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Chemistry

न्यूट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी डेटा संग्रह और प्रोटीन संरचनाओं में हाइड्रोजन परमाणुओं के मॉडलिंग के लिए प्रसंस्करण

Published: December 1, 2020 doi: 10.3791/61903
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, 2Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी एक संरचनात्मक तकनीक है जो हाइड्रोजन परमाणुओं के स्थानीयकरण की अनुमति देती है, जिससे प्रोटीन फ़ंक्शन का महत्वपूर्ण यांत्रिक विवरण प्रदान किया जाता है। हम यहां प्रोटीन क्रिस्टल, न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह, संरचना शोधन और न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई घनत्व मानचित्रों के विश्लेषण को बढ़ाने के लिए वर्कफ़्लो प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

न्यूट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी एक संरचनात्मक तकनीक है जो जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के भीतर हाइड्रोजन परमाणु पदों के निर्धारण की अनुमति देती है, जिससे विकिरण क्षति को प्रेरित नहीं करते हुए प्रोटॉनाइजेशन और हाइड्रेशन राज्यों के बारे में यांत्रिक रूप से महत्वपूर्ण जानकारी मिलती है। एक्स-रे विवर्तन, इसके विपरीत, प्रकाश परमाणुओं की स्थिति पर केवल सीमित जानकारी प्रदान करता है और एक्स-रे बीम तेजी से प्रकाश संवेदी कोफ़ैक्टर्स और धातु केंद्रों के विकिरण क्षति को प्रेरित करता है। यहाँ प्रस्तुत किया गया वर्कफ़्लो Oak Ridge National Laboratory (ORNL) में IMAGINE और MaNDi beamlines के लिए नियोजित है ताकि एक न्यूट्रॉन विवर्तन संरचना प्राप्त की जा सके, एक बार उपयुक्त आकार (> 0.1 mm3) का प्रोटीन क्रिस्टल उगाया गया है। हम न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह के लिए क्वार्ट्ज केशिकाओं में हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन क्रिस्टल के बढ़ते का प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा D2O युक्त बफर के साथ घुड़सवार क्रिस्टल की वाष्प विनिमय प्रक्रिया प्रस्तुत की है ताकि ड्यूटेरियम के साथ विनिमय योग्य साइटों पर हाइड्रोजन परमाणुओं के प्रतिस्थापन को सुनिश्चित किया जा सके। ड्यूटेरियम का निगमन हाइड्रोजन परमाणुओं के असंगत प्रकीर्णन से उत्पन्न पृष्ठभूमि को कम करता है और उनकी नकारात्मक सुसंगत प्रकीर्णन लंबाई के कारण घनत्व रद्दीकरण को रोकता है। नमूना संरेखण और कमरे के तापमान डेटा संग्रह रणनीतियों को उच्च फ्लक्स आइसोटोप रिएक्टर (HFIR) में IMAGINE में अर्ध-लाउ डेटा संग्रह का उपयोग करके सचित्र किया गया है। इसके अलावा, क्रिस्टल बढ़ते और क्रायो-डेटा संग्रह के लिए तरल नाइट्रोजन में तेजी से ठंड labile प्रतिक्रिया मध्यवर्ती जाल करने के लिए स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत (SNS) पर MaNDi समय की उड़ान उपकरण पर प्रदर्शित किया जाता है। मॉडल समन्वय और विवर्तन डेटा फ़ाइलों की तैयारी और न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई घनत्व (एसएलडी) मानचित्रों के विज़ुअलाइज़ेशन को भी संबोधित किया जाएगा। ब्याज के प्रोटीन की एक ऑल-एटम संरचना प्राप्त करने के लिए न्यूट्रॉन डेटा-केवल या संयुक्त एक्स-रे / न्यूट्रॉन डेटा के खिलाफ संरचना शोधन पर अंततः चर्चा की जाएगी। न्यूट्रॉन संरचना को निर्धारित करने की प्रक्रिया को लिटिक पॉलीसेकेराइड मोनोऑक्सीजेनेस न्यूरोस्पोरा क्रैसा एलपीएमओ 9 डी के क्रिस्टल का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाएगा, जो ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड के ऑक्सीडेटिव दरार के माध्यम से अड़ियल पॉलीसेकेराइड के क्षरण में शामिल एक तांबा युक्त मेटालोप्रोटीन है।

Introduction

न्यूट्रॉन मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी एक ऐसी तकनीक है जो प्रोटीन की संरचना और अंतर्निहित रसायन विज्ञान में एक अद्वितीय खिड़की प्रदान करती है। अवधारणात्मक रूप से एक्स-रे विवर्तन के समान, न्यूट्रॉन विवर्तन मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना के परमाणुवादी विवरण प्रदान करता है, हालांकि, नाभिक के साथ न्यूट्रॉन की बातचीत प्रकाश परमाणुओं के स्थानीयकरण को सक्षम बनाती है, अक्सर एक्स-रे विवर्तन 1 के साथ पता लगाना मुश्किल होता है। एक्स-रे विवर्तन के दौरान, एक्स-रे इलेक्ट्रॉन बादल से बिखरजाते हैं, जिससे हाइड्रोजन (एच) जैसे प्रकाश परमाणु इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्रों में खराब रूप से दिखाई देते हैं, जिनमें उप-Ångström रिज़ॉल्यूशन 2 के पास नहीं होता है। इसके विपरीत, न्यूट्रॉन की प्रकीर्णन तीव्रता नाभिक के साथ जटिल बातचीत पर निर्भर करती है, जिसमें एक ही तत्व के आइसोटोप अलग-अलग बिखरने की लंबाई प्रदर्शित करते हैं। इसलिए, प्रकाश परमाणुओं और उनके आइसोटोप, जैसे हाइड्रोजन (1H) और ड्यूटेरियम (2H या D), न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई घनत्व (SLD) मानचित्रों में रीढ़ कार्बन, नाइट्रोजन और ऑक्सीजन परमाणुओं के लिए तुलनीय दृश्यता है। इसके अलावा, चूंकि न्यूट्रॉन प्रकीर्णन का परिमाण इलेक्ट्रॉनों की संख्या से स्वतंत्र है, इसलिए प्रकाश तत्वों से प्रकीर्णन भारी तत्वों द्वारा अस्पष्ट नहीं होता है जब वे एक दूसरे के करीब होते हैं, जैसा कि एक्स-रे प्रकीर्णन में देखा जाता है। न्यूट्रॉन विवर्तन को नियोजित करते समय एच और इसके आइसोटोप डी की बढ़ी हुई दृश्यता उत्प्रेरक रूप से महत्वपूर्ण अवशेषों, कोफ़ैक्टर्स और लिगेंड की प्रोटोनेशन स्थिति के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करती है और पानी के अणुओं के अभिविन्यास में सहायता करती है, उत्प्रेरक तंत्र और प्रोटीन रसायन विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का खुलासा करती है। न्यूट्रॉन विवर्तन भी एक गैर-विनाशकारी तकनीक होने का लाभ प्रदान करता है, विशेष रूप से आयनीकरण के प्रति संवेदनशील जैविक नमूनों के लिए उपयुक्त है जैसे कि धातु केंद्रों या फोटोसेंसिटिव रेडॉक्स कोफ़ैक्टर्स 2 के साथ प्रोटीन। इस आलेख का प्राथमिक फ़ोकस एक उच्च-गुणवत्ता वाले न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टल संरचना को प्राप्त करने के लिए वर्कफ़्लो का अवलोकन प्रदान करना है। हम रुचि रखने वाले पाठक को Podjarny et al.4, Blakeley5, Blakeley et al.6 और O'Dell et al.3 को न्यूट्रॉन प्रोटीन विवर्तन और Ashkar et al.7 न्यूट्रॉन प्रकीर्णन के आगे के अनुप्रयोगों के लिए उत्कृष्ट अवलोकन के लिए संदर्भित करते हैं।

न्यूट्रॉन मुख्य रूप से परमाणु प्रतिक्रियाओं के दौरान उत्पन्न होते हैं जो दो प्रक्रियाओं में से किसी एक को नियोजित करते हैं: रिएक्टर स्रोतों पर परमाणु विखंडन या त्वरक-आधारित स्रोतों पर स्पैलेशन। रिएक्टर स्रोत 235U आइसोटोप के परमाणु विखंडन को नियोजित करके एक निरंतर न्यूट्रॉन बीम प्रदान करते हैं, जबकि स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत एक लक्ष्य पर बमबारी करके एक स्पंदित न्यूट्रॉन बीम का उत्पादन करते हैं, उदाहरण के लिए एक तरल धातु जैसे पारा, प्रोटॉन 9 के साथ। ओक रिज, टेनेसी में ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी (ORNL), उच्च फ्लक्स आइसोटोप रिएक्टर (HFIR) पर एक स्थिर-राज्य न्यूट्रॉन स्रोत और स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत (SNS) पर 60 हर्ट्ज स्पंदित स्रोत दोनों की मेजबानी करता है। एचएफआईआर में स्थित इमेजिन बीमलाइन, एक न्यूट्रॉन विवर्तनमापी है जो जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स (पूरक चित्र1) 10 के लिए अनुकूलित है। कल्पना एक न्यूट्रॉन छवि प्लेट डिटेक्टर को मापने के लिए अर्ध-लाउ डेटा को मापने के लिए 2.8 - 4.5 Å की सीमा में एक संकीर्ण बैंडपास का उपयोग करके इकाई सेल किनारों <150 Å के साथ एकल क्रिस्टल से नियोजित करता है। SnS पर स्थित Macromolecular Neutron Diffractometer (MaNDi), एक टाइम-ऑफ-फ्लाइट (TOF) Laue न्यूट्रॉन diffractometer है जो एक गोलाकार डिटेक्टर सरणी फ्रेम (DAF) (अनुपूरक चित्रा 2) 11 से सुसज्जित है। MaNDi 10 - 300 Å की सीमा में इकाई सेल किनारों के साथ एकल क्रिस्टल से डेटा को 2.0 - 6.0 Å12 के बीच एक tunable 2 Å-तरंग दैर्ध्य बैंडविड्थ को नियोजित करके मापता है।

न्यूट्रॉन उत्पन्न करने की प्रक्रिया अत्यधिक ऊर्जा गहन है, जिसके परिणामस्वरूप सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर एक्स-रे बीम फ्लक्स के विपरीत अपेक्षाकृत कमजोर न्यूट्रॉन बीम फ्लक्स होता है13। डेटा संग्रह के दौरान पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर अनुपात सुनिश्चित करने के लिए, उपयुक्त आकार और गुणवत्ता के क्रिस्टल विकसित करना आवश्यक है। आमतौर पर, 0.1 mm3 > वॉल्यूम वाले क्रिस्टल को पर्याप्त statistics15 के साथ डेटा एकत्र करने की आवश्यकता होती है। कम फ्लक्स के अलावा, न्यूट्रॉन और नमूना नाभिक के बीच बातचीत के अंतर्निहित गुणों को ध्यान में रखा जाना चाहिए16। न्यूट्रॉन की प्रकीर्णन लंबाई एक ही तत्व के आइसोटोप के लिए भिन्न होती है, एक संपत्ति जिसे छोटे कोण न्यूट्रॉन स्कैटरिंग (एसएएनएस) में एक नमूने के क्षेत्रों को मुखौटा या हाइलाइट करने के लिए लाभप्रद रूप से शोषण किया जा सकता है - एक प्रक्रिया जिसे कंट्रास्ट मिलान 17 के रूप में जाना जाता है। विवर्तन प्रयोगों में, H की नकारात्मक सुसंगत न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई (1H के लिए-3.741 fm) न्यूट्रॉन प्रकीर्णन घनत्व मानचित्र विशेषताओं को रद्द करने का कारण बन सकती है, क्योंकि कार्बन (12C के लिए 6.6511 fm), नाइट्रोजन (14N के लिए 9.37 fm), ऑक्सीजन (16O के लिए 5.803 fm) सहित अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक परमाणुओं की सुसंगत न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई, फास्फोरस (31P के लिए 5.13 fm) और सल्फर (32S के लिए 2.804 fm), धनात्मक हैं (तालिका 1)12,14। इसके अलावा, एच (25.274 एफएम) की बड़ी असंगत प्रकीर्णन लंबाई, डेटा संग्रह के दौरान पृष्ठभूमि को बढ़ाती है, डेटासेट की गुणवत्ता को बाधित करती है और डेटा रिज़ॉल्यूशन 7 से समझौता करती है। एच द्वारा शुरू की गई इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, न्यूट्रॉन विवर्तन के लिए, एच को अपने आइसोटोप ड्यूटेरियम, 2 एच (डी) के लिए विनिमय करना आवश्यक है, जिसमें एक सकारात्मक सुसंगत न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई (6.671 एफएम) और काफी कम असंगत प्रकीर्णन लंबाई (4.04 एफएम) 19 है। यह perdeuteration द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, एक ऐसी प्रक्रिया जिसमें प्रोटीन को पूरी तरह से deuterated मीडिया में उगाए गए जीवों द्वारा व्यक्त किया जाता है जो एच साइट20 पर डी के पूर्ण निगमन को सुनिश्चित करता है। एच को पूरी तरह से विनिमय योग्य साइटों (टिट्राटेबल समूहों) पर डी के साथ प्रतिस्थापित करके आंशिक रूप से प्रोटीन को डियूटेरेट करना भी संभव है, जबकि गैर-विनिमय योग्य कार्बन-बाउंड साइटें हाइड्रोजनीकृत रहती हैं21। यह deuterated मदर लिकर 22 में हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन क्रिस्टल के विकास से प्राप्त किया जा सकता है। सबसे आम तौर पर हालांकि, हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन का एच / डी विनिमय एच 2 ओ-आधारित बफर 23 में उपयुक्त रूप से बड़े क्रिस्टल के विकास के बाद वाष्प विनिमय द्वारा किया जाता है। ऐसे मामलों में, क्रिस्टल को एक क्वार्ट्ज केशिका में रखा जाता है और डी 20-आधारित मां शराब के साथ वाष्प-संतुलित होता है।

