर लागू होते हैं:
   1. फिजी टूलबार पर पूर्णकालिक वीडियो / छवि स्टैक को खींचें और छोड़ दें।
   2. अंशांकन स्टैक सेटअप (चित्रा 2 ए)।
      1. आयामीता की जाँच करें और छवि> गुणों का चयन करके छवि गुण असाइन करें। लंबाई, पिक्सेल आयाम और फ़्रेम अंतराल बक्से की इकाई भरें.
         नोट: अंशांकन करने के लिए, माइक्रोचैनलों की ज्ञात लंबाई (500 μm, चित्रा 1C) का उपयोग करें और पिक्सेल में संबंधित मापी गई लंबाई से विभाजित करें। 2 डी टाइम-सीरीज़ के लिए, जेड/टी फ़ील्ड को जेड-स्लाइस और मूवी फ्रेम की सही संख्या के रूप में 1 दर्ज करना सुनिश्चित करें। यदि पूरा नहीं किया जाता है, तो ट्रैकमेट मात्रात्मक आउटपुट और पैरामीटर पिक्सेल इकाइयों और समय सीमा में रिपोर्ट किए जाएंगे।
   3. छवियों का पूर्व प्रसंस्करण।
      1. शोर-शराबे वाली पृष्ठभूमि से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सही भेदभाव को बढ़ाने के लिए, कलाकृतियों की क्षतिपूर्ति के लिए उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों को पूर्व-संसाधित करें। सुनिश्चित करें कि डेटासेट में 8-बिट टीआईएफएफ छवियां (चमक सीमा: 0-255) शामिल हैं।
         नोट: असमान रोशनी, कम एसएनआर, और दृश्य प्रकाश छवियों में छोटे मलबे कण द्वारा संदूषण सेल ट्रैकिंग प्रक्रिया की सफलता से समझौता कर सकता है। यहां, समय-श्रृंखला डेटासेट को पृष्ठभूमि घटाव, चमक / कंट्रास्ट समायोजित फ़ंक्शन और मूल छवियों से गॉसियन ब्लर के स्थानीय छवि घटाव के माध्यम से पूर्व-संसाधित किया जाता है। फेज-कंट्रास्ट या ब्राइट-फील्ड छवियों के प्रसंस्करण और विभाजन के लिए इमेजजे में अन्य अलग-अलग विश्लेषण टूलकिट उपलब्ध हैं, जिनमें अनुभवजन्य ग्रेडिएंट थ्रेशोल्ड (ईजीटी) ⁵⁹ शामिल हैं।
   4. पहला अंशांकन पैनल (चित्रा 2 ए)
      1. छवि स्टैक का चयन करने के साथ, Trackmate (प्लगइन्स>ट्रैकिंग) शुरू करें।  डेटा की आयामीता और अस्थायी विंडो (यानी, पिक्सेल-चौड़ाई और फ्रेम अंतराल) को संशोधित / पुष्टि करें।
         नोट: TrackMate स्वचालित रूप से छवि गुण बॉक्स में पढ़ता है ताकि कैलिब्रेटेड भौतिक इकाइयों (यानी, μm और मिनट) में अंतिम ट्रैकिंग परिणाम दिए जा सकें।
      2. मैन्युअल रूप से मान सम्मिलित करके या सक्रिय छवि पर एक बंद क्षेत्र खींचकर, और फिर स्रोत ताज़ा करें बटन दबाकर, प्रतिरक्षा ट्रैक के निष्कर्षण की गणना करने के लिए रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें। वैश्विक प्रतिरक्षा प्रवास पथ निकालने के लिए, माइक्रोचैनल (केंद्रीय कक्ष, चित्रा 1 ई) के दाईं ओर और बाईं ओर (ट्यूमर कक्ष, चित्रा 1 डी) क्रमशः आयताकार क्षेत्रों का चयन करें। कैंसर और प्रतिरक्षा हॉटस्पॉट के बीच बातचीत का विश्लेषण करने के लिए, आरओआई टूल का उपयोग करके परिपत्र उप-क्षेत्रों को आकर्षित करें (संपादन → चयन → निर्दिष्ट करें) पर जाएं।
         नोट: पहली बार इस टूलबॉक्स को एक नए जैविक अनुप्रयोग पर चलाते समय, पटरियों के पुनर्निर्माण के लिए सेटिंग्स को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक समय व्यतीत करें।
         नोट: सेल प्रक्षेपपथ (लगभग 50-100 कोशिकाओं) की मैन्युअल ट्रैकिंग करें ताकि अनुभवजन्य रूप से सही कॉन्फ़िगरेशन मिल सके और आंदोलनों के स्वचालित निष्कर्षण की विश्वसनीयता को बेंचमार्क के रूप में मान्य किया जा सके। इसके अतिरिक्त, चुने हुए मापदंडों की सटीकता की आसानी से जांच करने के लिए शुरू में एक छोटे से क्षेत्र पर काम करें।
   5. प्रतिरक्षा धब्बों का पता लगाने का चरण (चित्रा 2 बी)
      1. गॉसियन (एलओजी) डिटेक्टर के डिफ़ॉल्ट लैप्लाशियन का चयन करें। एलओजी डिटेक्टर उज्ज्वल, ब्लॉब जैसी, गोल वस्तुओं को खोजने और मध्यवर्ती स्पॉट आकार (व्यास में 5-से-20 पिक्सेल) के लिए ट्यून की गई छवि पर गॉसियन फिल्टर का लैप्लाशियन लगाने के लिए काम करता है।
      2. अनुमानित ब्लॉब व्यास (यहां, 10-13 μm) में अपेक्षित स्पॉट आकार से थोड़ा बड़ा मान दर्ज करें। सीमा बढ़ाएं (यहां 1-3 μm) मान तब तक जब तक कि ऑब्जेक्ट सुविधाओं को हटाए बिना अतिरिक्त नकली पृष्ठभूमि स्पॉट कम न हो जाएं। थ्रेशोल्ड मान से नीचे का पता लगाना (गुणवत्ता मैट्रिक्स के आधार पर) बाद के विश्लेषण से हटा दिया जाएगा। स्पॉट डिटेक्शन की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए माध्य फ़िल्टर और उप-पिक्सेल स्थानीयकरण के लिए बॉक्स चेक करें।
      3. मैजेंटा-रंगीन मंडलियों द्वारा छवियों पर चिह्नित प्रतिरक्षा कोशिकाओं को देखने और जल्दी से निरीक्षण करने के लिए पूर्वावलोकन बटन का उपयोग करें।
         नोट: पहचान के दौरान गलतियों का लिंकिंग प्रक्रिया पर काफी प्रभाव पड़ेगा। अन्य अवांछित पहचानों को उपयोगकर्ता-परिभाषित फिल्टर (यानी, स्पॉट तीव्रता, आकार या स्थिति द्वारा) द्वारा बाद के मेनू में ठीक किया जा सकता है।
   6. एक बार चयन से संतुष्ट होने के बाद, अगला हिट करें।
      नोट: ये सेटिंग्स प्रयोगात्मक सेटअप और अधिग्रहण इमेजिंग तौर-तरीकों (जैसे, एफओवी, उद्देश्य आवर्धन, उज्ज्वल-क्षेत्र या फ्लोरोसेंट छवियां), सेल प्रकार (अनुयायी या फ्लोटिंग कोशिकाएं), धीमी या तेज गतिशीलता, सेलुलर व्यवहार के प्रकार (बातचीत या नहीं) और अवलोकन क्षेत्र में कम / मध्यम / उच्च घनत्व के आधार पर भिन्न हो सकती हैं।
   7. आगे बढ़ें और प्रारंभिक थ्रेशोल्डिंग मेनू छोड़ दें। हाइपरस्टैक डिस्प्लेर विंडो का चयन करें।
   8. स्पॉट पैनल पर फ़िल्टर सेट करें (चित्रा 2 सी)।
      1. चयन करें: समान रंग. फ़िल्टर, जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है, को फीचर मानों के साथ लेबल किए गए स्पॉट को बनाए रखने के लिए जोड़ा जा सकता है, जो हिस्टोग्राम में प्रदर्शित होता है, एक प्रतिवर्ती सीमा के ऊपर या नीचे।
   9. ट्रैकर चयन चरण (चित्रा 3 ए)। सरल एलएपी ट्रैकर चुनें, कण लिंकिंग एल्गोरिदम के रूप में तीन फ़ील्ड भरने के लिए कहता है (इस मामले में, "अधिकतम दूरी जोड़ना": 30-50 μm, "गैप-क्लोजिंग अधिकतम दूरी": 25-50 μm, "गैप-क्लोजिंग मैक्स फ्रेम गैप": 4-6)। यह डिटेक्टर गैप-क्लोजिंग घटनाओं का प्रबंधन करता है, जिसमें लागत लिंकिंग गणना केवल उनकी संबंधित दूरी के आधार पर होती है।
      नोट: अधिकतम अनुमत लिंकिंग दूरी उम्मीदवार मिलान स्पॉट के लिए स्थानिक खोज सीमा को सीमित करती है, जो दो बाद के फ्रेम (चित्रा 3 डी) के बीच यात्रा की गई अधिकतम अनुमत विस्थापन के अनुरूप है।
      1. अधिकतम विस्थापन के बड़े मूल्य प्रदान करें जब अत्यधिक मोटिव कणों के पटरियों का विखंडन देखा जाता है।
         नोट: यदि फ्रेम-टू-फ्रेम आंदोलन दिए गए अधिकतम दूरी मान से बड़ा है तो दो लिंक कनेक्ट नहीं होंगे। यदि खंड दो अलग-अलग कोशिकाओं को बुरी तरह से पुल करते हैं, तो अधिकतम विस्थापन के मूल्य को कम करें।
      2. लापता स्थानों को फिर से जोड़ने का प्रयास करें, "अंतराल समापन के लिए अधिकतम दूरी" और "अधिकतम फ्रेम गैप" के मूल्यों को बदलते हैं।
         नोट: ये पैरामीटर गैर-आसन्न फ्रेम में गैप-क्लोजिंग घटनाओं से निपटते हैं। स्पॉट गायब होना कुछ फ्रेम के लिए हो सकता है (यानी, फोकस कणों से बाहर, कोशिकाओं को छोड़ दिया जाता है और एफओवी में, शोर छवि में विभाजन विफलताएं)।
         नोट: विभाजन या विलय घटनाओं को संभालने के लिए, डिटेक्टर के रूप में एलएपी लिंकर का चयन करें जो लिंकिंग लागत मैट्रिक्स दंड का परिचय देता है।
   10. ट्रैकिंग गणना चलाने के लिए अगला क्लिक करें. अगला दबाएँ.
   11. फ़िल्टरिंग ट्रैक पैनल (चित्रा 3 बी)। ड्रॉप-डाउन मेनू, "ट्रैक आईडी" या अन्य ट्रैक सुविधाओं से चयन करने वाले प्रतिरक्षा पथों का रंग बदलें। इस बिंदु पर, परिणाम की गुणवत्ता में सुधार करने और प्रक्रिया को फिर से देखने के लिए, इंटरैक्टिव फिल्टर को कार्यात्मक सेट करने के लिए वैकल्पिक रूप से चुनें।
       नोट: नकली धब्बे छवि में शोर और फीचर गुणवत्ता के नुकसान से उत्पन्न होते हैं। यह छोटे खंड उत्पन्न करेगा जबकि रुचि की कोशिकाओं को कई फ्रेम पर ट्रैक किया जा सकता है।
       1. छोटे पथों को हटाने के लिए, उनमें मौजूद धब्बों की संख्या के आधार पर फ़िल्टर करने का प्रयास करें. इसके अतिरिक्त, ट्रैक विस्थापन, ट्रैक अवधि या न्यूनतम / माध्य / अधिकतमवेग जैसे विकल्पों के संयोजन का उपयोग करके ट्रैक को क्रमबद्ध करें ताकि गलत या अवांछित ट्रैक (समय-चूक की समग्र अवधि के संबंध में कम फ्रेम के साथ या गंदे या नहीं चलने वाले कणों को शामिल किया जा सके) को आगे के पोस्ट-प्रोसेसिंग से बाहर रखा जा सके।
          नोट: फ़िल्टर की पसंद विशिष्ट अनुप्रयोग और जैविक प्रणाली के आधार पर भिन्न हो सकती है।
   12. प्रदर्शन विकल्प इंटरफ़ेस में सभी ट्रैक्स की जाँच करें, समय के माध्यम से स्क्रॉल करें, और सत्यापित करें कि सटीक ट्रैक सेल माइग्रेशन पथों से कैसे मेल खाते हैं। ड्रॉप-डाउन मेनू कई तौर-तरीकों (जैसे, गतिज पैरामीटर, तीव्रता, अस्थायी या स्थानिक स्थिति) द्वारा आसान विज़ुअलाइज़ेशन और फ़िल्टरिंग के लिए स्पॉट और पथ के लिए रंग कोड प्रदान करता है।
       नोट: उच्च घनत्व वाली संस्कृतियों, या उच्च-मोटिव कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए, अधिग्रहण फ्रेम दर को बढ़ाएं जो लगातार समय अंतराल में यात्रा किए गए सेल विस्थापन को कम करता है।
   13. विभाजन और लिंकिंग गलतियों का मैन्युअल सुधार (चित्रा 3 ई)।
       1. परिणामों की गुणवत्ता को और बढ़ाने के लिए, मैन्युअल रूप से धब्बे (मलबे के कण, स्थिर कोशिकाएं) संपादित करें और ट्यूमर-प्रतिरक्षा इंटरैक्शन आरओआई का विश्लेषण करते समय पता लगाए गए ट्यूमर सीमाओं से प्राप्त गलत ट्रैक को हटा दें।
       2. सबसे पहले, ImageJ उपकरण पट्टी में TrackMate उपकरण का चयन करें। पूरे स्टैक में एक मौजूदा स्थान को समाप्त करने के लिए, माउस कर्सर द्वारा लक्ष्य स्थान (हरे सर्कल में संपादित) पर एक आरओआई मास्क दबाएं और फिर डीईएल कुंजी दबाएं।
       3. एक नया स्थान जोड़ने के लिए (धब्बे गायब होने के कारण पटरियों के गायब होने के मामले में) ए कुंजी दबाएं, माउस को नुकीले स्थान पर रखें। इस चरण के बाद ट्रैक-लिंकिंग गणना प्रक्रिया दोहराएं।
   14. संतुष्ट होने पर, तीन पाठ फ़ाइलें (चित्रा 3 सी और 3 एफ) उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शन विकल्प पैनल में विश्लेषण का चयन करें। "ट्रैक स्टैटिस्टिक्स में स्पॉट" में तालिका प्रतिरक्षा धब्बों (संबंधित फ्रेम और ट्रैक नंबर के साथ लेबल की गई कोशिकाओं की एक्स-वाई-जेड स्थिति) के स्थानिक निर्देशांक प्रदान करती है। "ट्रैक स्टैटिस्टिक्स में लिंक" और "ट्रैक स्टैटिस्टिक्स" में पटरियों के सापेक्ष जानकारी होती है: ट्रैक अवधि, पता लगाए गए अंतराल या स्पॉट की संख्या, प्रारंभिक और स्टॉप-फ्रेम ट्रैक करना आदि। प्रत्येक डेटासेट के लिए सहेजें और निर्यात करें.
       नोट: परिणाम विंडो के भीतर एक पंक्ति पर क्लिक करते समय, दृश्य निरीक्षण के लिए टाइम-लैप्स वीडियो के भीतर संबंधित स्थान, लिंक या ट्रैक सक्रिय हो जाता है। ट्रैक का चयन/निकालने के लिए फ़िल्टरिंग चरणों को दोहराएँ. भविष्य में निर्यात किए गए सभी डेटा को अपडेट किया जाएगा। टिप: प्रारंभिक और स्टॉप-फ्रेम ट्रैक करें और इंटरैक्शन के आरओआई को संसाधित करते समय कैंसर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच संपर्क के समय की गणना करने के लिए ट्रैक अवधि मूल्यों का उपयोग किया जा सकता है।
   15. परिणामी XML फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए सहेजें बटन दबाएँ जिसमें सभी पैरामीटर मान, छवियों का पथ और समय में स्थिति को स्पॉट करें. 'लोड ट्रैकमेट फ़ाइल' कमांड (प्लगइन्स> ट्रैकिंग) प्रत्येक मूवी फ़ाइल के लिए व्यक्तिगत रूप से पूरी प्रक्रिया सत्र को पुनर्स्थापित करता है।
   16. जीयूआई के अंतिम पैनल पर जाएं जिसे एक कार्रवाई का चयन करें कहा जाता है। सूची में, कैप्चरओवरले > निष्पादित फ़ंक्शन का उपयोग करके ट्रैक के साथ एक वीडियो का निर्माण करें। टिप: "प्लॉट एन-स्पॉट बनाम समय" विकल्प का उपयोग आरओआई (चित्रा 6 बी, दाएं पैनल) में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानिक घनत्व की गणना करने के लिए किया जा सकता है।
   17. पोस्ट-प्रोसेसिंग विश्लेषण और माइग्रेशन के आंकड़े
       1. प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन व्यवहार (उदाहरण के लिए, निर्देशित या स्थिर गति 30) को वर्गीकृत करने के लिए व्यापक गतिज मापदंडों²⁹ (यानी, कुल प्रक्षेपवक्र लंबाई, यूक्लिडियन दूरी, कारावास अनुपात, माध्य-वर्ग विस्थापन⁵⁶, औसत या तात्कालिक ट्रैक वेग, गिरफ्तारी गुणांक, माइग्रेशन के^{कोणों} का वितरण, फॉरवर्ड माइग्रेशन इंडेक्स, माध्य सीधी रेखा गति) की गणना करने के लिए ट्रैकमेट या निर्यात डेटा में सीधे कच्चे स्थितिगत डेटा का विश्लेषण करें^{। 31}) और लक्षित कैंसर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया (उदाहरण के लिए, इलाज बनाम नियंत्रण)।
          नोट: अतिरिक्त उपयोगी प्लगइन्स जैसे कि केमोटैक्सिस और माइग्रेशन टूल (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) विभिन्न ग्राफ़ (जैसे, रोज़ या सेक्टर प्लॉट, जैसे चित्रा 6 में चित्रित) और उन्नत विश्लेषण और प्रयोगात्मक माइग्रेशन और केमोटैक्सिस डेटा के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए सांख्यिकीय परीक्षण प्रदान करते हैं। सेल ट्रैकिंग और सेल विभाजन एल्गोरिदम ^24,25,45 के संयोजन से एकल-सेल स्तर (यानी, सेल सतह क्षेत्र, प्रमुख और मामूली अक्ष लंबाई और सेल पहलू अनुपात) पर रूपात्मक मैट्रिक्स के माप को सक्षम किया जा सकता है।

