Summary
中子蛋白晶体学是一种结构技术,允许氢原子的定位,从而提供蛋白质功能的重要机制细节。我们在这里介绍了用于安装蛋白质晶体,中子衍射数据收集,结构细化以及中子散射长度密度图分析的工作流程。
Abstract
中子晶体学是一种结构技术,可以确定生物大分子内的氢原子位置,产生有关质子化和水合状态的机械重要信息,同时不会引起辐射损伤。相比之下,X射线衍射仅提供有关光原子位置的有限信息,并且X射线束会迅速引起光敏辅助因子和金属中心的辐射损伤。这里介绍的是橡树岭国家实验室(ORNL)的IMAGINE和MaNDi光束线所采用的工作流程,一旦生长出合适尺寸(>0.1 mm3)的蛋白质晶体,就可以获得中子衍射结构。我们展示了在石英毛细管中安装氢化蛋白质晶体,用于中子衍射数据收集。还介绍了用含D2O的缓冲液安装的晶体的蒸汽交换过程,以确保用氘替换可交换位点的氢原子。氘的掺入减少了氢原子不相干散射产生的背景,并防止了由其负相干散射长度引起的密度抵消。在高通量同位素反应器(HFIR)的IMAGINE上使用准Laue数据收集来说明样品对准和室温数据收集策略。此外,在散裂中子源(SNS)的MaNDi飞行时间仪器上演示了晶体镶样和液氮中的快速冷冻,用于冷冻数据收集以捕获不稳定的反应中间体。还将处理模型坐标和衍射数据文件的准备以及中子散射长度密度(SLD)图的可视化。最后将讨论针对中子数据或针对联合X射线/中子数据的结构细化,以获得目标蛋白质的全原子结构。确定中子结构的过程将使用裂解多糖单加氧酶 Neurospora crassa LPMO9D的晶体进行演示,LPMO9D是一种含铜的金属蛋白, 通过 糖苷键的氧化切割参与顽固性多糖的降解。
Introduction
中子大分子晶体学是一种技术,为蛋白质的结构和潜在化学提供了一个独特的窗口。在概念上与X射线衍射相似,中子衍射提供了大分子结构的原子细节,然而,中子与原子核的相互作用使轻原子的定位成为可能,通常很难用X射线衍射检测到1。在 X 射线衍射过程中,X 射线从电子云中散射,使得氢 (H) 等轻原子在没有接近亚 Ångström 分辨率的电子密度图中不可见2。相反,中子的散射强度取决于与原子核的复杂相互作用,同一元素的同位素显示出不同的散射长度。因此,轻原子及其同位素,如氢(1H)和氘(2H或D),在中子散射长度密度(SLD)图中具有与骨架碳,氮和氧原子相当的可见性。此外,由于中子散射的大小与电子的数量无关,因此当轻元素彼此靠近时,轻元素的散射不会被重元素遮挡,正如在X射线散射中观察到的那样。H及其同位素D在采用中子衍射时的能见度增强,提供了有关催化重要残基、辅因子和配体质子化状态的宝贵信息,并有助于水分子的取向,揭示了有关催化机理和蛋白质化学的重要信息3。中子衍射还具有非破坏性技术的优点,特别适用于对电离敏感的生物样品,例如具有金属中心的蛋白质或光敏氧化还原辅因子2。本文的主要重点是概述获得高质量中子蛋白晶体结构的工作流程。我们将感兴趣的读者推荐给Podjarny et al.4,Blakeley5,Blakeley et al.6和O'Dell et al.3,以很好地概述中子蛋白衍射和Ashkar等人7对中子散射的进一步应用。
中子主要在核反应过程中产生,采用两个过程之一:反应堆源的核裂变或加速器源的散裂8。反应堆源通过利用 235U同位素的核裂变来提供连续的中子束,而散裂中子源通过用质子轰击目标(例如液态金属,如汞)来产生脉冲中子束9。位于田纳西州橡树岭的橡树岭国家实验室(ORNL)在高通量同位素反应堆(HFIR)拥有稳态中子源,在散裂中子源(SNS)拥有60 Hz脉冲源。位于HFIR的IMAGINE光束线是针对生物大分子优化的中子衍射仪(补充图1)10。IMAGINE采用中子成像板探测器,使用2.8 – 4.5 Å范围内的窄带通测量准Laue数据,该带通来自具有单元单元边缘<150 Å的单晶。位于SNS的高分子中子衍射仪(MaNDi)是一种飞行时间(TOF)劳埃中子衍射仪,配有球形探测器阵列框架(DAF)(补充图2)11。MaNDi 采用 2.0 – 6.0 Å12 之间的可调 2 Å 波长带宽,测量来自具有 10 – 300 Å 范围内单元边缘的单晶的数据。
产生中子的过程是高度能量密集型的,与同步子源处的X射线束通量相比,导致中子束通量相对较弱13。为了确保在数据收集过程中具有足够的信噪比,有必要生长合适尺寸和质量的晶体14。通常,需要体积>0.1 mm3的晶体来收集具有足够统计数据的数据15。除了较低的通量外,还必须考虑中子与样品核之间相互作用的固有特性16。对于同一元素的同位素,中子的散射长度不同,这一特性可以在小角度中子散射(SANS)中得到有利利用,以掩盖或突出显示样品的区域 - 这一过程称为对比度匹配17。在衍射实验中,H的负相干中子散射长度(-3.741 fm表示1H)可导致中子散射密度图特征的抵消,因为其他生物相关原子的相干中子散射长度包括碳(12C为6.6511 fm),氮(14N为9.37 fm),氧(16O为5.803 fm), 磷(31P为5.13 fm)和硫(32S为2.804 fm)为正(表1)12,14。此外,H (25.274 fm) 的大不相干散射长度增加了数据收集过程中的背景,影响了数据集的质量并影响了数据分辨率7。为了规避H引入的这些限制,对于中子衍射,有必要将H换成其同位素氘2H(D),其具有正相干中子散射长度(6.671 fm)和显着降低的非相干散射长度(4.04 fm)19。这可以通过氘散来实现,在氘透过程中,蛋白质由在完全氘代培养基中生长的生物体表达,确保在H位点20完全掺入D。也可以通过仅在可交换位点(可滴定基团)处用D代替H来部分氘化蛋白质,而不可交换的碳结合位点保持氢化21。这可以通过在氘代母液中生长氢化蛋白质晶体来实现22。然而,最常见的是,氢化蛋白的H / D交换是在基于H2O的缓冲液中生长适当大的晶体23之后通过蒸汽交换进行的。在这种情况下,晶体安装在石英毛细管中,并与基于D20的母液进行蒸汽平衡。
中子源的中子通量有限,导致数据收集时间更长,从几天到几周不等24。在ORNL,IMAGINE和MaNDi都采用2-6 Å范围内的窄波长带通来优化数据收集25。数据可以在室温或低温下收集。冷冻数据收集可以潜在地提高数据质量,并为冷冻捕获催化中间体开辟可能性。在收集中子衍射数据之后,通常在相同温度下在同一晶体上或在相同条件下生长的晶体上收集X射线数据集26。在相同温度下收集数据允许针对X射线和中子数据进行结构细化,防止任何潜在的温度引起的伪影,例如水的能见度和位置的变化或具有交替构象的残留物的占用27。联合X射线中子数据细化增加了数据与参数的比率,并提供了允许根据X射线数据细化蛋白质骨架坐标的优势,而中子衍射数据用于细化H / D原子的位置28。当使用部分氘代样品时,这特别有用,其中由于蛋白质上不可交换位点处的H原子存在密度抵消。虽然X射线结构的数量远远超过蛋白质数据库(PDB)中沉积的中子结构的数量,但最初设计用于改进X射线数据的软件包已经扩展到包括中子数据3,29,30。在数据收集之后,可以使用phenix.refine,CNSsolve(nCNS)或SHELXL28,31,32,33等细化包来优化模型。在细化过程中,可以使用COOT34可视化中子散射密度图,以便手动拟合。按照结构解决方案,坐标以及中子和/或X射线衍射数据文件可以提交给PDB,PDB将验证并存放模型,使其可供公众访问18,29,30。
