Summary
免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin vitroおよび計算ツールを必要としています。2Dおよび3D設定での腫瘍免疫マイクロ流体共培養を活用するためのプロトコルについて説明し、細胞機能の動的マルチパラメトリックモニタリングと互換性があります。
Abstract
複雑な疾患モデルには、生理学的および病理学的に関連する実用的な洞察を提供し、他の方法では目に見えないプロセスを明らかにすることができる最先端のツールが必要です。in vivoの風景を厳密に模倣した高度な細胞アッセイは、がんの進行に影響を与える双方向の腫瘍と宿主の相互作用を視覚化および測定するための新しい方法としての地位を確立しています。ここでは、自然および治療誘発性の免疫監視下で、腫瘍微小環境(TME)の複雑さを模倣して、マイクロデバイスで高度に制御可能な2Dおよび3D共培養を再現するための2つの汎用性の高いプロトコルについて説明します。セクション1では、明視野タイムラプス顕微鏡によって、接着性腫瘍細胞と浮遊免疫集団との間のクロストークを監視するための実験設定が提供されます。応用シナリオとして、免疫原性がん細胞死誘導剤などの抗がん治療が免疫細胞の動員と活性化に及ぼす影響を解析します。セクション2では、3D腫瘍免疫微小環境が競争力のあるレイアウトで組み立てられています。免疫浸潤の違いは、組み合わせ治療戦略を評価するために、最大72時間の蛍光スナップショットによって監視されます。両方の設定において、多数の免疫細胞パラメータ(例えば、免疫細胞の移動および相互作用、治療薬への応答)を抽出するための画像処理ステップが図示される。これらのシンプルで強力な方法は、がん、間質細胞、免疫細胞のサブタイプの不均一性と可塑性、およびがん進化のドライバーとしてのそれらの相互相互作用を含むTMEの複雑さをシミュレートするようにさらに調整できます。これらの急速に進化する技術を生細胞ハイコンテントイメージングに準拠させることは、大規模な有益なデータセットの生成につながり、新たな課題をもたらす可能性があります。実際、「共培養/顕微鏡/高度なデータ分析」という三角形は、オーダーメイドの治療プロトコルを支援する可能性のある正確な問題パラメータ化への道筋を設定します。将来的には、がん免疫オンチップと人工知能を統合してハイスループット処理を行うことで、精密でパーソナライズされた腫瘍学のための予測および前臨床ツールとしての能力を活用する上で大きな一歩が相乗効果を発揮できると期待しています。
Introduction
実験分野としての医学のさまざまな分野の進化は、制御された条件下で細胞集団と臓器機能を操作する能力に依存してきました1。そのような能力は、私たちの体で起こっているプロセスを再現できる測定可能なモデルの可用性にルーツがあります。
免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代2において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するために、新しいin vitroおよび計算モデルを利用する必要があります2,3。
腫瘍微小環境4(TME)は、がん細胞が継続的に相互作用し、他の細胞(免疫細胞、間質細胞、内皮細胞)および非細胞(細胞外マトリックス、ECM)成分と動的に共進化する複雑な組織です。この複雑な状況の動的な性質は、免疫細胞が悪性細胞の味方または敵として果たすかどうかを決定し、したがって、疾患の進行と治療への反応の両方に強く影響します。今日、腫瘍免疫学者、バイオインフォマティシャン、およびシステム生物学の専門家による多大な努力が集まって、空間(すなわち、異なる腫瘍領域)および時間(すなわち、異なる腫瘍進行段階)5,6のいずれかにおける癌の不均一性の臨床的意義5,6に対処し、単一細胞レベルで癌および免疫細胞の表現型および機能を特徴付けるために収束しています。この相乗効果の一例として、高度なコンピュータビジョン技術が、組織学的試料における免疫浸潤物の空間マッピングのために現在日常的に使用されている7、8。
実験モデルの最前線では、動物実験と従来のin vitro法を橋渡しし、マイクロフルイディクスと共培養技術の進歩により、オルガノイド、マイクロ生理学的システム9,10,11(MPS)、臓器オンチップ12,13,14などのさまざまなクラスのマイクロエンジニアリング細胞モデルにアクセスできます。 (OOC)。彼らは、細胞生態系の「全体像」のビューを拡大し、ハイコンテント顕微鏡15と画像処理アプローチを活用しながら、微小環境要因を制御するin vitroの可能性を拡大するという共通の特徴を共有しています。
今日、最先端のMPSおよびOOCシステムは、炎症性疾患、創傷治癒、粘膜免疫、毒素や日常の食品への反応などのさまざまなプロセスを調査および測定するために、既存の組織および共培養に免疫細胞のさまざまなサブタイプを組み込む免疫学的側面を含み始めています16。TMEオンチップモデル10、11、12、13、14、15、16、17は、灌流性マイクロ血管18、19、20、21とも統合されており、細胞型依存性相互作用、物理的および化学的摂動、および細胞毒性活性を調べるために開発されました。浸潤リンパ球22、ならびに臨床的に関連する免疫調節剤23。
ここでは、チップへの細胞のロードから画像処理ツールに至るまで、2D(セクション1)および3D(セクション2)設定16での高度な腫瘍免疫マイクロ流体共培養を活用するための汎用性の高いプロトコルを提供し、細胞機能の動的マルチパラメトリック24モニタリングおよび視覚化と互換性があります。これは、フィジーのフリーウェアソフトウェアとそのツールボックス25,26を利用して、サンプル管理とデータ分析の両方で使いやすさと柔軟性を維持しながら達成されます。
セクション1で説明したマイクロ流体デバイスは、付着性癌と浮遊免疫細胞の2D共培養を実行するように設計されています。このプラットフォームは、遺伝子変異27 および/または免疫不全28の存在下での免疫細胞の挙動のin vitro測定のために検証されました。ここでは、Trackmate(フィジーのソフトウェアに実装されているプラグイン)に基づく半自動方式を利用して、タイムラプス明視野画像で免疫細胞を追跡する手順を説明します。この手順は、免疫原性細胞死誘導因子 27 で処理されたか否かを標的とする癌細胞に対する免疫遊走29および応答(すなわち、相互作用時間)の運動学的記述子の抽出を可能にする。
重要なことに、時系列画像から抽出されたこれらのパラメータは、高度な数学機械で処理できます。このアプローチの可能性の例として、私たちのグループは最近、確率過程と統計力学からの数学的方法に基づく分析を発表し、細胞ネットワークの特性をモデル化し、免疫細胞の挙動のパラメータ化された説明を提供します(すなわち、偏ったまたは無相関のランダムウォーク、高度にまたは協調していない運動30,31)。
2番目のセクションで提供される3D設定は、共培養プロトコルに基づいており、細胞タイプと薬物の異なる組み合わせで2つのゲル領域に埋め込まれたより複雑な免疫適格TMEを競合的に再現します。ここでは、画像処理ステップは、異なる時点で、マトリゲル内で培養されたヒトA375Mメラノーマ細胞における染色免疫細胞の浸潤を測定し、抗腫瘍剤組合せ32を評価するために説明する。A375M株は、高度に転移性の表現型を特徴とするA375P由来細胞株であり、免疫細胞の存在下でのそれらの転移能を評価するために選択された32。
記載されたモデルは、異なる細胞源(マウスおよびヒト不死化または初代細胞株、オルガノイド、異種移植片など)に完全に準拠することができる。私たちの研究室の最近の研究では、ハイコンテントビデオ顕微鏡と画像分析を組み合わせることにより、競合する3Dレイアウトを適用して調査しました:i)抗腫瘍(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、ADCC)免疫応答と解剖HER2+ 乳がんオンチップモデル33;ii)腫瘍回避およびT細胞の動員のメカニズムにおける骨髄系細胞(すなわち、癌関連マクロファージ)の作用34;iii)コラーゲンマトリックス中の薬物処理された結腸癌細胞とともに培養されたインターフェロンα馴化樹状細胞(IFN-DC)に基づく免疫療法レジームの有効性、および効率的な運動とその後の食作用イベントを評価する35;iv)IL−33処置または未処置のメラノーマ細胞36に向かう骨髄由来好酸球の走化性遊走。
これらの高度なモデルは、がんの転移と耐性メカニズムにおける免疫コンテクスチャーの役割を理解するための観察ウィンドウとして役立つ可能性がありますが、調査結果を臨床に変換し、基礎研究とのギャップを埋めるための努力が必要です37。
新たなシナリオとして、自動化されたハイコンテント顕微鏡の力と、より生理学的に関連性のあるマイクロシステムの使用を組み合わせることで、1つの実験キャンペーンから生成できる数百、さらには数千ギガバイトのマルチパラメトリックデータの処理、処理、解釈に新たな潜在的な課題が生じています。これは、OOC実験と人工知能38,39,40,41,42(AI)ベースのアルゴリズムとの直接的なリンクを意味し、高度な自動分析と、癌と免疫の相互作用のインシリコモデルを順番にフィードできる機能の生成43、予測薬物スクリーニングアッセイの開発などのエキサイティングな新しいアプリケーション44。
拡大し続ける取り組みの流れは、疾患モデルの設計と、単一細胞マルチオミクス読み出しを備えた大規模な摂動スクリーンを実装するための戦略の最適化に焦点を当てています。これは間違いなく、免疫疾患と癌の播種メカニズムに関する新しい洞察を得るための体系的な腫瘍免疫学オンチップアプローチの開発と、できれば適切な程度の方法の標準化を伴う臨床実装に役立つでしょう。
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Protocol
1. 接着細胞と浮遊細胞の2D共培養のためのチップ設計
注:2D共培養レイアウト(図1A-C)は、2セットのマイクロチャネルアレイ(500 x 12 x 10 μm 3、L×W×H)によって相互接続された3つのチャンバー(高さ100 μm)によって特徴付けられます。中間チャンバーは、負荷ステップ2.5の間に腫瘍部位にオーバーフローする浮遊免疫細胞をブロックする2つの閉じた行き止まりコンパートメントを形成します。このデバイスタイプは、単一細胞(接着性または浮遊性のいずれか)の運動性、および細胞間相互作用のリアルタイム二次元測定に役立ちます16、27、28、30、31。典型的な細胞遊走研究(数時間から数日実施)は、取得した画像配列を数値的特徴に変換するために、生細胞顕微鏡と画像処理アルゴリズム45を組み合わせる25。遊走パターンに基づいて、細胞の変位および速度、ならびに免疫細胞および標的細胞相互作用の持続時間など、いくつかの生物物理学的指標を推定することができる24。
- がんおよびPBMC細胞の調製
- がん細胞培養