2. एक प्रतिस्पर्धी परख में 3 डी इम्यूनो-सक्षम कैंसर ऑन-चिप मॉडल

नोट:चित्रा 4 में दर्शाए गए 3 डी चिप डिजाइन में  5 प्रमुख डिब्बे शामिल हैं: फ्लोटिंग प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सेवन के लिए एक केंद्रीय, हाइड्रोगेल मैट्रिसेस (150-250 किमी उच्च) में ट्यूमर कोशिकाओं को एम्बेड करने के लिए दो साइड क्षेत्र, और मीडिया छिड़काव कक्ष। प्रतिरक्षा और ट्यूमर कक्ष माइक्रोचैनलों के संकीर्ण सरणियों के दो सेटों से जुड़े होते हैं (200×12×10 μm³, L×W×H, चित्रा 4E)। नियमित रूप से 100 μm-spaceed ट्रेपोज़ॉइडल आइसोसेले माइक्रोपिलर (प्रत्येक साइड जेल क्षेत्र के लिए लगभग 25-30 इंटरफेस, चित्रा 4C) इंजेक्शन के दौरान जेल समाधान को सीमित करने के लिए बाधाओं के रूप में काम करते हैं जो सतह तनाव और केशिका^{बलों 60,61} के बीच संतुलन का फायदा उठाते हैं और ट्यूमर क्षेत्रों को जेल-तरल इंटरफ़ेस सेट करने के लिए दो पार्श्व अतिरिक्त मीडिया कक्षों से जोड़ते हैं (चित्रा 5)। 3 डी प्रतिस्पर्धी परख की विस्तृत विशेषताओं को चित्रा 4 में दिखाया गया है। विभिन्न उपचारों से गुजरने वाले ट्यूमर कोशिकाओं की मेजबानी करने वाले दो हाइड्रोगेल डिब्बों की ओर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अधिमान्य प्रवास की निगरानी और मात्रा निर्धारित की जा सकती है। विशेष प्रतिस्पर्धी लेआउट को विभिन्न कैंसर जीव विज्ञान फेनोटाइप्स (जैसे, दवा प्रतिरोधी बनाम आक्रामक, प्राथमिक या मेटास्टैटिक, उत्तरदाताओं बनाम गैर-उत्तरदाताओं) की अधिकता की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, जेल एम्बेडेड क्षेत्रों को आसानी से विभिन्न सेल आबादी के साथ एकीकृत किया जा सकता है, जिसमें स्ट्रोमल घटक (फाइब्रोब्लास्ट, एंडोथेलियल कोशिकाएं) ²³ शामिल हैं या दवा प्रतिरोध और ट्यूमर चोरी के विच्छेदन तंत्र के लिए विशिष्ट इम्यूनोसप्रेसिव परिवेश³⁴ (जैसे, मैक्रोफेज) का अनुकरण करने के लिए।
मृत परख (जैसे, थर्मो फिशर साइंटिफिक, इनक्यूसाइट अभिकर्मकों) के लिए वाणिज्यिक किट का उपयोग करके परमाणु और सक्रिय कैसपेज़ धुंधलापन, माइटोटिक या एपोप्टोटिक मृत्यु की घटनाओं का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसा कि गुयेन एट अल ^.33 में बताया गया है।