蛋白质的结构分析是一种多方面的方法,其中许多技术用于探测其功能和机制35。中子蛋白晶体学提供了有价值的化学见解,以扩展和补充其他研究的发现,如X射线衍射,光谱学,核磁共振(NMR)或微晶电子衍射(microED)36。中子蛋白衍射具有独特的优势,可以提供对酶学机制的见解,因为H原子是其化学的核心。没有中子诱导的辐射损伤使它们成为特别适合研究金属蛋白的探针37。我们在这里展示了从样品制备到数据收集,细化和分析的中子蛋白衍射过程的代表性示例(图1)。已经生长了足够大小的晶体,用于中子衍射实验的金属蛋白神经孢子菌LPMO9D(NcLPMO9D)。数控LPMO9D是一种含铜的金属蛋白,通过在糖苷键处插入氧原子来参与顽固纤维素的降解38,39。NcLPMO9D活性位点在由N端组氨酸和第二保守组氨酸组成的特征性"组氨酸支撑"内包含一个单核铜中心(补充图3)40。真菌LPMO的N端被甲基化,但在酵母的重组表达过程中不会发生过渡后修饰。在NcLPMO9D静息状态下,铜中心以Cu2+氧化态存在,并通过单电子还原为Cu1 +被激活,允许分子氧结合并通过迅速还原为超氧化物物种而被激活41,42。整个NcLPMO9D反应需要进一步添加一个电子和两个质子以形成羟基化多糖产物43。负责从多糖底物中提取氢原子(HAA)的活性氧物种的身份尚未确定,目前正在进行密集的结构和计算研究44,45。鉴于NcLPMO9D活性位点的氧化还原化学性质,减轻辐射损伤尤其重要。我们在这里说明在NcLPMO9D晶体上的室温和低温数据收集,以确定NcLPMO9D结构在静止状态和活化还原形式中分别46。重点将放在蛋白质晶体安装,用于数据收集的光束线仪器设置,数据和坐标文件的准备以及建模全原子中子结构所需的改进步骤。
Protocol
1. 晶体尺寸评估
- 使用配备法向和偏振光的显微镜测量晶体的大小。选择最小体积约为0.1 mm3的晶体(补充图4)。
- 用足够大的晶体标记孔,并注意用于产生这些晶体的结晶条件。
2. 氘化结晶缓冲液的制备
- 将结晶缓冲液组分溶解在D2O中,生成氘化结晶缓冲液。
- 使用以下等式计算溶液的pD来调整缓冲液的pH值:
(1)
其中 pH 测量值是使用标准玻璃电极测量的 pH 值。NcLPMO9D结晶缓冲液的原始pH值为6.0,因此我们将使用pH值为5.6的pH值作为pD 6.0的氘化结晶缓冲液。 - 使用前将pH计电极浸入D2O中十分钟(补充图5)。
- 通过使用碱NaOD或酸性DCl将 pH值调节至5.6。
3. 水晶收获
- 将硅化的22毫米圆形载玻片放在结晶托盘旁边,从中收获晶体。每个晶体使用干净的载玻片(图2A)。
- 打开9孔大体积硅化玻璃板中含有蛋白质晶体的密封夹层盒。
- 用微量移液管从结晶储液槽溶液中取出10-20μL,并将溶液放在载玻片上(图2B)。
- 使用适当尺寸的微循环收集晶体,并将晶体放入载玻片上的储液溶液滴中,以除去通常与晶体一起收获的碎屑(图2C 和 图2D)。
注意:由于小体积的液滴可能会蒸发,因此有必要快速工作。收获的晶体在暴露于大气中时也有干燥的风险。可能需要向蛋白质液滴中添加一些储液槽溶液,以防止晶体在小的结晶液滴体积中变干。
4. 晶体安装
注意:毛细管安装方案因实验人员的偏好而异。为防止损坏晶体,需要缩短的毛细管应用切割石或砂纸划痕,以确保顺利断裂。
- 通过毛细管作用或将约10μL储液缓冲液移入毛细管中,用储液缓冲液填充2 mm直径50mm长的石英毛细管的一端(图3A)。
注:鼓励用户使用石英毛细管,因为除了其机械强度外,还必须限制中子束吸收并降低毛细管的背景贡献。玻璃毛细管引入高背景并吸收中子,从而影响数据质量。 - 使用安装回路将晶体轻轻地放置在石英毛细管的储液缓冲液中(图3B 和 图3C)。
- 轻轻敲击管以将储液缓冲液和其中的浸没晶体向下移动毛细管(图3D)。
- 将晶体放置在不小于13.5毫米的位置,并且不再靠近毛细管的一端27.5毫米;这将是安装端(补充图6)。
- 使用长而薄的移液管尖端吸出晶体周围的缓冲溶液,使晶体略微湿润。请勿触摸晶体(附图7A)。
- 用薄纸芯擦干毛细管壁(补充图7B)。
- 将20-50μL氘代缓冲液移入与安装端相对的毛细管末端(图4A)。
- 用加热"魔杖"融化蜂蜡,然后将毛细管轻轻插入这种融化的蜂蜡中。重复此步骤,直到形成气密密封(图4B 和 图4C)。
- 在毛细管的安装端移取非常少量的氘代缓冲液,约5μL,作为热蜂蜡的"散热器"。将这一端浸入熔化的蜂蜡中,以产生气密密封,如前所述,形成两端密封的毛细管(图4D)。
- 安装后使用显微镜检查安装的晶体,以确保气密性(图4E)。
- 用Kim湿巾小心地将安装的晶体固定在容器中,例如15ml猎鹰管或培养皿,并在晶体生长的温度下水平储存(图4F)。
5. 蒸汽交换
- 晶体安装两天后,将氘代缓冲液更换为新鲜缓冲液。
- 用加热回路将蜡封从晶体最远处熔化,然后使用移液器和吸纸芯除去缓冲液。
- 用20-50μL氘化缓冲液重新填充毛细管,并用蜡密封。
- 每隔四天重复两次氘代缓冲液更换,以确保氘代缓冲液蒸汽交换完成并允许蒸汽交换至少两周。
6. 中子蛋白衍射
注:鼓励对IMAGINE光束线细节感兴趣的读者查阅Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47。
- 在HFIR的IMAGINE光束线上收集室温数据
- 样品安装
- 用腻子将毛细管安装的晶体固定在测角仪上。
- 将测角仪安装在样品棒上,并使用离线对准站将晶体在光束中居中。
- 将样品棒固定在仪器样品台上(补充图1B)。
- 确保实验小屋已腾空,并打开光束线快门以进行中子数据收集。
- 数据采集
- 在光束线控制计算机上打开数据采集程序,然后单击 设置 选项卡以设置数据收集策略。在 "实验参数 "下,在 "示例名称"旁边键入示例名称, 然后在" 建议"旁边输入建议编号。在" 图像命名 "下,选择 "文件夹模板" ,设置要保存的获取数据的目标,然后选择" 图像前缀" 并键入相关的帧名称(补充图 8)。
- 打开光学 GUI,单击 2.78 表示 λmin , 单击 4.78 表示 λmax ,以设置数据收集的准劳累范围(补充图 9)。
- 切换到" 收集 "选项卡,然后在" 下次扫描参数 "下,在 "曝光"下插入曝光时间(以秒为单位)、 "N 帧 "下的帧数以及 "Δ φ/帧"下数据收集的角度。在 "图像前缀" 下命名要收集的帧,然后单击" 开始扫描" 按钮启动数据收集(补充图 10)。
- 衍射中子将由成像板探测器检测。在每次曝光结束时,将读取图像板并在数据采集GUI上显示图案(补充图11)。
- 由负责的光束线科学家使用Lauegen,Lscale50 和Scala对帧进行索引,集成,波长归一化和缩放,他们将在数据收集后为用户提供合并的反射文件(补充图12)。
注:IMAGINE和MaNDi的数据收集将以准Laue模式进行,使用Helliwell等人和Nieh等人为Laue衍射数据收集开发的方法和软件。 - 在中子衍射数据收集后,在相同温度下收集同一晶体上的相应X射线数据集(补充图13)。
注意:从相同液滴或在相同结晶条件下生长的晶体也可用于收集X射线衍射数据,以进行联合中子/X射线细化。
- 样品安装
- 在 SNS 的 MaNDi 光束线上收集低温数据
注:鼓励对光束线细节感兴趣的读者查阅Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11。- 样品安装
- 制备氘化抗坏血酸浸泡溶液,用于还原晶体和氘化冷冻保护剂。将20μL滴这些溶液中的每一种放入结晶板中的静置滴孔中。
注意:冷冻保护剂溶液通常是已被证明对在D2O中制备的低温X射线衍射数据收集有效的冷冻保护剂。如有必要,可以进一步优化(例如浓度)以收集中子数据。 - 选择用于样品安装的环路,并按照 MaNDi 指南将其连接到磁性冷冻底座(补充图 14)。
- 用液氮填充泡沫冷冻杜瓦瓶。将金属冷冻保护套管置于液氮内冷却(补充图15A)。
- 从毛细管的两端取下蜡塞,然后敲击毛细管以移动缓冲塞,以便将安装的晶体浸入缓冲液中。将晶体洗涤到静置液滴孔中的20μL储液槽液滴中(补充图15B 和 补充图15C)。