न्यूट्रॉन स्रोतों पर सीमित न्यूट्रॉन फ्लक्स के परिणामस्वरूप लंबे समय तक डेटा संग्रह समय होता है, जो दिनों से लेकर कई हफ्तों तक होता है24। ORNL में, दोनों IMAGINE और MaNDi डेटा संग्रह 25 को अनुकूलित करने के लिए 2-6 Å रेंज में एक संकीर्ण तरंग दैर्ध्य बैंडपास को नियोजित करते हैं। डेटा को कमरे के तापमान पर या क्रायो-तापमान पर एकत्र किया जा सकता है। क्रायो-डेटा संग्रह संभावित रूप से डेटा की गुणवत्ता में सुधार कर सकता है और फ्रीज-ट्रैपिंग उत्प्रेरक मध्यवर्ती के लिए संभावना खोलता है। न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह के बाद, एक एक्स-रे डेटासेट आमतौर पर एक ही क्रिस्टल पर एक ही तापमान पर या समान परिस्थितियों में उगाए गए क्रिस्टल पर एकत्र किया जाता है26। एक ही तापमान पर डेटा संग्रह संरचना शोधन को एक्स-रे और न्यूट्रॉन डेटा दोनों के खिलाफ करने की अनुमति देता है, जिससे किसी भी संभावित तापमान-प्रेरित कलाकृतियों को रोका जा सकता है जैसे कि दृश्यता और पानी की स्थिति में परिवर्तन या वैकल्पिक संरचनाओं के साथ अवशेषों के अधिभोग 27। संयुक्त एक्स-रे न्यूट्रॉन डेटा परिशोधन डेटा-टू-पैरामीटर अनुपात को बढ़ाता है और प्रोटीन बैकबोन निर्देशांक को एक्स-रे डेटा के खिलाफ परिष्कृत करने की अनुमति देने का लाभ प्रदान करता है, जबकि न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा का उपयोग एच / डी परमाणुओं की स्थिति को परिष्कृत करने के लिए किया जाता है28। यह आंशिक रूप से deuterated नमूनों का उपयोग करते समय विशेष रूप से उपयोगी है, जहां प्रोटीन पर गैर-विनिमय योग्य साइटों पर एच परमाणुओं के कारण घनत्व रद्दीकरण मौजूद है। यद्यपि एक्स-रे संरचनाओं की संख्या प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) में जमा न्यूट्रॉन संरचनाओं की संख्या से कहीं अधिक है, शुरू में एक्स-रे डेटा के शोधन के लिए डिज़ाइन किए गए सॉफ़्टवेयर पैकेजों को न्यूट्रॉन डेटा के साथ-साथ 3,29,30 को शामिल करने के लिए विस्तारित किया गया है। डेटा संग्रह के बाद, मॉडल को phenix.refine, CNSsolve (nCNS) या SHELXL28,31,32,33 जैसे शोधन पैकेजों का उपयोग करके परिष्कृत किया जा सकता है। शोधन प्रक्रिया के दौरान, न्यूट्रॉन प्रकीर्णन घनत्व मानचित्रों को COOT34 का उपयोग करके मैन्युअल फिटिंग के लिए विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है। संरचना समाधान के बाद, निर्देशांक और न्यूट्रॉन और / या एक्स-रे विवर्तन डेटा फ़ाइलों को पीडीबी को प्रस्तुत किया जा सकता है, जो मॉडल को मान्य और जमा करेगा, जिससे यह सार्वजनिक पहुंच 18,29,30 के लिए उपलब्ध होगा।

प्रोटीन का संरचनात्मक विश्लेषण एक बहुआयामी दृष्टिकोण है जिसमें उनके कार्य और तंत्र की जांच करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी एक्स-रे विवर्तन, स्पेक्ट्रोस्कोपी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) या माइक्रो क्रिस्टल इलेक्ट्रॉन विवर्तन (माइक्रोईडी) 36 जैसे अतिरिक्त अध्ययनों से निष्कर्षों का विस्तार और पूरक करने के लिए मूल्यवान रासायनिक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। न्यूट्रॉन प्रोटीन विवर्तन को एंजाइमेटिक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विशिष्ट रूप से तैनात किया गया है, क्योंकि एच परमाणु उनके रसायन विज्ञान के लिए केंद्रीय हैं। न्यूट्रॉन द्वारा प्रेरित विकिरण क्षति की अनुपस्थिति उन्हें मेटलोप्रोटीन 37 के अध्ययन के लिए असाधारण रूप से अनुकूल एक जांच बनाती है। हम यहां नमूना तैयारी से डेटा संग्रह, शोधन और विश्लेषण तक न्यूट्रॉन प्रोटीन विवर्तन की प्रक्रिया का एक प्रतिनिधि उदाहरण प्रस्तुत करते हैं (चित्रा 1)। न्यूट्रॉन विवर्तन प्रयोगों के लिए पर्याप्त आकार के क्रिस्टल metaloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D) के बड़े किए गए हैं। नेकां LPMO9D एक तांबे युक्त metaloprotein ग्लाइकोसिडिक बांड 38,39 पर ऑक्सीजन परमाणु सम्मिलन द्वारा अड़ियल सेल्यूलोज के क्षरण में शामिल है। NcLPMO9D सक्रिय साइट में एक विशेषता "हिस्टिडीन-ब्रेस" के भीतर एक मोनोन्यूक्लियर कॉपर सेंटर होता है जो एन-टर्मिनल हिस्टिडीन और एक दूसरे संरक्षित हिस्टिडीन (पूरक चित्रा 3) 40 से बना होता है। कवक LPMOs के एन टर्मिनल methylated है, लेकिन पोस्ट संक्रमणकालीन संशोधन खमीर में पुनः संयोजक अभिव्यक्ति के दौरान नहीं होता है। NcLPMO9D आराम राज्य में, तांबा केंद्र एक Cu2 + ऑक्सीकरण राज्य में मौजूद है और Cu1 + के लिए एकल इलेक्ट्रॉन कमी द्वारा सक्रिय है, आणविक ऑक्सीजन को बांधने और तेजी से एक सुपरऑक्साइड प्रजातियों के लिए कम किया जा रहा द्वारा सक्रिय किया जा करने की अनुमति देता है41,42. समग्र NcLPMO9D प्रतिक्रिया के लिए हाइड्रॉक्सिलेटेड पॉलीसेकेराइड उत्पाद 43 बनाने के लिए एक इलेक्ट्रॉन और दो प्रोटॉन के आगे के अतिरिक्त की आवश्यकता होती है। पॉलीसेकेराइड सब्सट्रेट से हाइड्रोजन परमाणु अमूर्तता (एचएए) के लिए जिम्मेदार सक्रिय ऑक्सीजन प्रजातियों की पहचान की पहचान नहीं की गई है और गहन संरचनात्मक और कम्प्यूटेशनल अध्ययन वर्तमान में चल रहे हैं44,45। NcLPMO9D सक्रिय साइट पर रेडॉक्स रसायन विज्ञान को देखते हुए, विकिरण क्षति का शमन विशेष रूप से प्रासंगिक है। हम यहाँ कमरे के तापमान और NcLPMO9D क्रिस्टल पर क्रायो-तापमान डेटा संग्रह को आराम की स्थिति में और सक्रिय रूप में NcLPMO9D संरचना को निर्धारित करने के लिए, क्रमशः 46 को चित्रित करते हैं। प्रोटीन क्रिस्टल बढ़ते, डेटा संग्रह के लिए बीमलाइन इंस्ट्रूमेंट सेटअप, डेटा की तैयारी और फ़ाइलों का समन्वय करने और सभी परमाणु न्यूट्रॉन संरचना को मॉडल करने के लिए आवश्यक शोधन चरणों पर जोर दिया जाएगा।

Protocol

1. क्रिस्टल आकार मूल्यांकन

  1. सामान्य और ध्रुवीकृत प्रकाश से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करके क्रिस्टल के आकार को मापें। ~ 0.1 mm3 (अनुपूरक चित्रा 4) की एक न्यूनतम मात्रा के साथ क्रिस्टल का चयन करें।
  2. पर्याप्त रूप से बड़े क्रिस्टल के साथ कुओं को लेबल करें और इन क्रिस्टलों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली क्रिस्टलीकरण स्थितियों पर ध्यान दें।

2. deuterated क्रिस्टलीकरण बफर की तैयारी

  1. D2O में क्रिस्टलीकरण बफर घटकों को भंग करने के लिए deuterated क्रिस्टलीकरण बफर उत्पन्न करने के लिए.
  2. निम्न समीकरण का उपयोग कर समाधान के pD की गणना करके बफ़र के pH को समायोजित करें:
    Equation 1 (1)
    जहां pHmeas एक मानक ग्लास इलेक्ट्रोड के साथ मापा गया पीएच है। NcLPMO9D क्रिस्टलीकरण बफर का मूल पीएच 6.0 था, इसलिए हम पीडी 6.0 पर deuterated क्रिस्टलीकरण बफर के लिए 5.6 के pHmeas का उपयोग करेंगे।
  3. उपयोग करने से पहले दस मिनट के लिए D2O में पीएच मीटर इलेक्ट्रोड को विसर्जित करें (पूरक चित्रा 5)।
  4. आधार NaOD या एसिड DCl का उपयोग करके pHmeas को 5.6 पर समायोजित करें।

3. क्रिस्टल कटाई

  1. क्रिस्टलीकरण ट्रे के बगल में सिलिकॉनाइज्ड 22 मिमी गोल ग्लास स्लाइड रखें जिसमें से क्रिस्टल काटा जाएगा। क्रिस्टल प्रति एक साफ ग्लास स्लाइड का उपयोग करें (चित्रा 2A)।
  2. 9-अच्छी तरह से बड़ी मात्रा में सिलिकॉनाइज्ड ग्लास प्लेट में प्रोटीन क्रिस्टल युक्त सील किए गए सैंडविच बॉक्स को खोलें।
  3. एक माइक्रोपिपेट के साथ क्रिस्टलीकरण जलाशय समाधान से 10-20 μL निकालें और कांच की स्लाइड (चित्रा 2B) पर समाधान रखें।
  4. उचित आकार के माइक्रोलूप का उपयोग करके क्रिस्टल को काट लें और क्रिस्टल को कांच की स्लाइड पर जलाशय समाधान ड्रॉप में रखें ताकि मलबे को हटाया जा सके जो अक्सर क्रिस्टल (चित्रा 2 सी और चित्रा 2 डी) के साथ काटे जाते हैं।
    नोट: यह जल्दी से काम करने के लिए आवश्यक हो जाएगा के बाद से छोटे मात्रा की बूंदों वाष्पित हो सकता है. काटे गए क्रिस्टल को भी वायुमंडल के संपर्क में आने पर सूखने का खतरा होता है। क्रिस्टल को छोटे क्रिस्टलीकरण ड्रॉप वॉल्यूम में सूखने से रोकने के लिए प्रोटीन ड्रॉप में कुछ जलाशय समाधान जोड़ना आवश्यक हो सकता है।

4. क्रिस्टल बढ़ते

नोट: केशिका बढ़ते प्रोटोकॉल प्रयोगवादी प्राथमिकताओं के साथ भिन्न होते हैं। क्रिस्टल को नुकसान को रोकने के लिए, केशिकाओं को छोटा करने की आवश्यकता होती है, उन्हें एक चिकनी ब्रेक सुनिश्चित करने के लिए काटने वाले पत्थर या सैंडपेपर के साथ स्कोर किया जाना चाहिए।

  1. केशिका कार्रवाई द्वारा जलाशय बफर के साथ एक 2 मिमी व्यास 50 मिमी लंबाई क्वार्ट्ज केशिका के एक छोर को भरें या सीधे केशिका में जलाशय बफर के ~ 10 μL pipetting द्वारा (चित्रा 3A)।
    नोट: उपयोगकर्ताओं को क्वार्ट्ज केशिका ट्यूबों का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है क्योंकि, इसकी यांत्रिक ताकत के अलावा, न्यूट्रॉन बीम अवशोषण और केशिका से कम पृष्ठभूमि योगदान को सीमित करना आवश्यक है। ग्लास केशिकाएं उच्च पृष्ठभूमि का परिचय देती हैं और न्यूट्रॉन को अवशोषित करती हैं, डेटा की गुणवत्ता से समझौता करती हैं।
  2. धीरे से बढ़ते लूप (चित्रा 3B और चित्रा 3C) का उपयोग कर क्वार्ट्ज केशिका में जलाशय बफर में क्रिस्टल जगह.
  3. जलाशय बफर को स्थानांतरित करने के लिए ट्यूब को धीरे से टैप करें और उसमें केशिका के नीचे क्रिस्टल को विसर्जित करें (चित्रा 3 डी)।
  4. क्रिस्टल को 13.5 मिमी से अधिक करीब नहीं रखें और केशिका के एक छोर से 27.5 मिमी आगे नहीं रखें; यह बढ़ते अंत (अनुपूरक चित्रा 6) होगा।
  5. एक लंबी पतली पिपेट टिप का उपयोग करके क्रिस्टल के चारों ओर बफर समाधान को एस्पिरेट करें, जिससे क्रिस्टल थोड़ा गीला हो जाता है। क्रिस्टल को स्पर्श न करें (अनुपूरक चित्र7A)।
  6. एक पतली कागज बाती के साथ केशिका की दीवारों सूखी (पूरक चित्रा 7B).
  7. बढ़ते अंत (चित्रा 4A) के विपरीत केशिका के अंत में deuterated बफर समाधान के पिपेट 20-50 μL.
  8. एक गर्मी "छड़ी" के साथ मोम पिघलाएं और धीरे से इस पिघले हुए मोम में केशिका डालें। एक एयरटाइट सील रूपों तक दोहराएं (चित्रा 4 बी और चित्रा 4 सी)।
  9. पिपेट एक बहुत ही कम मात्रा में deuterated बफर, केशिका के बढ़ते अंत में लगभग 5 μL गर्म मधुमक्खी के लिए एक "गर्मी सिंक" के रूप में कार्य करने के लिए। पिघले हुए मोम में इस छोर को डुबोएं ताकि एक एयरटाइट सील उत्पन्न हो सके जैसा कि पहले वर्णित किया गया था ताकि दोनों सिरों पर सील की गई केशिका बनाई जा सके (चित्रा 4 डी)।
  10. हवाबंदता सुनिश्चित करने के लिए बढ़ते के बाद एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके घुड़सवार क्रिस्टल का निरीक्षण करें (चित्रा 4 ई)।
  11. सावधानी से एक कंटेनर में किम वाइप्स के साथ घुड़सवार क्रिस्टल को सुरक्षित करें जैसे कि 15-मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब या पेट्री डिश और उस तापमान पर क्षैतिज रूप से स्टोर करें जिस पर क्रिस्टल उगाए गए थे (चित्रा 4 एफ)।

5. वाष्प विनिमय

  1. क्रिस्टल बढ़ते के दो दिन बाद ताजा बफर के साथ deuterated बफ़र को बदलें।
  2. एक हीटिंग लूप के साथ क्रिस्टल से मोम सील सबसे दूर पिघलाएं, और बफर को हटाने के लिए एक पिपेट और पेपर विक्स का उपयोग करें।
  3. deuterated बफर समाधान और मोम के साथ सील के 20-50 μL के साथ केशिका फिर से भरना.
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए कि deuterated बफर वाष्प विनिमय पूरा हो गया है और कम से कम दो सप्ताह के लिए वाष्प विनिमय की अनुमति देने के लिए चार दिन के अंतराल पर दो बार और deuterated बफर प्रतिस्थापन को दोहराएं।

6. न्यूट्रॉन प्रोटीन विवर्तन

नोट: इमेजिन बीम लाइन बारीकियों में रुचि रखने वाले पाठकों को Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47 से परामर्श करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।