1. डिवाइस में कोशिकाओं और लोडिंग के साथ मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
   नोट: निम्नलिखित प्रयोगात्मक सेटिंग में, दो जेल क्षेत्रों में मानव ए 375 एम मेलेनोमा सेल लाइनों का मिश्रण होता है, जो मैट्रिक्स समाधान (जैसे, मैट्रिगेल) में उगाया जाता है, जो मोनोथेरेपी के रूप में या संयोजन में उपयोग किए जाने वाले चिकित्सीय एजेंटों के संपर्क में आता है। इस सेटिंग ने हमें प्रतिस्पर्धी तरीके से एकल दवाओं के संबंध में दो दवाओं के संयोजन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने और पीबीएमसी को आकर्षित करने की उनकी क्षमता को निर्धारित करने की अनुमति दी।
   1. प्रयोग से एक दिन पहले 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में बर्फ पर रखकर मैट्रिक्स समाधान (जैसे, मैट्रिगेल) के एक स्टॉक को डीफ्रॉस्ट करें।
      नोट: उत्पाद को कई फ्रीज-पिघलना चक्रों में उजागर न करें क्योंकि यह "झुरमुट" बन जाता है। अन्य सिंथेटिक या प्राकृतिक हाइड्रोगेल प्रोटोकॉल इस सेटिंग में उपयोग करने के लिए उपयुक्त हो सकते हैं। कोलेजन मैट्रिसेस ^{में कैंसर} कोशिकाओं की तैयारी के लिए कृपया ^33,34,35 देखें।
   2. ए 375 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, मैट्रिक्स समाधान (2 मिलीग्राम एमएल ^-1) में लाइव-संगत पीकेएच 67 ग्रीन फ्लोरोसेंट सेल लिंकर के साथ सना हुआ। जहां संकेत दिया गया है, उचित खुराक³² पर 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC; 2.5 μM), जिसे DAC, और / या IFN-a2b के रूप में संदर्भित किया जाता है, जोड़ें।
      नोट: मैट्रिक्स बोतल स्पेक शीट पर लॉट # का मिलान करें। एकाग्रता के आधार पर 2 मिलीग्राम एमएल ^-1 तक बनाने के लिए आवश्यक माध्यम की मात्रा की गणना करें कृपया अपनी रुचि के आवेदन के अनुसार इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता और कैंसर सेल निलंबन एकाग्रता को समायोजित करें।
   3. बुलबुले की पीढ़ी से बचने के लिए पिपेट को सावधानी से ऊपर और नीचे करें। किसी भी अवांछित पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए मिश्रण करते समय माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को बर्फ पर रखें।
   4. नसबंदी के बाद, सेल लोडिंग की पूरी प्रक्रिया के दौरान मैट्रिक्स समाधान जमने से बचने के लिए उपकरणों को बर्फ पर रखें (बर्फ की बाल्टी और ढक्कन का उपयोग करके)।
   5. धीरे-धीरे दो आईएफएन और डीएसी / आईएफएन मैट्रिगेल / ट्यूमर सेल मिश्रण (2-4 μL) को क्रमशः बाएं और दाएं जेल पोर्ट में इंजेक्ट करें, कोल्ड टिप्स का उपयोग करके 10-μL माइक्रोपिपेट के साथ (चित्रा 5 ए)। मैट्रिक्स समाधान को एक तरफ से धक्का देने के लिए कोमल दबाव लागू करें जब तक कि विपरीत तक न पहुंच जाए।
      नोट: आसन्न चैनलों में अतिप्रवाह से बचने के लिए मैट्रिक्स समाधान की मात्रा को चुना गया था। समाधान को मीडिया और केंद्रीय चैनलों में लीक होने से रोकने के लिए अत्यधिक पाइपलाइन दबाव न डालें। यदि लोडिंग के दौरान जेल पथ चैनल के साथ अवरुद्ध है, तो जेल के मोर्चों के मिलने तक दूसरे इनलेट से समाधान डालने का प्रयास करें। इनलेट्स से माइक्रोपिपेट को हटाते समय, प्लंजर को पकड़ें, अन्यथा नकारात्मक दबाव मैट्रिक्स समाधान को एस्पिरेट करेगा।
   6. डिवाइस को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂ पर सीधी स्थिति में इनक्यूबेटर में रखें ताकि मैट्रिक्स समाधान का गेलेशन हो सके (चित्रा 5 बी)। जेल चैनल से रिसाव को रोकने के लिए एम्बेडेड अनपॉलीमराइज्ड जेल के साथ देखभाल चिप्स के साथ संभालें।
   7. इस बीच, पीकेएच 67-लेबल वाले पीबीएमसी (1x10⁶ कोशिकाओं) को पूर्ण डीएमईएम (डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम) के 10 μL में पुन: निलंबित करें।
   8. मैट्रिक्स गेलेशन के बाद, चिप्स में जेल को सूखने से रोकने के लिए सभी छह जलाशयों में कल्चर माध्यम के एक ही एलिकोट के साथ मीडिया चैनलों को (50-100 μL) भरें। प्रतिरक्षा कोशिका निलंबन सीडिंग तक इनक्यूबेटर में रखें।
      नोट: एक माइक्रोस्कोप के तहत जेल में ट्यूमर कोशिकाओं के सही और सजातीय वितरण और बहुलक जेल बाधाओं की अखंडता की जांच करें। आंशिक रूप से या समान गेल्ड क्षेत्र या मिश्रण में बुलबुले दबाव प्रारंभिक उतार-चढ़ाव के कारण प्रयोग के शुरुआती बिंदु पर जेल मीडिया चैनलों में पीबीएमसी के समय से पहले प्रवाह का कारण बनते हैं।
   9. छह कुओं से एस्पिरेटेड मीडिया और मध्यम दबाव पीबीएमसी सेल निलंबन के साथ धीरे से इंजेक्ट करने के लिए एक मीडिया चैनल के इनलेट के पास नोक को रखें। लोडिंग अस्थायी अनुक्रम चित्रा 5 सी में दर्शाया गया है:
      1. ऊपरी केंद्रीय कुएं में 10 μL माध्यम में PBMC।
      2. पार्श्व चैनलों के चार कुओं में से प्रत्येक में 50-100 μL माध्यम।
      3. ऊपरी मध्य कुएं में 40-90 μL माध्यम।
      4. निचले केंद्रीय कुएं में 50-100 μL माध्यम।
   10. माइक्रोस्कोप के तहत सुनिश्चित करें कि लोडिंग चरण के बाद पीबीएमसी वितरण केंद्रीय कक्ष में सीमित रहता है। (चित्र 7ए)।
       नोट: यदि यह इष्टतम नहीं है, तो यदि आवश्यक हो तो एकाग्रता को समायोजित करें और प्राचीन चिप्स का उपयोग करके सीडिंग चरणों को दोहराएं। नियोजित प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए मात्रा की गणना करते समय, संभावित त्रुटियों और समायोजन को ध्यान में रखते हुए चिप्स की अतिरिक्त संख्या (15-20%) देखें। वॉल्यूम और सांद्रता को विशिष्ट अनुप्रयोग के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
   11. बाद में फ्लोरेसेंस इमेजिंग अधिग्रहण के लिए इनक्यूबेटर में एक स्तर की सतह पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ₂ पर इकट्ठे उपकरणों को रखें। प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लोड करने के बाद देखभाल चिप्स के साथ संभालें जो तैर रहे हैं।
       नोट: हर 2-3 दिनों में मीडिया को बदलकर जलाशयों में मात्रा के बाष्पीकरणीय नुकसान की भरपाई करें। केमोकाइन प्रोफाइलिंग के लिए, कल्चर डिब्बों के दो कुओं में से प्रत्येक से 100 μL तक एस्पिरेटेड किया जा सकता है, कृपया चरण 1 में चरण 2.7 देखें।
2. ImageJ में एकल-चैनल फ्लोरोसेंट छवियों में भर्ती पीबीएमसी की स्वचालित गिनती
   नोट: कॉन्फोकल उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के शास्त्रीय तरीकों को एंडपॉइंट माप के रूप में ऑन-चिप संचालन पर लागू किया जा सकता है। मूल धुंधला प्रक्रिया में सेल ऑन-चिप निर्धारण, परमेबिलाइजेशन, ब्लॉकिंग, एंटीबॉडी बाइंडिंग, बीच में धोने के चरणों के साथ नाभिक का धुंधला होना शामिल है। एम्बेडेड कैंसर माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ 3 डी जैल क्षेत्रों में घुसपैठ की गई अनलेबल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को वांछित समय-बिंदुओं पर तय किया जा सकता है और सक्रियण / थकावट / परिपक्वता के अभिव्यक्ति मार्करों के लिए दाग दिया जा सकता है (उदाहरण के लिए, सीडी 8 कोशिकाओं के लिए, सीडी 69, सीडी 95, पीडी 1, टीआईएम 3 मार्करों की निगरानी)। पार्लाटो एट अल में।³⁵एसडब्ल्यू 620 एपोप्टोटिक कोशिकाओं के फागोसाइटोसिस का मूल्यांकन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा किया गया था, जिसमें 170 μm-मोटी कवरलिप्स पर लगाए गए उपकरणों का उपयोग किया गया था। आईएफएन-डीसी को ऑन-चिप एंटी-ह्यूमन एचएलए-डीआर-एफआईटीसी एबी एलिकोट्स को जोड़कर दाग दिया गया था।
   प्रतिस्पर्धी संकेतों के साथ चुनौती दी गई घुसपैठ फ्लोरोसेंटली दाग वाली जीवित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सीमा की गणना करने के लिए, एक सामान्य छवि विश्लेषण वर्कफ़्लो निम्नानुसार सेट किया गया है (चित्र 7D-G):