注意:如果H/D交换是通过平衡结晶滴与氘代缓冲液或将晶体直接浸泡在氘化缓冲液中来执行的,则不需要此步骤。 - 将晶体浸入抗坏血酸浸泡溶液中两小时。将晶体安装在连接到磁性冷冻底座的微循环中。将安装的晶体浸入冷冻保护剂中10秒钟,然后将晶体和冷冻支架插入液氮中冷冻(补充图15D)。
- 晶体冻结后,使用预冷的冷冻针钳将晶体安装在装有冷冻流的MaNDi样品台上。轻轻打开冷冻针钳,确保晶体保持在冷冻流中(补充图2C)。
- 制备氘化抗坏血酸浸泡溶液,用于还原晶体和氘化冷冻保护剂。将20μL滴这些溶液中的每一种放入结晶板中的静置滴孔中。
- 数据采集
- 打开将自动填充实验信息的数据收集软件。
- 单击晶体的中心,使其与计算机控制的测角仪居中(补充图16)。
- 在 "表"下,通过输入"phi"下数据收集的角度以及 值下每帧的总中子束暴露来设置数据收集策略(补充图17)。
- 单击" 提交 "以开始数据收集。
- 随着数据的收集,衍射中子将可见(补充图17)。随着曝光时间的增加,衍射光斑将变得更加清晰,从而改善了信噪比(图5)。
- 由负责的光束线科学家使用Mantid和Lauenorm对帧进行索引,集成,波长归一化和缩放,他们将在数据收集后为用户提供合并的强度文件51。
- 样品安装
7. 结构细化
- 联合X射线和中子数据细化
- 结构准备
- 使用 phenix.refine 软件包和Coot进行手动构建以获得蛋白质结构以获得完整的结构的X射线数据。
- 打开 CCP4 并选择 "转换为/修改/扩展 MTZ "程序,以将中子数据的无 R 数据标志与 X 射线数据的标志相匹配。选择以 MTZ 格式导入反射文件。 在"上传 "下,获取的中子 MTZ 文件,并在 "导入 FreeR MTZ "下上传 X 射线 MTZ 文件(补充图 18)。在 "输出 "下为新 MTZ 文件命名,然后单击" 运行"。
- 打开Phenix软件包,然后单击"优化工具"下的 "就绪集 "。在 PDB文件 旁边上传PDB坐标文件,根据X射线数据进行优化。选择" 如果不存在则将氢气添加到模型 中",然后从下拉菜单中选择 "在可交换站点的 H/D,其他位置 "。选择 将氘添加到溶剂分子 ,并将其余选项保留其默认值(补充图19A)。
注意:如果使用氘化蛋白,请选择选项 "如果不存在则将氢气添加到模型 中",然后在 可交换位点选择"H/D,D 在其他地方"。
- 结构细化
- 在"细化"选项卡下打开 phenix.refine 程序,使用 X 射线和中子数据设置细化。在"输入文件"的"配置"选项卡中,输入来自 X 射线结构的 PDB 文件(该文件已使用 ReadySet 进行处理)以及任何相关配体所需的 CIF 约束文件。使用使用 CCP4 分配的 Rfree 标志从中子数据上传 MTZ 文件,并在数据类型标题下将其指定为"中子数据"和"无中子"。从 X 射线数据上传 MTZ 文件,并将其指定为"数据类型"标题下的"X 射线数据"和"无 X 射线"。上传数据后,空间组和数据标签将自动填充(补充图 19B)。
注:执行细化并输入晶体信息时,请使用从X射线数据确定的晶胞。 - 在"优化"设置的"配置"选项卡下,保留标准优化策略。将循环次数增加到五个(补充图20)
- 选择 所有参数,单击" 高级 ",然后选择" 氢气..."。将 氢细化模型 更改为 单个 模型,并关闭 力骑乘adp (补充图20)。
- 选择" 所有参数 ",然后打开 "搜索参数 "选项。搜索" 核 "一词,然后选择 "使用 X-H/D 的核距离 "(补充图 20)。
- 选择" 运行 "以启动优化。
- 在"细化"选项卡下打开 phenix.refine 程序,使用 X 射线和中子数据设置细化。在"输入文件"的"配置"选项卡中,输入来自 X 射线结构的 PDB 文件(该文件已使用 ReadySet 进行处理)以及任何相关配体所需的 CIF 约束文件。使用使用 CCP4 分配的 Rfree 标志从中子数据上传 MTZ 文件,并在数据类型标题下将其指定为"中子数据"和"无中子"。从 X 射线数据上传 MTZ 文件,并将其指定为"数据类型"标题下的"X 射线数据"和"无 X 射线"。上传数据后,空间组和数据标签将自动填充(补充图 19B)。
- 模型构建
- 在Phenix中进行细化之后,单击"结果"选项卡中的"在Coot中打开"以可视化X射线电子密度和中子SLD图。单击"显示管理器"选项卡,然后在"地图"下单击"_neutron映射旁边的"删除映射"以删除中子映射(补充图 21)。单击"文件>打开 MTZ、mmCIF fcf 或 phs..."。选择当前优化文件并打开 .mtz 文件。对于"振幅和相位"选项,请从下拉菜单中选择"2FOFC WT_no_fill_neutron数据"。重复此操作并打开 FOFC WT_neutron数据。打开显示管理器并切换到滚动中子和X射线2FOFCWT映射,然后滚动以将2FOFCWT映射的均方根降低到1.00(补充图21)。对于中子和 X 射线 FOFCWT 映射,切换到"滚动",然后滚动以将 FOFCWT 映射的均方根值降低到 3.00。
- 对残留物执行目视检查,以确定模型是否适合数据。通过分析差密度图峰值,确定所有可交换站点的正确方向和 H/D 占用率。这包括丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的羟基;组氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺和赖氨酸的氮;半胱氨酸的巩基;天冬氨酸和谷氨酸的羧基;骨架酰胺基团;配体;辅助因子和任何潜在的功能化残基(图6)。
- 根据中子密度和氢键相互作用重新定向水分子,方法是使用 旋转平移区/链/分子 特征旋转它们(补充图22A 和 补充图22B)。使用 "编辑Chi Angles" 工具和 "旋转平移区/链/分子 "功能调整蛋白质残基H/D可交换位点的位置(补充图22C 和 补充图22D)。
- 结构准备
- 结构细化 – 仅中子数据细化
- 结构准备
- 打开Phenix并选择"分子替换",然后选择"Phaser-MR(全功能)",以推导出仪器科学家通过分子替换提供的缩放强度的相位,以生成pdb格式的起始坐标文件。在"输入和常规选项"选项卡中输入起始 pdb 结构,并完成"集成"、"ASU 内容"和"搜索过程"选项。
- 打开 模型工具 ,然后选择 PDB 工具。将 pdb 文件作为 输入文件插入。导航到 "选项" 选项卡,然后在 "删除原子选择 "下选择溶剂、配体、辅因子和金属的名称。这去除了所有水分子,辅因子,配体和金属离子,以产生最小的模型。此外,选择从模型 中删除备用符合性 (补充图 23)。
- 在 Phenix 中选择"细化",然后打开"就绪集"。在 PDB 文件旁边输入编辑过的 pdb 坐标文件。选择"如果不存在则将氢添加到模型中",然后从"中子细化"选项的下拉菜单中选择"在可交换位点、H 处的 H/D"(补充图 23)。
- 结构细化
- 在Phenix的"细化"选项卡下打开phenix.refine程序。在"配置"选项卡中,输入已使用"输入文件"框下的"就绪集"处理的 PDB 文件。在"输入文件"框中,从中子数据上传 MTZ 文件,并将其指定为"数据类型"列下的 X 射线数据和无 X 射线 R,即使它是中子数据。在下一步中设置的细化配置将用于将反射文件视为中子数据。上传数据后,空间组和数据标签将自动填充(补充图 24A)。
- 在"优化"设置的"配置"选项卡下,保留标准优化策略。将周期数增加到五个。在其他选项下,从散射表下拉菜单中选择中子。取消选择"更新水域"选项(补充图 24B)。