注:MDA-MB-231トリプルネガティブ[エストロゲン受容体(ER)-、プロゲステロン受容体(PR)-、およびヒト上皮成長因子受容体2(HER2)-]ヒト乳房腺癌細胞は、10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 IU mL-1ペニシリンGナトリウム塩および100 μg mL-1硫酸ストレプトマイシン(増殖培地)を添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地で日常的に増殖されます。 標準培養条件下(37°Cおよび5%CO2)。- 細胞培養増殖を最適化するために、MDA-MB-231細胞を12〜15mLの増殖培地中で1×10個の細胞mL-1の密度で75cm2フラスコにプレートする。
- 細胞がコンフルエントの75〜80%に達したら、増殖培地を廃棄し、予温したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄してFBSを完全に除去し、次に予温したトリプシンで剥離します(37°Cで1〜2分)。
- 増殖培地を添加してトリプシン酵素活性を不活性化し、剥離した細胞を回収します。室温(RT)で1,100 x gで5分間細胞を2回洗浄します。
- Trypan Blue色素排除試験によって細胞計数スライド内の細胞をカウントし、維持培養(解凍から6継代以内)または実験手順のためにそれらを再播種します。
- マイクロ流体実験では、3 mLの増殖培地中の6ウェルプレートに1×106細胞を播種し、コントロールとして25 μMドキソルビシン(DOXO)または等容量のFOXO溶媒(PBS)で処理します。
- 4〜6時間後、DOXO処理した細胞を予熱したPBSで2回洗浄し、RTで1,100 x gで5分間洗浄します。
- 上記のようにDOX処理およびPBS処理されたコントロール細胞をカウントし(ステップ1.1.1.5を参照)、マイクロ流体デバイス内の末梢血単核球(PBMC)との共培養を設定します。
- PBMC アイソレーション
- 健康なボランティアから静脈全血(約10 mL)をヘパリン化バイアルに集め、チューブを2〜4回反転させて穏やかに混ぜます47。
- 血液をPBSで1:1に希釈し、50 mLチューブに10 mLの密度勾配培地Lymphoprepを層状にします。
注:血液とリンパ球が2つの異なる層を形成するように、非常に穏やかかつゆっくりと重ね合わせを行うようにしてください。 - ブレーキなしのスイングアウトバケットで4°Cで400 x gで30分間遠心チューブ。4つの異なる層が形成されます:(i)上部の血漿、(ii)PBMCを含む白くて曇った層、(iii)リンパ球、および(iv)赤血球と顆粒球のペレット。
- PBMCを2 mLピペットで穏やかに吸引し、すぐに温かい増殖培地(ステップ1.1.1で使用したもの)に再懸濁し、RTで1,100 x gで5分間2回洗浄します。
- 上記のようにペレットPBMCを数え(ステップ1.1.1.5を参照)、実験手順に使用するか、長期保存のために凍結します。
- がん細胞培養
- 2Dチップでのセルのメッキ
メモ: PBMC はこのプロトコルでは染色されません。オンチップで特定の表現型を特徴付けるために、免疫細胞サブポピュレーションを免疫磁気ビーズ選択によって単離し、蛍光細胞トラッカーで染色し、標識されていない残りの画分と再混合し、したがって標的癌細胞と対峙させることができる(オンチップ実験で報告されているように、Vacchelli et al.27およびRacioppi et al.34)。- 共培養実験を開始する前に、試薬の添加を容易にするために、酸素プラズマ処理によって保存されたチップを数秒間活性化します。すぐにリザーバーに脱イオン水またはPBSを満たし、めっきステップまでPDMS(ポリジメチルシロキサン)表面の親水性を維持します。
注意: PDMSは本質的に疎水性であるため、操作やマイクロチャネルへの気泡の閉じ込めが困難になる可能性があります。酸素プラズマの活性化に関する詳細を提供する補足ファイルのステップ7を参照してください。 - UVキャビネット下で20分間滅菌し、新鮮なPBSで2〜3回洗浄した後、培地で1時間インキュベートします。めっき工程を行うまでチップをインキュベーターに保管してください。
- 6つのリザーバーすべてから余分な培地を取り出します。メインの培養室から培地を吸い上げないように注意してください。
- 1〜20 μLの増殖培地に再懸濁した1×105個のがん細胞を左上のリザーバーにゆっくりと適用し、次に下のウェルに塗布します(図1A、リザーバー1および2)。細胞が腫瘍室に付着するまで5分間待ちます。いくつかの細胞は沈降し、貯水池に付着します。
注意: チャネル開口部の横にセルラー懸濁液を挿入します。この手順はMDA-MB-231癌細胞に適用され、他の系統は細胞密度の最適化を必要とするであろう。癌細胞の付着を改善するために、表面のコーティング機能化(例えば、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン)を行うことができる。コーティングステップ16、48、49、50については、以前に公開されたプロトコルを参照してください。 - 右側で、1×10個の6 PBMCを50 μLの成長培地に再懸濁してウェル3および4に穏やかにピペッティングします(図1A、リザーバー3および4を参照)。
注:流れた後、PBMCは中間チャンバーに分配し、実験の開始点を表す「フロント」を作成します。 - 6つのリザーバーすべてに最大100〜150 μLの成長培地を充填します。顕微鏡下で、図1D-Eに示すように、細胞が培養コンパートメントに正しく分布していることを確認します。最終的な容量は、貯水池のサイズによって異なります。すべてのウェルで等しくなるように容量を調整します。
- チップをインキュベーターに約1時間戻し、タイムラプス記録の前にシステムを安定させます。蒸発損失を受ける可能性があるため、3日ごとに新しい培地を追加します。
注:このシステムは、生細胞/死細胞分析と、馴化培地からの動的マルチプレックスサイトカイン分泌プロファイリングの両方と互換性があります。ケモカイン分析の場合、各コンパートメントの2つのリザーバーから培地を収集することにより、最大200〜250 μLの上清アリコートにアクセスできます。従来のELISAおよびLuminexサイトカインプロファイリングアッセイでは、約50 μLの上清が必要です。OOCモデルでサイトカインプロファイリングを実施している他の研究室の研究の51,52の例をご覧ください。
- 共培養実験を開始する前に、試薬の添加を容易にするために、酸素プラズマ処理によって保存されたチップを数秒間活性化します。すぐにリザーバーに脱イオン水またはPBSを満たし、めっきステップまでPDMS(ポリジメチルシロキサン)表面の親水性を維持します。
- 非標識がんおよび免疫細胞のタイムラプス取得
注:通常、3つのチップが1つの顕微鏡スライドに配置されます(2Dチップについては図1A、3Dチップについては図4Bを参照)。4枚のスライドを割り当てるステージホルダーを使用して、共培養は、実験条件の大規模なバッチを分析するために自動化されたハイコンテント顕微鏡法によるモニタリングに適しています。チップは、厚さ1mmまたは170ミクロンのスライド(プラスチックまたはガラスカバースリップ、6ウェル光学底部マルチウェル)に簡単に取り付けることができ、高解像度の共焦点イメージングが可能です。- インキュベーションシステムを備えたビデオ顕微鏡セットアップを使用して、ラベルのない細胞の明視野画像シリーズを記録します。
注:ここでは、時系列データセット(時間枠:48時間、フレームレート:2分)を、標準的な細胞培養インキュベーターに収まるように最適化された4倍の対物レンズとCMOS 1.3Mピクセルを備えた蛍光顕微鏡で取得しました。 - 顕微鏡を少なくとも2時間温めて、37°Cと5%CO2に平衡化してから取得を開始します。
- 腫瘍と中央コンパートメントの間のマイクロチャネルアレイを中央に配置することにより、観察ウィンドウを選択します。これにより、免疫浸潤の動態やがん細胞が播種される領域内の相互作用を可視化することができます。
- がんや免疫細胞の照度と焦点を調整します。
- タイムラプス取得を開始するには、実験と研究中の細胞タイプに応じてフレームレートと時間を最適化します。
注意: 良好な信号対雑音比(SNR)を維持しながら、過度の露光を避けるために、イメージング条件を最適化する必要があります。免疫細胞は非常に運動性であるため、獲得フレームレートは、対象の動的プロセスに従い、容易な追跡を可能にするのに十分高い必要がある53。追跡アルゴリズム、結果のデータセットのサイズとの互換性、および観察された細胞の生存率、密度、および運動性の間で妥協点に達する必要があります。 - タイムラプスの最後に、ImageJソフトウェアの[画像シーケンスのインポート]と[名前を付けて保存]機能を使用して、フレームデータセットを25fpsの非圧縮ビデオファイルに変換します。
注:生成されたビデオファイルは、セルトラッキング分析の準備が整いました。ここでは、RGB(1280x1024ピクセル)画像を1.33μm/ピクセルの空間分解能で収集しました。単一視野 (FOV) の 24 時間のムービー (3.5 GB スタック) は、条件ごとに 720 フレームで構成されます。
- インキュベーションシステムを備えたビデオ顕微鏡セットアップを使用して、ラベルのない細胞の明視野画像シリーズを記録します。
- データ解析:トラックメイトによる非標識免疫トラックの半自動抽出
注:ここでは、TrackMateを使用して、2Dラベルなしタイムラプス画像の免疫運動分析が実行されます54、フィジー/ImageJソフトウェアバンドル(https://imagej.nih.gov/ij/)で利用可能なオープンソースツールボックス。自動化された単一粒子追跡を実行するために、いくつかのアルゴリズムが提供されています55(SPT)斑点状構造の。これらは、SNRの高い暗い背景(すなわち、サブ解像度蛍光スポット、標識された交通小胞、核)で物体が明るい蛍光画像に効率的に適用されています。1,25,56,57,58.SPTは主に2つの連続したステップに基づいています。まず、オブジェクトは、図式化されているように、複数のフレームで識別された位置(セグメンテーション)でローカライズされます。図 2.第2段階(パーティクルリンク)では、検出されたスポットが連続したフレームにわたってリンクされ、動きを推定し、トラックの形状でそれらの軌道を再構築します(図 3).数値特徴は、抽出された各 X、Y、Z 座標配列から経時的に計算できます。拡張ドキュメントは、54オンライン(http://imagej.net/TrackMate)と同様に、TrackMate入門チュートリアルに従います。プロセスの精度を即座に検査でき、直感的なグラフィカルユーザーインターフェイス(ウィザードのようなGUI)を使用して、ユーザーはすべてのステップで設定を再調整できます。次のパートでは、Trackmateを使用して、可視光画像に適用される画像処理と定量化の手順を簡単に説明します。- フルタイムのビデオ/画像スタックをフィジーツールバーにドラッグアンドドロップします。
- キャリブレーションスタックのセットアップ(図2A)。