   1. विशिष्ट समय पर, चरण कंट्रास्ट, और लाल / हरे चैनल फ्लोरेसेंस माइक्रोफोटोग्राफ प्राप्त करें, जिसमें ट्यूमर कोशिकाएं क्रमशः एकल या औषधीय शासन के संयोजन के संपर्क में आती हैं।
      नोट: यहां छवियों को सेल लोडिंग (0 घंटे) के बाद, 48 घंटे के बाद और इनक्यूबेशन के 72 घंटे के बाद ईवीओएस-एफएल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप द्वारा कैप्चर किया गया था (चित्रा 7 ए-बी)। केंद्रीय कक्ष, माइक्रोचैनल सरणियों और ए 375 प्लस आईएफएन और ए 375 प्लस डीएसी / आईएफएन वाले दो अलग-अलग साइड चैनलों को प्राप्त करने के लिए एक 4x-10x आवर्धन का उपयोग किया गया था।
      1. अधिग्रहण संचालन करते समय, गणना की जाने वाली विशेषताओं की संतृप्ति को मापने और उससे बचने के लिए मापदंडों पर विचार करें। इष्टतम विभाजन परिणाम अधिग्रहित छवियों की प्रकृति पर निर्भर करते हैं, जैविक नमूनों में परिवर्तनशीलता, धुंधला होने की गुणवत्ता और उपयोगकर्ता-उन्मुख अनुप्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली माइक्रोस्कोपी तकनीकों के कारण।
   2. फिजी में फ्लोरेसेंस सिंगल-चैनल डेटा लोड करें (इस मामले में लाल = पीबीएमसी), इसे मुख्य विंडो (चित्रा 7 डी) में खींचकर। अंतिम विभाजन तक प्री-प्रोसेसिंग फिल्टर के चयन के दौरान कच्चे डेटा को ओवरराइटिंग से बचने के लिए छवि को डुप्लिकेट करें।
      1. यदि छवि एक रंगीन छवि (RGB) है, तो ग्रेस्केल में परिवर्तित करने के लिए छवि > टाइप 8 या 16-बिट दबाएं। जाँचें कि > विकल्प संपादित करें > रूपांतरण कनवर्ट करते समय स्केल करने के लिए सेट है.
   3. शोर और कलाकृतियों की सफाई के माध्यम से कच्चे डेटा को प्रीप्रोसेसिंग करना।
      1. तीव्रता की बड़ी स्थानिक विविधताओं के साथ असमान शोर पृष्ठभूमि को सही करने के लिए रोलिंग बॉल एल्गोरिदम लागू करके प्रक्रिया > घटाएं पृष्ठभूमि मेनू पर जाएं। त्रिज्या को कम से कम सबसे बड़े अग्रभूमि कण के आकार में सेट करें। इष्टतम परिणाम देने के लिए परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के लिए पूर्वावलोकन बॉक्स चुनें। बहुत छोटे मान गलत तरीके से रुचि की संरचनाओं को हटा सकते हैं।
      2. ब्राइटनेस एंड कंट्रास्ट कमांड में हिस्टोग्राम में तीव्रता की सीमा को बदलने के लिए न्यूनतम / अधिकतम स्लाइडर्स खींचें। वॉश-आउट सुविधाओं के बिना, चमक बढ़ाने के लिए अधिकतम स्लाइडर को बाईं ओर स्थानांतरित करें। पृष्ठभूमि में कम दिखाई देने वाली विशेषताओं के गायब होने से बचने के लिए छवि के विपरीत को बढ़ाने के लिए न्यूनतम स्लाइड को दाईं ओर ले जाएं। परिवर्तनों को ठीक करने के लिए लागू करें क्लिक करें.
   4. छवि वृद्धि.
      1. प्रोसेस > फिल्टर पर जाएं और छवियों पर मेडियन, गॉसियन फिल्टर के साथ प्रयोग करें (चित्रा 7 ई)।
         नोट: पूर्व-फ़िल्टरिंग त्रिज्या को छवि शोर पिक्सेल के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। नमक और काली मिर्च के शोर को कम करने के लिए, गैर-रैखिक मेडियन फिल्टर पड़ोसियों के औसत मूल्य के साथ पिक्सेल मूल्य को बदल देता है। "गॉसियन ब्लर" का उपयोग पिक्सेल को आसपास के पिक्सेल के भारित औसत के साथ बदलकर, डिजिटल तस्वीर को चिकना करने के लिए किया जाता है। वजन गॉसियन संभाव्यता वितरण से आते हैं, इसलिए निकटतम पिक्सेल अधिक प्रभावशाली होते हैं।
      2. कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए वैकल्पिक रूप से गणित > > गामा > प्रक्रिया करें।
         नोट: बी एंड सी पैनल में निर्धारित तीव्रता को दो मिनट और अधिकतम सीमाओं के बीच स्केल किया जाता है। मान < 1.0 कम तीव्रता के बीच अंतर को बढ़ाते हैं जबकि 1.0 > मान उच्च तीव्रता के बीच अंतर को बढ़ाते हैं। गामा सुधार एक डिस्प्ले रेंज खोजने के लिए कार्यात्मक है, जो सबसे चमकीले को संतृप्त किए बिना सबसे मंद वस्तुओं को दिखाता है।
   5. एक द्विआधारी छवि मुखौटा का निर्माण।
      1. छवि पर जाएँ > > सीमा समायोजित करें. थ्रेसहोल्ड निर्धारित करने के लिए सबसे सरल नियोजित विधि तीव्रता के स्तर के हिस्टोग्राम विश्लेषण पर निर्भर करती है, जैसा कि चित्रा 7 एफ में दिखाया गया है। ड्रॉप-मेनू में, विभिन्न वैश्विक थ्रेशोल्डिंग विधियों के साथ खेलें (हमारे मामले में, ओत्सु लागू होता है)।
      2. मैन्युअल रूप से हिस्टोग्राम पैनलों में पिक्सेल तीव्रता की एक ज्ञात श्रृंखला को स्क्रॉल या टाइप करें, छवि को ओवरले करने वाले लाल पैटर्न के परिवर्तन का निरीक्षण करें जो ज्यादातर वास्तविक सेल क्षेत्र जैसा दिखता है। रीसेट बटन ओवरले को हटा देता है। संतुष्ट होने के बाद, छवि का द्विआधारी संस्करण उत्पन्न करने के लिए लागू करें पर क्लिक करें। द्विआधारी > विकल्पों > प्रक्रिया की जांच करें ताकि यह नियंत्रित किया जा सके कि थ्रेशोल्ड छवियां कैसे प्रदर्शित की जाती हैं और कण विश्लेषक द्वारा वस्तुओं की पहचान कैसे की जाती है।
   6. दहलीज के दौरान आंशिक रूप से अतिव्यापी या विलय को विभाजित करने के लिए मेनू कमांड प्रक्रिया / बाइनरी / वाटरशेड कणों का उपयोग करें। वाटरशेड अक्सर 1-पिक्सेल मोटी रेखा जोड़कर उन्हें सटीक रूप से काट सकता है। पिक्सेल को नीचे या अधिक संतृप्त पिक्सेल से बढ़ाने या हटाने के लिए पतला या इरोड ऑपरेशन जैसे रूपात्मक संचालन करें।
      नोट: अधिक जानकारी के लिए मेनू कमांड अनुभाग देखें या द्विआधारी डेटा को संसाधित करने के लिए गणितीय आकृति विज्ञान पर आधारित एक एकीकृत पुस्तकालय मोर्फोलिबजे देखें।
   7. मात्रात्मक छवि सुविधा विवरण.
      1. एक बार संतोषजनक वस्तु पहचान प्राप्त करने के बाद, कणों का विश्लेषण > विश्लेषण से कण विश्लेषक खोलें। कणों को उनके आकार और परिपत्रता से बाहर रखा जा सकता है, पिक्सेल में या माप की कैलिब्रेटेड इकाई में व्यक्त किया जा सकता है (छवि > गुणों के तहत माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के सापेक्ष सही पैमाने की जांच करें)। सब कुछ शामिल करने के लिए, 0-इन्फिनिटी और सर्कुलरिटी डिफॉल्ट रेंज के डिफ़ॉल्ट को 0.00 - 1.00 (0 = सीधी रेखा, 1 = सही सर्कल) पर रखें।
      2. छोटे "शोर" पिक्सेल या रुचि नहीं की विशेषताओं को फ़िल्टर करने के लिए, न्यूनतम और अधिकतम सीमा सेट करें। विंडो फ़ील्ड में छेद, दिखाएँ, रूपरेखा और प्रदर्शन परिणाम विकल्प शामिल करें. किनारों पर बाहर छवि की सीमाओं पर पाए गए कणों को छोड़ देगा। प्रबंधक में जोड़ें कण की स्थिति की जानकारी को ध्यान में रखते हुए आगे के विश्लेषण के लिए आरओआई प्रबंधक को प्राप्त चयन जोड़ता है।
         नोट: "आरओआई प्रबंधक" में, स्वचालित विभाजन रिकॉर्ड किए गए आउटपुट (मर्ज स्प्लिट सेल, स्प्लिट मर्ज सेल) को सही करना संभव है। फिजी टूलबार में चयन उपकरणों का उपयोग करके, दोनों जेल क्षेत्रों के अंदर आरओआई का चयन करें जहां प्रतिरक्षा घुसपैठ का अनुमान लगाने के लिए कैंसर कोशिकाएं एम्बेडेड हैं।
   8. जैसा कि चित्र 7 जी में दिखाया गया है, सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए प्राप्त मूल्यों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें। "परिणाम" पहचाने गए क्रमांकित उल्लिखित कण गुणों के सापेक्ष एक डेटा तालिका सूचीबद्ध करता है। "संक्षेप में" छवि के नाम, कुल गणना और पूरी छवि के लिए अन्य जानकारी के साथ एक विंडो खोलता है।
      1. मापदंडों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल करने के लिए विश्लेषण > सेट माप पर जाएं।
   9. प्रोसेसिंग वर्कफ़्लो को स्वचालित करने और बड़े डेटासेट पर समय विश्लेषण सहेजने के लिए वैकल्पिक रूप से मैक्रो रिकॉर्ड करें (प्लगइन्स > मैक्रोज़ > रिकॉर्ड करके)।
      1. 3^{डी क्षेत्रों} में ट्यूमर कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए एक ही क्षेत्रों में हरे प्रतिदीप्ति चैनल का विश्लेषण करने के लिए एक ही प्रसंस्करण दिनचर्या का उपयोग करें