  1. HFIR पर IMAGINE beamline पर कमरे का तापमान डेटा संग्रह
    1. नमूना बढ़ते
      1. पुट्टी के साथ गोनियोमीटर पर केशिका-घुड़सवार क्रिस्टल को सुरक्षित करें।
      2. नमूना छड़ी पर गोनोमीटर माउंट और ऑफ लाइन संरेखण स्टेशन का उपयोग कर बीम में क्रिस्टल केंद्र.
      3. उपकरण नमूना चरण (पूरक चित्रा 1B) पर नमूना छड़ी सुरक्षित करें।
      4. सुनिश्चित करें कि प्रयोगात्मक हच खाली हो गया है और न्यूट्रॉन डेटा संग्रह के लिए बीमलाइन शटर खोलें।
    2. डेटा संग्रह
      1. बीमलाइन नियंत्रण कंप्यूटर पर डेटा अधिग्रहण प्रोग्राम खोलें और डेटा संग्रह रणनीति सेट करने के लिए सेटअप टैब पर क्लिक करें। के अंतर्गतप्रयोग पैरामीटर्स नमूना नाम के आगे नमूना नाम टाइप करें और प्रस्ताव के आगे प्रस्ताव संख्या इनपुट करें। छवि नामकरण के अंतर्गत फ़ोल्डर टेम्पलेट का चयन करें और अधिग्रहित डेटा को सहेजने के लिए गंतव्य सेट करें और छवि उपसर्ग का चयन करें और प्रासंगिक फ़्रेम नाम लिखें (अनुपूरक चित्र8).
      2. ऑप्टिक्स GUI खोलें और डेटा संग्रह (अनुपूरक चित्रा 9) के लिए अर्ध-Laue रेंज सेट करने के लिए πmin के लिए 2.78 और 4.78 पर क्लिक करें।
      3. एकत्रित करें टैब पर टॉगल करें और अगले स्कैन पैरामीटर के तहत एक्सपोज़र के तहत सेकंड में एक्सपोज़र समय डालें, N फ़्रेम्स के तहत फ़्रेमों की संख्या और डेटा संग्रह के लिए कोणों के अंतर्गत Π φ/Frame. छवि उपसर्ग के अंतर्गत एकत्रित किए जाने वाले फ़्रेम का नाम दें और प्रारंभ स्कैन बटन (अनुपूरक चित्र10) पर क्लिक करके डेटा संग्रह प्रारंभ करें.
      4. विवर्तित न्यूट्रॉन छवि प्लेट डिटेक्टर द्वारा पता लगाया जाएगा। प्रत्येक एक्सपोज़र के अंत में, छवि प्लेट को पढ़ा जाएगा और डेटा अधिग्रहण जीयूआई (पूरक चित्रा 11) पर प्रदर्शित पैटर्न।
      5. फ्रेम्स को अनुक्रमित, एकीकृत, तरंग दैर्ध्य सामान्यीकृत किया जाता है और जिम्मेदार बीमलाइन वैज्ञानिक द्वारा Lauegen, Lscale50 और Scala का उपयोग करके स्केल किया जाता है, जो उपयोगकर्ता को डेटा संग्रह (पूरक चित्रा 12) के बाद मर्ज किए गए प्रतिबिंब फ़ाइल के साथ प्रदान करेगा।
        नोट: दोनों IMAGINE और MaNDi पर डेटा संग्रह अर्ध-Laue मोड में प्रदर्शन किया जाएगा, पद्धति और Laue विवर्तन डेटा संग्रह के लिए विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के रूप में Helliwell et al.48 और Nieh et al.49 द्वारा विकसित किया गया है।
      6. न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह (पूरक चित्र13) के बाद एक ही तापमान पर एक ही क्रिस्टल पर एक संबंधित एक्स-रे डेटासेट एकत्र करें।
        नोट: एक ही बूंद से या एक ही क्रिस्टलीकरण शर्तों के तहत उगाए गए क्रिस्टल का उपयोग संयुक्त न्यूट्रॉन / एक्स-रे शोधन के लिए एक्स-रे विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए भी किया जा सकता है।
  2. Sns पर MaNDi बीमलाइन पर क्रायो डेटा संग्रह
    नोट: बीम लाइन विशिष्टताओं में रुचि रखने वाले पाठकों को कोट्स एट अल (2015), Meilleur et al. 201810,11 से परामर्श करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।
    1. नमूना बढ़ते
      1. क्रिस्टल और deuterated क्रायोप्रोटेक्टेंट की कमी के लिए deuterated ascorbate भिगोने के समाधान तैयार करें। एक क्रिस्टलीकरण प्लेट में बैठे ड्रॉप कुओं में इन समाधानों में से प्रत्येक की 20 μL बूँदें रखें।
        नोट: क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान आमतौर पर क्रायोप्रोटेक्टेंट है जो क्रायो-तापमान एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के लिए प्रभावी साबित हुआ है जो डी 2 ओ में तैयार किया गया है। यदि आवश्यक हो तो न्यूट्रॉन डेटा संग्रह के लिए इस क्रायोप्रोटेक्टेंट को आगे अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे एकाग्रता)।
      2. नमूना बढ़ते के लिए छोरों का चयन करें और उन्हें एक चुंबकीय क्रायो-बेस MaNDi दिशानिर्देशों (अनुपूरक चित्रा 14) का पालन करने के लिए संलग्न करें।
      3. तरल नाइट्रोजन के साथ एक फोम क्रायो-देवर भरें। ठंडा करने के लिए तरल नाइट्रोजन के भीतर एक धातु क्रायो-सुरक्षा आस्तीन रखें (पूरक चित्रा 15 ए)।
      4. केशिका के दोनों सिरों से मोम प्लग निकालें और बफर प्लग को स्थानांतरित करने के लिए केशिका को टैप करें ताकि माउंटेड क्रिस्टल बफर में डूब जाए। क्रिस्टल को 20 μL जलाशय समाधान ड्रॉप में अच्छी तरह से बैठने की बूंद में धोलें (पूरक चित्रा 15B और पूरक चित्रा 15C)।
        नोट:: यह चरण आवश्यक नहीं है यदि H/D विनिमय deuterated बफ़र के खिलाफ क्रिस्टलीकरण बूँदें के संतुलन द्वारा या deuterated बफ़र में क्रिस्टल के सीधे भिगोने से किया गया था।
      5. दो घंटे के लिए ascorbate भिगोने के समाधान में क्रिस्टल विसर्जित करें। एक चुंबकीय क्रायो-बेस से जुड़े एक माइक्रोलूप में क्रिस्टल माउंट करें। 10 सेकंड के लिए क्रायोप्रोटेक्टेंट में घुड़सवार क्रिस्टल को विसर्जित करें और क्रिस्टल और क्रायो माउंट को तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करने के लिए डुबोएं (पूरक चित्रा 15 डी)।
      6. एक बार क्रिस्टल जमे हुए है, पूर्व ठंडा क्रायो पिन टोंग का उपयोग करें और एक क्रायो-स्ट्रीम के साथ फिट MaNDi नमूना चरण पर क्रिस्टल माउंट। धीरे से क्रायो पिन टोंग खोलें और सुनिश्चित करें कि क्रिस्टल क्रायो-स्ट्रीम (पूरक चित्रा 2 सी) में रहता है।
    2. डेटा संग्रह
      1. डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर खोलें जिसमें प्रयोग जानकारी में ऑटो-पॉपुलेटेड होगा.
      2. कंप्यूटर-नियंत्रित गोनोमीटर (पूरक चित्रा 16) के साथ इसे केंद्र में रखने के लिए क्रिस्टल के केंद्र पर क्लिक करें।
      3. तालिका के तहत, "phi" के तहत डेटा संग्रह के लिए कोणों के साथ-साथ मूल्य (अनुपूरक चित्र17) के तहत प्रति फ्रेम कुल न्यूट्रॉन बीम एक्सपोजर को इनपुट करके डेटा संग्रह रणनीति सेट करें।
      4. डेटा संग्रह शुरू करने के लिए सबमिट पर क्लिक करें।
      5. जैसा कि डेटा एकत्र होता है, विवर्तित न्यूट्रॉन दिखाई देगा (पूरक चित्रा 17)। विवर्तन धब्बे स्पष्ट हो जाएंगे क्योंकि एक्सपोजर समय बढ़ जाता है, सिग्नल-टू-शोर अनुपात (चित्रा 5) में सुधार होता है।
      6. फ्रेम्स को अनुक्रमित, एकीकृत, तरंग दैर्ध्य सामान्यीकृत किया जाएगा और जिम्मेदार बीमलाइन वैज्ञानिक द्वारा मैंटिड और लाउनोर्म का उपयोग करके स्केल किया जाएगा, जो उपयोगकर्ता को डेटा संग्रह 51 के बाद मर्ज की गई तीव्रता फ़ाइल प्रदान करेगा।