- 次元を確認し、[画像] > [プロパティ] を選択して画像のプロパティを割り当てます。[長さの塗りつぶし単位]、[ピクセルサイズ]、[フレーム間隔] ボックス。
注意: キャリブレーションを実行するには、マイクロチャンネルの既知の長さ(500 μm、図1C)を使用し、対応する測定された長さ(ピクセル単位)で除算します。2D 時系列の場合は、Z スライスとして 1 を入力する Z/T フィールドと正しいムービー フレーム数を入れ替えてください。達成されない場合、トラックメイトの定量的出力とパラメーターはピクセル単位と時間枠で報告されます。
- 次元を確認し、[画像] > [プロパティ] を選択して画像のプロパティを割り当てます。[長さの塗りつぶし単位]、[ピクセルサイズ]、[フレーム間隔] ボックス。
- 画像の前処理。
- ノイズの多い背景からの免疫細胞の正しい識別を強化するには、明視野画像を前処理してアーチファクトを補正します。データセットが 8 ビット TIFF 画像 (明るさの範囲: 0 から 255) で構成されていることを確認します。
注:不均一な照明、低いSNR、および可視光画像の小さな破片粒子による汚染は、細胞追跡プロセスの成功を損なう可能性があります。ここでは、時系列データセットは、背景減算、明るさ/コントラスト調整機能、および元の画像からのガウスぼかしのローカル画像減算によって前処理されます。ImageJには、経験的勾配閾値(EGT)59など、位相差画像または明視野画像の処理とセグメンテーションのために利用できる他のさまざまな解析ツールキットがあります。
- ノイズの多い背景からの免疫細胞の正しい識別を強化するには、明視野画像を前処理してアーチファクトを補正します。データセットが 8 ビット TIFF 画像 (明るさの範囲: 0 から 255) で構成されていることを確認します。
- 最初のキャリブレーションパネル(図2A)
- 画像スタックを選択した状態で、トラックメイト(プラグイン>トラッキング)を起動します。 データの次元と時間ウィンドウ(ピクセル幅とフレーム間隔など)を修正/確認します。
注意: TrackMateは、画像のプロパティボックスを自動的に読み取り、キャリブレーションされた物理単位(つまり、μmと分)で最終的な追跡結果を提供します。 - 免疫トラックの抽出を計算するための関心領域を定義するには、手動で値を挿入するか、アクティブな画像の上に閉じた領域を描画し、[ソースの更新]ボタンを押します。全体的な免疫移動経路を抽出するには、マイクロチャネルの右側(中央チャンバー、図1E)と左側(腫瘍チャンバー、図1D)の長方形領域をそれぞれ選択します。がんと免疫ホットスポットの相互作用を分析するには、ROI ツールを使用して円形のサブ領域を描画します (「選択→編集」→「指定」に移動します)。
注:このツールボックスを新しい生物学的アプリケーションで初めて実行する場合は、トラックを再構築するための設定を最適化するために必要な時間を費やしてください。
注:セル軌道(約50〜100セル)を手動で追跡して、経験的に適切な構成を見つけ、次にベンチマークとして動きの自動抽出の信頼性を検証します。さらに、選択したパラメータの精度を簡単に確認できるように、最初はより小さな領域で作業します。
- 画像スタックを選択した状態で、トラックメイト(プラグイン>トラッキング)を起動します。 データの次元と時間ウィンドウ(ピクセル幅とフレーム間隔など)を修正/確認します。
- 免疫スポット検出ステップ(図2B)
- デフォルトのラプラシアンガウス(LoG)検出器を選択します。LoG検出器は、明るくブロブのような丸みを帯びたオブジェクトを見つけ、中間スポットサイズ(直径5〜20ピクセル)に調整された画像にガウスのラプラシアンフィルターを適用するように機能します。
- 推定ブロブ直径(ここでは10〜13 μm)に、予想されるスポットサイズよりわずかに大きい値を入力します。しきい値(ここでは1〜3μm)の値を、オブジェクトの特徴を削除せずに余分なスプリアスバックグラウンドスポットが減少するまで増やします。(品質指標に基づく) しきい値を下回る検出は、後続の分析から破棄されます。メディアンフィルターとサブピクセルローカリゼーションのチェックボックスをオンにして、スポット検出の品質を向上させます。
- プレビューボタンを使用すると、画像上にマゼンタ色の円を重ねた同定された免疫細胞を表示してすばやく検査できます。
注意: 検出中の間違いは、リンクプロセスに大きな影響を与えます。その他の不要な検出は、ユーザー定義のフィルター(つまり、スポット強度、サイズ、または位置)によって後続のメニューで修正できます。
- 選択に満足したら、[次へ]をクリックします。
注:これらの設定は、実験のセットアップと取得イメージングモダリティ(FOV、対物倍率、明視野または蛍光画像など)、細胞タイプ(接着細胞または浮遊細胞)、遅い運動性または速い運動性、細胞挙動の種類(相互作用するかどうか)、および観察領域の低/中/高密度。 - 続行し、初期しきい値メニューをスキップします。[ハイパースタック ディスプレイ] ウィンドウを選択します。
- スポットパネルにフィルターを設定します(図2C)。
- 選択:均一な色。図2Cに示すように、フィルタを追加して、可逆閾値を上回ったり下回ったりするヒストグラムで表示される特徴値を持つラベル付きスポットを保持することができます。
- トラッカー選択段階(図3A)。入力する3つのフィールドを要求するパーティクルリンクアルゴリズムとして、Simple LAPトラッカーを選択します(この場合、「リンク最大距離」:30〜50 μm、「ギャップを閉じる最大距離」:25〜50 μm、「ギャップを閉じる最大フレームギャップ」:4〜6)。この検出器は、ギャップを閉じるイベントを管理し、それぞれの距離のみに基づいてコストリンクを計算します。
注:最大許容リンク距離は、2つの後続のフレーム間を移動する最大許容変位に対応して、一致する候補スポットの空間検索範囲を制限します(図3D)。- 運動性の高い粒子のトラックの断片化に気付いたときに、最大変位の値を大きくします。
注意: フレーム間の移動が指定された最大距離値よりも大きい場合、2つのリンクは接続されません。セグメントが 2 つの異なるセルをうまく橋渡ししない場合は、最大変位の値を小さくします。 - 「ギャップを閉じるための最大距離」と「最大フレームギャップ」の値を変えて、欠落しているスポットを再接続してみてください。
注: これらのパラメータは、隣接していないフレームのギャップ クロージング イベントを処理します。スポット消失は、一部のフレーム(すなわち、焦点の合っていない粒子、FOV内の細胞が流出し、ノイズの多い画像でのセグメンテーションの失敗)で発生する可能性があります。
注:イベントの分割またはマージを処理するには、リンクコストマトリックスペナルティを導入する検出器としてLAPリンカを選択します。
- 運動性の高い粒子のトラックの断片化に気付いたときに、最大変位の値を大きくします。
- [次へ] をクリックして、トラッキング計算を実行します。[次へ] を押します。
- フィルタリングトラックパネル(図3B)。ドロップダウンメニューから「トラックID」またはその他のトラック機能を選択して、免疫経路の色を変更します。この時点で、オプションで対話型フィルターを機能するように設定し、結果の品質を向上させ、手順を再検討することを選択します。
注:スプリアススポットは、画像内のノイズとフィーチャ品質の低下から発生します。これにより、短いセグメントが生成されますが、関心のあるセルを多くのフレームで追跡できます。- 短いパスを削除するには、パスに含まれるスポットの数に基づいて除外してみてください。さらに、トラックの変位、トラックの継続時間、最小/平均/最大速度などのオプションの組み合わせを使用してトラックを並べ替え、誤ったトラックや不要なトラック(タイムラプスの全体的な継続時間に対してフレームが少ない、または汚れたパーティクルや移動していないパーティクルを含む)を以降の後処理から除外します。
注:フィルターの選択は、特定のアプリケーションと生物学的システムによって異なります。
- 短いパスを削除するには、パスに含まれるスポットの数に基づいて除外してみてください。さらに、トラックの変位、トラックの継続時間、最小/平均/最大速度などのオプションの組み合わせを使用してトラックを並べ替え、誤ったトラックや不要なトラック(タイムラプスの全体的な継続時間に対してフレームが少ない、または汚れたパーティクルや移動していないパーティクルを含む)を以降の後処理から除外します。
- [表示オプション] インターフェイスですべてのトラックを調べ、時間をスクロールして、トラックがセル移動パスとどの程度一致するかを確認します。ドロップダウンメニューには、スポットとパスのカラーコードが表示され、いくつかのモダリティ(運動パラメータ、強度、時間的または空間的位置など)による視覚化とフィルタリングを簡単に行うことができます。
注:高密度培養または高運動細胞を追跡するには、取得フレームレートを上げて、連続した時間間隔で移動する細胞の変位を最小限に抑えます。 - セグメンテーションとリンクの間違いを手動で修正します(図3E)。
- 結果の品質をさらに高めるには、手動でスポット(破片粒子、静止細胞)を編集し、腫瘍と免疫の相互作用のROIを分析するときに、検出された腫瘍境界に由来する誤ったトラックを削除します。
- まず、ImageJツールバーでトラックメイトツールを選択します。スタック全体の既存のスポットを削除するには、Shiftキーを押しながらマウスカーソルでターゲットスポットの上にROIマスクを作成し(緑色の円で編集)、DELキーを押します。
- 新しいスポットを追加するには(スポットが消えたためにトラックが欠落している場合)、Aキーを押して、ポイントされた場所にマウスを置きます。このステップの後、トラックリンク計算プロセスを繰り返します。
- 問題がなければ、[表示オプション]パネルの[解析]を選択して、3つのテキストファイルを生成します(図3Cおよび3F)。「トラック内のスポット統計」の表は、免疫スポットの時空間座標(関連するフレームとトラック番号でラベル付けされた細胞のX-Y-Z位置)を提供します。「トラック統計内のリンク」と「トラック統計」には、トラックに関連する情報(トラックの継続時間、検出されたギャップまたはスポットの数、トラックの初期フレームとストップフレームなど)が含まれます。データセットごとに保存してエクスポートします。
注:結果表示ウィンドウ内の行をクリックすると、タイムラプスビデオ内でそれぞれのスポット、リンク、またはトラックがアクティブになり、目視検査が行われます。フィルタリング手順を繰り返して、トラックを選択/削除します。今後エクスポートされるすべてのデータが更新されます。ヒント:トラックの初期フレームとストップフレームの値、およびトラック期間の値を利用して、相互作用のROIを処理するときにがんと免疫細胞の間の接触時間を計算することができます。 - [保存] ボタンを押すと、すべてのパラメーター値、画像へのパス、および時間内のスポット位置を含む結果の XML ファイルが生成されます。''TrackMate ファイルをロード'' コマンド (プラグイン> トラッキング) は、各ムービーファイルのプロセスセッション全体を個別に復元します。