Representative Results

ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ मेजबान एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रिया का एक पैरामीटर है। ट्यूमर ल्यूकोसाइट्स में घुसपैठ करने की संरचना, घनत्व, स्थान और कार्यात्मक स्थिति में विषम हैं जो कैंसर कोशिकाओं के साथ बातचीत रोग पाठ्यक्रम और चिकित्सा की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक जानकारी को रेखांकित कर सकती है। इस अर्थ में, माइक्रोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों का उपयोग ट्यूमर के प्रतिरक्षा संदर्भ का पता लगाने के साथ-साथ एंटीकैंसर थेरेपी की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए पूरक और विशेषाधिकार प्राप्त इन विट्रो टूल के रूप में किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक परख, लाइव-सेल इमेजिंग और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का युग्मन विश्वसनीय परिमाणीकरण विधियों को स्थापित कर सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि प्रतिरक्षा कोशिकाएं विभिन्न संदर्भों में अपने माइग्रेशन पैटर्न को कैसे समायोजित करती हैं। इस अध्याय में, हमने मानक सॉफ्ट-लिथोग्राफिक प्रक्रियाओं द्वारा महसूस किए गए तदर्थ माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में प्रतिरक्षा और लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं की बहुमुखी 2 डी या 3 डी सह-संस्कृतियों की स्थापना के लिए कदमों की सूचना दी है। धारा 1 में माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को अनुयायियों (एमडीए-एमबी -231 कैंसर कोशिकाओं) और गैर-अनुयायी (पीबीएमसी) आबादी के बीच रासायनिक और भौतिक संपर्कों की अनुमति देने के लिए नियोजित किया गया था। कुछ कीमोथेरेपी एजेंट (उदाहरण के लिए, दूसरों के बीच एंथ्रासाइक्लिन) घातक कोशिकाओं के "इम्युनोजेनिक" एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकते हैं, इस प्रकार इम्यूनोसक्षम मेजबानों में उनकी दृश्यता को बढ़ा सकते हैं। कैंसर इम्युनोजेनिक सेल डेथ (आईसीडी) प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए अलार्मिन के रूप में काम करने वाली मरने वाली कोशिकाओं द्वारा वितरित झिल्ली-बाध्य और घुलनशील संकेतों की रिहाई की विशेषता है। आईसीडी प्रतिक्रिया का मात्रात्मक सत्यापन प्रदान करने के लिए, हम माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म में एकत्र किए गए डेटा को नियोजित करते हैं जहां ल्यूकोसाइट्स अपने लक्ष्य कोशिकाओं की ओर उपयुक्त रूप से निर्मित माइक्रोचैनल पुलों के माध्यम से आगे बढ़ सकते हैं। स्वस्थ दाताओं (डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार) से पीबीएमसी को सह-लोड करने के बाद टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग की गई, जिसमें मानव एमडीए-एमबी -231 स्तन कैंसर कोशिकाओं का एंथ्रासाइक्लिन डीओएक्सओ के साथ पूर्व-उपचार किया गया या नहीं। माइक्रोफोटोग्राफ हर 2 मिनट में 24 और 48 घंटे के दो क्रमिक समय अंतराल के लिए उत्पन्न किए गए थे। मूवी S1 0-24 घंटे के अंतराल)। मरने (DOXO-उपचारित) या जीवित (PBS-उपचारित) कैंसर कोशिकाओं के साथ चुनौती देने वाले व्यक्तिगत PBMC का ट्रैकिंग विश्लेषण Trackmate प्लग-इन का उपयोग करके किया गया था, जैसा कि इसमें देखा गया है चित्र 6A (बाएं पैनल)। केमोटैक्सिस और माइग्रेशन टूल का उपयोग करके प्रासंगिक केमोटैक्सिस मान और माइग्रेशन प्लॉट स्वचालित रूप से उत्पन्न किए गए थे, जैसा कि इसमें विस्तृत है⁶². सेल प्रक्षेपपथ को 24 घंटे के समय (x, y) = 0 तक विस्तारित किया गया था। परिणामों ने डीओएक्सओ या पीबीएस के संपर्क में आने वाले स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ सह-लोड होने पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक अलग प्रवासी प्रोफ़ाइल का संकेत दिया। जब पीबीएमसी को एपोप्टोटिक कैंसर कोशिकाओं का सामना करना पड़ा, तो उन्होंने माइक्रोचैनलों को मरने / मृत कोशिकाओं (लेकिन अनुपचारित कोशिकाओं को जीने के लिए नहीं) की ओर पार किया। माइग्रेशन एक्स / वाई मकड़ी और गुलाब के भूखंड, बाएं पैनल में प्रस्तुत चित्र 6B-C, प्रतिरक्षा गतिशीलता में अंतर पर इम्युनोजेनिक इंड्यूसर एजेंटों के प्रभाव को उजागर करने के लिए मैप और तुलना की गई थी। गुलाब के भूखंडों से पता चलता है कि पीबीएमसी मुख्य रूप से नियंत्रण प्रयोग में लगभग सभी दिशाओं में स्थानांतरित हो गए, केवल एक नगण्य अंश कैंसर कोशिकाओं के प्रसार से उत्पन्न ढाल को निर्देशित करता है। इसके विपरीत, व्यक्तिगत कोशिकाओं के पथ एपोप्टोटिक स्तन कैंसर कोशिकाओं (नकारात्मक एक्स-दिशा) की दिशा के साथ एक मजबूत पूर्वाग्रह आंदोलन को उजागर करते हैं। DOXO-उपचारित या PBS-उपचारित कैंसर कोशिकाओं की ओर निर्देशित प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास का मूल्यांकन करने के लिए, कई केमोटैक्सिस मापदंडों की गणना की जाती है, जिनमें शामिल हैं: a) द्रव्यमान का केंद्र (सभी समापन बिंदुओं का स्थानिक औसत बिंदु); ख) दिशात्मकता; सी) फॉरवर्ड माइग्रेशन इंडेक्स (यानी, ब्याज की दिशा में औसत सेल विस्थापन जिसका अर्थ है हमारे मामले में लक्ष्य ट्यूमर साइट की ओर)। बाद के मान दिए गए केमोटैक्टिक उत्तेजनाओं की दिशा में पलायन करने के लिए एक सेल की दक्षता के माप का प्रतिनिधित्व करते हैं। बाएं कक्ष तक पहुंचने के बाद, 24-48 घंटे से अधिक बढ़ते घनत्व वाले ल्यूकोसाइट्स के एक अंश ने डीओएक्सओ-उपचारित एमडीए-एमबी -231 के साथ दीर्घकालिक (>60 मिनट) संपर्क प्रदर्शित किए। पीबीएमसी बड़े पैमाने पर प्रवास करने और जीवित कैंसर कोशिकाओं के साथ इस तरह की दीर्घकालिक और लगातार बातचीत में संलग्न होने में विफल रहते हैं (जैसा कि पीबीएमसी के पास आने वाले प्रतिनिधि माइक्रोफोटोग्राफ द्वारा दिखाया गया है)। चित्र 6A, ठीक है)। ट्यूमर-प्रतिरक्षा अंतःक्रिया में अंतर को निर्धारित करने के लिए, ट्यूमर क्षेत्र को 20-80 माइक्रोन व्यास के एक निश्चित चक्र के साथ चित्रित किया गया था, जिसे "हॉटस्पॉट" नाम दिया गया था। प्रतिनिधि एफओवी से परिमाणीकरण और विश्लेषण में दिखाया गया है चित्र 6 (दाएं पैनल, बी-सी)।

खंड 2 में एपिजेनेटिक दवाओं³² (डीएसी / आईएफएन बनाम आईएफएन अकेले) के कैंसर विरोधी संयोजनों के जवाब में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती को निर्धारित करने के लिए एक नया 3 डी इम्यूनो-सक्षम ट्यूमर मॉडल वर्णित किया गया था, जिससे ए 375 मेलेनोमा कोशिकाओं की दो अलग-अलग उपचार स्थितियों की तुलना एक साथ की जा सकती है। इस प्रकार, पीकेएच 67 हरे फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किए गए ए 375 एम मेलेनोमा कोशिकाओं को प्रत्येक जेल कक्ष में डीएसी और / या आईएफएन की उपस्थिति में मैट्रिगेल मैट्रिसेस में एम्बेडेड किया गया था, जबकि पीकेएच 26 लाल लेबल वाले पीबीएमसी को शुरुआती बिंदु पर केंद्रीय द्रव कक्ष में समरूप रूप से वितरित किया गया था (चित्रा 7 ए)। हमने पीबीएमसी को आकर्षित करने की उनकी क्षमता के लिए 3 डी मैट्रिसेस में दो ट्यूमर द्रव्यमानों की एक साथ तुलना की। 48 और 72 घंटे में, पीबीएमसी को बड़े पैमाने पर दाईं ओर के माइक्रोचैनलों में निर्देशित किया जाता है, जैसा कि चित्र 7 बी में देखा गया है।

आईएफएन-उपचारित, मेलेनोमा साइट के बजाय डीएसी / आईएफएन-उपचारित जेल मैट्रिक्स की ओर पीबीएमसी का एक अधिमान्य होमिंग स्पष्ट रूप से देखा गया था, जबकि एकल उपचार (बाएं चिप साइड) के संपर्क में आने वाली ए 375 कोशिकाओं की ओर खराब प्रवासन दर दिखाई दे रही थी। प्रतिस्पर्धी सेटिंग विभिन्न कैंसर जीव विज्ञान फेनोटाइप्स (जैसे, दवा प्रतिरोधी बनाम आक्रामक, प्राथमिक या मेटास्टैटिक (जैसे, ए 375 पी बनाम ए 375 एम मेलेनोमा कोशिकाओं), और उत्तरदाताओं बनाम गैर-उत्तरदाताओं) की अधिकता की जांच करने के लिए लागू होती है। जेल कक्षों में घातक कोशिकाओं और कई गैर-कैंसर ट्यूमर से जुड़ी कोशिकाओं की जटिल सह-संस्कृतियां शामिल हो सकती हैं, जैसे कि एंडोथेलियल कोशिकाएं, प्रतिरक्षा कोशिकाएं और फाइब्रोब्लास्ट³³ टीएमई-स्तर की दवा प्रतिक्रियाओं को चिह्नित करने के लिए। कैंसर कोशिकाओं के माइटोसिस और एपोप्टोटिक मृत्यु की घटनाओं को जीवित^{रंगों के} साथ धुंधला करके निगरानी की जा सकती है। 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों पर इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रियाओं को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी³⁵ द्वारा ट्यूमर साइटों में घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियण की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस अर्थ में, ये 3 डी माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम जटिल ट्यूमर संरचनाओं और बहुकोशिकीय इंटरैक्शन की नकल कर सकते हैं और इसलिए अधिक विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल दवा परीक्षण के लिए मूल्यवान मंच हैं।