7. संरचना शोधन

  1. संयुक्त एक्स-रे और न्यूट्रॉन डेटा शोधन
    1. संरचना तैयारी
      1. एक पूर्ण संरचना प्राप्त करने के लिए मैन्युअल निर्माण के लिए phenix.refine सॉफ़्टवेयर पैकेज और Coot का उपयोग करके एक प्रोटीन संरचना प्राप्त करने के लिए एक्स-रे डेटा को परिष्कृत करें।
      2. CCP4 खोलें और न्यूट्रॉन डेटा के R-मुक्त डेटा ध्वजों को एक्स-रे डेटा से मिलान करने के लिए MTZ प्रोग्राम में कनवर्ट/संशोधित/विस्तारित करें का चयन करें. MTZ स्वरूप में प्रतिबिंब फ़ाइल आयात करने के लिए चुनें। के तहत अपलोड में प्राप्त न्यूट्रॉन MTZ फ़ाइल और अपलोड एक्स-रे mtz फ़ाइल आयात FreeR MTZ (अनुपूरक चित्रा 18) के तहत फ़ाइल. बाहर के अंतर्गत नई MTZ फ़ाइल के लिए कोई नाम दें और चलाएँक्लिक करें।
      3. Phenix सॉफ़्टवेयर पैकेज खोलें और परिशोधन उपकरण के तहत ReadySet पर क्लिक करें। PDB फ़ाइल के बगल में PDB निर्देशांक फ़ाइल को एक्स-रे डेटा के विरुद्ध परिष्कृत अपलोड करें. मॉडल में हाइड्रोजन जोड़ने के लिए चुनें यदि अनुपस्थित है और विनिमय योग्य साइटों पर एच / डी का चयन करें, ड्रॉप-डाउन मेनू से कहीं और एच। विलायक अणुओं के लिए ड्यूटेरियम जोड़ें का चयन करें और शेष विकल्पों को उनके डिफ़ॉल्ट मानों (अनुपूरक चित्रा 19A) पर छोड़ दें।
        नोट:: यदि एक perdeuterated प्रोटीन का उपयोग किया जाता है, तो विकल्प का चयन करें मॉडल के लिए हाइड्रोजन जोड़ें यदि अनुपस्थित है और विनिमय योग्य साइटों पर H / D का चयन करें, कहीं और डी।
    2. संरचना परिष्करण
      1. एक्स-रे और न्यूट्रॉन डेटा दोनों का उपयोग करके परिशोधन सेट करने के लिए परिशोधन टैब के तहत phenix.refine प्रोग्राम खोलें। इनपुट फ़ाइलों में कॉन्फ़िगर टैब में एक्स-रे संरचना से पीडीबी फ़ाइल इनपुट होती है जिसे रेडीसेट के साथ संसाधित किया गया है और आवश्यक सीआईएफ किसी भी प्रासंगिक लिगेंड के लिए फ़ाइल को रोकता है। CCP4 का उपयोग करके असाइन किए गए Rfree झंडे के साथ न्यूट्रॉन डेटा से MTZ फ़ाइल अपलोड करें और इसे डेटा प्रकार शीर्षक के तहत "न्यूट्रॉन डेटा" और "न्यूट्रॉन आर-फ्री" के रूप में असाइन करें। एक्स-रे डेटा से MTZ फ़ाइल अपलोड करें और इसे डेटा प्रकार शीर्षक के तहत "एक्स-रे डेटा" और "एक्स-रे आर-फ्री" के रूप में असाइन करें। डेटा अपलोड होने के बाद स्पेस समूह और डेटा लेबल स्वत: पॉप्युलेट हो जाएंगे (अनुपूरक चित्र19B).
        नोट:: परिशोधन करते समय, और क्रिस्टल जानकारी inputting, एक्स-रे डेटा से निर्धारित इकाई कक्ष का उपयोग करें।
      2. परिशोधन सेटिंग्स में कॉन्फ़िगर करें टैब के अंतर्गत मानक परिशोधन रणनीति रखें। चक्रों की संख्या बढ़ाकर पांच कर दें (अनुपूरक चित्र 20)
      3. सभी पैरामीटर का चयन करें, उन्नत पर क्लिक करें और Hydrogens का चयन करें .... हाइड्रोजन परिशोधन मॉडल को व्यक्तिगत रूप से बदलें और फोर्स राइडिंग एडीपी (अनुपूरक चित्रा 20) को बंद कर दें।
      4. सभी पैरामीटरका चयन करें और खोज पैरामीटरविकल्प खोलें. परमाणु शब्द के लिए खोजें और X-H/ D के लिए परमाणु दूरी का उपयोग करने के लिए चुनें (अनुपूरक चित्र20)।
      5. परिशोधन प्रारंभ करने के लिए चलाएँ का चयन करें।
    3. मॉडल बिल्डिंग
      1. Phenix में शोधन के बाद, एक्स-रे इलेक्ट्रॉन घनत्व और न्यूट्रॉन SLD मानचित्रों की कल्पना करने के लिए परिणाम टैब में Coot में खोलें पर क्लिक करें। प्रदर्शन प्रबंधक टैब पर क्लिक करें और मानचित्र के तहत न्यूट्रॉन मानचित्र (अनुपूरक चित्र21) को हटाने के लिए _neutron मानचित्र के बगल में मानचित्र हटाएँ पर क्लिक करें। फ़ाइल > ओपन MTZ, mmCIF fcf या phs पर क्लिक करें .... वर्तमान परिशोधन फ़ाइलों का चयन करें और .mtz फ़ाइल खोलें। Amplitudes और Phases विकल्प दोनों के लिए ड्रॉपडाउन मेनू से 2FOFC WT_no_fill_neutron डेटा का चयन करें। इसे दोहराएं और FOFC WT_neutron डेटा खोलें। प्रदर्शन प्रबंधक खोलें और न्यूट्रॉन और एक्स-रे 2FOFCWT मानचित्र दोनों के लिए स्क्रॉल करने के लिए टॉगल करें, फिर 2FOFCWT मानचित्रों के rmsd को 1.00 (पूरक चित्रा 21) तक कम करने के लिए स्क्रॉल करें। दोनों न्यूट्रॉन और एक्स-रे FOFCWT मानचित्रों के लिए स्क्रॉल करने के लिए टॉगल करें और FOFCWT मानचित्रों के rmsd को 3.00 तक कम करने के लिए स्क्रॉल करें।
      2. यह निर्धारित करने के लिए अवशेषों का दृश्य निरीक्षण करें कि मॉडल डेटा में फिट बैठता है या नहीं। अंतर घनत्व मानचित्र चोटियों का विश्लेषण करके सभी विनिमय योग्य साइटों के सही अभिविन्यास और एच / डी अधिभोग का निर्धारण करें। इसमें सेरीन, थ्रेओनिन्स और टायरोसिन के हाइड्रॉक्सिल समूह शामिल हैं; हिस्टिडीन, ग्लूटामाइन, शतावरी और लाइसिन का नाइट्रोजन; सिस्टीन का सल्फहाइड्रिल; एस्पार्टेट और ग्लूटामेट के कार्बोक्सिल समूह; रीढ़ एमाइड समूहों; लिगेंड; cofactors और किसी भी संभावित कार्यात्मक अवशेषों (चित्रा 6).
      3. न्यूट्रॉन घनत्व और हाइड्रोजन बांड इंटरैक्शन के अनुसार पानी के अणुओं को घुमाएं, उन्हें रोटेट ट्रांसलेट ज़ोन / चेन / मॉलिक्यूल फीचर (पूरक चित्रा 22 ए और पूरक चित्रा 22 बी) का उपयोग करके घुमाएं। संपादित करें ची कोण उपकरण और रोटेट अनुवाद क्षेत्र / श्रृंखला / अणु सुविधा (अनुपूरक चित्रा 22C और पूरक चित्रा 22D ) का उपयोग करके प्रोटीन अवशेष H / D विनिमय योग्य साइटों की स्थिति समायोजित करें।
  2. संरचना परिशोधन - न्यूट्रॉन डेटा-केवल शोधन
    1. संरचना तैयारी
      1. Phenix खोलें और "आणविक प्रतिस्थापन" का चयन करें और का चयन करें "Phaser-MR (पूर्ण विशेष रुप से प्रदर्शित)" का चयन करने के लिए आणविक प्रतिस्थापन द्वारा उपकरण वैज्ञानिक द्वारा प्रदान की गई स्केल की गई तीव्रता के चरण को प्राप्त करने के लिए पीडीबी प्रारूप में एक प्रारंभिक समन्वय फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए। "इनपुट और सामान्य विकल्प टैब में प्रारंभिक pdb संरचना इनपुट और Ensembles, ASU सामग्री और खोज प्रक्रिया विकल्पों को पूरा करें।
      2. मॉडल उपकरण खोलें और PDB उपकरण का चयन करें। pdb फ़ाइल को इनपुट फ़ाइल के रूप में सम्मिलित करें. विकल्प टैब पर नेविगेट करें और परमाणु चयन निकालें के तहत विलायक, लिगेंड, cofactors और धातुओं के नाम का चयन करें। यह एक न्यूनतम मॉडल उत्पन्न करने के लिए सभी पानी के अणुओं, cofactors, लिगेंड और धातु आयनों को हटा देता है। साथ ही, मॉडल (अनुपूरक चित्र23) से वैकल्पिक conformers को निकालने के लिए का चयन करें।
      3. Phenix में शोधन का चयन करें और ReadySet खोलें। PDB फ़ाइल के आगे संपादित pdb निर्देशांक फ़ाइल इनपुट करें। मॉडल में हाइड्रोजन जोड़ने के लिए चुनें यदि अनुपस्थित है और विनिमय योग्य साइटों पर एच / डी का चयन करें, न्यूट्रॉन शोधन विकल्पों के ड्रॉप-डाउन मेनू से कहीं और एच (पूरक चित्रा 23)।
    2. संरचना परिष्करण
      1. Phenix में परिशोधन टैब के अंतर्गत phenix.refine प्रोग्राम खोलें। कॉन्फ़िगर टैब इनपुट में PDB फ़ाइल जो Input फ़ाइलें बॉक्स के अंतर्गत ReadySet के साथ संसाधित किया गया है। इनपुट फ़ाइलें बॉक्स में न्यूट्रॉन डेटा से MTZ फ़ाइल अपलोड करें और इसे डेटा प्रकार स्तंभ के तहत एक्स-रे डेटा और एक्स-रे आर-फ्री के रूप में असाइन करें, भले ही यह न्यूट्रॉन डेटा हो। अगले चरण में स्थापित परिशोधन कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग प्रतिबिंब फ़ाइल को न्यूट्रॉन डेटा के रूप में मानने के लिए किया जाएगा। डेटा अपलोड होने के बाद स्पेस समूह और डेटा लेबल स्वत: पॉप्युलेट हो जाएंगे (अनुपूरक चित्र24A).
      2. परिशोधन सेटिंग्स में कॉन्फ़िगर करें टैब के अंतर्गत मानक परिशोधन रणनीति रखें। चक्रों की संख्या बढ़ाकर पांच कर दें। अन्य विकल्पों के अंतर्गत प्रकीर्णन तालिका ड्रॉपडाउन मेनू से न्यूट्रॉन का चयन करें. पानी अद्यतन करने के लिए विकल्प का चयन रद्द करें (अनुपूरक चित्र 24B).
      3. सभी पैरामीटर>उन्नत>हाइड्रोजन का चयन करें। नई विंडो में हाइड्रोजन शोधन मॉडल ड्रॉपडाउन मेनू से व्यक्तिगत का चयन करें और एडीपी की सवारी करने वाले बल को बंद कर दें (पूरक चित्रा 20)।
      4. खोज पैरामीटर्स > सभी पैरामीटर्स का चयन करें... विकल्प। परमाणु शब्द के लिए खोजें और X-H/ D के लिए परमाणु दूरी का उपयोग करने के लिए चुनें (अनुपूरक चित्र20)।
      5. परिशोधन प्रारंभ करने के लिए चलाएँ का चयन करें.
        नोट: प्रारंभिक शोधन के बाद, न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का नेत्रहीन निरीक्षण करना और कूट में मैनुअल मॉडल बिल्डिंग करना आवश्यक होगा। मॉडल में मौजूद लिगेंड / कोफ़ैक्टर्स सम्मिलित करना आवश्यक हो सकता है। बाद के शोधन के लिए किसी भी प्रासंगिक लिगेंड के लिए आवश्यक CIF restraints फ़ाइल की आवश्यकता होगी और इन्हें phenix.refine के कॉन्फ़िगर टैब में अपलोड किया जाना चाहिए।
    3. मॉडल बिल्डिंग
      1. Phenix में शोधन के बाद, न्यूट्रॉन SLD मानचित्र और संरचना की कल्पना करने के लिए परिणाम टैब में Coot में खोलें पर क्लिक करें। प्रदर्शन प्रबंधक टैब पर क्लिक करें और मानचित्र के तहत 2FOFCWT और FOFCWT मानचित्र (अनुपूरक चित्रा 25) दोनों को हटाने के लिए मानचित्र हटाएँ पर क्लिक करें। फ़ाइल > ओपन MTZ, mmCIF fcf या phs पर क्लिक करें .... वर्तमान परिशोधन फ़ोल्डर का चयन करें और .mtz फ़ाइल का चयन करें। Amplitudes और Phases दोनों विकल्प के लिए ड्रॉपडाउन मेनू से 2FOFC WT_no_fill डेटा का चयन करें। MTZ, mmCIF fcf या phs खोलें > फ़ाइल पर क्लिक करके दोहराएँ ... और आयाम और चरणों दोनों विकल्प के लिए ड्रॉपडाउन मेनू से FOFCWT डेटा का चयन करें। प्रदर्शन प्रबंधक खोलें और 2FOFC WT_no_fill मानचित्र के लिए स्क्रॉल करने के लिए टॉगल करें, फिर 2FOFC WT_no_fill डेटा के rmsd को 1.00 (अनुपूरक चित्र25) तक कम करने के लिए स्क्रॉल करें। FOFCWT मानचित्र के लिए स्क्रॉल करने के लिए टॉगल करें और FOFCWT डेटा के rmsd को 3.00 तक कम करने के लिए स्क्रॉल करें।
      2. यह निर्धारित करने के लिए प्रोटीन संरचना का दृश्य निरीक्षण करें कि मॉडल न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र में फिट बैठता है या नहीं।
      3. जैसा कि 7.1.3.2 में वर्णित है, एच / डी विनिमय योग्य साइटों के साथ अवशेषों और समूहों के सही अभिविन्यास और एच / डी अधिभोग का निर्धारण करें। रोटेट अनुवाद उपकरण का उपयोग करके अवशेष पदों को समायोजित करें और ची एंगल्स संपादित करें (चित्रा 6)। यदि आवश्यक हो, तो रियल स्पेस रिफाइन ज़ोन का उपयोग किया जा सकता है। सही परमाणु निर्देशांक सम्मिलित करने के लिए पाठ संपादक का उपयोग करके मैन्युअल रूप से अवशेषों से विस्फोट करने वाले D परमाणुओं को ठीक करें
        नोट: रियल स्पेस रिफाइन ज़ोन को कूट में न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है और इसके परिणामस्वरूप डी से बंधे परमाणुओं के लिए अनियमित बंधन लंबाई हो सकती है, जिसे विस्फोट अवशेष (पूरक चित्रा 26) कहा जाता है। आवश्यक परमाणु निर्देशांक को मैन्युअल रूप से संपादित करना और वास्तविक अंतरिक्ष रिफाइन ज़ोन के उपयोग से बचना बेहतर है।
      4. डालें और न्यूट्रॉन घनत्व के अनुसार पानी के अणुओं को पुन: उन्मुख करें। कूट में पानी जोड़ने के लिए सूचक आइकन पर प्लेस परमाणु का चयन करें और पानी के अणु को सम्मिलित करने के लिए चुनें (अनुपूरक चित्र27A)। Coot डिफ़ॉल्ट रूप से इस स्थिति में एक O परमाणु सम्मिलित करेगा।
      5. Coot में डाला पानी के ओ परमाणुओं के लिए डी परमाणुओं को जोड़ने के लिए Phenix का उपयोग करें. परिशोधन मेनू खोलें और ReadySet पर क्लिक करें। न्यूट्रॉन शोधन विकल्प के बगल में विलायक अणुओं के लिए ड्यूटेरियम जोड़ने के लिए केवल विकल्प का चयन करें। अनुपस्थित होने पर मॉडल में हाइड्रोजन जोड़ें का चयन रद्द करें (अनुपूरक चित्र27B और अनुपूरक चित्र 27C).
        नोट: न्यूट्रॉन-केवल डेटा का उपयोग करके मॉडल बिल्डिंग एक संयुक्त एक्स-रे / न्यूट्रॉन संरचना के मॉडल निर्माण से अलग है क्योंकि रीढ़ की हड्डी और भारी परमाणुओं के निर्देशांक के शोधन में योगदान करने के लिए कोई एक्स-रे डेटा नहीं है। एक संयुक्त शोधन में, इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र का उपयोग शुरू में प्रोटीन बैकबोन और साइडचेन निर्देशांक को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस मॉडल का उपयोग बाद में एक संयुक्त एक्स-रे / न्यूट्रॉन डेटा शोधन में किया जाता है जिसमें एच / डी परमाणुओं का अभिविन्यास और अधिभोग न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र से लिया जाता है। न्यूट्रॉन-केवल शोधन में, पूरी संरचना न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों के विश्लेषण से प्राप्त होती है, जिसमें एच / डी परमाणुओं के अलावा पानी के अणुओं, रीढ़, साइड-चेन और लिगेंड के निर्माण की आवश्यकता होती है (चित्रा 6)। डेटा-टू-पैरामीटर अनुपात अकेले न्यूट्रॉन डेटा के खिलाफ शोधन में कम है और डेटा को ओवरफिट न करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए।

Representative Results

Neurospora crassa (NcLPMO9D) से एक लिटिक पॉलीसेकेराइड monooxygenase के क्रिस्टल पर न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा कमरे के तापमान पर HFIR पर IMAGINE पर और ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद क्रायो-शर्तों के तहत SNS में MaNDi पर एकत्र किए गए थे। 0.1 मिमी 3 से अधिक मात्रा के साथ H2O-आधारित बफर में उगाए गए हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन के क्रिस्टल का उपयोग किया गया था (बड़े क्रिस्टल के उदाहरण अनुपूरक चित्र 4 और उसके बाद के आंकड़ों में दिखाए गए हैं)। क्रिस्टल क्वार्ट्ज केशिकाओं में घुड़सवार थे और D2O-आधारित बफर के साथ वाष्प विनिमय डेटा संग्रह (चित्रा 4) से पहले तीन सप्ताह के लिए किया गया था।

कमरे का तापमान डेटा संग्रह इमेजिन बीमलाइन (चित्रा 1) पर किया गया था। एक चार घंटे के सफेद बीम परीक्षण ने उच्च रिज़ॉल्यूशन विवर्तन का नेतृत्व किया, यह सुझाव देते हुए कि क्रिस्टल एक पूर्ण डेटासेट एकत्र करने के लिए उपयुक्त आकार और गुणवत्ता का था। क्रिस्टल की विवर्तन गुणवत्ता पर प्रारंभिक जानकारी प्रदान करने के अलावा, प्रारंभिक व्यापक बैंडपास एक्सपोजर का उपयोग विवर्तन पैटर्न को अनुक्रमित करने और क्रिस्टल अभिविन्यास मैट्रिक्स को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। क्रिस्टल के P21 अंतरिक्ष समूह को देखते हुए, प्रति फ्रेम 20 घंटे के संग्रह समय के साथ 18 फ्रेम की एक डेटा संग्रह रणनीति लागू की गई थी। एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के साथ, उच्च समरूपता अंतरिक्ष समूहों को एक पूर्ण डेटासेट एकत्र करने के लिए कम फ्रेम (यानी कम कोणीय कवरेज) की आवश्यकता होती है। डेटा को 2.8 - 4.0 Å की तरंग दैर्ध्य सीमा का उपयोग करके अर्ध-लाउ मोड में एकत्र किया गया था। डेटा संग्रह के बाद, डेटा को अनुक्रमित, एकीकृत स्केल किया गया और 2.14 Å के रिज़ॉल्यूशन पर MTZ प्रारूप में न्यूट्रॉन SLD फ़ाइल देने के लिए विलय कर दिया गया। एक्स-रे डेटा विश्लेषण के लिए समान दिशानिर्देशों का पालन करते हुए डेटा को पर्याप्त गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया था, हालांकि 80% की पूर्णता और कम से कम 0.3 के CC1/2 को स्वीकार्य माना जाता था क्योंकि न्यूट्रॉन प्रोटीन विवर्तन एक फ्लक्स-सीमित तकनीक है।