- GUIの最後のパネル「アクションの選択」に移動します。リストで、オーバーレイ>実行機能を使用して、トラックがオーバーレイされたビデオを作成します。ヒント:「Nスポット対時間プロット」オプションを使用して、ROIにおける免疫細胞の空間密度を計算できます(図6B、右パネル)。
- 後処理分析と移行統計
- 生の位置データをトラックメイトで直接分析するか、またはデータをエクスポートして、包括的な運動パラメータ29(すなわち、総軌道長、ユークリッド距離、閉じ込め比、平均二乗変位56、平均または瞬間トラック速度、停止係数、移動角の分布、前方移動指数、平均直線速度)を計算して、免疫細胞遊走挙動(例えば、指向性または拡散運動30、31)および標的癌細胞に対する応答(例えば、治療対対照)。
注:走化性および移行ツール(http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/)などの追加の便利なプラグインは、さまざまなグラフ(図6に示されているようなローズプロットまたはセクタープロットなど)と、実験的な移動および走化性データの高度な分析と視覚化のための統計テストを提供します。細胞追跡および細胞セグメンテーションアルゴリズム24、25、45を組み合わせることで、単一細胞レベルでの形態学的測定基準(すなわち、細胞表面積、長軸および短軸の長さ、ならびに細胞アスペクト比)の測定が可能になり得る。
- 生の位置データをトラックメイトで直接分析するか、またはデータをエクスポートして、包括的な運動パラメータ29(すなわち、総軌道長、ユークリッド距離、閉じ込め比、平均二乗変位56、平均または瞬間トラック速度、停止係数、移動角の分布、前方移動指数、平均直線速度)を計算して、免疫細胞遊走挙動(例えば、指向性または拡散運動30、31)および標的癌細胞に対する応答(例えば、治療対対照)。
2. 競合アッセイにおける3D免疫コンピテントがんオンチップモデル
注:図4に示す 3Dチップの設計は、浮遊免疫細胞摂取用の中央コンパートメント、ヒドロゲルマトリックス(高さ150〜250μm)に腫瘍細胞を埋め込むための2つのサイド領域、および培地灌流チャンバーの5つの主要なコンパートメントで構成されています。免疫室および腫瘍室は、2組の狭いアレイのマイクロチャネル(200×12×10μm3、L×W×H、図4E)によって接続されている。規則的に100μm間隔の台形二等辺三角形のマイクロピラー(各側ゲル領域に約25〜30の界面、図4C)は、表面張力と毛細管力のバランスを利用して、注入中にゲル溶液を閉じ込めるための障壁として機能し60,61、腫瘍領域を2つの横方向の追加媒体チャンバーに接続してゲル-液体界面を設定します(図5)。3D競合アッセイの詳細な特徴を図4に示します。異なる治療を受けた腫瘍細胞をホストする2つのヒドロゲル区画への免疫細胞の優先的移動をモニターおよび定量化することができる。特定の競合レイアウトは、多数の異なるがん生物学表現型(例えば、薬剤耐性対攻撃性、原発性または転移性、レスポンダー対非レスポンダー)を調査するために適用することができる。さらに、ゲル包埋領域は、異なる細胞集団と容易に統合して、間質成分(線維芽細胞、内皮細胞)23を含むより不均一なTMEを再現したり、薬剤耐性および腫瘍回避のメカニズムを解剖するための特異的免疫抑制環境34(マクロファージなど)をシミュレートしたりすることができます。
注:Nguyenらで報告されているように、核および活性カスパーゼ染色は、生/死アッセイ用の市販キット(サーモフィッシャーサイエンティフィック、Incucyte試薬など)を使用して実施できます。
- 細胞を含むマトリックス溶液の調製とデバイスへのローディング
注:次の実験設定では、2つのゲル領域には、マトリックス溶液(マトリゲルなど)で増殖し、単剤療法または組み合わせて使用される治療薬にさらされたヒトA375Mメラノーマ細胞株の混合物が含まれています。この設定により、単一の薬剤に対する2つの薬剤の組み合わせの有効性を競争力のある方法で評価し、PBMCを引き付ける能力を定量化することができました。- 実験の1日前に、氷上に4°Cの冷蔵庫に入れて、マトリックス溶液(マトリゲルなど)のストックを解凍します。
注意: 製品は「塊状」になるため、製品を複数の凍結解凍サイクルにさらさないでください。他の合成または天然ヒドロゲルのプロトコルは、この設定において使用するのに適し得る。コラーゲンマトリックス中の癌細胞の調製については、33,34,35を参照してください。 - A375ヒト黒色腫細胞を、生態性PKH67緑色蛍光細胞リンカーでマトリックス溶液(2 mg mL-1)に再懸濁します。指示がある場合は、DACと呼ばれる5-アザ-2'-デオキシシチジン(DAC;2.5 μM)、および/またはIFNと呼ばれるIFN-α2bを適切な用量で追加します32。
注意: マトリックスボトルのスペックシートのロット#と一致します。濃度に基づいて、最大2 mg mL-1を作るのに必要な培地の量を計算します 目的の用途に応じて、最適なタンパク質濃度と癌細胞懸濁液濃度を調整してください。 - 気泡の発生を避けるために慎重に上下にピペットします。不要な重合を防ぐために、混合中は微量遠心チューブを氷上に置いてください。
- 滅菌後、セルローディングの全手順中にマトリックス溶液が固化するのを防ぐために、デバイスを氷上に置きます(アイスバケットと蓋を使用)。
- 2つのIFNおよびDAC/IFNマトリゲル/腫瘍細胞混合物(2〜4 μL)を、コールドチップを使用してそれぞれ10 μLのマイクロピペットで左右のゲルポートにゆっくりと注入します(図5A)。穏やかな圧力を加えて、マトリックス溶液を反対側に達するまで一方の側から押します。
注:マトリックス溶液の体積は、隣接するチャネルにオーバーフローしないように選択されました。溶液が媒体や中央チャネルに漏れるのを防ぐために、過度のピペッティング圧力をかけないでください。ローディング中にゲル経路がチャネルに沿ってブロックされている場合は、ゲルの前面が出会うまで、もう一方の入口から溶液を挿入してみてください。マイクロピペットを入口から取り外すときは、プランジャーを握ってください、そうでなければ負圧がマトリックス溶液を吸引します。 - 装置を37°Cの直立位置のインキュベーターに置き、5%CO2を30分間使用して、マトリックス溶液のゲル化を起こさせます(図5B)。未重合ゲルが埋め込まれたケアチップで取り扱い、ゲルチャネルからの漏れを防ぎます。
- それまでの間、PKH67標識PBMC(1x106細胞)を10 μLの完全DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)に再懸濁します。
- マトリックスゲル化後、チップ内のゲル乾燥を防ぐために、6つのリザーバーすべてに培地チャネルに同じアリコートの培地(50-100 μL)を満たします。免疫細胞懸濁液が播種されるまでインキュベーターに保管してください。
注:顕微鏡で、ゲル内の腫瘍細胞の正確で均質な分布と重合ゲルバリアの完全性を確認します。混合物中の部分的または均一ではないゲル化領域または気泡は、圧力初期変動のために、実験の開始点でゲル媒体チャネルにおけるPBMCの早期流動をもたらす。 - 6つのウェルから培地を吸引し、先端を培地チャネルの入口付近に配置して、中程度の圧力のPBMC細胞懸濁液を穏やかに注入します。読み込み時間シーケンスを図 5C に示します。
- PBMCを10 μL培地で上部中央ウェルに入れます。
- 50〜100μLの培地を横方向チャネルの4つのウェルのそれぞれに入れる。
- 上部中央ウェルに40〜90μLの培地を入れます。
- 50〜100μLの培地を下部中央ウェルに入れます。
- 顕微鏡下で、ローディングステップ後、PBMCの分布が中央チャンバーに閉じ込められたままであることを確認します。(図7A)。
注意: 最適でない場合は、必要に応じて濃度を調整し、手付かずのチップを使用して播種手順を繰り返します。計画された実験条件の体積を計算するときは、潜在的なエラーと調整を考慮して、過剰なチップ数(15〜20%)を参照してください。容量と濃度は、特定の用途に応じて最適化する必要があります。 - 組み立てたデバイスをインキュベーター内の平らな面に37°C、5%CO2で置き、その後の蛍光イメージング取得を行います。浮遊している免疫細胞をロードした後、ケアチップで取り扱ってください。
注意: 2〜3日ごとにメディアを交換することにより、リザーバー内のボリュームの蒸発損失を補います。ケモカインプロファイリングでは、培養コンパートメントの2つのウェルのそれぞれから最大100 μLを吸引できます(ステップ1のステップ2.7を参照してください)。
- 実験の1日前に、氷上に4°Cの冷蔵庫に入れて、マトリックス溶液(マトリゲルなど)のストックを解凍します。
- ImageJのシングルチャンネル蛍光画像中のリクルートされたPBMCの自動カウント
注:共焦点高解像度イメージングのための免疫蛍光の古典的な方法は、エンドポイント測定としてオンチップ操作に適用できます。基本的な染色手順には、細胞オンチップ固定、透過処理、ブロッキング、抗体結合、核の染色が含まれ、その間に洗浄ステップがあります。がん微小環境が埋め込まれた3Dゲル領域に浸潤した非標識免疫細胞は、所望の時点で固定し、活性化/枯渇/成熟の発現マーカーについて染色することができます(例:CD8細胞の場合、CD69、CD95、PD1、TIM3マーカーのモニタリング)。パルラートらで。35、SW620アポトーシス細胞の食作用は、厚さ170μmのカバーガラスに取り付けられたデバイスを使用して、共焦点顕微鏡によって評価されました。IFN-DCは、オンチップの抗ヒトHLA-DR-FITC Abアリコートを加えて染色した。
競合シグナルに挑戦した浸潤蛍光染色された生きた免疫細胞の程度を計算するために、一般的な画像解析ワークフローを次のように設定します(図 7D-G):- 腫瘍細胞を含む左右のゲル領域を、それぞれ単一または薬理学的レジームの組み合わせに曝露した左右のゲル領域の特定の時間エンドポイント、位相差、および赤/緑チャネルの蛍光顕微鏡写真を取得します。
注:ここでは、細胞ローディング後(0時間)、48時間後、およびインキュベーション72時間後にEVOS-FL蛍光顕微鏡で画像を取得しました(図7A-B)。4倍から10倍の倍率を使用して、中央チャンバー、マイクロチャネルアレイ、およびA375とIFNとA375とDAC / IFNを含む2つの並置されたサイドチャネルを取得しました。- 取得操作を実行するときは、カウントするフィーチャの飽和を測定して回避するためのパラメータを考慮してください。最適なセグメンテーションの結果は、生物学的サンプル自体のばらつき、染色の品質、およびユーザー指向のアプリケーションに使用される顕微鏡技術により、取得した画像の性質によって異なります。
- 蛍光シングルチャンネルデータ(この場合は赤=PBMC)をメインウィンドウにドラッグしてフィジーにロードします(図7D)。最終セグメンテーションまでの前処理フィルターの選択中に生データが上書きされないように、画像を複製します。