चित्र 1. "2 डी ट्यूमर-प्रतिरक्षा सह-संस्कृतियों को इकट्ठा करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की प्लैनिमेट्री"। (ए) 3 चिप्स की वास्तविक माइक्रोफोटोग्राफ एक एकल माइक्रोस्कोप स्लाइड में इकट्ठी होती है। जलाशयों को लोडिंग अनुक्रम के आधार पर क्रमांकित किया जाता है और किंवदंती में सूचीबद्ध संबंधित संस्कृति कक्षों के रूप में रंग-कोडित किया जाता है। स्केलबार, 6 मिमी (बी) चिप का 3 डी सीएडी जिसमें माइक्रोग्रूव्स से जुड़े तीन मुख्य सेल कल्चर क्षेत्र शामिल हैं। सी) संकीर्ण माइक्रोग्रूव पुल का विवरण, कैंसर कोशिकाओं और पीबीएमसी आकार के अनुरूप आयाम दिखाता है। डी-ई) दृश्य मान प्रकाश माइक्रोफोटोग्राफ को टाइम-लैप्स की शुरुआत से पहले हासिल किया गया था, जो क्रमशः बाएं और मध्यवर्ती कक्ष में कैंसर कोशिकाओं और पीबीएमसी के वितरण को दर्शाता है। स्केलबार, 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्र 2. समय-श्रृंखला छवियों में प्रतिरक्षा धब्बों के स्थानीयकरण के लिए ट्रैकमेट विश्लेषण पाइपलाइन। ए) ऊपरी पैनल: ट्रैकमेट छवि अंशांकन मेनू का स्क्रीनशॉट। निचला पैनल: समय और स्थानिक इकाइयों को सेट करने के लिए फिजी "छवि गुण मेनू"। बी) ऊपरी पैनल: ट्रैकमेट "स्पॉट डिटेक्शन" मेनू का स्क्रीनशॉट। निचला पैनल: "थ्रेशोल्ड" के लागू विभिन्न मूल्यों के साथ आउटपुट छवि। सी) ऊपरी पैनल: ट्रैकमेट "स्पॉट फ़िल्टरिंग" मेनू का स्क्रीनशॉट जो कुछ फिल्टर को दर्शाता है। निचला पैनल: अनुकरणीय टाइम-लैप्स छवि, मध्यवर्ती कक्ष में एक्स के साथ स्थिति द्वारा फ़िल्टर किए गए प्रतिरक्षा धब्बों को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 3. समय-श्रृंखला छवि अनुक्रमों में प्रतिरक्षा ट्रैक के पुनर्निर्माण के लिए ट्रैकमेट विश्लेषण पाइपलाइन। ए-सी) ट्रैक बिल्डिंग, ट्रैक फ़िल्टरिंग और अंतिम डेटा निर्यात करने के लिए ट्रैकमेट मेनू के स्क्रीनशॉट। डी) लिंकिंग डिटेक्टर सेटिंग्स को अलग-अलग पूर्व-संसाधित टाइम-लैप्स छवियों में उत्पन्न ट्रैक के उदाहरण। ई) ट्यूमर कोशिकाओं की सीमाओं का पता लगाने से प्राप्त झूठे ट्रैक और खराब लिंक का उदाहरण। एफ) परिणामों की फ़ाइल .txt में पंक्तियों का चयन करके ट्रैक को हरे रंग में हाइलाइट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 4. 3 डी इम्यूनोसक्षम ट्यूमर-ऑन चिप्स के लिए योजनाबद्ध अवलोकन। ए) एक सूक्ष्म संरचित सिलिकॉन मास्टर का उदाहरण। पीडीएमएस के लिए टिकटों को ई-बीम और ऑप्टिकल लिथोग्राफी से लैस क्लीनरूम सुविधा में एसयू -8 नकारात्मक प्रतिरोध में पैटर्न किया गया था। बी) पीडीएमएस प्रतिकृतियां मानक नरम-लिथोग्राफी विधियों द्वारा बनाई गई थीं। केंद्रीय इकाई में चिप के 3 डी प्रतिपादन में खींचे गए कक्षों के रूप में रंगीन कक्ष होते हैं, जिन्हें पैनल डी सी में दर्शाया गया है) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) हाइड्रोगेल समाधान फंसाने के लिए उपयुक्त माइक्रोपिलर की सरणी का बढ़ा हुआ दृश्य। डी) 3 डी सीएडी कक्षों को दर्शाता है, जो माइक्रोग्रूव और लोडिंग कुओं से जुड़ा हुआ है। डैश किए गए बक्से को विवरण (पैनल सी, और ई) की एसईएम तस्वीरों के लिए संदर्भित किया जाता है। ई) माइक्रोग्रूव को जोड़ने वाले 10 मीटर ऊंचे एसईएम फोटो। एफ) 2 डी सीएडी लेआउट माइक्रोस्ट्रक्चर के आयामों को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 5. 3 डी सह-संस्कृतियों को इकट्ठा करने के लिए मुख्य लोडिंग प्रोटोकॉल चरणों का योजनाबद्ध वर्कफ़्लो। ए) ऊपरी पैनल: प्रत्येक जेल साइड क्षेत्र में मैट्रिगेल समाधान के इंजेक्शन चरण के योजनाबद्ध। निचला पैनल: लोडिंग चरण के दौरान चैनल के साथ जेल फ्रंट एडवांसमेंट दिखाने वाली चिप की असली तस्वीर। बी) मैट्रिगेल पोलीमराइजेशन चरण की योजनाबद्धता। निचला पैनल: गेलेशन चरण के बाद बनने वाले जेल-एयर इंटरफ़ेस का चरण-कंट्रास्ट सूक्ष्म दृश्य। स्केलबार, 100 μm. C) ऊपरी पैनल: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अनुकरणीय संस्करणों के साथ कोशिकाओं और मीडिया के लोडिंग को चित्रित करना। निचला पैनल: 0एच पर इकट्ठे सह-संस्कृति की एक 4 एक्स चरण-कंट्रास्ट छवि दिखाई गई है। स्केलबार, 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 6. 24-48 घंटे की समय अवधि में मरने / जीवित ट्यूमर कक्ष के प्रति पीबीएमसी के प्रवासी प्रोफाइल और इंटरैक्शन व्यवहार का विश्लेषण। बाएं पैनल। ए) ट्रैकमेट द्वारा निकाले गए प्रतिरक्षा रंगीन ट्रैक के साथ ओवरलोड किए गए टाइम-लैप्स प्री-प्रोसेस्ड छवियों के स्क्रीनशॉट। प्रतिरक्षा पथ मध्यवर्ती कक्ष में 24-से-48 घंटे के अंतराल में संकेतित प्रयोगात्मक स्थितियों में एकल एफओवी द्वारा प्राप्त किए जाते हैं। बी-सी) दो अलग-अलग स्थितियों (एन = 1550 पीबीएमसी बनाम डोक्सो-उपचारित कैंसर कोशिकाओं, डोक्सो + या एन = 1434 पीबीएमसी बनाम नियंत्रण कैंसर कोशिकाओं, डीओएक्सओ-) में उगाए गए पीबीएमसी के प्रतिनिधि प्रवासन ट्रैक और गुलाब भूखंड। एक्स-वाई भूखंडों के अंदर प्रत्येक पंक्ति एक एकल पीबीएमसी प्रक्षेपवक्र को दर्शाती है और प्रत्येक सर्कल प्रारंभिक स्थिति के संबंध में एकल सेल की अंतिम स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। प्रारंभिक बिंदुओं को एक समन्वय परिवर्तन का उपयोग करके (0,0) पर सेट किया जाता है। सेल माइग्रेशन के द्रव्यमान के केंद्र के निर्देशांक और विस्थापन को संकेतित प्रयोगात्मक स्थितियों में प्रदर्शित किया जाता है। द्रव्यमान निर्देशांक और विस्थापन का केंद्र (एक्स और वाई घटकों के लिए औसत यूक्लिडियन दूरी के रूप में गणना) औसत दिशा का संकेत प्रदान करता है जिसमें कोशिकाओं का समूह मुख्य रूप से यात्रा करता है और स्थिति समूहों में समग्र सेल आंदोलन का परिमाण है। नीली और हरी रेखाएं क्रमशः यूक्लिडियन दूरी मान द्वारा अलग-अलग पटरियों को एक दहलीज मान (100 μm) से अधिक / छोटा चिह्नित करती हैं। डी) सेल ट्रैक द्वारा निकाले गए संख्यात्मक डेटा की योजना। ई-एफ) बॉक्स और मूंछें क्रमशः दिशात्मकता (पी <0,0001 वेल्च के सुधार के साथ अप्रकाशित टी परीक्षण) और एफएमआई (पी <0,0001 वेल्च के सुधार के साथ अप्रकाशित टी परीक्षण) को दर्शाती हैं। बक्से में क्षैतिज रेखा माध्य मानों का प्रतिनिधित्व करती है। एफएमआई मान प्रत्येक स्थिति समूह में सभी सेल-ट्रैक के लिए औसत हैं। दायां पैनल। ए) ट्रैकमेट निकाले गए आरओआई के स्क्रीनशॉट पीबीएमसी और डीओएक्सओ या पीबीएस-उपचारित कैंसर कोशिकाओं के बीच अंतर इंटरैक्शन दिखाते हैं। बी) डीओएक्सओ-उपचारित या नियंत्रण एमडीए-एमबी -231 कैंसर कोशिकाओं के आसपास पीबीएमसी का समय घनत्व। प्रत्येक स्थिति के लिए कैंसर कोशिकाओं के आसपास चयनित आरओआई में मौजूद पीबीएमसी की संख्या। रिपोर्ट किए गए मान एकल टाइम-लैप्स एफओवी से 9 चयनित आरओआई से औसत हैं। कैंसर हॉटस्पॉट को आरओआई (व्यास में 80 μm) में परिभाषित किया गया है। संबंधित घनत्व हीटमैप प्रदर्शित किया जाता है। डॉट्स इंगित समय बिंदुओं पर 9 कैंसर हॉटस्पॉट पर गणना की गई कोशिकाओं की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। ग) प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए संपर्कों के समय (मिनट) का वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 7. चिप मॉडल पर प्रतिस्पर्धी 3 डी इम्यूनो-सक्षम मेलेनोमा में डीएसी प्लस आईएफएन दवा संयोजनों के जवाब में पीबीएमसी की अधिमान्य भर्ती। ए) माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के केंद्रीय कक्ष में शुरू में लोड किए गए पीबीएमसी का वितरण। माइक्रोफोटोग्राफ 0-72 घंटे के अंतराल के दौरान ईवीओएस-एफएल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप द्वारा प्राप्त किए जाते हैं। लाल प्रतिदीप्ति (पीकेएच 67-लेबल कोशिकाएं) स्वस्थ दाताओं से पीबीएमसी का प्रतिनिधित्व करती हैं। पीकेएच 67-लेबल (हरे) मानव मेलेनोमा कोशिकाओं को एकल या दोहरे संयोजन उपचार वाले मैट्रिगेल में एम्बेडेड पार्श्व कक्षों में चढ़ाया गया था। बी) ए 375 सेल प्लस बाईं ओर आईएफएन बनाम दाईं ओर ए 375 प्लस डीएसी / आईएफएन। प्रतिदीप्ति छवियों को सह-संस्कृति के 72 घंटे पर दिखाया गया था। बंद किए गए पीले बॉक्स में ए 375 प्लस डीएसी / आईएफएन पक्ष में बड़े पैमाने पर भर्ती को दर्शाया गया है। सी) पीबीएमसी आईएफएन कक्षों बनाम डीएसी + आईएफएन कक्षों से चार अलग-अलग आरओआई में गिना जाता है। हिस्टोग्राम सेल गणना +/- एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं; हीटमैप ने प्रत्येक ROI से मूल्यों की गणना की। डी-जी) एकल चैनल फ्लोरेसेंस छवियों पर लागू जेल मैट्रिसेस में घुसपैठ किए गए पीबीएमसी के विभाजन और परिमाणीकरण चरणों की योजनाबद्धता। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फाइल। माइक्रोफैब्रिकेशन प्रोटोकॉल कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फिल्म 1. 2 डी ट्यूमर-इम्यून ऑन-चिप सह-संस्कृति में टाइम-लैप्स सीक्वेंस। एक मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखे गए कॉम्पैक्ट माइक्रोस्कोप के माध्यम से 0-24 घंटे के समय अंतराल में हर 2 मिनट में माइक्रोफोटोग्राफ हासिल किए गए थे। बाएं पैनल। स्वस्थ दाताओं (डब्ल्यूटी, जंगली प्रकार) से पीबीएमसी की फिल्म, एमडीए-एमबी -231 के साथ चढ़ाई गई स्तन कैंसर कोशिकाओं को नियंत्रित करती है। दायां पैनल। चिप कक्ष की ओर पीबीएमसी डब्ल्यूटी के बड़े पैमाने पर प्रवास की फिल्म जहां एमडीए-एमबी -231 डीओएक्सओ-उपचारित कैंसर कोशिकाएं भरी हुई हैं। 2 डी चिप लेआउट प्रोटोकॉल के खंड 1 में विस्तार से वर्णित है और चित्रा 1 में दिखाया गया है। कृपया इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्णित विधियां ऑन्को-इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में दो महत्वपूर्ण पहलुओं, जटिलता की मोडुलेबल डिग्री के साथ, पुन: उत्पन्न करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण डिजाइन करने की कोशिश करती हैं, जो अधिक प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल को अपनाने से लाभ उठा सकती हैं। पहले में ट्यूमर सेल जनसंख्या पक्ष शामिल है, जहां एकल कोशिका विशेषताओं से निपटने से विषमता और सहसंबद्ध जैविक और नैदानिक महत्व का बेहतर वर्णन हो सकता है जिसमें चिकित्सा के प्रतिरोध, मेटास्टेसिस के लिए प्रोपेन्सन, स्टेम सेल और भेदभाव ग्रेड शामिल हैं। कहानी के दूसरे पक्ष को टीएमई द्वारा दर्शाया गया है, जिसमें गैर-कैंसर घटक (प्रतिरक्षा और स्ट्रोमल कोशिकाएं, रक्त वाहिकाएं) और रासायनिक / भौतिक परिदृश्य (ईसीएम घटक, केमोकाइन और अन्य घुलनशील कारक जारी) शामिल हैं जो रोग की विशेषताओं और चिकित्सा के लिए व्यक्ति की प्रतिक्रिया दोनों को गहराई से आकार दे^सकते हैं, विशेष रूप से इम्यूनोथेरेपी के लिए। यह ध्यान देने योग्य है कि अन्य अनुसंधान क्षेत्रों में वर्णित दृष्टिकोण का निर्यात करने के लिए नए मॉडलों के विकास और अपनाने से लाई गई सीमाओं और चुनौतियों की गहरी समझ की आवश्यकता होती है।