कमरे के तापमान न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह के बाद, एक ही क्रिस्टल का उपयोग 1.90 Å रिज़ॉल्यूशन (पूरक चित्रा 13) पर कमरे के तापमान एक्स-रे विवर्तन डेटासेट को इकट्ठा करने के लिए किया गया था। एक्स-रे डेटा का उपयोग सी, एन, ओ और एस सहित "भारी" परमाणुओं की स्थिति निर्धारित करने के लिए किया गया था। अकेले एक्स-रे डेटा के खिलाफ परिष्कृत संरचना का उपयोग तब एक्स-रे और न्यूट्रॉन डेटा के खिलाफ संयुक्त शोधन करने के लिए शुरुआती मॉडल के रूप में किया गया था। Phenix ReadySet का उपयोग गैर-विनिमय योग्य साइटों पर एच परमाणुओं को जोड़ने के लिए किया गया था, विनिमय योग्य साइटों पर एच और डी परमाणुओं और शुरुआती एक्स-रे मॉडल के पानी के अणुओं के लिए डी परमाणुओं को जोड़ा गया था। इस मॉडल की तैयारी के बाद, दोनों डेटासेट (पूरक चित्रा 19 और पूरक चित्रा 20) के खिलाफ पुनरावर्ती शोधन किया गया था। इंटरैक्टिव मॉडल बिल्डिंग को कोट में साइड-चेन और पानी के अणुओं को तदनुसार उन्मुख करने के लिए घनत्व मानचित्रों का नेत्रहीन निरीक्षण करके किया गया था (पूरक चित्रा 22)। न्यूट्रॉन डेटा का उपयोग मुख्य रूप से प्रोटॉन राज्यों और पानी के अणु अभिविन्यास को निर्धारित करने के लिए किया गया था। सेरीन और ट्रिप्टोफैन जैसे अवशेषों के इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र की तुलना और संबंधित न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र उस जानकारी को दर्शाता है जिसे न्यूट्रॉन प्रोटीन विवर्तन से एच / डी विनिमय योग्य साइटों पर प्रोटॉन राज्यों पर प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 7)। पानी के अणुओं के लिए इलेक्ट्रॉन और न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का एक नक्शा ओवरले यह भी इंगित करता है कि जबकि हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन को एक्स-रे डेटा से अनुमान लगाया जा सकता है, न्यूट्रॉन इन हाइड्रोजन बांडों के अभिविन्यास के बारे में स्पष्ट जानकारी प्रदान करते हैं (चित्रा 8)। न्यूट्रॉन एसएलडी एफओ-एफसी ने मैप्स को छोड़ दिया था ताकि साइड-चेन के प्रोटोनेशन राज्यों और एच / डी अभिविन्यास को निर्धारित किया जा सके। इलस्ट्रेटेड टाइरोसिन और थ्रेओनिन अवशेषों के लिए प्राप्त न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र हैं, जिसमें न्यूट्रॉन एफओ-एफसी मानचित्र स्पष्ट रूप से एच / डी (चित्रा 9) की उपस्थिति को दर्शाते हुए सकारात्मक चोटियों को इंगित करते हैं। एकत्र किए गए न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा ने कई प्रोटोनेशन राज्यों के बारे में मूल्यवान जानकारी भी प्रदान की, जैसे कि लाइस के -एनडी 3 + समूह (चित्रा 10)। परिशोधन आँकड़े (Rwork और Rfree) बारीकी से मॉडल अनुकूलन के दौरान निगरानी की गई थी ताकि ओवर-फिटिंग को रोका जा सके। अंतिम आंकड़ों ने 12.77% का एक्स-रे Rwork और 18.21% का Rfree, और 14.48% का न्यूट्रॉन Rwork और 389 पानी के अणुओं के साथ 21.41% का Rfree दिया (अनुपूरक चित्र28)।

क्रायो-तापमान डेटा NcLPMO9D पर एकत्र किया गया था एक ascorbate सोखने के बाद MaNDi बीमलाइन पर CuII से CuI के लिए तांबा सक्रिय साइट को कम करने के लिए (पूरक चित्रा 2 और पूरक चित्रा 15)45. विवर्तन की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए 4 घंटे के जोखिम का उपयोग करके न्यूट्रॉन विवर्तन परीक्षण के बाद टीओएफ लाउ मोड का उपयोग करके डेटा एकत्र किया गया था। क्रिस्टल के अंतरिक्ष समूह को देखते हुए, प्रति फ्रेम 80 कूलम्ब्स की संग्रह खुराक के साथ 18 फ्रेम की एक डेटा संग्रह रणनीति तैयार की गई थी। डेटा को 2.0 - 4.0 Å की तरंग दैर्ध्य सीमा पर TOF-Laue मोड में एकत्र किया गया था। डेटा संग्रह के बाद, डेटा को अनुक्रमित, एकीकृत, स्केल किया गया और 2.40 Å51,52 के रिज़ॉल्यूशन पर MTZ प्रारूप में एक प्रतिबिंब फ़ाइल देने के लिए विलय कर दिया गया।

डेटा संग्रह के बाद, न्यूट्रॉन-केवल डेटा शोधन के लिए 2.40 Å क्रायो-तापमान NcLPMO9D न्यूट्रॉन विवर्तन डेटासेट का उपयोग किया गया था। न्यूट्रॉन डेटा को प्रारंभिक मॉडल के रूप में पीडीबी 5टीकेएच का उपयोग करके आणविक प्रतिस्थापन द्वारा चरणबद्ध किया गया था। Phenix ReadySet का उपयोग गैर-विनिमय योग्य साइटों पर एच परमाणुओं और विनिमय योग्य साइटों पर आंशिक अधिभोग के साथ एच / डी परमाणुओं को जोड़ने के लिए किया गया था। पानी के अणुओं को पीडीबी टूल्स (पूरक चित्रा 23) के साथ शुरुआती मॉडल से हटा दिया गया था। मॉडल की तैयारी न्यूट्रॉन प्रकीर्णन तालिका (अनुपूरक चित्रा 24) का उपयोग करके phenix.refine के साथ शोधन के बाद किया गया था। इंटरैक्टिव मॉडल बिल्डिंग कूट में किया गया था, जिसमें पानी के अणुओं को एफओ-एफसी मानचित्र की सकारात्मक चोटियों का उपयोग करके जोड़ा गया था और संभावित हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन (चित्रा 11 ए और चित्रा 11 बी) के अनुसार तैनात किया गया था। न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का विश्लेषण करते समय, पानी के अणु स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं यदि वे अत्यधिक क्रमबद्ध होते हैं, हालांकि उनका घनत्व गोलाकार या अंडाकार हो सकता है यदि वे अच्छी तरह से क्रमबद्ध नहीं हैं (चित्रा 11 सी-ई)। न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का उपयोग शतावरी जैसे अवशेषों के अभिविन्यास पर मूल्यवान जानकारी प्रदान करने के लिए किया गया था, जिसमें अकेले एक्स-रे विवर्तन डेटा का उपयोग करते समय कार्बोनिल और अमीनो समूहों के बीच अंतर करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है (चित्रा 12 ए और चित्रा 12 बी)। FO-FC न्यूट्रॉन SLD में चोटियों को छोड़ दिया मानचित्र भी N δ- या N ε-स्थिति (चित्रा 12C और चित्रा 12D) पर हिस्टिडीन अवशेषों के प्रोटॉन राज्यों को निर्धारित करने में बहुत जानकारीपूर्ण थे। कई एच / डी विनिमय योग्य साइटों के साथ अवशेषों की प्रोटॉन स्थिति को न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का उपयोग करके भी निर्धारित किया जा सकता है। यह स्पष्ट रूप से एक FO-FC न्यूट्रॉन SLD arginine के नक्शे को छोड़ देने के साथ सचित्र था, जो एक सकारात्मक चार्ज (चित्रा 12E और चित्रा 12F) के लिए जाना जाता है। पहले की तरह, Rwork और Rfree की निगरानी करके ओवर-फिटिंग को रोका गया था। अंतिम आंकड़ों ने 22.58% का Rwork और 30.84% का Rfree (अनुपूरक चित्रा 29) दिया। यह देखते हुए कि न्यूट्रॉन प्रोटीन विवर्तन एक फ्लक्स सीमित तकनीक है जिसमें नकारात्मक प्रकीर्णन लंबाई और एच के बड़े असंगत प्रकीर्णन कारक को ध्यान में रखा जाना चाहिए, यह उम्मीद की जा सकती है कि न्यूट्रॉन डेटा-केवल शोधन में कम दिखाई देने वाले पानी के अणुओं के साथ संयुक्त एक्स-रे / न्यूट्रॉन-डेटा शोधन की तुलना में गरीब आंकड़े होंगे (पूरक चित्र28 और पूरक चित्र29)।

न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का विश्लेषण करते समय, यह स्पष्ट हो जाएगा कि एच की नकारात्मक न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई के कारण घनत्व रद्दीकरण हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन के लिए होगा जो डी 2 ओ-युक्त क्रिस्टलीकरण बफर के साथ वाष्प विनिमय के अधीन थे। इस कारण से, न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र जिसमें गैर-विनिमय योग्य एच परमाणु कार्बन से जुड़े होते हैं, उनके इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र समकक्ष (चित्रा 13 ए) की तुलना में अपूर्ण दिखाई देते हैं। रद्दीकरण का प्रभाव अक्सर गरीब संकल्पों पर अधिक स्पष्ट होता है, जिससे उच्च गुणवत्ता के प्रोटीन क्रिस्टल प्राप्त करना अनिवार्य हो जाता है। इसलिए एक्स-रे और न्यूट्रॉन डेटा दोनों के साथ एक नमूने का संयुक्त शोधन करना बेहतर है जिसमें एक्स-रे डेटा का उपयोग प्रोटीन बैकबोन (चित्रा 13 बी) की स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, सिस्टीन और मेथिओनिन में सल्फर परमाणु खराब रूप से दिखाई दे सकते हैं, सटीक परमाणु प्लेसमेंट के लिए एक्स-रे डेटा की आवश्यकता होती है (चित्रा 13 सी और चित्रा 13 डी)। कमजोर न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई वाली धातुएं न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों में मॉडल के लिए भी चुनौतीपूर्ण हो सकती हैं, जैसा कि हमारे एलपीएमओ 9 डी मानचित्रों में स्पष्ट है। एक ही क्रिस्टल पर एक कम खुराक (विकिरण क्षति से मुक्त) एक्स-रे डेटासेट का संग्रह इसलिए उपयोगी है, क्योंकि यह इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (चित्रा 13 ई और चित्रा 13 एफ) का उपयोग करके धातु परमाणु स्थिति की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1: न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी वर्कफ़्लो का फ्लो चार्ट. प्रोटीन उत्पादन। न्यूट्रॉन संरचना प्राप्त करने के लिए, प्रोटीन को पहले व्यक्त किया जाता है। H2O- या D2O-आधारित मीडिया में बैक्टीरियल अभिव्यक्ति का उपयोग आमतौर पर क्रमशः हाइड्रोजनीकृत या perdeuterated पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च उपज का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। प्रोटीन को H2O-आधारित बफर में शुद्ध किया जाता है और फिर क्रिस्टलीकृत किया जाता है या तो H2O- या D2O-आधारित क्रिस्टलीकरण बफर में क्रिस्टलीकृत किया जाता है ताकि क्रिस्टल को 0.1 मिमी 3 के न्यूनतम आकार तक बढ़ाया जा सके। नमूना तैयारी: न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह से पहले, एच 2 ओ-उगाए गए क्रिस्टल डी के साथ प्रोटीन टिट्राटेबल एच परमाणुओं का आदान-प्रदान करने के लिए एच / डी एक्सचेंज से गुजरते हैं एच / डी एक्सचेंज को ड्यूटेरेटेड क्रिस्टलीकरण बफर में क्रिस्टल के प्रत्यक्ष भिगोने, डी 2 ओ-आधारित जलाशय के साथ क्रिस्टलीकरण ड्रॉप का संतुलन, या डियूटेरेटेड क्रिस्टलीकरण बफर के साथ वाष्प विनिमय के लिए क्वार्ट्ज केशिकाओं में क्रिस्टल को माउंट करके किया जा सकता है। न्यूट्रॉन डेटा संग्रह: एच / डी विनिमय के बाद, विवर्तन गुणवत्ता को निर्धारित करने के लिए संभावित क्रिस्टल की जांच की जाती है। 2.5 Å के न्यूनतम रिज़ॉल्यूशन वाले क्रिस्टल को एकत्र किए जाने वाले पूर्ण डेटासेट के लिए उपयुक्त माना जाता है। क्रिस्टल को कमरे के तापमान पर डेटा संग्रह के लिए क्वार्ट्ज केशिकाओं में रखा जाता है या क्रायोजेनिक तापमान पर डेटा संग्रह के लिए क्रायो-लूप में जमे हुए फ्लैश होते हैं। एक एक्स-रे डेटासेट एक ही तापमान पर एक ही (या एक समान) क्रिस्टल पर एकत्र किया जाता है। मॉडल बिल्डिंग: परिशोधन न्यूट्रॉन और एक्स-रे डेटा दोनों के खिलाफ या केवल न्यूट्रॉन डेटा के खिलाफ phenix.refine का उपयोग करके किया जाता है। प्रोटीन संरचना के मैनुअल मॉडल का निर्माण न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का उपयोग करके कूट में किया जाता है। पूर्ण संरचना: प्रोटीन संरचना के पूरा होने के बाद, समन्वय मॉडल को मान्य किया जाता है और प्रोटीन डेटा बैंक में जमा किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रोटीन क्रिस्टल की कटाई। (ए) क्रिस्टल को माइक्रोस्कोप के तहत संभाला जाता है। (बी) सिलिकॉनाइज्ड ग्लास प्लेट वाले सील बंद सैंडविच बॉक्स को खोला जाता है। जलाशय बफर सिलिकॉनीकृत कांच स्लाइड पर pipetted है. (c) एक क्रिस्टल को एक माइक्रोलूप के साथ काटा जाता है। (डी) क्रिस्टल को किसी भी मलबे को धोने के लिए मदर लिकर की एक बूंद में रखा जाता है जो अक्सर क्रिस्टल के साथ काटा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: क्वार्ट्ज केशिका के लिए क्रिस्टल का स्थानांतरण। (ए) क्वार्ट्ज केशिका का अंत जलाशय बफर से भरा होता है। (बी) क्रिस्टल को क्वार्ट्ज केशिका में स्थानांतरित किया जाता है और (सी) जलाशय बफर में विसर्जित किया जाता है। (d) क्रिस्टल को जलाशय बफर का उपयोग करके केशिका के नीचे ले जाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: क्वार्ट्ज केशिका की सीलिंग. (ए) एक "प्लग" बनाने के लिए केशिका के अंत में ड्यूटेरेटेड बफर जोड़ा जाता है। (बी) मोम को "छड़ी" के साथ पिघलाया जाता है। (C) केशिका को सील करने के लिए पिघले हुए मोम में रखा जाता है। (डी) केशिका को सील करने के लिए दोनों सिरों पर मोम प्लग बनाए जाते हैं। (ई) बढ़ते के बाद क्रिस्टल। (च) सील बंद केशिका को पेट्री डिश में रखा जाता है और पुट्टी के साथ जगह में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: न्यूट्रॉन विवर्तन पैटर्न के सिग्नल-टू-शोर में वृद्धि। जैसे-जैसे डेटा संग्रह आगे बढ़ता है, विवर्तित धब्बे अधिक तीव्र हो जाते हैं। (नोट: यहां प्रस्तुत लाइव विवर्तन छवियां चित्रण के लिए हैं और विभिन्न क्रिस्टल से ली गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: Coot में न्यूट्रॉन डेटा का उपयोग करके इंटरैक्टिव मॉडल बिल्डिंग। (ए) एक सकारात्मक एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी घनत्व शिखर (हरे) को दर्शाता है कि सेरीन को ची कोणों को संपादित करके पुन: उन्मुख किया जाना चाहिए। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित होता है और 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र नीले रंग में प्रदर्शित होता है। (बी) सही ढंग से तैनात सेरीन। (सी) सकारात्मक और नकारात्मक एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी घनत्व चोटियों (क्रमशः हरे और लाल) से संकेत मिलता है कि ट्रिप्टोफैन को अंतर घनत्व शिखर से मेल खाने के लिए घुमाया / अनुवाद किया जाना चाहिए। (d) सही ढंग से उन्मुख tryptophan. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों से अतिरिक्त जानकारी। (ए) 2एफओ-एफसी इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (नीला) सेरीन में "भारी" परमाणुओं की स्थिति को प्रदर्शित करता है। (बी) 2एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र (बैंगनी) स्पष्ट रूप से सेरीन में "लाइटर" डी परमाणु की स्थिति को प्रदर्शित करता है। (C) 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (नीला) ट्रिप्टोफैन में "भारी" परमाणुओं की स्थिति को प्रदर्शित करता है। (डी) 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र (बैंगनी) स्पष्ट रूप से ट्रिप्टोफैन में "लाइटर" डी परमाणु की स्थिति को प्रदर्शित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: पानी के अणु की स्थिति। (ए) पानी के लिए एक 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (नीला) विशेषता का गोलाकार आकार। (बी) 2एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र (बैंगनी) जल अभिविन्यास और हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन के बारे में जानकारी प्रदान करता है। (C) पानी के इलेक्ट्रॉन और न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का मानचित्र ओवरले। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित होता है और 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र नीले रंग में प्रदर्शित होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: न्यूट्रॉन SLD FO-FComit मानचित्र(A)  FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र (हरा) टायरोसिन अवशेषों के H/D अभिविन्यास के बारे में स्पष्ट जानकारी प्रदान करता है। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित होता है और 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र नीले रंग में प्रदर्शित होता है। (बी) सही एच / डी अभिविन्यास के साथ टायरोसिन अवशेष। (सी) एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र (हरा) थ्रेओनिन अवशेषों के एच / डी अभिविन्यास के बारे में स्पष्ट जानकारी प्रदान करता है। (डी) सही एच / डी अभिविन्यास के साथ थ्रेओनिन अवशेष। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों के साथ प्रदर्शित एकाधिक प्रोटोनेशन राज्य। (A) 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (नीला) केवल लाइसिन ε-अमोनियम समूह के N परमाणु की स्थिति प्रदान करता है। (B-E) FO-FC न्यूट्रॉन SLD छोड़ मानचित्र (हरा) स्पष्ट रूप से सकारात्मक रूप से आवेशित -NH3 समूह को दर्शाता है। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित होता है और 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र नीले रंग में प्रदर्शित होता है। (च) इलेक्ट्रॉन घनत्व और न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों का ओवरले। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्रा 11: न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों में पानी के अणुओं की उपस्थिति। (ए) पानी के अणुओं को एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों (हरे) और संभावित हाइड्रोजन बांडों के अनुसार तैनात किया जाता है। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित किया जाता है। (बी) सही ढंग से स्थित पानी के अणु। (C-E) बी-कारकों और हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन के आधार पर पानी के अणुओं के लिए न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों के विभिन्न आकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्रा 12: न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों द्वारा प्रदान किए गए अमीनो एसिड अभिविन्यास और प्रोटोनेशन के बारे में जानकारी। (ए) न्यूट्रॉन एसएलडी एफओ-एफसी मानचित्र चोटियों (हरे) एक शतावरी अवशेषों के गलत अभिविन्यास को इंगित करता है। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित होता है और 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र नीले रंग में प्रदर्शित होता है। (बी) सही शतावरी अभिविन्यास का 2एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र (बैंगनी)। (c) न्यूट्रॉन SLD FO-FC मानचित्र शिखर (हरा) N ε पर हिस्टिडीन के एकल प्रोटॉन को इंगित करता है। (डी) हिस्टिडीन एन ε -प्रोटोनेशन का 2एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र (बैंगनी)। (ई) न्यूट्रॉन एसएलडी एफओ-एफसी मानचित्र चोटियों (हरे) को छोड़ दें, आर्जिनिन के सकारात्मक चार्ज की पुष्टि करते हैं। (एफ) सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए आर्जिनिन का 2एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र (बैंगनी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्रा 13: असंतत न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र। (ए) एक हाइड्रोजनीकृत, वाष्प एच / डी का 2एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र (बैंगनी) का आदान-प्रदान प्रोटीन। ग्लूटामिक एसिड गैर-विनिमय योग्य एच परमाणुओं की नकारात्मक प्रकीर्णन लंबाई के कारण न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र रद्दीकरण प्रदर्शित करता है। (बी) एक ओवरले 2एफओ-एफसी इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (नीला) स्पष्ट रूप से ग्लूटामिक एसिड के घनत्व को प्रदर्शित करता है। (सी) मेथिओनिन में सल्फर परमाणु 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्रों (बैंगनी) में खराब रूप से दिखाई देता है। (डी) एक ओवरले इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र स्पष्ट रूप से मेथिओनिन के घनत्व को प्रदर्शित करता है। (ई) धातु परमाणु, यहां तांबा, न्यूट्रॉन 2एफओ-एफसी एसएलडी मानचित्रों (बैंगनी) में खराब रूप से दिखाई देते हैं। (एफ) एक ओवरले 2एफओ-एफसी इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (नीला) स्पष्ट रूप से समन्वित तांबे के परमाणु के घनत्व को प्रदर्शित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समस्थानिक सुसंगत प्रकीर्णन लंबाई (fm) असंगत प्रकीर्णन लंबाई (fm)
1H -3.741 25.274
2H 6.671 4.04
12C 6.6511 0
14N 9.37 2
16O 5.803 0
23Na 3.63 3.59
24Mg 5.66 0
31P 5.13 0.2
32S 2.804 0
35Cl 11.65 6.1
39K 3.74 1.4
40Ca 4.8 0
55Mn -3.73 1.79
56Fe 9.94 0
63Cu 6.43 0.22
64Zn 5.22 0