- 画像がカラー画像(RGB)の場合は、画像>タイプ8または16ビットを押してグレースケールに変換します。[ 変換> > オプションの編集]が変換時に拡大縮小に設定されていることを確認します。
- ノイズやアーティファクトのクリーンアップによる生データの前処理。
- ローリングボールアルゴリズムを適用して、[バックグラウンド>減算]メニューに移動し、強度の空間的変化が大きい不均一なノイズバックグラウンドを修正します。半径を少なくとも最大の前景パーティクルのサイズに設定します。最適な結果を得るための試行錯誤の手順のプレビューボックスを選択します。値が小さすぎると、目的の構造体が誤って削除される可能性があります。
- [明るさとコントラスト] コマンドで、[最小/最大] スライダーをドラッグして、ヒストグラムの強度の範囲を変更します。[最大] スライダーを左にシフトして、ウォッシュアウト機能なしで明るさを上げます。[最小] スライドを右に移動すると、画像のコントラストが上がり、背景の目立たないフィーチャが消えなくなります。[適用] をクリックして変更を修正します。
- 画像強調。
- >フィルターの処理に移動し、画像の中央値、ガウスフィルターを試してください(図7E)。
注意: 事前フィルタリング半径は、画像のノイズピクセルに適合させる必要があります。非線形メディアンフィルターは、ピクセル値を隣接の中央値に置き換えて、塩コショウのノイズを低減します。「ガウスぼかし」は、ピクセルを周囲のピクセルの加重平均に置き換えることにより、デジタル画像を滑らかにするために使用されます。重みはガウス確率分布から取得されるため、最も近いピクセルがより影響力があります。 - 必要に応じて、[>数学>ガンマをオンにしたプレビューボックスで処理]に移動して、コントラストを上げます。
注:B&Cパネルで設定された強度は、2つの最小制限と最大制限の間でスケーリングされます。値 < 1.0 は低強度間の違いを強調し、値 > 1.0 は高強度間の違いを強調します。ガンマ補正は、表示範囲を見つけるために機能し、最も明るいオブジェクトを飽和させることなく、最も暗いオブジェクトを表示します。
- >フィルターの処理に移動し、画像の中央値、ガウスフィルターを試してください(図7E)。
- バイナリイメージマスクの作成。
- 画像に移動し>>しきい値を調整します。閾値を決定するために最も簡単に採用される方法は、図7Fに示すように、強度レベルのヒストグラム分析に依存しています。ドロップダウンメニューで、さまざまなグローバルしきい値処理方法を試します(この場合、Otsuが適用されます)。
- 手動でスクロールするか、ヒストグラムパネルに既知の範囲のピクセル強度を入力し、実際のセル領域にほとんど似ている画像にオーバーレイする赤いパターンの変化を観察します。[リセット] ボタンをクリックすると、オーバーレイが削除されます。問題がなければ、[適用] をクリックしてイメージのバイナリ バージョンを生成します。[バイナリ>>処理オプション]をオンにして、しきい値画像の表示方法とパーティクルアナライザによるオブジェクトの識別方法を制御します。
- メニュー コマンドの[プロセス/バイナリ/集水域パーティクル]を使用して、しきい値中に部分的に重なり合っている、またはマージされているものを分割します。集水域では、多くの場合、1 ピクセルの太い線を追加することで、それらを正確に分割できます。拡張操作や侵食操作などの形態学的操作を実行して、飽和不足または過飽和のピクセルからピクセルを拡大または削除します。
注: 詳細については、「メニュー コマンド」セクションを参照するか、バイナリ データを処理するための数学的形態に基づく統合ライブラリである MorphoLibJ を参照してください。 - 定量的な画像機能の説明。
- 満足のいく物体認識が得られたら、[分析]>[粒子の分析]から粒子分析ツールを開きます。粒子は、ピクセルまたはキャリブレーションされた測定単位で表すサイズと円形度によって除外できます(画像>のプロパティで顕微鏡設定に対する正しいスケールを確認してください)。すべてを含めるには、既定値の 0-無限大と真円度の既定の範囲を 0.00 から 1.00 (0 = 直線、1 = 完全な円) のままにします。
- 小さな「ノイズ」ピクセルまたは関心のないフィーチャをフィルタリングするには、最小範囲と最大範囲を設定します。ウィンドウフィールドに穴を含める、表示、アウトライン、および結果を表示するオプションにチェックマークを付けます。[エッジで除外]は、画像の境界で検出されたパーティクルを破棄します。[マネージャに追加]は、取得した選択範囲をROIマネージャに追加し、パーティクルの位置情報を保持したままさらに解析します。
注:「ROIマネージャー」では、自動セグメンテーションの記録出力を修正することができます(分割セルのマージ、マージされたセルの分割)。フィジーツールバーの選択ツールを使用して、がん細胞が埋め込まれている両方のゲル領域内のROIを選択し、免疫浸潤を推定します。
- 取得した値をスプレッドシートにエクスポートして、図7Gに示すように統計分析を実行します。「結果」は、識別された番号付き概説粒子特性に関連するデータテーブルをリストする。「要約」は、画像の名前、合計数、および画像全体のその他の情報を含むウィンドウを開きます。
- [測定値の分析>セット]に移動して、さまざまなパラメータを含めます。
- オプションでマクロを記録し(プラグイン>マクロ>記録を選択)、処理ワークフローを自動化し、大規模なデータセットの分析時間を節約します。
- 同じ処理ルーチンを使用して同じ領域の緑色蛍光チャネルを分析し、3D領域の腫瘍細胞の形態学的変化を解析する16
- 腫瘍細胞を含む左右のゲル領域を、それぞれ単一または薬理学的レジームの組み合わせに曝露した左右のゲル領域の特定の時間エンドポイント、位相差、および赤/緑チャネルの蛍光顕微鏡写真を取得します。
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Representative Results
腫瘍免疫浸潤は、宿主抗腫瘍応答のパラメータである。腫瘍は、浸潤白血球の組成、密度、位置、および機能状態において不均一であり、癌細胞との相互作用は、疾患の経過および治療への反応を予測するための臨床的関連情報の根底にある可能性があります。この意味で、マイクロ流体技術は、腫瘍の免疫コンテクスチャーを探索し、抗がん療法に対する反応を監視するための補完的で特権的なin vitroツールとして使用できます。マイクロ流体アッセイ、生細胞イメージング、および追跡ソフトウェアの結合により、免疫細胞がさまざまな状況で遊走パターンをどのように調整するかを定量化するための信頼性の高い定量方法が確立される可能性があります。本章では、標準的なソフトリソグラフィ法で実現されるアドホックマイクロ流体デバイスにおいて、免疫がん細胞と標的がん細胞の汎用性の高い2Dまたは3D共培養のセットアップ手順を報告しました。セクション1では、マイクロ流体デバイスを使用して、接着性(MDA-MB-231がん細胞)集団と非接着性(PBMC)集団間の化学的および物理的接触を可能にしました。いくつかの化学療法剤(例えば、とりわけアントラサイクリン)は、悪性細胞の「免疫原性」アポトーシスを誘導することができ、したがって、免疫適格宿主におけるそれらの可視性を高めることができる。がん免疫原性細胞死(ICD)は、免疫細胞のアラームとして機能する死にかけている細胞によって送達される膜結合および可溶性シグナルの放出によって特徴付けられる。ICD応答の定量的検証を提供するために、白血球が適切に構築されたマイクロチャネルブリッジを通って標的細胞に向かって移動できるマイクロ流体プラットフォームで収集されたデータを使用します。タイムラプス記録は、健康なドナー(WT、野生型)からのPBMCを、アントラサイクリンDROXで前処理した、または処理していないヒトMDA-MB-231乳がん細胞と同時ロードした後に実行されました。顕微鏡写真は、24時間および48時間の2つの連続した時間間隔で、2分ごとに生成された(例示的な ムービーS1 0〜24時間間隔)。死にかけている(FOXO処理された)がん細胞または生きたがん細胞(PBS処理済み)に挑戦した個々のPBMCの追跡分析は、Trackmateプラグインを使用して行われました。 図 6A (左パネル)。関連する走化性値と移行プロットは、走化性および移行ツールを使用して自動的に生成されました。62.細胞軌道は、すべて、時間24時間で(x,y)=0に外挿した。結果は、DOXOまたはPBSに曝露された乳がん細胞と同時負荷した場合の免疫細胞の異なる遊走プロファイルを示しました。PBMCがアポトーシス癌細胞に直面したとき、それらは死にかけている/死んだ細胞に向かってマイクロチャネルを通過しました(ただし、未処理の細胞は生きていません)。移行X/Yスパイダーとバラのプロット(左パネルに表示) 図 6B-C、免疫動態の違いに対する免疫原性誘導剤の影響を強調するためにマッピングおよび比較された。ローズプロットは、PBMCが対照実験において主にほぼすべての方向に遊走し、癌細胞の増殖によって生成される勾配を上って導かれるのはごくわずかな部分であることを示しています。逆に、個々の細胞の経路は、アポトーシス乳がん細胞の方向(負のx方向)に沿った強いバイアス運動を強調しています。FOXO処理またはPBS処理された癌細胞への指向性免疫細胞の移動を評価するために、以下を含むいくつかの走化性パラメータが計算されます:a)重心(すべてのエンドポイントの空間平均点);b)方向性;c)前方移動指数(すなわち、我々の場合、標的腫瘍部位に向かうことを意味する関心のある方向への平均細胞変位)。後者の値は、走化性刺激が与えられた方向に移動する細胞効率の測定値を表す。左チャンバーに到達した後、24〜48時間にわたって密度が増加する白血球の一部は、DROX処理されたMDA-MB-231との長期(>60分)接触を示しました。.PBMCは大規模に遊走せず、生きた癌細胞とのそのような長期的かつ持続的な相互作用に従事することができません(接近するPBMCの代表的な顕微鏡写真によって示されるように 図 6A、右)。腫瘍と免疫の相互作用の違いを定量化するために、腫瘍領域は、「ホットスポット」と名付けられた20〜80ミクロンの範囲の直径の固定円で描かれました。代表的なFOVからの定量化と分析は、 図 6 (右パネル、B-C)。
セクション2では、エピジェネティック薬の抗がん剤の組み合わせに応答した免疫細胞の動員を定量化するために、新しい3D免疫適格腫瘍モデルが説明されました32 (DAC / IFN 対 IFN単独)、A375メラノーマ細胞の2つの異なる治療条件を同時に比較できるようになりました。したがって、PKH67緑色蛍光色素で標識されたA375Mメラノーマ細胞は、DACおよび/またはIFNの存在下で各ゲルチャンバーにマトリゲルマトリックスに埋め込まれましたが、PKH26赤色標識PBMCは、開始点で中央の流体チャンバーに均一に分布していました(図7A)。PBMCを引き付ける能力について、3Dマトリックスの2つの腫瘍塊を同時に比較しました。図7Bに示すように、48時間および 72時間で、PBMCは右側のマイクロチャネルに大規模に誘導されます。