- 选择"所有参数>高级>氢"在新窗口中,从氢细化模型下拉菜单中选择个人,然后关闭力骑行adp(补充图20)。
- 选择" 搜索参数>所有参数..."选择。搜索" 核 "一词,然后选择 "使用 X-H/D 的核距离 "(补充图 20)。
- 选择" 运行" 以启动优化。
注意:在初始细化之后,有必要在Coot中目视检查中子SLD图并执行手动模型构建。可能需要插入模型中存在的配体/辅因子。后续的细化将需要任何相关配体的必要CIF约束文件,这些配体应上传到phenix.refine的"配置"选项卡中。
- 模型构建
- 在Phenix中进行细化之后,单击"结果"选项卡中的"在Coot中打开"以可视化中子SLD图和结构。单击"显示管理器"选项卡,然后在"地图"下单击"删除地图"以删除 2FOFCWT 和 FOFCWT 映射(补充图 25)。单击"文件>打开 MTZ、mmCIF fcf 或 phs..."。选择当前优化文件夹,然后选择 .mtz 文件。对于"振幅和相位"选项,请从下拉菜单中选择"2FOFC WT_no_fill数据"。单击"文件">"打开 MTZ"、"mmCIF fcf"或"phs...",然后从"振幅和相位"选项的下拉菜单中选择 FOFCWT 数据。打开"显示管理器"并切换到"滚动"以显示 2FOFC WT_no_fill映射,然后滚动以将 2FOFC WT_no_fill数据的均方根值降至 1.00(补充图 25)。切换到 FOFCWT 地图的滚动,然后滚动以将 FOFCWT 数据的均方根值降低到 3.00。
- 对蛋白质结构进行目视检查,以确定模型是否适合中子SLD图谱。
- 如 7.1.3.2 中所述,确定具有 H/D 可交换位点的残留物和基团的正确方向和 H/D 占用率。使用 旋转平移 工具和 编辑刻度角 调整残留位置(图6)。如有必要,可以使用 真实空间优化区 。修复使用文本编辑器插入正确的原子坐标,手动从残留物中爆炸的D个原子
注意: Real Space Refine Zone 没有针对Coot中的中子SLD图进行优化,并且可能导致与D结合的原子的键长不规则,称为爆炸残基(补充图26)。最好手动编辑必要的原子坐标,并避免使用 真实空间细化区。 - 根据中子密度插入和重新定向水分子。要在 Coot 中添加水,请选择" 将原子放在指针处 "图标,然后选择插入水分子(补充图 27A)。默认情况下,Coot 将在此位置插入一个 O 原子。
- 要将D原子添加到插入Coot中的水的O原子中,请使用Phenix。打开" 优化 "菜单,然后单击" 就绪集"。在 "中子细化选项" 旁边,仅选择" 向溶剂分子添加氘"选项。取消选择 "如果不存在,则将氢气添加到模型" (补充图 27B 和 补充图 27C)。
注:仅使用中子数据的模型构建与联合X射线/中子结构的模型构建不同,因为没有X射线数据有助于优化骨干和较重原子的坐标。在联合细化中,电子密度图最初用于确定蛋白质主链和侧链坐标。该模型随后用于联合X射线/中子数据细化,其中H / D原子的方向和占用从中子SLD图中得出。在仅中子的细化中,整个结构来自对中子SLD图的分析,除了H / D原子之外,还需要构建水分子,骨架,侧链和配体(图6)。仅针对中子数据的细化,数据与参数的比率较低,应注意不要过度拟合数据。
- 结构准备
Representative Results
按照上述方案,在室温下HFIR的IMAGINE和SNS的MaNDi上收集了来自Crassa神经孢子(NcLPMO9D)的裂解多糖单加氧酶晶体的中子衍射数据。使用在基于H2O的缓冲液中生长的体积大于0.1 mm3的氢化蛋白的晶体(大晶体的说明性示例显示在补充图4和随后的图中)。晶体安装在石英毛细管中,并在数据收集之前与基于D2O的缓冲液进行蒸汽交换三周(图4)。
在IMAGINE光束线上进行室温数据收集(图1)。四个小时的白光束测试导致高分辨率衍射,表明晶体的尺寸和质量适合收集完整的数据集。除了提供有关晶体衍射质量的初步信息外,初始宽带通曝光还可用于衍射图的索引并确定晶体取向矩阵。给定晶体的P21 空间群,实施了18帧的数据收集策略,每帧收集时间为20小时。与X射线衍射数据收集一样,高度对称的空间组需要更少的帧(即较少的角度覆盖)来收集完整的数据集。数据是在准劳氏模式下收集的,波长范围为2.8 – 4.0 Å。在数据收集之后,对数据进行索引,集成缩放和合并,以生成分辨率为2.14 Å的MTZ格式的中子SLD文件。根据类似的X射线数据分析指南,对数据进行了足够质量的评估,尽管由于中子蛋白衍射是一种通量有限的技术,因此80%的完整性和至少0.3的CC1 / 2 被认为是可以接受的。
在收集室温中子衍射数据后,使用相同的晶体以1.90 Å分辨率收集室温X射线衍射数据集(补充图13)。X射线数据用于确定"较重"原子的位置,包括C,N,O和S。然后仅针对X射线数据改进的结构用作起始模型,以对X射线和中子数据进行联合细化。Phenix ReadySet用于将H原子添加到不可交换位点,H和D原子在可交换位点添加,D原子添加到起始X射线模型的水分子中。在此模型准备之后,对两个数据集执行了迭代优化(补充图19和补充图20)。在Coot中通过目视检查密度图来相应地定向侧链和水分子,在Coot中进行了交互式模型构建(补充图22)。中子数据主要用于确定质子化状态和水分子取向。比较丝氨酸和色氨酸等残基的电子密度图以及相应的中子SLD图,说明了从中子蛋白衍射可以获得的H / D可交换位点的质子化状态的信息(图7)。水分子的电子和中子SLD图谱的图谱叠加也表明,虽然可以从X射线数据推断出氢键相互作用,但中子提供了有关这些氢键取向的清晰信息(图8)。生成中子SLD FO-FC省略图,以确定侧链的质子化状态和H / D方向。图示为酪氨酸和苏氨酸残基获得的中子SLD图,其中中子Fo-FC图清楚地指示表示存在H / D的正峰(图9)。收集的中子衍射数据还提供了有关多个质子化状态的宝贵信息,例如Lys的-ND3 +组(图10)。在模型优化期间,对细化统计数据(Rwork 和 Rfree)进行了密切监控,以防止过度拟合。最终统计数据显示,X射线Rwork为12.77%,Rfree为18.21%,中子Rwork为14.48%,Rfree为21.41%,存在389个水分子(补充图28)。
在抗坏血酸浸泡后在NcLPMO9D上收集低温数据,以减少MaNDi光束线上从CuII到CuI的铜活性位点(补充图2和补充图15)45。在使用4小时暴露的中子衍射测试后,使用TOF Laue模式收集数据,以验证衍射质量。给定晶体的空间群,设计了18帧的数据收集策略,每帧收集剂量为80库仑。数据以TOF-Laue模式在2.0 – 4.0 Å的波长范围内收集。在数据收集之后,对数据进行索引,集成,缩放和合并,以生成分辨率为2.40 Å51,52的MTZ格式的反射文件。
在数据收集之后,使用2.40 Å低温NcLPMO9D中子衍射数据集进行仅中子数据细化。使用PDB 5TKH作为起始模型,通过分子替换对中子数据进行分阶段。Phenix ReadySet用于在不可交换的位点添加H原子,在可交换的位点添加部分占用的H / D原子。使用PDB工具从起始模型中去除水分子(补充图23)。模型制备后,使用中子散射表用phenix.refine进行细化(补充图24)。在Coot中进行了交互式模型构建,使用FO-Fc图的正峰添加水分子,并根据潜在的氢键相互作用进行定位(图11A和图11B)。在分析中子SLD图谱时,如果水分子是高度有序的,则它们清晰可见,但是如果它们不是有序的,它们的密度可能是球形的,或者椭圆体的(图11C-E)。中子SLD图用于提供有关天冬酰胺等残基取向的宝贵信息,其中当单独使用X射线衍射数据时,区分羰基和氨基可能具有挑战性(图12A和图12B)。FO-FC中子SLD省略图中的峰在确定组氨酸残基在N δ或N ε位置的质子化状态方面也非常有用(图12C和图12D)。具有多个H / D可交换位点的残留物的质子化状态也可以使用中子SLD图来确定。FO-FC中子SLD省略了精氨酸的图,这清楚地说明了这一点,精氨酸已知具有正电荷(图12E和图12F)。和以前一样,通过监视 Rwork 和 Rfree 可以防止过度拟合。最终统计数据显示,Rwork为22.58%,Rfree为30.84%(补充图29)。鉴于中子蛋白衍射是一种通量限制技术,其中必须考虑H的负散射长度和较大的非相干散射因子,可以预期,仅中子数据的细化将比具有较少可见水分子的联合X射线/中子数据细化具有更差的统计数据(补充图28和补充图29)。