तालिका 1: न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई और असंगत प्रकीर्णन मान। Sears, 199216 से अनुकूलित।

अनुपूरक चित्रा 1: उच्च फ्लक्स आइसोटोप रिएक्टर में कल्पना उपकरण। (ए) ठंडे न्यूट्रॉन गाइड हॉल में कल्पना उपकरण। (बी) एक क्वार्ट्ज केशिका में घुड़सवार में नमूना गोनियोमीटर के लिए पुट्टी के साथ जुड़ा हुआ है। नमूना और डिटेक्टर तालिका न्यूट्रॉन बीम में क्रिस्टल और बेलनाकार छवि प्लेट की स्थिति के लिए बंद हो जाती है। क्रिस्टलोग्राफी के अंतर्राष्ट्रीय संघ की अनुमति के साथ संशोधित 53. Genevieve मार्टिन, ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला की अनुमति के साथ प्रदान की छवियों. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत पर MaNDi उपकरण। (ए) MaNDi गुस्सा कैमरा डिटेक्टर सरणी. क्रिस्टलोग्राफी के अंतर्राष्ट्रीय संघ की अनुमति के साथ reproduced11. (बी) MaNDi गतिशील नमूना चरण। (सी) कमरे के तापमान डेटा संग्रह के लिए एमएएनडीआई में गोनियोमीटर पर घुड़सवार क्वार्ट्ज केशिका में घुड़सवार नमूना। Genevieve मार्टिन, ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला की अनुमति के साथ प्रदान की छवियों. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: लिटिक पॉलीसेकेराइड monooxygenase NcLPMO9D की संरचना। NcLPMO9D तांबा-सक्रिय साइट एक फ्लैट पॉलीसेकेराइड बाध्यकारी सतह पर स्थित है। तांबे को एक शास्त्रीय "हिस्टिडीन ब्रेस" के साथ-साथ एक अक्षीय टायरोसिन अवशेषों में दो हिस्टिडीन अवशेषों द्वारा समन्वित किया जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: बैठने ड्रॉप क्रिस्टलीकरण ट्रे में पर्याप्त मात्रा के साथ क्रिस्टल। (ए) बड़े क्रिस्टल 9-अच्छी तरह से सिलिकॉनाइज्ड ग्लास प्लेटों में स्थापित बैठने वाली बूंदों में उगाए जाते हैं। (बी और सी) क्रिस्टल को 0.1 मिमी 3 > मात्रा वाले लोगों की पहचान करने के लिए मापा जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: deuterated बफर रीडिंग के लिए स्थापित पीएच मीटर. पीएच इलेक्ट्रोड को उपयोग करने से पहले D2O में भिगोया जाता है। NaOD और DCl का उपयोग deuterated buffers के pH को समायोजित करने के लिए किया जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 6: MaNDi नमूना बढ़ते दिशानिर्देश. क्वार्ट्ज केशिका के अधिकतम आयाम और कमरे के तापमान डेटा संग्रह के लिए नमूना स्थिति।
से reproduced: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र7: अतिरिक्त बफर को हटाना। (ए) अतिरिक्त बफर माइक्रोकेशिका युक्तियों के साथ क्वार्ट्ज केशिका से एस्पिरेटेड होता है। (बी) शेष बफर को केशिका को पूरी तरह से सूखने के लिए एक पतली कागज की बाती के साथ हटा दिया जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 8: डेटा अधिग्रहण GUI. डेटा संग्रह के लिए "प्रयोग पैरामीटर" की इनपुट विंडो. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 9: ऑप्टिक्स जीयूआई। डेटा संग्रह और न्यूट्रॉन गणना दर की निगरानी के लिए अर्ध-लाउ रेंज का चयन। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 10: डेटा अधिग्रहण GUI में डेटा संग्रह. एक्सपोज़र समय, फ़्रेम की संख्या और डेटा संग्रह के लिए कोण "एकत्रित करें" टैब में निर्दिष्ट किए जाते हैं. डेटा संग्रह तब "स्कैन प्रारंभ करें" का उपयोग करके शुरू किया जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 11: विवर्तित न्यूट्रॉन का पता लगाया और प्रदर्शित किया गया। एक्सपोज़र समय के अंत में, न्यूट्रॉन संवेदनशील छवि प्लेट डिटेक्टर को पढ़ा जाता है और विवर्तन पैटर्न डेटा अधिग्रहण जीयूआई में प्रदर्शित होता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र12: न्यूट्रॉन विवर्तन के बाद डेटा प्रसंस्करण। फ्रेम अनुक्रमित, एकीकृत, तरंग दैर्ध्य सामान्यीकृत और Lauegen, Lscale और Scala का उपयोग कर स्केल डेटा संग्रह के बाद एक मर्ज प्रतिबिंब फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए स्केल कर रहे हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 13: एक्स-रे डेटा संग्रह। घर स्रोत एक्स-रे जनरेटर कमरे के तापमान डेटा संग्रह के लिए क्वार्ट्ज केशिका घुड़सवार क्रिस्टल के साथ स्थापित किया गया। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 14: MaNDi क्रायो-डेटा संग्रह के लिए बढ़ते दिशानिर्देश। CrystalCaps के आयाम और MaNDi में क्रायो-डेटा संग्रह के लिए पिन ऊंचाई.
से reproduced: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 15: क्रायो न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा संग्रह के लिए फ्लैश फ्रीजिंग। (ए) क्रिस्टल भिगोने के लिए सेटअप, एक माइक्रोलूप के साथ कटाई और एक क्रायो संगत कंटेनर जैसे फोम देवर का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन में ठंड। घुड़सवार क्रिस्टल को प्रीकूल्ड क्रायो पिन टोंग्स का उपयोग करके सीधे बीमलाइन क्रायो गोनियोमीटर पर स्थानांतरित किया जाता है। (बी) क्रिस्टल हटाने के लिए मोम सील को पिघलाया जाता है। (सी) क्रिस्टल को कटाई के लिए क्वार्ट्ज केशिका के अंत में फ्लश किया जाता है। (डी) क्रिस्टल को क्रमिक रूप से एस्कॉर्बेट सोख बफर में भिगोया जाता है और फिर क्रायोप्रोटेक्टेंट के बाद तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीजिंग होता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 16: नमूना संरेखण इंटरफ़ेस. न्यूट्रॉन बीम में क्रिस्टल संरेखण, नीले क्रॉस द्वारा दर्शाया गया है, बिंदु और क्लिक केंद्र द्वारा किया जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 17: डेटा संग्रह के लिए सीएसएस जीयूआई। डेटा संग्रह रणनीति, जिसमें एक्सपोज़र खुराक और कोण शामिल हैं, सीएसएस जीयूआई में अपलोड किए जाते हैं। जैसा कि डेटा संग्रह आगे बढ़ता है, वास्तविक समय डिटेक्टर पर पाए गए विवर्तन न्यूट्रॉन को ऊपरी पैनल में प्रदर्शित किया जाएगा। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 18: CCP4 में R-मुक्त झंडे मिलान. न्यूट्रॉन डेटा के आर-मुक्त झंडे संयुक्त शोधन के लिए एक ही या एक समान क्रिस्टल पर एकत्र किए गए एक्स-रे डेटा के आर-मुक्त झंडे के साथ मेल खाते हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 19: संरचना तैयारी और शोधन। (ए) Phenix ReadySet उपकरण का उपयोग विनिमय योग्य साइटों पर दोहरी एच / डी अधिभोग जोड़ने के लिए किया जाता है। (बी) न्यूट्रॉन डेटा और एक्स-रे डेटा दोनों का उपयोग संयुक्त शोधन के लिए किया जाता है, जबकि प्रारंभिक इनपुट मॉडल को एक ही क्रिस्टल या एक समान क्रिस्टल पर एकत्र एक्स-रे डेटासेट के खिलाफ परिष्कृत किया गया था। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 20: परिशोधन सेटिंग्स का कॉन्फ़िगरेशन। परिशोधन मॉडल के साथ-साथ परमाणु दूरी को संयुक्त एक्स-रे / न्यूट्रॉन डेटा शोधन के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 21: कूट मॉडल बिल्डिंग के लिए डेटा चयन। एक्स-रे और अपूर्ण न्यूट्रॉन डेटा युक्त फिनिक्स एमटीजेड फ़ाइल आउटपुट को इंटरैक्टिव मॉडल बिल्डिंग के लिए इलेक्ट्रॉन और न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र उत्पन्न करने के लिए कूट में खोला जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 22: एक संयुक्त शोधन के दौरान कूट में इंटरैक्टिव मॉडल बिल्डिंग। (ए) एक सकारात्मक और नकारात्मक एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी घनत्व शिखर (क्रमशः हरा और लाल) यह दर्शाता है कि पानी को रोटेशन / अनुवाद द्वारा पुन: उन्मुख किया जाना चाहिए। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित होता है और 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र नीले रंग में प्रदर्शित होता है। (b) सही ढंग से स्थित पानी। (सी) एक सकारात्मक एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र शिखर (हरे) से संकेत मिलता है कि थ्रियोनिन को ची कोणों को संपादित करके अंतर घनत्व शिखर से मेल खाने के लिए घुमाया जाना चाहिए। (d) सही ढंग से उन्मुख threonine. इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 23: न्यूट्रॉन-केवल डेटा शोधन के लिए संरचना की तैयारी। प्रारंभिक निर्देशांक फ़ाइल PDBTools में पानी के परमाणु हटाने और विनिमय योग्य साइटों पर दोहरी एच / डी अधिभोग के अलावा परिष्करण के लिए तैयार की जाती है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 24: न्यूट्रॉन डेटा-केवल शोधन। (ए) न्यूट्रॉन डेटा अपलोड किया जाता है और साथ ही तैयार शुरुआती मॉडल भी। (B) न्यूट्रॉन डेटा परिशोधन के लिए सेटिंग्स न्यूट्रॉन प्रकीर्णन तालिका का उपयोग करती हैं। कृपया इस चित्र को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 25: कूट मॉडल बिल्डिंग के लिए डेटा चयन। अपूर्ण न्यूट्रॉन डेटा को इंटरैक्टिव मॉडल निर्माण के लिए कूट में खोला जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 26: deuterated अवशेषों के लिए Coot में वास्तविक अंतरिक्ष शोधन. (ए) सकारात्मक और नकारात्मक एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी घनत्व चोटियों (क्रमशः हरे और लाल) से संकेत मिलता है कि एफओ-एफसी घनत्व शिखर को फिट करने के लिए एक आर्जिनिन अवशेषों को स्थानांतरित किया जाना चाहिए। 2FO-FC न्यूट्रॉन SLD मानचित्र बैंगनी रंग में प्रदर्शित होता है और 2FO-FC इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र नीले रंग में प्रदर्शित होता है। (बी) वास्तविक अंतरिक्ष का उपयोग करना लापता कूट ज्यामिति संयम पुस्तकालयों के कारण "विस्फोट" डी परमाणुओं में परिणामों को परिष्कृत करना। (c) D परमाणु शेष अवशेष परमाणुओं के साथ नहीं चलते हैं। (डी) डी परमाणु पदों को मैन्युअल रूप से एक पाठ संपादक का उपयोग करके तय किया जा सकता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 27: पानी के अणुओं का जोड़। (ए) पानी के अणुओं को मैन्युअल रूप से सकारात्मक एफओ-एफसी न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्र घनत्व चोटियों (हरे रंग) में जोड़ा जा सकता है। सम्मिलित पानी के अणुओं को शुरू में कूट में एक ओ परमाणु द्वारा दर्शाया जाएगा। (बी) Phenix ReadySet पानी के अणुओं के लिए O परमाणुओं के लिए डी परमाणुओं को जोड़ने के लिए प्रयोग किया जाता है। (C) deuterated पानी के अणु सफलतापूर्वक जोड़ा जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 28: परिशोधन आँकड़े. संयुक्त एक्स-रे / न्यूट्रॉन शोधन के बाद अंतिम डेटा शोधन आंकड़े। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 29: परिशोधन आँकड़े. न्यूट्रॉन डेटा-केवल परिशोधन के बाद अंतिम डेटा शोधन आँकड़े। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी प्रोटीन में प्रोटॉन राज्यों और पानी के अणु अभिविन्यास की जांच करने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है। यह जानकारी प्रोटीन उत्प्रेरक तंत्र पर प्रकाश डालती है क्योंकि प्रोटॉनेशन और हाइड्रोजन बॉन्डिंग इंटरैक्शन में परिवर्तन अक्सर एंजाइम रसायन विज्ञान 10 के लिए केंद्रीय होते हैं। न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी, हालांकि एक जानकारीपूर्ण तकनीक है, में कई कारक हैं जिन्हें न्यूट्रॉन विवर्तन प्रयोग करने की योजना बनाने से पहले ध्यान में रखा जाना चाहिए, अर्थात्:

  1. डेटा संग्रह के लिए बड़े प्रोटीन क्रिस्टल की आवश्यकता।
  2. हाइड्रोजन और अन्य तत्वों के प्रकीर्णन गुण, जैसे धातु आयन।
  3. deuterated नमूनों के साथ काम करते समय संरचना शोधन और मॉडल निर्माण सॉफ्टवेयर में सीमाएं।

न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी एक फ्लक्स सीमित तकनीक है। एक्स-रे विवर्तन डेटासेट के विपरीत, उच्च आर-कारक और कम पूर्णता, अतिरेक और सिग्नल-टू-शोर अनुपात न्यूट्रॉन डेटासेट के लिए तकनीक अंतर्निहित सीमाओं (फ्लक्स सीमित, अर्ध-लाउ, लंबे तरंग दैर्ध्य) के कारण अपेक्षित हैं। एक एकल फ्रेम का डेटा संग्रह आमतौर पर 12 - 18 घंटे होता है। एक प्रयोग की सफलता 0.1 mm3 के क्रिस्टल के साथ नमूना आकार और गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर करती है, जो अक्सर न्यूनतम आवश्यकता होती है3। न्यूट्रॉन विवर्तन को 10 से 800 μL तक की क्रिस्टलीकरण बूंदों को स्थापित करने के लिए बड़ी मात्रा में प्रोटीन के उत्पादन की आवश्यकता होती है। पर्याप्त रूप से बड़े क्रिस्टल बढ़ने के लिए न्यूनतम मात्रा का अनुमान क्रिस्टल और नमूना मापदंडों (https://neutrons.ornl.gov/imagine) को देखते हुए वॉल्यूम कैलकुलेटर का उपयोग करके लगाया जा सकता है। बड़े क्रिस्टल की वृद्धि सबसे प्रचलित रूप से वाष्प प्रसार 3 द्वारा पूरा किया गया है। हैंगिंग ड्रॉप क्रिस्टलीकरण 10-25 μL से लेकर बड़ी बूंदों में क्रिस्टल के विकास की अनुमति देता है, जबकि ~ 50 μL तक की बड़ी बूंदों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बैठे ड्रॉप उपकरणों 14,54 का उपयोग करके स्थापित किया जा सकता है। सिलिकॉनाइज्ड नौ-अच्छी तरह से ग्लास प्लेटों का उपयोग बहुत बड़ी बूंदों को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें 800 μL तक की मात्रा होती है। इन ग्लास प्लेटों को हैम्पटन रिसर्च से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध "सैंडविच बॉक्स" में रखा गया है। आगे क्रिस्टलीकरण तकनीकों में बैच क्रिस्टलीकरण शामिल है, जिसमें ड्रॉप आकार की सीमा पोत द्वारा निर्धारित की जाती है। बैच क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्थापित माइक्रोलीटर से मिलीलीटर 55 तक हो सकता है। क्रिस्टलीकरण को डायलिसिस तकनीक का उपयोग करके भी किया जा सकता है जिसमें प्रोटीन को डायलिसिस झिल्ली के माध्यम से या एक पूर्ववर्ती एकाग्रता ढाल के साथ काउंटर-प्रसार द्वारा या एक झरझरा प्लग के माध्यम से जैसे कि एगारोज़ 56,57 के माध्यम से संतुलित किया जाता है। सीडिंग वांछित मात्रा के क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए एक और विकल्प प्रदान करता है। माइक्रो- और मैक्रोसीडिंग को बड़े क्रिस्टल विकास के लिए सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है, जिसमें NcLPMO9D45 के बड़े क्रिस्टल शामिल हैं। प्रोटीन चरण आरेख का कुछ ज्ञान, घुलनशीलता पर तापमान के प्रभाव सहित, बड़े क्रिस्टल विकास में सहायता करता है।

न्यूट्रॉन विवर्तन प्रयोग की योजना बनाते समय, विवर्तन डेटा संग्रह के दौरान सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए प्रोटीन की तैयारी का अनुकूलन आवश्यक है। एच परमाणुओं के कारण घनत्व रद्दीकरण और उच्च असंगत प्रकीर्णन को दरकिनार करने के लिए, न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों को अपने आइसोटोप डी के लिए एच परमाणुओं का आदान-प्रदान करके सुधारा जा सकता है, जिसमें एक सकारात्मक सुसंगत प्रकीर्णन लंबाई और कम असंगत प्रकीर्णन लंबाई होती है। इसे पूरा करने के लिए, deuterated क्रिस्टलीकरण बफर के खिलाफ hydrogenated प्रोटीन क्रिस्टल का वाष्प विनिमय किया जाता है। यह विलायक अणुओं और labile, titratable प्रोटीन एच परमाणुओं के एच / डी विनिमय सुनिश्चित करता है23. वाष्प विनिमय D2O-आधारित, deuterated क्रिस्टलीकरण बफर "प्लग" के साथ एक क्वार्ट्ज केशिका में hydrogenated क्रिस्टल बढ़ते द्वारा किया जाता है और यह एक प्रभावी, कोमल तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है जो अक्सर 14,23,35 लागू होता है। एक्सचेंज में कई सप्ताह लग सकते हैं और अधिमानतः अधिकतम एच / डी एक्सचेंज सुनिश्चित करने के लिए अक्सर परिवर्तित करने के लिए ड्यूटेरेटेड बफर की आवश्यकता होती है। एच / डी विनिमय भी सीधे deuterated बफर में क्रिस्टल भिगोने के द्वारा किया जा सकता है। D2O एक्सपोजर के कारण क्रिस्टल को तनाव में रखने से बचने के लिए, भिगोने की प्रक्रिया को धीरे-धीरे D2O: H2O अनुपात 58 को वृद्धिशील रूप से बढ़ाकर किया जाना चाहिए। इसके अलावा, हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन का क्रिस्टलीकरण भी लैबिल एच साइट22,59 पर एच / डी एक्सचेंज के लिए ड्यूटेरेटेड बफर में किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि D2O-आधारित बफर का प्रोटीन घुलनशीलता पर प्रभाव पड़ता है, जिसके लिए ज्ञात H2O-आधारित स्थितियों के आगे समायोजन की आवश्यकता होती है3,59। D2O-आधारित बफ़र्स को कुछ मामलों में छोटे क्रिस्टल का नेतृत्व करने के लिए भी देखा गया है59। डी के लिए titratable और कार्बन-बाउंड एच परमाणुओं का पूर्ण आदान-प्रदान एक perdeuterated sample20 उत्पन्न करने के लिए deuterated मीडिया में प्रोटीन व्यक्त करके प्राप्त किया जा सकता है। perdeuterated नमूने के परिणामी न्यूट्रॉन SLD नक्शे काफी सुधार किया जाएगा, अब hydrogenated नमूना समकक्ष के घनत्व रद्दीकरण प्रदर्शित नहीं. यह फायदेमंद है जब एक प्रोटीन या cofactor में गैर-विनिमय योग्य साइटों पर बाध्य एच / डी की विशेषता है। हालांकि, perdeuterated प्रोटीन की अभिव्यक्ति दोनों लागत में उच्च और उपज में कम है60. ओक रिज नेशनल लेबोरेटरी (ORNL) संरचनात्मक आणविक जीव विज्ञान के लिए केंद्र (CSMB) उपयोगकर्ताओं के लिए एक deuteration सुविधा प्रदान करता है जो एक perdeuterated नमूना (https://www.ornl.gov/facility/csmb) उत्पन्न करने की मांग कर रहे हैं। Perdeuterated अभिव्यक्ति आमतौर पर एक bioreactor में 1 एल पैमाने पर ~ 50 मिलीग्राम शुद्ध प्रोटीन 61 उपज पर प्रदर्शन किया जाता है।

न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा के संग्रह के बाद, शोधन और इंटरैक्टिव मॉडल निर्माण किया जाता है। परिशोधन phenix.refine, nCNS या SHELXL28, 31,32,33 सहित कई सॉफ़्टवेयर सुइट्स का उपयोग करके चलाया जा सकता है। Phenix सुइट Coot के साथ संयोजन के रूप में न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा के शोधन के लिए सबसे अधिक उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर है जिसका उपयोग मैन्युअल रूप से न्यूट्रॉन SLD maps34 से मॉडल बनाने के लिए किया जाता है। यद्यपि Phenix और Coot दोनों न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा के प्रसंस्करण के लिए अनुमति देते हैं, वे न्यूट्रॉन डेटा और deuterated नमूनों के साथ जुड़े idiosyncrasies को संसाधित करने के लिए आवश्यक कुछ विशेषताओं की कमी हो सकती है। उदाहरण के लिए, कूट में deuterated अवशेषों के लिए ज्यामिति अनुकूलन नहीं होता है, जो मॉडल निर्माण के दौरान जटिलताओं को जन्म दे सकता है क्योंकि "रियल स्पेस रिफाइन" सुविधा के परिणामस्वरूप "विस्फोट" अवशेष (पूरक चित्रा 26) 62 होता है। यह सभी deuterated अवशेषों के लिए संयम फ़ाइलें उत्पन्न करके हल किया जा सकता है। हालांकि, यह एक गहन प्रक्रिया है और इस तरह के पुस्तकालय वर्तमान में सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। Phenix में शोधन करते समय, विनिमय योग्य एच / डी साइटों को शुरू में एच और डी के लिए 0.50 अधिभोग पर सेट किया जाएगा। जैसा कि शोधन किया जाता है, एच और डी के अधिभोग को न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों के अनुसार परिष्कृत किया जाएगा। इंटरैक्टिव मॉडल निर्माण के दौरान, अंतर घनत्व Fo-Fc मानचित्र एच / डी अधिभोग का आकलन करने में बहुत जानकारीपूर्ण हैं। मानचित्रों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कौन सी साइटों में उच्च डी अधिभोग है, जो सक्रिय साइट पर विशेष रूप से जानकारीपूर्ण है जहां प्रोटोनेशन राज्य उत्प्रेरक रूप से प्रासंगिक हैं। अस्पष्ट स्थितियां उत्पन्न होती हैं, हालांकि, जब एच: डी अधिभोग 0.70: 0.30 के करीब है जिसके परिणामस्वरूप न्यूट्रॉन एसएलडी मैप्स 64 में पूर्ण सिग्नल रद्द हो जाता है। यह भी ध्यान में रखा जाना चाहिए कि अर्ध-लाउ न्यूट्रॉन डेटा सेट में अक्सर 80% के आसपास पूर्णता होती है, जो एक्स-रे विवर्तन डेटा के लिए नियमित रूप से देखे गए ≥ 98% से कम है। Phenix में न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा को परिष्कृत करते समय, लापता देखे गए आयामों (Fo) की गणना इसलिए प्रतिबिंब सूची को पूरा करने के लिए मॉडल से की जाती है, इस प्रकार मॉडल पूर्वाग्रह पेश किया जाता है। इस संभावित पूर्वाग्रह के लिए खाते के लिए "no_fill" मानचित्रों को इंटरैक्टिव मॉडल बिल्डिंग के दौरान "भरे हुए" मानचित्रों के विपरीत जांच की जानी चाहिए।