PBMCのメラノーマ部位は、IFN処理よりもDAC/IFN処理を含むゲルマトリックスの方が優先的にホーミングが明瞭に観察されたが、単回処理で曝露されたA375細胞の方が遊走率の低さが認められた(左チップ側)。競争環境は、多数の異なるがん生物学表現型(例えば、薬剤耐性対攻撃性、原発性または転移性(例えば、A375P対A375Mメラノーマ細胞)、およびレスポンダー対非レスポンダー)を調査するために適用可能である。ゲルチャンバーは、TMEレベルの薬物応答を特徴付けるために、悪性細胞と複数の非癌性腫瘍関連細胞(内皮細胞、免疫細胞、線維芽細胞など)33との複雑な共培養で構成することができる。癌細胞の有糸分裂およびアポトーシス死の事象は、生色素33で染色することによってモニターすることができる。3Dマイクロ流体デバイス上の免疫染色手順は、共焦点顕微鏡法によって腫瘍部位の浸潤免疫細胞の活性化の状態を評価するように適合させることができます35。この意味で、これらの3Dマイクロ流体システムは、複雑な腫瘍構造と多細胞相互作用を模倣する可能性があるため、より信頼性の高い前臨床薬物検査のための貴重なプラットフォームです。
図 1.2D腫瘍免疫共培養を組み立てるためのマイクロ流体デバイスの平面測定。 (A)3つのチップを1つの顕微鏡スライドに組み立てた実際の顕微鏡写真。リザーバーにはローディングシーケンスに応じて番号が付けられ、凡例に記載されている対応する培養チャンバーとして色分けされています。スケールバー、6 mm。 (B)マイクログルーブで接続された3つの主要な細胞培養領域からなるチップの3D CAD。C)狭い微小溝ブリッジの詳細、癌細胞およびPBMCsサイズに合わせた寸法を示す。D-E)可視光顕微鏡写真は、タイムラプスの開始前に取得し、左室および中間室における癌細胞およびPBMCsの分布をそれぞれ示す。スケールバー、500 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.時系列画像における免疫スポットの局在化のためのトラックメイト解析パイプライン。 A)上部パネル:トラックメイト画像キャリブレーションメニューのスクリーンショット。下のパネル:時間と空間単位を設定するためのフィジーの「画像プロパティメニュー」。B)上部パネル:トラックメイトの「スポット検出」メニューのスクリーンショット。下パネル:「しきい値」の異なる値を適用した出力画像。C)上部パネル:いくつかのフィルターを示すトラックメイトの「スポットフィルタリング」メニューのスクリーンショット。下パネル:例示的なタイムラプス画像は、中間チャンバ内のXに沿った位置によってフィルタリングされた免疫スポットを描写する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.時系列画像シーケンスで免疫トラックを再構築するためのトラックメイト解析パイプライン。 A-C) トラック構築、トラックフィルタリング、最終データのエクスポートのためのトラックメイトメニューのスクリーンショット。D)リンク検出器の設定を変える前処理されたタイムラプス画像で生成されたトラックの例。E)腫瘍細胞の境界の検出に由来する偽の軌跡および不良リンクの例。F)結果のファイル.txt行を選択すると、トラックが緑色で強調表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.3D免疫適格腫瘍オンチップの概略図。 A)微細構造シリコンマスターの例。PDMS用スタンプは、電子ビームと光リソグラフィを備えたクリーンルーム施設でSU-8ネガレジストでパターン化されました。B)PDMSレプリカは、標準的なソフトリソグラフィ法によって作製した。中央ユニットは、パネルDに描かれているチップの3Dレンダリングで描かれたものとして着色されたチャンバーを有する。 C)ヒドロゲル溶液の閉じ込めに適したマイクロピラーのアレイの走査型電子顕微鏡(SEM)拡大図。D)マイクログルーブとローディングウェルで接続されたチャンバーを示す3D CAD。破線のボックスは、詳細のSEM写真(パネルC、およびE)を参照します。E)高さ10μmの連結微小溝のSEM写真。F)微細構造の寸法を表す2D CADレイアウト。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.3D共培養を組み立てるための主なローディングプロトコルステップの概略ワークフロー。 A)上パネル:各ゲル側領域におけるマトリゲル溶液の注入工程の概略図。下パネル:ローディングステップ中のチャネルに沿ったゲル前面の前進を示すチップの実際の写真。B)マトリゲル重合工程の概略図。下パネル:ゲル化工程後に形成されるゲル-空気界面の位相差顕微鏡図。スケールバー、100μm。 C)上部パネル:プロトコルで使用される例示的なボリュームを有する細胞および培地の負荷を描写する図面。下パネル:0hで組み立てられた共培養の4X位相差画像が示されています。スケールバー、200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.24〜48時間の時間枠における死にかけている/生きている腫瘍室に対するPBMCの移動プロファイルと相互作用行動の分析。左パネル。A)Trackmateによって抽出された、免疫色のトラックを重ねたタイムラプスの前処理画像のスクリーンショット。免疫経路は、中間チャンバー内の間隔24〜48時間で示された実験条件における単一のFOVによって得られる。B-C)2つの異なる条件で培養されたPBMCの代表的な遊走トラックとローズプロット(n = 1550 PBMC vs DOXO処理癌細胞、DOXO+またはn = 1434 PBMC 対対照癌細胞、DOXO-)。x-yプロット内の各線は単一のPBMC軌道を表し、各円は初期位置に対する単一セルの最終位置を表します。始点は、座標変換を使用して(0,0)に設定されます。細胞移動の重心の座標および変位は、示された実験条件において表示される。重心座標と変位 (X 成分と Y 成分の平均ユークリッド距離として計算) は、セル グループが主に移動した平均方向と、条件グループ内のセル全体の移動の大きさを示します。青と緑の線はそれぞれ、しきい値(100 μm)より大きい/小さいユークリッド距離値で個々のトラックをマークします。D)セルトラックによって抽出された数値データのスキーム。E-F) Box & Whiskers プロットは、方向性 (p<0,0001 Welch's 補正による対応のない t 検定) および FMI (p<0,0001 Welch's 補正による対応のない t 検定) をそれぞれ表しています。ボックス内の水平線は中央値を表します。FMI値は、各条件グループのすべてのセルトラックの平均です。右パネル。A)トラックメイトが抽出したROIのスクリーンショットは、PBMCとDOXまたはPBSで処理された癌細胞との間の異なる相互作用を示しています。B)DONOXO処理または対照MDA-MB-231癌細胞の周囲のPBMCの時間密度。各条件の癌細胞の周りの選択されたROIに存在するPBMCの数。報告される値は、1 回のタイムラプス FOV から選択した 9 つの ROI の平均です。がんホットスポットはROI(直径80μm)で定義されます。対応する密度ヒートマップが表示されます。ドットは、指定された時点で9つのがんホットスポットにわたって計算された細胞の平均数を表します。C)各実験群の接触の時間(分)の分布。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 7.競争力のある3D免疫適格メラノーマオンチップモデルにおけるDACとIFNの薬剤の組み合わせに応じたPBMCの優先的な採用。 A)マイクロ流体デバイスの中央チャンバーにおける初期負荷PBMCの分布。顕微鏡写真は、EVOS-FL蛍光顕微鏡によって0〜72時間間隔で取得されます。赤色蛍光(PKH67標識細胞)は、健康なドナーからのPBMCを表します。単一または二重の組み合わせ処理を含むMatrigelに埋め込まれたPKH67標識(緑色)ヒト黒色腫細胞を側腔に播種した。B)左側にA375セルとIFNを加えたセルに対して、右側にA375セルとDAC / IFNを追加します。共培養の72時間で蛍光画像が示されました。廃止された黄色のボックスは、A375とDAC / IFN側での目に見えて大規模な採用を示しています。C)PBMCは、IFNチャンバー と DAC + IFNチャンバーの4つの異なるROIでカウントされます。ヒストグラムは細胞数+/- S.D.を表します。各ROIから列挙された値をヒートマップします。スケールバー、200 μm。 D-G)単一チャンネル蛍光画像に適用されたゲルマトリックス中の浸潤PBMCのセグメンテーションおよび定量ステップの概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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補足動画 1.2D腫瘍免疫オンチップ共培養におけるタイムラプス配列。 顕微鏡写真を、標準的な細胞培養インキュベーターに入れたコンパクトな顕微鏡によって、0〜24時間の時間間隔で2分ごとに取得しました。左パネル。MDA-MB-231対照乳癌細胞で播種された健康なドナー(WT、野生型)からのPBMCの動画。右パネル。MDA-MB-231 DOOXO処理された癌細胞がロードされているチップチャンバーへのPBMCWTの大規模な移動の動画。2Dチップのレイアウトについては、プロトコルのセクション1で詳しく説明し、 図1に示します。この動画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載された方法は、より関連性の高いin vitroモデルの採用から利益を得ることができる腫瘍免疫学の分野における2つの重要な側面を、調節可能な程度の複雑さで再現するための一般的なアプローチを設計しようとする。1つ目は腫瘍細胞集団側に関するもので、単一細胞の特徴に取り組むことで、治療に対する耐性、転移に対するプロペンション、幹細胞、分化グレードなど、不均一性と相関する生物学的および臨床的意義のより良い説明につながる可能性があります。物語の反対側は、非癌性成分(免疫および間質細胞、血管)および化学的/物理的景観(ECM成分、ケモカインおよび他の放出される可溶性因子)を含むTMEによって表され、疾患の特徴と治療に対する個人の反応の両方を深く形作ることができます63、特に免疫療法。説明されているアプローチを他の研究分野にエクスポートするには、新しいモデルの開発と採用によってもたらされる制限と課題を深く理解する必要があることに注意してください。