在分析中子SLD图谱时,很明显,对于与含D2O的结晶缓冲液进行蒸汽交换的氢化蛋白质,由于H的负中子散射长度而导致的密度抵消。由于这个原因,与它们的电子密度图相比,不可交换的H原子附着在碳上的中子SLD图看起来不完整(图13A)。在分辨率较差的情况下,取消的影响通常更明显,因此必须获得高质量的蛋白质晶体。因此,最好使用X射线和中子数据对样品进行联合细化,其中X射线数据可用于确定蛋白质主链的位置(图13B)。此外,半胱氨酸和蛋氨酸中的硫原子可能不可见,需要X射线数据才能精确放置原子(图13C 和 图13D)。具有弱中子散射长度的金属也可能具有挑战性,在中子SLD图中建模,这在我们的LPMO9D图中很明显。因此,在同一晶体上收集低剂量(无辐射损伤)X射线数据集是有用的,因为它允许使用电子密度图进行金属原子定位(图13E 和 图13F)。
图1:中子蛋白晶体学工作流程流程图。蛋白质生产。为了获得中子结构,首先表达蛋白质。基于H2O或D2O的培养基中的细菌表达通常用于分别产生高产的氢化或氘基重组蛋白。蛋白质在基于H2O的缓冲液中纯化,然后在基于H2O或D2O的结晶缓冲液中结晶,以将晶体生长到最小尺寸为0.1 mm3。 样品制备: 在中子衍射数据收集之前,H2O生长的晶体进行H / D交换以将蛋白质可滴定的H原子与D交换.H / D交换可以通过直接将晶体浸泡在氘化结晶缓冲液中,用基于D2O的储液槽平衡结晶滴,或通过将晶体安装在石英毛细管中与氘化结晶缓冲液进行蒸汽交换来完成。 中子数据收集: 在H / D交换之后,筛选电位晶体以确定衍射质量。最小分辨率为2.5 Å的晶体被认为适合收集完整的数据集。晶体安装在石英毛细管中,用于在室温下收集数据,或在低温回路中快速冷冻,以便在低温下收集数据。在相同温度下在相同(或相同)晶体上收集X射线数据集。 模型构建: 使用 phenix.refine 对中子和X射线数据或仅针对中子数据进行细化。使用中子SLD图在Coot中执行蛋白质结构的手动模型构建。 完整结构: 完成蛋白质结构后,对坐标模型进行验证并将其存入蛋白质数据库。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:收获蛋白质晶体。 (A)晶体在显微镜下处理。(B)打开装有硅化玻璃板的密封夹层盒。将储液缓冲液移液到硅化载玻片上。(C)用微循环收获晶体。(D)将晶体放入一滴母液中,以洗掉经常与晶体一起收获的任何碎片。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:晶体向石英毛细管的转移。 (A)石英毛细管的末端充满储液器缓冲液。(B)将晶体转移到石英毛细管中,(C)浸入储液缓冲液中。(D)使用储液缓冲液将晶体向下输送毛细管。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4:石英毛细管的密封。 (A)在毛细管末端加入氘代缓冲液,形成"塞子"。(B)用"魔杖"融化蜡。(三)将毛细管置于熔化的蜡中密封。(D)两端形成蜡塞以密封毛细管。(E)安装后的晶体。(F)将密封的毛细管放置在培养皿中并用腻子固定到位。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5:中子衍射图的信噪比增加。 随着数据收集的进行,衍射斑点变得更加强烈。(注:此处显示的实时衍射图像仅用于说明,取自不同的晶体。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 6:在 Coot 中使用中子数据的交互式模型构建。 (A) 正 FO-FC 中子 SLD 密度峰值(绿色),指示必须通过编辑刻度来重新定向丝氨酸。2FO-FC中子SLD图以紫色显示,2FO-FC电子密度图以蓝色显示。(B)正确定位的丝氨酸。(C)正FO-FC中子SLD密度峰(分别为绿色和红色),表明色氨酸必须旋转/平移以匹配差密度峰。(D)正确定向色氨酸。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7:来自中子 SLD 图的其他信息。 (A)2FO-FC电子密度图(蓝色)显示丝氨酸中"较重"原子的位置。(B)2FO-FC中子SLD图(紫色)清楚地显示了丝氨酸中"较轻"的D原子的位置。(C)2FO-FC电子密度图(蓝色)显示色氨酸中"较重"原子的位置。(D)2FO-FC中子SLD图(紫色)清楚地显示了色氨酸中"较轻"D原子的位置。请点击此处查看此图的放大版本。
图8:水分子定位。 (A)水的2FO-FC电子密度图(蓝色)特征的球形形状。(B)2FO-FC中子SLD图(紫色)提供了有关水取向和氢键相互作用的信息。(C)水的电子和中子SLD图的图叠加。2FO-FC中子SLD图以紫色显示,2FO-FC电子密度图以蓝色显示。请点击此处查看此图的放大版本。
图9:中子SLD FO-FComit图(A) FO-FC中子SLD图(绿色)提供了有关酪氨酸残基H / D取向的清晰信息。2FO-FC中子SLD图以紫色显示,2FO-FC电子密度图以蓝色显示。(B)具有正确H / D方向的酪氨酸残基。(C)FO-FC中子SLD图谱(绿色)提供了有关苏氨酸残基H / D取向的明确信息。(D) 具有正确 H/D 取向的苏氨酸残留物。请点击此处查看此图的放大版本。
图 10:使用中子 SLD 图显示的多个质子化状态。 (A)2FO-FC电子密度图(蓝色)仅提供赖氨酸ε铵基团的N原子的位置。2FO-FC中子SLD图以紫色显示,2FO-FC电子密度图以蓝色显示。(F)电子密度和中子SLD图的叠加。请点击此处查看此图的放大版本。
图11:中子SLD图中水分子的外观。 (A)水分子根据FO-FC中子SLD图(绿色)和电位氢键定位。2FO-FC中子SLD图以紫色显示。(B)正确定位的水分子。(C-E)水分子的各种形状的中子SLD图取决于B因子和氢键相互作用。请点击此处查看此图的放大版本。
图12:中子SLD图提供的关于氨基酸取向和质子化的信息。 (A)中子SLD FO-FC图峰(绿色)表示天冬酰胺残基的方向不正确。2FO-FC中子SLD图以紫色显示,2FO-FC电子密度图以蓝色显示。(B)天冬酰胺正确取向的2FO-FC中子SLD图(紫色)。(C)中子SLD FO-FC图峰(绿色)表示组氨酸在N ε的单质子化。(D)组氨酸N-质子化的2FO-FC中子SLD图(紫色ε。(E)中子SLD FO-FC省略了地图峰(绿色)确认精氨酸的正电荷。(F)带正电荷的精氨酸的2FO-FC中子SLD图(紫色)。请点击此处查看此图的放大版本。
图 13:不连续中子 SLD 图。 (A)氢化蒸汽H/ D交换蛋白的2FO-FC中子SLD图(紫色)。谷氨酸显示中子SLD图由于不可交换的H原子的负散射长度而取消。(B)覆盖的2FO-FC电子密度图(蓝色)清楚地显示了谷氨酸的密度。(C)蛋氨酸中的硫原子在2FO-FC中子SLD图中不可见(紫色)。(D)叠加的电子密度图清楚地显示了蛋氨酸的密度。(E)金属原子,这里的铜,在中子2FO-FC SLD图中很难看到(紫色)。(F)叠加的2FO-FC电子密度图(蓝色)清楚地显示了配位铜原子的密度。请点击此处查看此图的放大版本。
同位素 | 相干散射长度 (fm) | 非相干散射长度 (fm) |
1小时 | -3.741 | 25.274 |
2小时 | 6.671 | 4.04 |
12摄氏度 | 6.6511 | 0 |
14N | 9.37 | 2 |
16O | 5.803 | 0 |
23钠 | 3.63 | 3.59 |
24毫克 | 5.66 | 0 |
31P | 5.13 | 0.2 |
32 秒 | 2.804 | 0 |
35Cl | 11.65 | 6.1 |
3.9万 | 3.74 | 1.4 |
40Ca | 4.8 | 0 |
5500万 | -3.73 | 1.79 |
56铁 | 9.94 | 0 |
63铜 | 6.43 | 0.22 |
64锌 | 5.22 | 0 |
表1:中子散射长度和非相干散射值。改编自西尔斯,199216。
补充图1:高通量同位素反应堆的IMAGINE仪器。 (A)IMAGINE仪器在冷中子引导大厅。(B)样品安装在石英毛细管中,用腻子连接到测角仪上。样品和检测器台关闭以将晶体和圆柱形成像板定位在中子束中。经国际晶体学联合会许可修改53。图片由橡树岭国家实验室Genevieve Martin许可提供。 请点击此处下载此图。
补充图2:散裂中子源的MaNDi仪器。 (A)MaNDi愤怒相机探测器阵列。经国际晶体学联合会许可转载11。(B) MaNDi可移动样品台。(C)样品安装在安装在MaNDi测角仪上的石英毛细管中,用于室温数据收集。图片由橡树岭国家实验室Genevieve Martin许可提供。 请点击此处下载此图。
补充图3:裂解多糖单加氧酶NcLPMO9D的结构。NcLPMO9D铜活性位点位于平坦的多糖结合表面上。铜由经典的"组氨酸支架"中的两个组氨酸残基以及轴向酪氨酸残基协调。请点击此处下载此图。
补充图4:在滴式结晶托盘中具有足够体积的晶体。 (A)大晶体生长在9孔硅化玻璃板中的坐滴中。(B 和 C)测量晶体以识别体积>0.1 mm3的晶体。 请点击此处下载此图。
补充图5:用于氘代缓冲液读数的pH计设置。 使用前将pH电极浸泡在D2O中。NaOD和DCl用于调节氘代缓冲液的pH值。 请点击此处下载此图。
补充图 6:MaNDi 示例安装指南。 用于室温数据收集的石英毛细管和样品位置的最大尺寸。
转载自: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment 请点击这里下载此图。
补充图7:去除多余的缓冲液。 (A)用微毛细管尖端从石英毛细管中吸出多余的缓冲液。(B)用薄纸芯除去剩余的缓冲液,以完全干燥毛细管。 请点击此处下载此图。
补充图8:数据采集GUI。 用于数据收集的"实验参数"的输入窗口。 请点击此处下载此图。
补充图9:光学GUI。 选择准劳厄范围,用于数据收集和监测中子计数率。 请点击此处下载此图。
补充图10:数据采集GUI中的数据收集。 用于数据收集的曝光时间、帧数和角度在"收集"选项卡中指定。然后使用"开始扫描"启动数据收集。 请点击此处下载此图。
补充图11:探测和显示的衍射中子。 在曝光时间结束时, 中子敏感图像板探测器被读出,衍射图显示在数据采集GUI中。 请点击此处下载此图。
补充图12:中子衍射后的数据处理。 使用Lauegen,Lscale和Scala对帧进行索引,集成,波长归一化和缩放,以在数据收集后生成合并的反射文件。 请点击此处下载此图。
补充图13:X射线数据收集。 家源X射线发生器设置有石英毛细管安装的晶体,用于室温数据收集。 请点击此处下载此图。
补充图14:MaNDi冷冻数据收集的安装指南。 用于在MaNDi收集冷冻数据的晶体帽尺寸和引脚高度。
转载自: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment 请点击这里下载此图。
补充图15:用于冷冻中子衍射数据收集的闪冻。(A)用于晶体浸泡,用微循环收获和使用冷冻兼容容器(如泡沫杜瓦瓶)在液氮中冷冻的设置。安装的晶体使用预冷的冷冻销钳直接转移到光束线冷冻测角仪上。(C)将晶体冲洗到石英毛细管的末端进行收获。(D)将晶体依次浸泡在抗坏血酸浸泡缓冲液中,然后冷冻保护剂,然后在液氮中快速冷冻。请点击此处下载此图。
补充图16:样品对准接口。 中子束中的晶体对齐(由蓝色十字表示)是通过点和单击居中完成的。 请点击此处下载此图。
补充图 17:用于数据收集的 CSS GUI。数据收集策略(包括暴露剂量和角度)在 CSS GUI 中上传。随着数据收集的进行,在实时探测器上检测到的衍射中子将显示在上图中。 请点击此处下载此图。
补充图 18:CCP4 中匹配的无 R 标志。 中子数据的无R标志与在相同或相同晶体上收集的X射线数据的无R标志相匹配,以进行联合细化。 请点击此处下载此图。
补充图19:结构准备和细化。 (A) Phenix ReadySet工具用于在可更换站点增加双H / D占用率。(B)中子数据和X射线数据都用于联合细化,而初始输入模型则根据在同一晶体或相同晶体上收集的X射线数据集进行改进。 请点击此处下载此图。
补充图 20:优化设置的配置。 细化模型以及核距离配置为联合X射线/中子数据细化。 请点击此处下载此图。
补充图21:Coot模型构建的数据选择。 包含X射线和未填充中子数据的phenix MTZ文件输出在Coot中打开,以生成电子和中子SLD图,用于交互式模型构建。 请点击此处下载此图。
补充图22:联合细化期间在Coot中构建交互式模型。(A)正FO-FC中子SLD密度峰(分别为绿色和红色),表明水必须通过旋转/平移重新定向。2FO-FC中子SLD图以紫色显示,2FO-FC电子密度图以蓝色显示。(B)正确定位的水。(C)正FO-FC中子SLD图峰(绿色)表明苏氨酸必须通过编辑chi角来旋转以匹配差密度峰。(D)正确定位的苏氨酸。请点击此处下载此图。
补充图23:纯中子数据细化的结构准备。准备起始坐标文件,以便通过在PDBTools中去除水原子和通过在可交换站点上增加双H / D占用来细化。 请点击此处下载此图。
补充图24:仅中子数据细化。(A)上传中子数据以及准备好的起始模型。(B)中子数据细化设置使用中子散射表。请点击此处下载此图。
补充图25:Coot模型构建的数据选择。 未填充的中子数据在 Coot 中打开,用于交互式模型构建。 请点击此处下载此图。
补充图26:Coot中氘化残留物的实际空间细化。(A)正FO-FC中子SLD密度峰(分别为绿色和红色),表明必须移动精氨酸残基以适合FO-FC密度峰。2FO-FC中子SLD图以紫色显示,2FO-FC电子密度图以蓝色显示。(B)利用真实空间细化会导致由于缺少Coot几何约束库而导致D原子"爆炸"。(C)D原子不随其余残留原子一起移动。(D)D原子位置可以使用文本编辑器手动固定。请点击此处下载此图。
补充图27:水分子的加入。(一)水分子可以手动加入到正FO-FC中子SLD密度峰图中(绿色)。插入的水分子最初将由Coot中的O原子表示。(B)Phenix ReadySet用于将D原子添加到水分子的O原子中。(C)氘化水分子成功加入。请点击此处下载此图。
补充图28:细化统计。 联合X射线/中子精炼后的最终数据细化统计数据。 请点击此处下载此图。
补充图 29:优化统计信息。 仅中子数据细化之后的最终数据细化统计。 请点击此处下载此图。
Discussion
中子蛋白晶体学是一种高度灵敏的技术,用于探测蛋白质中的质子化状态和水分子取向。这些信息揭示了蛋白质催化机制,因为质子化和氢键相互作用的变化通常是酶化学的核心10。中子蛋白晶体学虽然是一种信息丰富的技术,但在计划进行中子衍射实验之前,应考虑许多因素,即:
- 需要大蛋白质晶体进行数据收集。
- 氢和其他元素的散射性质,如金属离子。
- 处理氘代样品时,结构细化和模型构建软件的局限性。
中子蛋白晶体学是一种通量有限的技术。与X射线衍射数据集相比,由于技术固有的局限性(通量有限,准劳厄,更长波长),中子数据集预计会有更高的R因子和更低的完整性,冗余和信噪比。单个帧的数据收集通常为 12 – 18 小时。实验的成功很大程度上取决于样品大小和质量,0.1 mm3的晶体通常是最低要求3。中子衍射需要产生大量的蛋白质来建立10至800μL的结晶滴。生长足够大晶体的最小体积可以使用体积计算器估计,给定晶体和样品参数(https://neutrons.ornl.gov/imagine)。大晶体的生长最普遍地通过蒸汽扩散3完成。悬挂式滴结晶允许晶体在10-25 μL范围内的大液滴中生长,而使用市售的坐滴设备可以设置高达~50 μL的较大液滴14,54。硅化九孔玻璃板可用于设置非常大的液滴,体积高达800μL。这些玻璃板被放置在汉普顿研究公司市售的"三明治盒"中。进一步的结晶技术包括间歇结晶,其中液滴大小的限制由容器决定。批量结晶实验设置的范围可以从微升到毫升55。也可以使用透析技术进行结晶,其中蛋白质通过透析膜或沿沉淀剂浓度梯度或通过多孔塞(如琼脂糖)的反扩散与沉淀剂平衡56,57。播种提供了另一种获得所需体积的晶体的替代方法。微晶和晶状体已成功用于大晶体生长,包括NcLPMO9D45的大晶体。蛋白质相图的一些知识,包括温度对溶解度的影响,有助于大晶体生长。
在规划中子衍射实验时,必须优化蛋白质制备,以在衍射数据收集过程中最大限度地提高信噪比7。为了规避H原子引起的密度抵消和高不相干散射,可以通过用H原子交换其同位素D来改善中子SLD图谱,D具有正相干散射长度和低不相干散射长度。为此,对氢化蛋白质晶体进行蒸气交换以对抗氘化结晶缓冲液。这确保了溶剂分子和不稳定的可滴定蛋白H原子的H / D交换23。蒸汽交换是通过将氢化晶体安装到具有D2O基氘化结晶缓冲液"塞子"的石英毛细管中来进行的,它代表了一种有效,温和的技术,最常用于14,23,35。更换可能需要数周时间,最好需要频繁更换氘代缓冲液,以确保最大的H / D更换。H/ D交换也可以通过将晶体直接浸泡在氘代缓冲液中来进行。为避免将晶体置于由于D2O暴露而产生的应力下,应通过逐渐增加D2O:H2O比来逐渐进行浸泡过程58。除此之外,氢化蛋白的结晶也可以在氘代缓冲液中进行,用于在不稳定的H位点进行H / D交换22,59。然而,应该注意的是,基于D2O的缓冲液对蛋白质溶解度有影响,需要进一步调整已知的基于H2O的条件3,59。在某些情况下,基于D2O的缓冲液也会导致更小的晶体59。通过在氘化培养基中表达蛋白质以生成氘化样品,可以实现可滴定和碳结合的H原子与D的完全交换20。脱氘样品的中子SLD图谱将得到显着改善,不再显示氢化样品对应物的密度抵消。当表征在蛋白质或辅因子中不可交换位点结合的H / D时,这是有益的。然而,氘代蛋白的表达既高成本又低产量60。橡树岭国家实验室(ORNL)结构分子生物学中心(CSMB)为寻求生成氘化样本(https://www.ornl.gov/facility/csmb)的用户提供了氘传设施。纯化表达通常在1 L尺度上的生物反应器中进行,产生约50mg纯化蛋白61。
在收集中子衍射数据后,进行细化和交互式模型构建。可以使用多个软件套件运行细化,包括phenix.refine,nCNS或SHELXL28,31,32,33。Phenix套件是最常用的软件,用于与Coot一起优化中子衍射数据,Coot用于从中子SLD图手动构建模型34。虽然Phenix和Coot都允许处理中子衍射数据,但它们可能缺乏处理与中子数据和氘化样品相关的特性所必需的某些特征。例如,Coot 不包含氘代残留物的几何优化,这可能导致模型构建过程中的复杂情况,因为"真实空间细化"特征会导致"爆炸"残留物(补充图 26)62。这可以通过为所有氘代残留物生成约束文件来解决。但是,这是一个密集的过程,此类库目前尚未公开。在Phenix中执行优化时,H和D的可交换H / D站点最初将设置为0.50占用。随着细化,H和D的占用将根据中子SLD图进行细化。在交互式模型构建过程中,差密度 Fo-Fc 图在评估 H/D 占用率方面非常有用。地图可用于确定哪些位点具有高D占用率,这在质子化状态具有催化相关性的活动位点尤其有用63。然而,当H:D占用率接近0.70:0.30,这导致中子SLD图中的信号完全消除64。还应该考虑到,准劳埃中子数据集的完整性通常在80%左右,低于X射线衍射数据的常规观测≥98%。因此,在Phenix中细化中子衍射数据时,从模型中计算出缺失的观测振幅(Fo)以完成反射列表,从而引入模型偏差。为了解释这种潜在的偏差,应在交互式模型构建期间检查"no_fill"地图,而不是"填充"地图。
用户可以选择对其结构进行联合X射线/中子数据细化,或仅对中子数据进行细化。可视化中子SLD图谱,特别是在较低分辨率下,最初可能令人不安,特别是对于氢化蛋白质,尽管H / D蒸汽交换,H仍存在于不可交换的位点。这导致中子密度图取消,给人的印象是不连续的图65,66。收集相应的X射线数据集有利地补充了联合细化中的这些取消(图13A和图13B)。联合细化策略通常涉及根据X射线数据提炼蛋白质骨架坐标,而中子衍射数据用于细化H / D原子在可交换位点的位置和占用28。由于在可交换地点引入联合H/D占用增加了正在改进的参数数量,因此使用X射线数据的联合细化也增加了数据与参数的比率。联合细化需要在相同温度下在同一晶体或相同条件下生长的晶体上收集相应的X射线数据集。对于在室温(300K)下收集的中子衍射数据,应使用低剂量数据收集策略在室温下收集相应的X射线数据集,以限制辐射损伤。相比之下,经过氚化的样品提供改进的连续中子SLD图谱,因为它们不具有相同幅度的H / D信号消除。然而,包括金属和硫在内的某些元素的中子散射长度使它们在中子SLD图中不可见,即使蛋白质已经氘化(图13C-F)18。如果需要表征金属,最好在联合细化中利用X射线衍射或应用光谱技术来补充衍射实验。仅中子数据优化通常在中子数据集具有高分辨率或使用过氘蛋白质时执行。此外,如果正在研究对辐射损伤高度敏感的蛋白质,仅中子数据改进特别有用,因为X射线衍生的结构可能具有辐射诱导的伪影。如果要进行仅中子数据的细化,则必须确定相应的中子数据集是否具有足够的完整性和分辨率。
ORNL提供了两个用于收集中子衍射数据的设施:HFIR的IMAGINE光束线以及SNS36,67的MaNDi光束线。虽然这两种仪器都为使用类似原理收集中子衍射数据集提供了有效的手段,但每种仪器都有独特的规格,在应用光束时间时应予以考虑。IMAGINE 收集准劳厄数据,并针对晶胞高达 ~100 Å 的晶体的室温数据收集进行了优化。MaNDi可用于收集室温和低温数据,采用TOF-Laue收集方法收集晶胞高达约300 Å的晶体。在收集完整的数据集之前,对晶体进行测试以评估获得的衍射图的质量,其中晶体暴露于中子束中单帧。如果晶体质量足够高,将收集完整的中子衍射数据集,将其索引,集成,缩放和合并,该过程类似于X射线数据处理。IMAGINE利用Lauegen和Lscale,MaNDi利用Mantid封装并采用三维轮廓拟合48,50,51,68,69,70。成为这些设施用户的科学家将获得MTZ或HDL格式的数据集,以进行进一步分析。
中子衍射是一种非破坏性、高度灵敏的技术,用于探测生物大分子的质子化状态和氢键相互作用。它对光敏蛋白和金属蛋白特别有用。在进行实验之前,必须考虑有关该技术以及数据处理的几个考虑因素,但是结果产生的结果可能会对感兴趣蛋白质的催化机制提供有价值的见解。中子蛋白晶体学是对计算、结构、生化和光谱研究的补充,使其成为生物学家用于表征生物大分子的技术工具箱中的宝贵工具。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
蛋白质表达,纯化和结晶实验在结构分子生物学中心(CSMB)进行,该中心是美国能源部橡树岭国家实验室生物与环境研究用户设施。中子衍射数据是在BL-11B MaNDi上收集的,位于ORNL的散裂中子源(SNS),由美国能源部基础能源科学办公室科学用户设施司赞助。作者感谢Brendan Sullivan在数据减少方面的帮助。X射线衍射数据是在北卡罗来纳州立大学的分子教育,技术和研究创新中心(METRIC)设施中收集的,该中心由北卡罗来纳州提供支持。GCS感谢南非国家研究基金会(NRF)和ORNL的毕业生机会(GO!)计划的部分支持。FM感谢美国农业部NIFA Hatch 211001的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length | DiaDent/DiaVet | 218-292 | |
Capillary wax | Hampton | HR4-328 | |
CCP4 | Version 7.0.077 | ||
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | CLS430790 | |
Conical Centrifuge Tubes (50mL) | Corning | CLS430828 | |
Coot | Version 0.8.9.2 | ||
CrystalCap ALS | Hampton | HR4-779 | |
Curved-Tip Forceps | Mitegen | TW-CTF-1 | |
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 | |
Deuterium oxide 99.9 atom % D | Sigma-Aldrich | 151882 | |
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm | Mitegen | M5-L18SP-1000 | |
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit | Mettler Toledo | 30266626 | |
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml | Spearlab | M-FD-800 | |
Four Color Mounting Clay | Hampton | HR4-326 | |
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), | Sigma-Aldrich | 54457 | |
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector | Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris | XtaLAB Synergy-R | Home source X-ray diffractometer |
Magnetic Wand Straight | Mitegen | M-R-1013198 | |
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) | Eppendorf | 930001007 | |
Microtubes volume 1.5 mL | Eppendorf | Z606340 | |
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter | Fischerbrand | FB0875713 | |
Phenix | Version 1.14-3260 | ||
Pin Tong 18 mm | Mitegen | M-R-1013196 | |
Pipette Volume 0.1-2.5 μL | Eppendorf Research | Z683779 | |
Pipette Volume 100-1000 μL | Eppendorf Research | Z683825 | |
Pipette Volume 10-100 μL | Eppendorf Research | Z683809 | |
Pipette Volume 20-200 μL | Eppendorf Research | Z683817 | |
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length | Hampton | HR6-146 | Thin-walled capillary |
Research Stereomicroscope System | Olympus | SZX16 | |
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases | Mitegen | GB-B3-R | |
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length | VitroCom | CV1012 | Thick-walled capillary |
Sandwich Box with cover | Hampton | HR3-132 | |
Siliconized 9 Well Glass Plate | Hampton | HR3-134 | |
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) | Mitegen | XQ-P-24S-A | |
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D | Sigma-Aldrich | 176788 | |
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) | Hampton | HR3-247 | |
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL | VWR | 76322-528 | |
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL | VWR | 76322-136 | |
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL | VWR | 76322-154 | |
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL | VWR | 76322-150 | |
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL | VWR | 76322-134 | |
Wax pen | Hampton | HR4-342 |
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