इंजीनियरिंग मॉडलिंग ("मॉडल समस्या सिस्टम नहीं है") में लागू एक मैक्सिम को उद्धृत करते हुए, इसे अनुकूलित किया जाना चाहिए जो पूरे प्रयोग के साथ अपने ऑन-चिप मॉडल को जैविक रूप से प्रासंगिक और स्थिर बनाने के लिए आवश्यक (सेलुलर, भौतिक और रासायनिक) घटकों और स्थितियों की न्यूनतम संख्या है। इस प्रकार, सेल प्रकारों / माइक्रोएन्वायरमेंटल / प्रायोगिक सेटिंग के प्रत्येक संयोजन को सटीक रूप से चुना जाना चाहिए, मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और एकल प्रयोगों के साथ और सत्र से सत्र तक लगातार निगरानी की जानी चाहिए। इन जांचों में, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभागों में उल्लेख किया गया है, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में वॉल्यूम जैसे मापदंडों का सख्त नियंत्रण शामिल है, जिन्हें आर्द्रता की स्थिति या रोशनी स्रोतों से हीटिंग द्वारा संशोधित किया जा सकता है, संभावित आंदोलनों और अनियंत्रित तरल बहाव के कारण चरणों की गैर-प्लानेरिटी, लेकिन सेल स्थिति, व्यवहार्यता और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन का कुछ समापन बिंदु सत्यापन भी शामिल है। एक महत्वपूर्ण कदम संवहनी (जैसे) संरचनाओं को बनाने के लिए छिड़काव प्रणाली का उपयोग करने के निर्णय से संबंधित है, या ऑन-चिप दवा वितरण³³ के लिए, क्योंकि यह प्रतिरक्षा जैसी फ्लोटिंग कोशिकाओं की उपस्थिति में रासायनिक कारकों की बढ़ती जटिलता, सेल कल्चर अवधि और मॉड्यूलेशन के संदर्भ में प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है।

निम्नलिखित में, हम प्रयोगात्मक सेटिंग्स और सबसे हाल के साहित्य में पाए जाने वाले मुख्य महत्वपूर्ण और प्रासंगिक मुद्दों को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं।

ईसीएम और रासायनिक परिदृश्य परिभाषा
टीएमई परिवेश 63^{, 66 के यांत्रिक 64,65} गुणों से भी गहराई से प्रभावित ^है। इस कारण से, संवर्धन मैट्रिक्स की पसंद मौलिक है, खासकर जब प्रतिरक्षा कोशिकाओं से निपटते हैं, जो कुछ स्थितियों में, मैट्रिक्स द्वारा जारी संकेतों का जवाब दे सकते हैं। अगले भविष्य में भी नई सामग्रियों और हाइड्रोगेल (अन्य मापदंडों के बीच विभिन्न कठोरता, सरंध्रता, घुलनशील कारकों की उपस्थिति द्वारा चित्रित) के डिजाइन और विकास से प्रासंगिक प्रगति की उम्मीद है, जो एक तेजी से परिष्कृत और नियंत्रणीय ईसीएम को सक्षम कर रहे हैं, जो आज विभिन्न ऊतकों की विशिष्टताओं की नकल करते हैं, कल विभिन्न रोगियों। दूसरी ओर ईसीएम में विभिन्न सेल आबादी द्वारा प्रेरित परिवर्तनों की निगरानी करने और गतिशील और फेनोटाइपिक विश्लेषणों में इस जानकारी को शामिल करने के लिए रणनीतियों को परिभाषित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है।

डेटा प्रबंधन
नैदानिक वर्कफ़्लो में ट्यूमर ऑन-चिप तकनीकों की तैनाती की दिशा में मार्ग एक विशाल प्रयोगात्मक कार्य से लाभान्वित होने जा रहा है जो कई दिशाओं में हो रहा है। ऑर्गन-ऑन-चिप मॉडल, कई इन विट्रो तकनीकों के रूप में, कार्यात्मक हैं, कम से कम संभावित रूप से, उच्च-थ्रूपुट / उच्च-सामग्री माप करने के लिए। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित प्रयोगात्मक स्थितियों का समानांतरकरण, और तकनीकी / जैविक प्रतिकृति एक ही प्लेट पर कई चिप्स को एकीकृत करके संभव बना दिया गया है। मात्रात्मक थ्रूपुट में वृद्धि इम्यूनोथेरेपी के लिए तेजी से दवा या जीन स्क्रीनिंग पाइपलाइन में इन प्रणालियों का अनुवाद और सत्यापन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। दरअसल, कई कंपनियों ने पहले से ही एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में प्लेटफ़ॉर्म विकसित किए हैं, और विभिन्न इमेजिंग दृष्टिकोणों का परीक्षण किया जा रहा है ताकि^{एक साथ उच्च} संख्या में उपकरणों की निगरानी की जा सके। उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल में, हमने एक मानक माइक्रोस्कोप मल्टी-स्लाइड ट्रे का उपयोग करके समानांतर में 12 प्रयोगात्मक स्थितियों तक की कल्पना करने की संभावना के साथ 3 चिप्स तक आवंटित माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग किया। यह सेटअप हाथ पाइपिंग के साथ संगत है और हमारे माइक्रोफैब्रिकेशन सुविधा में किए गए कस्टम उन्मुख समायोजन के लिए उपयुक्त है। इसके विपरीत, जब एक मजबूत समानांतरकरण आवश्यक होता है (कई स्क्रीनिंग परीक्षण और नियंत्रण), स्वचालन के उच्च स्तर को सेट करने के लिए सेटअप अनुकूलन (यानी, पाइपिंग रोबोट, प्लास्टिक मल्टी-वेल्स का उपयोग) की आवश्यकता होती है।

प्रयोगों को डिजाइन करते समय, स्थानिक और लौकिक संकल्प के बीच एक व्यापार-बंद को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

उच्च सामग्री माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पादित डेटा की भारी मात्रा, भंडारण, हस्तांतरण और विश्लेषण के संदर्भ में एक सीमित कारक का गठन करती है। इन मुद्दों को मशीन लर्निंग टूल्स और हार्डवेयर / सॉफ्टवेयर संसाधनों को लागू करने वाले कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोणों के साथ संबोधित किया जा रहा है, जो चिकित्सीय रणनीतियों को चुनने में ऑन-चिप / इन-सिलिको^{प्रयोगों 67,68} को जोड़ने की भविष्य की संभावना को बढ़ावा दे सकता है, और यह एक महत्वाकांक्षी लेकिन गैर-स्थगित अवसर का प्रतिनिधित्व करता है।