エンジニアリングモデリングに適用される格言(「システムではなく問題をモデル化する」)を引用すると、実験全体に沿って独自のオンチップモデルを生物学的に関連性があり安定したものにするために必要な(細胞、物理、化学)コンポーネントの最小数と条件を最適化する必要があります。したがって、細胞タイプ/微小環境/実験設定のすべての組み合わせは、単一の実験に沿って、およびセッションごとに正確に選択、評価、および継続的に監視する必要があります。これらのチェックには、プロトコルのセクションで述べたように、湿度条件や照明源からの加熱によって変更される可能性のあるマイクロ流体デバイスの体積などのパラメータの厳密な制御、制御されていない液体ドリフトを引き起こすステージの動きと非平面性だけでなく、細胞の状態、生存率、表現型の特性評価のエンドポイント検証も含まれます。重要なステップの1つは、灌流システムを使用して血管化された(類似の)構造を作成するか、オンチップドラッグデリバリーに使用するかの決定に関するものです33、これは、複雑さの増大、細胞培養期間、および免疫細胞のような浮遊細胞の存在下での化学的要因の調節の観点から実験に影響を与える可能性があるためです。
以下では、実験環境と最新の文献で見つかった主な重要かつ関連性のある問題を要約します。
ECMと化学的ランドスケープの定義
TMEは、周囲63、66の機械的64、65特性によっても深く影響を受ける。 このため、培養マトリックスの選択は、特に特定の条件下でマトリックス自体によって放出されるシグナルに応答する可能性のある免疫細胞を扱う場合の基本です。今後は、新しい材料やヒドロゲル(剛性、多孔性、可溶性因子の存在などが異なるパラメータを特徴とする)の設計と開発から、今日のさまざまな組織、明日のさまざまな患者の特異性を模倣して、ますます洗練され制御可能なECMを可能にすることからも、関連する進歩が期待されています。一方、ECMのさまざまな細胞集団によって誘発される変化を監視し、この情報を動的および表現型分析に含めるための戦略を定義することも重要です。
データ管理
臨床ワークフローにおける腫瘍オンチップ技術の展開への道は、いくつかの方向に沿って行われている巨大な実験的研究の恩恵を受けるでしょう。臓器オンチップモデルは、多くのin vitro技術と同様に、少なくとも潜在的に、ハイスループット/ハイコンテント測定を実行するために機能します。ポジティブコントロールとネガティブコントロール、および技術的/生物学的複製を含む実験条件の並列化は、同じプレート上に複数のチップを統合することによって可能になります。定量スループットの向上は、免疫療法の迅速な薬物または遺伝子スクリーニングパイプラインにおけるこれらのシステムの翻訳と検証において重要な役割を果たします。実際、いくつかの企業はすでにマルチウェル形式のプラットフォームを開発しており、多数のデバイスを同時に監視できるように、さまざまなイメージングアプローチがテストされています14。上記のプロトコルでは、標準の顕微鏡マルチスライドトレイを使用して、最大3つのチップを割り当てる顕微鏡スライドを使用し、最大12の実験条件を並行して視覚化することができました。このセットアップはハンドピペッティングと互換性があり、当社の微細加工施設で行われるカスタム指向の調整に適しています。逆に、強力な並列化が必要な場合(複数のスクリーニングテストと制御)、より高いレベルの自動化を設定するためのセットアップの最適化(つまり、ピペッティングロボット、プラスチックマルチウェルの使用)が必要です。
実験を計画するときは、空間分解能と時間分解能のトレードオフを考慮する必要があります。
ハイコンテント顕微鏡によって生成される膨大な量のデータは、保存、転送、分析の面で制限要因を構成します。これらの問題は、機械学習ツールとハードウェア/ソフトウェアリソースを実装する計算アプローチで対処されており、治療戦略を選択する際にオンチップ/インシリコ実験67,68をリンクする将来の可能性を促進する可能性があり、野心的でありながら延期不可能な機会を表しています。
蛍光イメージングを超えて
色素またはレポーター遺伝子による蛍光標識は、その高い特異性により、共培養条件で異なる細胞集団を同定し、高いSNRで分子特性を分離するためのゴールドスタンダードの方法であることは間違いありません。OOCモデルでは、このアプローチは一般的に参照として使用され、特に不均一な腫瘍オンチップ微小環境では、浸潤および相互作用する免疫細胞の表現型を特徴付けることが有用です。
それにもかかわらず、蛍光色素によって誘発される効果、面倒な染色手順および照明ルーチンは、細胞の挙動および状態に深く影響し得るので69、最小限に抑えられなければならないという証拠が増えている70、71。このリスクは、免疫細胞などの脆弱なシステムに特に当てはまるようです72,73。光毒性反応は、高い空間分解能および時間分解能でモニターした場合、生細胞の時間的ウィンドウ獲得を定義する際に制限をもたらす可能性があります。さらに、免疫亜集団の多様性は、顕微鏡で一般的に利用可能なフィルターの数が限られていることを考えると、蛍光染色だけではそれらを区別することを不可能にします。
この問題に対処するために、機器の観点から、ホログラフィック56やハイパースペクトル顕微鏡57などの新しいラベルフリー74顕微鏡技術が現在ステージに登場しています。蛍光を超えた高度な細胞プロセス分類戦略を約束し、高感度サンプルの研究に特に役立ちます。データ分析の観点から、ディープラーニングアルゴリズム75(蛍光画像データセットによって訓練された)に基づく高度な計算アプローチは、いわゆる「インシリコラベリング」76,77を実行するための扉を開くものである。それらは、明視野画像78から蛍光マーカーを予測するために首尾よく適用され、細胞を染色することなく標識画像を生成し、したがって明視野顕微鏡の有益な力を増加させる。この戦略は、他のマーカーの時間と蛍光チャネルを節約するのにも役立ちます。OOCコミュニティは、細胞集団の相互作用の侵襲性の低い研究を可能にするこれらの新しい技術の恩恵を受けると信じています。
データ分析
免疫癌細胞と標的癌細胞との間の相互作用のメカニズムは、細胞運動の追跡を通じて調査することができる28,79。複雑で不均一な共培養におけるタイムラプス追跡実験は、細胞移動パターン、形態学的および状態変化、および包括的な系統情報を抽出するために非常に貴重です。手動解析の実行は、実際には細胞数が少ない短いシーケンスでのみ実行可能であり、ハイスループットで体系的な実験では実行できません。したがって、完全にまたは部分的に自動化された細胞追跡のための計算ツールの開発は、画像解析における重要な研究分野です24。通常、従来の細胞追跡では、セグメンテーションタスクを正しく実行するために比較的高い頻度のサンプリングと空間分解能が必要であり、これは多くの実験条件で困難な場合があります。細胞を局在化するために、このプロトコルまたは専用のプロプライエタリソフトウェアに提示されているように、利用可能なオープンアクセスセグメンテーションおよび追跡ツール(例えば、ImageJソフトウェア22)がある。大規模な研究では、ローマのトルヴェルガータ大学が開発したCell Hunter16,31と呼ばれる独自のソフトウェアを適用して、マルチポピュレーションコンテキストで癌と免疫細胞を完全自動で区別しました。機械学習とニューラルネットワークアプローチ80,81,82に基づくオーダーメイドのソリューションは、SNRの改善から重要な取得パラメータまたはセグメンテーションステップの管理まで、顕微鏡ソフトウェアパッケージ83に今日実装され始めています。機械学習を利用して、微小環境要因に関する生物学的応答を特徴付けるために、一般的な細胞パターン(運動スタイルなど)を認識することができます。
Comes et al.41では、事前にトレーニングされたディープラーニング畳み込みニューラルネットワークアーキテクチャを適用して、マイクロデバイスのコラーゲンマトリックス中の乳がん細胞とPBMCの共培養のタイムラプスデータから追跡された免疫細胞の運動性を「マーカー」として使用して、がん細胞が薬物治療にさらされているかどうかを分類しました。 33に記載されているように。
シングルセルオミクス法とオントロジー開発
我々は、シングルセルオミクス技術84(プロテオミクス、メタボロミクス、ゲノミクスなど)とオンチップ法との間の戦略的提携の必要性を指摘する:機能動的情報と結合した分子の詳細な特性評価は、基本的なメカニズムと臨床記述の理解を高めることができる。この場合、2つの世界をつなぐための新しい楽器は、その始まりにあります85。第1の課題は、単一細胞オミクスアプローチを腫瘍免疫学チップ22に直接実装することである。さらに、臓器チップは、ゲノミクスおよびプロテオミクス分析によって特定された潜在的な標的をテストするためのプラットフォームとして利用される可能性があります86,87。まだほとんど欠けている2番目のリンクツールは、測定されたシステム結果に注釈を付けて保存するための構造化された標準化された方法です88,89。しかし、これはまさに、細胞の定量結果と測定された特性の体系的なデータベースを構築し、それらをマイニングし、推測し、固有の生物学的情報と相関させるために将来必要なものです。一言で言えば、異種実験データセットの標準化と体系的な分析の必要性は、オントロジーフレームワークを必要とします。
モデルのパーソナライズ
臓器オンチップ技術は、単一の患者(または患者のクラス)からの細胞および組織を制御された条件下でデバイス内で使用でき、臨床的に関連する読み出しをもたらし、治療または予防戦略を知らせるのに有用であるため、パーソナライゼーション12に適している。いくつかの例が文献90に登場し始めています。もちろん、腫瘍オンチップモデルの場合、この課題は解決すべきいくつかの技術的および科学的問題を提起します36 (酸素濃度、サイトカイン勾配などのTME特性制御など)。重要なことに、各患者の有害な影響を減らしながら、腫瘍学および腫瘍免疫学療法をより効果的にするという見通しは、医療資源の最適化と同様に生活の質の観点から魅力的です。
結論として、この分野は真に学際的な分野であり、そのため、研究者、臨床医、業界だけでなく、さまざまな分野(工学、生物学、データサイエンス、医学、化学)の間で共通の言語と共通の目標を確立するために多大な努力が必要であることは明らかですバランスと新しいソリューションを見つける91。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。ASは、イタリア・スル・カンクロ財団(AIRC、スタートアップ2016 #18418)とイタリアン・デッラ・サルーテ大臣(RF_GR-2013-02357273)によってサポートされています。GSとFMは、イタリア癌研究協会(AIRC)番号21366からGSによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| 50 mL tubes | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | centrifuge tubes |
| 5-aza-2'-deoxycytidine DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | DNA-hypomethylating agent |
| 6-well plates | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS3506 | culture dishes |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Corning, New York, NY | 430641U | culture flasks |
| A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | CVCL_B222 |
human melanoma cell line |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | D1515 | anthracycline antibiotic |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0728L | Culture medium for SK-MEL-28 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB4004L | saline buffer solution |
| Fetal Bovine Serum | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECS0180L | ancillary for cell culture |
| Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | separation of mononuclear cells from human blood. |
| hemocytometer | Neubauer | Cell counter | |
| Heparinized vials | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Vials for venous blood collection | |
| interferon alpha-2b | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | SRP4595 | recombinant human cytokine |
| L-Glutamine 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3000D | ancillary for cell culture |
| Liquid nitrogen | |||
| Lympholyte cell separation media | Cedarlane Labs, Burlington, Canada | Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway | ||
| Matrigel | Corning, New York, NY | 354230 | growth factor reduced basement membrane matrix |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | HTB-26 | human breast cancer cell line |
| Penicillin/ Streptomycin 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3001D | ancillary for cell culture |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | Liquid handling |
| PKH26 Red Fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH26GL | red fluorescent cell dye |
| PKH67 Green fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH67GL | green fluorescent cell dye |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM2001L | Culture medium for MDA-MB-231 cells |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | Liquid handling |
| sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | tips for micropipette |
| Timer | |||
| Trypan Blue solution | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 15250061 | cell stain to assess cell viability |
| Trypsin | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0920D | dissociation reagent for adherent cells |
| Cell culture equipment | |||
| EVOS-FL fluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Fluorescent microscope for living cells | |
| Humified cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 | Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2 |
| Juli Microscope | Nanoentek | ||
| Laboratory refrigerator (4 °C) | FDM | ||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Steril VBH 72 MP | Laminar flow hood | |
| Optical microscope | Zeiss | ||
| Refrigerable centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thermostatic bath | |||
| Microfabrication materials | |||
| 3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip |
| Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ | MB W&A, Germany | optical masks for photolithography | |
| Glass coverslip, D 263 M Schott glass, (170 ± 5 µm) | Ibidi, Germany | 10812 | |
| Hydrogen Peroxide solution 30% | Carlo Erba Reagents | 412081 | reagents for piranha solution |
| Methyl isobutyl ketone | Carlo Erba Reagents | 461945 | PMMA e-beam resist developer |
| Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm | Sail Brand | 7101 | substrates for bonding chips |
| Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm | Tedpella | dermal biopsy punches for chip reservoirs | |
| PMMA 950 kDa | Allresist,Germany | AR-P. 679.04 | Positive electronic resists for patterning optical masks |
| Polymer untreated coverslips | Ibidi, Germany | 10813 | substrates for bonding chips |
| Prime CZ-Si Wafer, 4”, (100), Boron Doped | Gambetti Xenologia Srl, Italy | 30255 | |
| Propan-2-ol | Carlo Erba Reagents | 415238 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Sigma Aldrich | 484431-4L | SU-8 resists developer |
| SU-8 3005 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0001 | Negative Photoresists |
| SU-8 3050 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0005 | Negative Photoresists |
| Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm | Tedpella | 15111-40, 15111-60, 15111-80 | dermal biopsy punches for chip reservoirs |
| Sulfuric acid 96% | Carlo Erba Reagents | 410381 | reagents for piranha solution |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dowsil, Dow Corning | 11-3184-01 | Silicone Elastomer (PDMS) |
| Trimethylchlorosilane (TMCS) | Sigma Aldrich | 92360-100ML | silanizing agent for SU-8 patterned masters |
| Microfabrication equipment | |||
| 100 kV e-beam litography | Raith-Vistec EBPG 5HR | ||
| hotplate | |||
| Optical litography system | EV-420 double-face contact mask-aligner | ||
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab 80 plus system | ||
| Vacuum dessicator |
References
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