उपयोगकर्ता अपनी संरचना के संयुक्त एक्स-रे / न्यूट्रॉन डेटा शोधन, या न्यूट्रॉन-डेटा केवल शोधन करने का विकल्प चुन सकते हैं। न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों की कल्पना करना, विशेष रूप से कम रिज़ॉल्यूशन पर, शुरू में विशेष रूप से हाइड्रोजनीकृत प्रोटीन के लिए निराशाजनक हो सकता है जिसमें एच अभी भी एच / डी वाष्प विनिमय के बावजूद गैर-विनिमय योग्य साइटों पर मौजूद है। इसके परिणामस्वरूप न्यूट्रॉन घनत्व मानचित्र रद्दीकरण होता है, जिससे असंतत मानचित्र65,66 की छाप मिलती है। एक संबंधित एक्स-रे डेटासेट एकत्र करना लाभप्रद रूप से एक संयुक्त शोधन (चित्रा 13 ए और चित्रा 13 बी) में इन रद्दीकरणों को पूरा करता है। एक संयुक्त-शोधन रणनीति में आमतौर पर एक्स-रे डेटा के खिलाफ प्रोटीन बैकबोन निर्देशांक को परिष्कृत करना शामिल होता है, जबकि न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा का उपयोग विनिमय योग्य साइटों पर एच / डी परमाणुओं की स्थिति और अधिभोग को परिष्कृत करने के लिए किया जाता है28। चूंकि विनिमय योग्य स्थलों पर संयुक्त एच / डी अधिभोग की शुरूआत से परिष्कृत होने वाले मापदंडों की संख्या बढ़ जाती है, एक्स-रे डेटा के साथ एक संयुक्त शोधन भी डेटा-टू-पैरामीटर अनुपात को बढ़ाता है। एक संयुक्त शोधन के लिए एक संबंधित एक्स-रे डेटासेट की आवश्यकता होती है जिसे एक ही क्रिस्टल पर एक ही तापमान पर एकत्र किया जाना चाहिए या एक ही स्थिति में उगाए गए क्रिस्टल की आवश्यकता होती है। कमरे के तापमान (300K) पर एकत्र किए गए न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा के लिए, विकिरण क्षति को सीमित करने के लिए कम खुराक डेटा संग्रह रणनीति का उपयोग करके कमरे के तापमान पर संबंधित एक्स-रे डेटासेट एकत्र किया जाना चाहिए। इसके विपरीत, Perdeuterated नमूने, बेहतर और निरंतर न्यूट्रॉन SLD मानचित्र प्रदान करते हैं क्योंकि उनके पास एच / डी सिग्नल रद्दीकरण का समान परिमाण नहीं होता है। हालांकि, धातुओं और सल्फर सहित कुछ तत्वों की न्यूट्रॉन प्रकीर्णन लंबाई उन्हें न्यूट्रॉन एसएलडी मानचित्रों में खराब रूप से दिखाई देती है, भले ही प्रोटीन को perdeuterated किया गया हो (चित्रा 13C-F)18। यदि किसी धातु को विशेषता देने की आवश्यकता है, तो संयुक्त शोधन में एक्स-रे विवर्तन का उपयोग करना या विवर्तन प्रयोगों के पूरक के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकों को लागू करना सबसे अच्छा है। न्यूट्रॉन-केवल डेटा शोधन अक्सर तब किया जाता है जब न्यूट्रॉन डेटासेट में उच्च रिज़ॉल्यूशन होता है या यदि एक perdeuterated प्रोटीन का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, न्यूट्रॉन-केवल डेटा शोधन विशेष रूप से उपयोगी है यदि विकिरण क्षति के प्रति अत्यधिक संवेदनशील प्रोटीन का अध्ययन किया जा रहा है, क्योंकि एक एक्स-रे व्युत्पन्न संरचना में विकिरण-प्रेरित कलाकृतियां हो सकती हैं। यदि न्यूट्रॉन-डेटा-केवल शोधन किया जाना है, तो यह पता लगाया जाना चाहिए कि संबंधित न्यूट्रॉन डेटासेट में पर्याप्त पूर्णता और रिज़ॉल्यूशन है या नहीं।

ORNL न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा के संग्रह के लिए दो सुविधाएं प्रदान करता है: HFIR पर इमेजिन बीमलाइन के साथ-साथ SNS36,67 पर MaNDi बीमलाइन। जबकि दोनों उपकरण समान सिद्धांतों को नियोजित करने वाले न्यूट्रॉन विवर्तन डेटासेट को इकट्ठा करने के लिए प्रभावी साधन प्रदान करते हैं, प्रत्येक उपकरण में अद्वितीय विनिर्देश होते हैं जिन्हें बीम समय के लिए आवेदन करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। कल्पना अर्ध Laue डेटा एकत्र करता है और ~ 100 Å तक इकाई कोशिकाओं के साथ क्रिस्टल पर कमरे के तापमान डेटा संग्रह के लिए अनुकूलित है। MaNDi कमरे के तापमान और क्रायो-तापमान डेटा के संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो ~ 300 Å तक इकाई कोशिकाओं के साथ क्रिस्टल पर TOF-Laue संग्रह को नियोजित करता है। एक पूर्ण डेटासेट एकत्र करने से पहले, प्राप्त विवर्तन पैटर्न की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए क्रिस्टल पर एक परीक्षण किया जाता है जिसमें क्रिस्टल को एक फ्रेम के लिए न्यूट्रॉन बीम के संपर्क में लाया जाता है। यदि क्रिस्टल पर्याप्त गुणवत्ता का है, तो एक पूर्ण न्यूट्रॉन विवर्तन डेटासेट एकत्र किया जाएगा, अनुक्रमित, एकीकृत, स्केल किया जाएगा और एक्स-रे डेटा प्रोसेसिंग के अनुरूप प्रक्रिया में विलय कर दिया जाएगा। कल्पना Lauegen और Lscale का उपयोग करता है और MaNDi Mantid पैकेज का उपयोग करता है और तीन आयामी प्रोफ़ाइल फिटिंग 48,50,51,68,69,70 को रोजगार देता है। वैज्ञानिक जो इन सुविधाओं में से किसी एक पर उपयोगकर्ता बन जाते हैं, उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए एमटीजेड या एचकेएल प्रारूप में डेटासेट प्रदान किया जाएगा।

न्यूट्रॉन विवर्तन जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के प्रोटोनेशन राज्य और हाइड्रोजन बॉन्ड इंटरैक्शन की जांच के लिए एक गैर-विनाशकारी, अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है। यह विशेष रूप से फोटो-संवेदनशील प्रोटीन और मेटलोप्रोटीन के लिए उपयोगी है। एक प्रयोग करने से पहले तकनीक के साथ-साथ डेटा के प्रसंस्करण के बारे में कई विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए, हालांकि परिणाम परिणाम प्राप्त करता है जो ब्याज के प्रोटीन के उत्प्रेरक तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि दे सकता है। न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी कम्प्यूटेशनल, संरचनात्मक, जैव रासायनिक और स्पेक्ट्रोस्कोपिक अध्ययनों को पूरक करती है, जिससे यह जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स की विशेषता के लिए उपयोग की जाने वाली तकनीकों के जीवविज्ञानी के टूलबॉक्स में एक मूल्यवान उपकरण बन जाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को संरचनात्मक आणविक जीव विज्ञान केंद्र (सीएसएमबी) में आयोजित किया गया था, जो ओक रिज राष्ट्रीय प्रयोगशाला में ऊर्जा जैविक और पर्यावरण अनुसंधान उपयोगकर्ता सुविधा के अमेरिकी विभाग है। न्यूट्रॉन विवर्तन डेटा BL-11B MaNDi में ORNL में स्पैलेशन न्यूट्रॉन स्रोत (SNS) में एकत्र किया गया था जो वैज्ञानिक उपयोगकर्ता सुविधा प्रभाग, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय, अमेरिकी ऊर्जा विभाग द्वारा प्रायोजित है। लेखकों ने डेटा में कमी के साथ सहायता के लिए ब्रेंडन सुलिवन को धन्यवाद दिया। एक्स-रे विवर्तन डेटा उत्तरी कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी में आणविक शिक्षा, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान नवाचार केंद्र (मीट्रिक) सुविधाओं में एकत्र किया गया था, जो उत्तरी कैरोलिना राज्य द्वारा समर्थित है। जीसीएस राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ), दक्षिण अफ्रीका और ORNL में स्नातक अवसर (जीओ!) कार्यक्रम से भाग में समर्थन स्वीकार करता है। एफएम यूएसडीए निफा हैच 211001 से समर्थन को स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length DiaDent/DiaVet 218-292
Capillary wax Hampton HR4-328
CCP4 Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL) Corning CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL) Corning CLS430828
Coot Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS Hampton HR4-779
Curved-Tip Forceps Mitegen TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich 543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D Sigma-Aldrich 151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm Mitegen M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit Mettler Toledo 30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml Spearlab M-FD-800
Four Color Mounting Clay Hampton HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T), Sigma-Aldrich 54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris XtaLAB Synergy-R Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight Mitegen M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.) Eppendorf 930001007
Microtubes volume 1.5 mL Eppendorf Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter Fischerbrand FB0875713
Phenix Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm Mitegen M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL Eppendorf Research Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL Eppendorf Research Z683825
Pipette Volume 10-100 μL Eppendorf Research Z683809
Pipette Volume 20-200 μL Eppendorf Research Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder Sigma-Aldrich P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length Hampton HR6-146 Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System Olympus SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases Mitegen GB-B3-R
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length VitroCom CV1012 Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover Hampton HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate Hampton HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well) Mitegen XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D Sigma-Aldrich 176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm) Hampton HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL VWR 76322-528
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL VWR 76322-136
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL VWR 76322-154
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL VWR 76322-150
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL VWR 76322-134
Wax pen Hampton HR4-342

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References

  1. Neumann, P., Tittmann, K. Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).
  2. Pynn, R. Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).
  3. O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
  4. Niimura, N., Podjarny, A. Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).
  5. Blakeley, M. P. P. Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).
  6. Blakeley, M. P., Cianci, M., Helliwell, J. R., Rizkallah, P. J. Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).
  7. Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).
  8. Teixeira, S. C. M., et al. New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).
  9. Furrer, A., Mesot, J., Strässle, T. Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).
  10. Meilleur, F., Coates, L., Cuneo, M. J., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).
  11. Coates, L., et al. The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).
  12. Coates, L., Stoica, A. D., Hoffmann, C., Richards, J., Cooper, R. The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).
  13. Koetzle, T. F., Piccoli, P. M. B., Schultz, A. J. Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).
  14. Ng, J. D., et al. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
  15. Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
  16. Sears, V. F. Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).
  17. Weik, M., Patzelt, H., Zaccai, G., Oesterhelt, D. Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).
  18. Helliwell, J. R. Fundamentals of neutron crystallography in structural biology. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  19. Niimura, N., Bau, R. Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).
  20. Hazemann, I., et al. High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).
  21. Niimura, N., Chatake, T., Ostermann, A., Kurihara, K., Tanaka, I. High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).
  22. Meilleur, F., Contzen, J., Myles, D. A. A., Jung, C. Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).
  23. Bennett, B. C., Gardberg, A. S., Blair, M. D., Dealwis, C. G. On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).
  24. Meilleur, F., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. IMAGINE: The neutron protein crystallography beamline at the high flux isotope reactor. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  25. Wang, X. P., et al. A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802 (2018).
  26. Wlodawer, A., Hendrickson, W. A. A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).
  27. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  28. Adams, P. D., Mustyakimov, M., Afonine, P. V., Langan, P. Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).
  29. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).
  30. Liebschner, D., Afonine, P. V., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).
  31. Afonine, P. V., Mustyakimov, M., Grosse-Kunstleve, R. W., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).
  32. Brünger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).
  33. Gruene, T., Hahn, H. W., Luebben, A. V., Meilleur, F., Sheldrick, G. M. Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  35. Lakey, J. H. Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).
  36. Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).
  37. Halsted, T. P., et al. Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).
  38. Meier, K. K., et al. Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).
  39. Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., Marletta, M. A. Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).
  40. Walton, P. H., Davies, G. J. On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).
  41. Bertini, L., et al. Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).
  42. Hedegård, E. D., Ryde, U. Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).
  43. Hangasky, J. A., Detomasi, T. C., Marletta, M. A. Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).
  44. Bacik, J. P., et al. Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).
  45. O'Dell, W. B., Agarwal, P. K., Meilleur, F. Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).
  46. O'Dell, W. B., Swartz, P. D., Weiss, K. L., Meilleur, F. Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).
  47. Meilleur, F., et al. The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).
  48. Helliwell, J. R., et al. The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).
  49. Nieh, Y. P., et al. Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).
  50. Arzt, S., Campbell, J. W., Harding, M. M., Hao, Q., Helliwell, J. R. LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).
  51. Sullivan, B., et al. Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).
  52. Sullivan, B., et al. BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).
  53. Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).
  54. Blum, M. M., et al. Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).
  55. Tomanicek, S. J., et al. Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).
  56. Metcalfe, C., et al. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).
  57. Hughes, R. C., et al. Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).
  58. Bennett, B. C., Meilleur, F., Myles, D. A. A., Howell, E. E., Dealwis, C. G. Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).
  59. Snell, E. H., et al. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
  60. Golden, E., Attwood, P. V., Duff, A. P., Meilleur, F., Vrielink, A. Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).
  61. Munshi, P., et al. Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).
  62. Logan, D. T. Interactive model building in neutron macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  63. Koruza, K., Lafumat, B., Végvári,, Knecht, W., Fisher, S. Z. Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).
  64. Fisher, S. J., et al. Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).
  65. Chen, J. C. H., Hanson, B. L., Fisher, S. Z., Langan, P., Kovalevsky, aY. Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).
  66. Cuypers, M. G., et al. Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).
  67. Coates, L., Sullivan, B. The macromolecular neutron diffractometer at the spallation neutron source. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
  68. Ren, Z., Kingman, N. G., Borgstahl, G. E. O., Getzoff, E. D., Moffat, K. Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).
  69. Campbell, J. W., Hao, Q., Harding, M. M., Nguti, N. D., Wilkinson, C. LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).
  70. Arnold, O., et al. Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).

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Schröder, G. C., Meilleur, F. Neutron Crystallography Data Collection and Processing for Modelling Hydrogen Atoms in Protein Structures. J. Vis. Exp. (166), e61903, doi:10.3791/61903 (2020).

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