फ्लोरेसेंस इमेजिंग से परे
प्रतिदीप्ति लेबलिंग, रंजक या रिपोर्टर जीन द्वारा, इसकी उच्च विशिष्टता के कारण, निस्संदेह सह-संस्कृति स्थितियों में विभिन्न सेल आबादी की पहचान करने और उच्च एसएनआर के साथ आणविक गुणों को हल करने के लिए स्वर्ण मानक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। ओओसी मॉडल में इस दृष्टिकोण का उपयोग आमतौर पर एक संदर्भ के रूप में किया जाता है और विशेष रूप से विषम ट्यूमर-ऑन-चिप माइक्रोएन्वायरमेंट में, यह घुसपैठ और बातचीत करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए मूल्यवान हो सकता है।

फिर भी, इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि फ्लोरोफोरेस, श्रमसाध्य धुंधला प्रक्रियाओं और रोशनी दिनचर्या से प्रेरित प्रभावों की निगरानी की जानी चाहिए और^{उन्हें कम} से कम किया जाना चाहिए क्योंकि सेल व्यवहार और स्थिति^70,71 को गहराई से प्रभावित कर सकते हैं। यह जोखिम नाजुक प्रणालियों के लिए विशेष रूप से सच लगता है, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाएं^72,73। फोटोटॉक्सिक प्रतिक्रियाएं उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर निगरानी किए जाने पर जीवित कोशिकाओं के अस्थायी खिड़की अधिग्रहण को परिभाषित करने में सीमाएं पेश कर सकती हैं। इसके अलावा, प्रतिरक्षा उप-आबादी की विविधता में समृद्धि माइक्रोस्कोप पर आमतौर पर उपलब्ध फिल्टर की सीमित संख्या को देखते हुए, केवल फ्लोरोसेंट धुंधला करके उनके बीच भेदभाव करना असंभव बनाती है।

इस मुद्दे को हल करने के लिए, एक वाद्य दृष्टिकोण से, उपन्यास लेबल मुक्त⁷⁴ माइक्रोस्कोपी तकनीक जैसे होलोग्राफिक⁵⁶ या हाइपरस्पेक्ट्रल माइक्रोस्कोपी⁵⁷ अब मंच पर दिखाई दे रहे हैं। वे प्रतिदीप्ति से परे उन्नत सेलुलर प्रक्रिया वर्गीकरण रणनीतियों का वादा करते हैं और संवेदनशील नमूनों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हो सकते हैं। डेटा विश्लेषण के दृष्टिकोण से, डीप लर्निंग एल्गोरिदम⁷⁵ (फ्लोरेसेंस इमेज डेटासेट द्वारा प्रशिक्षित) के आधार पर उन्नत कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण, तथाकथित "इन सिलिको लेबलिंग" ^76,77 करने के लिए दरवाजे खोलने वाले हैं। उन्हें चमकदार-क्षेत्र छवियों⁷⁸ से फ्लोरोसेंट मार्करों की भविष्यवाणी करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है, कोशिकाओं को धुंधला किए बिना लेबल छवियों को उत्पन्न करता है, इस प्रकार उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी सूचनात्मक शक्ति में वृद्धि करता है। यह रणनीति अन्य मार्करों के लिए समय और प्रतिदीप्ति चैनलों को बचाने के लिए भी उपयोगी हो सकती है। हमारा मानना है कि ओओसी समुदाय इन नई तकनीकों से लाभान्वित होगा जो सेल आबादी की बातचीत के कम आक्रामक अध्ययन की अनुमति देगा।

डेटा विश्लेषण
प्रतिरक्षा और लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के बीच बातचीत के तंत्र की जांच सेल आंदोलनों की ट्रैकिंग के माध्यम से की जा सकती ^{है 28,79}। जटिल और विषम सह-संस्कृतियों में टाइम-लैप्स ट्रैकिंग प्रयोग सेल माइग्रेशन पैटर्न, रूपात्मक और राज्य परिवर्तन और व्यापक वंश जानकारी निकालने के लिए बेहद मूल्यवान हैं। मैन्युअल विश्लेषण करना व्यावहारिक रूप से केवल कुछ कोशिकाओं के साथ छोटे अनुक्रमों के लिए संभव है, लेकिन उच्च-थ्रूपुट, व्यवस्थित प्रयोगों के लिए नहीं। नतीजतन, सेल ट्रैकिंग के लिए कम्प्यूटेशनल टूल का विकास, या तो पूरी तरह से या आंशिक रूप से स्वचालित,^{छवि विश्लेषण में} अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। आमतौर पर, पारंपरिक सेल ट्रैकिंग को विभाजन कार्यों को सही ढंग से करने के लिए नमूनाकरण और स्थानिक संकल्प की अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति की आवश्यकता होती है, जो कई प्रयोगात्मक स्थितियों में चुनौतीपूर्ण हो सकती है। कोशिकाओं को स्थानीयकृत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल या समर्पित मालिकाना सॉफ़्टवेयर में प्रस्तुत ओपन-एक्सेस विभाजन और ट्रैकिंग टूल (जैसे, इमेजजे सॉफ़्टवेयर²²) उपलब्ध हैं। बड़े पैमाने पर अध्ययनों में, हमने सेल हंटर^16,31 नामक एक मालिकाना सॉफ्टवेयर लागू किया, जिसे रोम में टोर वर्गाटा विश्वविद्यालय द्वारा विकसित किया गया था, ताकि बहु-जनसंख्या संदर्भ में कैंसर और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पूरी तरह से स्वचालित तरीके से अलग किया जा सके। मशीन लर्निंग और न्यूरल नेटवर्क दृष्टिकोण^80,81,82 पर आधारित तैयार समाधान आज माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर पैकेज ⁸³ में लागू किए जाने लगे हैं, एसएनआर में सुधार से लेकर महत्वपूर्ण अधिग्रहण मापदंडों या विभाजन चरणों के प्रबंधन तक। माइक्रोएन्वायरमेंटल कारकों के संबंध में जैविक प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए सामान्य सेलुलर पैटर्न (जैसे, गति शैलियों) को पहचानने के लिए मशीन लर्निंग का उपयोग किया जा सकता है।

कम्स एट ^अल.41 में, एक पूर्व-प्रशिक्षित डीप लर्निंग कन्वोल्यूशनल न्यूरल नेटवर्क आर्किटेक्चर को यह वर्गीकृत करने के लिए लागू किया गया था कि कैंसर कोशिकाएं प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिशीलता को "मार्कर" के रूप में उपयोग करके दवा उपचार के संपर्क में हैं या नहीं, जो सूक्ष्म उपकरणों में कोलेजन मैट्रिसेस में स्तन कैंसर कोशिकाओं और पीबीएमसी की सह-संस्कृतियों के टाइम-लैप्स डेटा से ट्रैक किया गया था। जैसा कि³³ में वर्णित है।

एकल-कोशिका ओमिक्स विधियों और ऑन्टोलॉजी विकास
हम एकल-सेल ओमिक्स प्रौद्योगिकियों⁸⁴ (जैसे, प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलॉमिक्स, जीनोमिक्स) और ऑन-चिप विधियों के बीच एक रणनीतिक गठबंधन की आवश्यकता को इंगित करते हैं: आणविक विस्तृत लक्षण वर्णन, कार्यात्मक गतिशील जानकारी के लिए संयुग्मित बुनियादी तंत्र और नैदानिक विवरण की समझ को बढ़ा सकता है। इस मामले में दोनों दुनियाओं को जोड़ने के लिए नए उपकरण उनकी^{शुरुआत में} हैं। पहली चुनौती ऑन्को-इम्यूनोलॉजी चिप्स²² पर सीधे एकल-सेल ओमिक्स दृष्टिकोण को लागू करना है। इसके अलावा, जीनोमिक्स और प्रोटिओमिक्स विश्लेषण^86,87 द्वारा पहचाने गए संभावित लक्ष्यों का परीक्षण करने के लिए मंचों के रूप में ऑर्गन-ऑन-चिप्स का उपयोग किया जा सकता ^है। एक दूसरा लिंकिंग टूल, जो अभी भी काफी हद तक गायब है, मापा सिस्टम परिणामों^88,89 को एनोटेट करने और संग्रहीत करने का एक संरचित, मानकीकृत तरीका है। लेकिन यह वही है जो हमें भविष्य में सेलुलर मात्रात्मक परिणामों और मापा विशेषताओं के व्यवस्थित डेटाबेस बनाने के लिए चाहिए, उन्हें अंतर्निहित जैविक जानकारी के साथ खनन, अनुमान लगाने और सहसंबंधित करने के लिए। एक शब्द में, विषम प्रयोगात्मक डेटासेट के मानकीकरण और व्यवस्थित विश्लेषण की आवश्यकता एक ऑन्कोलॉजी ढांचे की मांग करती है।

मॉडल को वैयक्तिकृत करना
ऑर्गन्स-ऑन-चिप तकनीक निजीकरण¹² के लिए उपयुक्त है, क्योंकि एकल रोगियों (या रोगियों के वर्गों) से कोशिकाओं और ऊतकों का उपयोग नियंत्रित परिस्थितियों में उपकरणों में किया जा सकता है, जिससे चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक रीडआउट होते हैं, जो चिकित्सीय या रोकथाम रणनीतियों को सूचित करने के लिए उपयोगी होते हैं। कुछ उदाहरण साहित्य⁹⁰ में दिखाई देने लगे हैं। बेशक, ट्यूमर-ऑन-चिप मॉडल के लिए, यह चुनौती कई तकनीकी और वैज्ञानिक प्रश्नों को हल करने के लिए प्रस्तुत करती है⁽ जैसे टीएमई विशेषताओं का नियंत्रण जैसे ऑक्सीजन एकाग्रता, साइटोकिन ग्रेडिएंट, आदि)। महत्वपूर्ण रूप से, प्रत्येक रोगी के लिए हानिकारक प्रभावों को कम करते हुए ऑन्कोलॉजी और ऑन्को-इम्यूनोलॉजी उपचारों को अधिक प्रभावी बनाने की संभावना आकर्षक है, स्वास्थ्य देखभाल संसाधनों के अनुकूलन के लिए जीवन की गुणवत्ता के दृष्टिकोण से।

अंत में, यह स्पष्ट है कि यह क्षेत्र एक प्रामाणिक रूप से अंतःविषय है और इस तरह, शोधकर्ता, चिकित्सकों, उद्योग के बीच एक सामान्य भाषा और साझा लक्ष्यों^को स्थापित करने में एक महान प्रयास की आवश्यकता होती है, लेकिन विभिन्न विषयों (इंजीनियरिंग, जीव विज्ञान, डेटा विज्ञान, चिकित्सा, रसायन विज्ञान) से भी अच्छा संतुलन और नए समाधान खोजने की आवश्यकता होती है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator