Coleta e processamento de dados de cristalografia de nêutrons para modelagem de átomos de hidrogênio em estruturas proteicas

Summary

A cristalografia de proteína de nêutrons é uma técnica estrutural que permite a localização de átomos de hidrogênio, fornecendo detalhes mecanicistas importantes da função proteica. Apresentamos aqui o fluxo de trabalho para a montagem de um cristal proteico, coleta de dados de difração de nêutrons, refinamento de estrutura e análise dos mapas de densidade de extensão de dispersão de nêutrons.

Abstract

A cristalografia de nêutrons é uma técnica estrutural que permite a determinação de posições de átomos de hidrogênio dentro de macromoléculas biológicas, produzindo informações mecanicamente importantes sobre estados de protonação e hidratação, sem induzir danos causados pela radiação. A difração de raios-X, em contraste, fornece apenas informações limitadas sobre a posição dos átomos de luz e o feixe de raios-X induz rapidamente danos à radiação de cofatores fotosensíveis e centros metálicos. Apresentado aqui é o fluxo de trabalho empregado para as linhas de luz IMAGINE e MaNDi no Oak Ridge National Laboratory (ORNL) para obter uma estrutura de difração de nêutrons uma vez que um cristal proteico de tamanho adequado (> 0,1 ^mm3) tenha sido cultivado. Demonstramos a montagem de cristais de proteína hidrogenada em capilares de quartzo para coleta de dados de difração de nêutrons. Também é apresentado o processo de troca de vapor dos cristais montados com buffer contendo _D2O para garantir a substituição de átomos de hidrogênio em locais trocaveis por deutério. A incorporação do deutério reduz o fundo decorrente da dispersão incoerente dos átomos de hidrogênio e evita o cancelamento da densidade causada pelo seu comprimento de dispersão coerente negativo. As estratégias de alinhamento amostral e coleta de dados de temperatura ambiente são ilustradas usando a coleta de dados quase-Laue no IMAGINE no Reator de Isótopos de Alto Fluxo (HFIR). Além disso, a montagem cristalina e o congelamento rápido em nitrogênio líquido para coleta de dados criominos para capturar intermediários de reação labile é demonstrado no instrumento de tempo de voo MaNDi na Fonte de Neutron spallation (SNS). A preparação dos arquivos de dados de coordenadas e difração do modelo e visualização dos mapas de densidade de comprimento de dispersão de nêutrons (SLD) também serão abordadas. O refinamento da estrutura contra dados de nêutrons ou contra dados articulares de raios-X/nêutrons para obter uma estrutura de todos os átomos da proteína de interesse será finalmente discutido. O processo de determinação de uma estrutura de nêutrons será demonstrado utilizando cristais do polissacarídeo lítico monooxicante Neurospora crassa LPMO9D, uma metaloproteína contendo cobre envolvida na degradação de polissacarídeos recalcitrantes através de decote oxidativo da ligação glicósidica.

Introduction

A cristalografia macromolecular de nêutrons é uma técnica que fornece uma janela única para a estrutura e química subjacente das proteínas. Conceitualmente semelhante à difração de raios-X, a difração de nêutrons fornece detalhes atomísticos da estrutura macromolecular, no entanto, a interação dos nêutrons com núcleos permite a localização de átomos de luz, muitas vezes difíceis de detectar com difração de raios-X1. Durante a difração de raios-X, os raios-X se espalham da nuvem eletrônica, tornando os átomos de luz como o hidrogênio (H) pouco visíveis em mapas de densidade de elétrons que não têm resolução sub-Ångström2. Em contraste, a intensidade de dispersão de nêutrons depende de interações complexas com o núcleo, com isótopos do mesmo elemento exibindo diferentes comprimentos de dispersão. Portanto, átomos de luz e seus isótopos, como hidrogênio (^1H) e deutério (^2H ou D), têm visibilidade comparável aos átomos de carbono, nitrogênio e oxigênio em mapas de densidade de extensão de dispersão de nêutrons (SLD). Além disso, uma vez que a magnitude da dispersão de nêutrons é independente do número de elétrons, a dispersão de elementos leves não é obscurecida por elementos pesados quando eles estão próximos uns dos outros, como é observado na dispersão de raios-X. A visibilidade aprimorada de H e seu isótopo D ao empregar difração de nêutrons fornece informações valiosas sobre o estado de protonação de resíduos catalíticos, cofatores e ligantes e auxilia na orientação de moléculas de água, revelando informações importantes sobre mecanismos catalíticos e química de ^proteína3. A difração de nêutrons também oferece a vantagem de ser uma técnica não destrutiva, particularmente adequada a amostras biológicas sensíveis à ionização, como proteínas com centros metálicos ou cofatores de redox ^{fotosensível2}. O foco principal deste artigo é fornecer uma visão geral do fluxo de trabalho para obter uma estrutura de cristal de proteína de nêutrons de alta qualidade. Encaminhamos o leitor interessado para Podjarny et ^al.4, ^Blakeley5, Blakeley et ^al.6 e O'Dell et ^al.3 para uma excelente visão geral da difração de proteína de nêutrons e Ashkar et ^al.7 para novas aplicações de dispersão de nêutrons.

Os nêutrons são gerados principalmente durante reações nucleares que empregam qualquer um dos dois processos: fissão nuclear em fontes de reator ou spallation em fontes baseadas em ^acelerador8. As fontes do reator fornecem um feixe de nêutrons contínuo empregando fissão nuclear do isótopo ^235U, enquanto fontes de nêutrons spallation produzem um feixe de nêutrons pulsado bombardeando um alvo, por exemplo, um metal líquido como mercúrio, com prótons9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) em Oak Ridge, Tennessee, hospeda uma fonte de nêutrons de estado estável no Reator de Isótopos de Alto Fluxo (HFIR) e uma fonte pulsada de 60 Hz na Fonte de Neutron spallation (SNS). A linha de feixe IMAGINE, localizada no HFIR, é um difrítmetro de nêutrons otimizado para macromoléculas biológicas (Figura Suplementar 1)¹⁰. IMAGINE emprega um detector de placas de imagem de nêutrons para medir dados quase-Laue usando um bandpass estreito na faixa de 2,8 – 4,5 Å de cristais únicos com bordas celulares unitárias <150 Å. O Difractômetro de Nêutrons Macromolecular (MaNDi), localizado no SNS, é um difámetro de nêutrons Laue (TOF) equipado com um quadro de matriz de detector esférico (DAF) (Figura Suplementar 2)¹¹. O MaNDi mede dados de cristais únicos com bordas de células unitárias na faixa de 10 – 300 Å, empregando uma largura de banda tunable de 2 Å entre 2.0 e 6.0 ^Å12.

O processo de geração de nêutrons é altamente intensivo em energia, resultando em fluxos de feixe de nêutrons relativamente fracos quando contrastados com fluxos de raios-X em fontes síncrotrons13. Para garantir relações sinal-ruído suficientes durante a coleta de dados, é necessário cultivar cristais de tamanho e qualidade ^adequados14. Normalmente, cristais com volumes > 0,1 ^mm3 são necessários para coletar dados com estatísticas ^adequadas15. Além dos fluxos mais baixos, devem ser ^{levadas em} consideração as propriedades inerentes à interação entre nêutrons e núcleos amostrais. O comprimento de dispersão de nêutrons difere para isótopos do mesmo elemento, uma propriedade que pode ser explorada vantajosamente em dispersão de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) para mascarar ou destacar regiões de uma amostra – um processo conhecido como contraste ^{correspondente17}. Em experimentos de difração, o comprimento de dispersão de nêutrons coerente negativo de H (-3.741 fm para ^1H) pode levar ao cancelamento de características do mapa de densidade de dispersão de nêutrons, uma vez que os comprimentos coerentes de dispersão de nêutrons de outros átomos biologicamente relevantes, incluindo carbono (6,6511 fm para ^12C), nitrogênio (9,37 fm para ^14N), oxigênio (5.803 fm para ^16O), fósforo (5,13 fm para ^31P) e enxofre (2.804 fm para ^32S), são positivos (Tabela 1)^12,14. Além disso, o grande comprimento de dispersão incoerente de H (25.274 fm), aumenta o fundo durante a coleta de dados, dificultando a qualidade do conjunto de dados e comprometendo a resolução de ^dados7. Para contornar essas limitações introduzidas por H é necessário, para difração de nêutrons, trocar H por seu deutério isótopo, ^2H(D), que tem um comprimento de dispersão de nêutrons coerente positivo (6.671 fm) e comprimento de dispersão incoerente significativamente menor (4,04 fm)¹⁹. Isso pode ser alcançado por perditeração, um processo no qual a proteína é expressa por organismos cultivados em mídia totalmente deutada garantindo a incorporação completa de D em locais ^H20. Também é possível desutar parcialmente a proteína substituindo H por D apenas nos locais trocaveis (grupos titulados) enquanto os locais não permutáveis ligados ao carbono permanecem ^{hidrogenados21}. Isso pode ser alcançado pelo crescimento de cristais de proteína hidrogenada em bebidas maternas desuteradas22. Mais comumente, no entanto, a troca de proteínas hidrogenadas é realizada pela troca de vapor após o crescimento de cristais adequadamente grandes em buffer baseado em _H2O23. Nesses casos, os cristais são montados em um capilar de quartzo e equilibrados com um licor materno baseado em _D20.

Os fluxos limitados de nêutrons em fontes de nêutrons resultam em tempos mais longos de coleta de dados, variando de dias a várias ^semanas24. Na ORNL, tanto a IMAGINE quanto a MaNDi empregam um bandpass de comprimento de onda estreito na faixa de 2 a 6 Å para otimizar a coleta ^{de dados25}. Os dados podem ser coletados à temperatura ambiente ou à temperatura criobito. A coleta de dados criográficos pode potencialmente melhorar a qualidade dos dados e abre a possibilidade de intermediários catalíticos de captura de congelamento. Após a coleta de dados de difração de nêutrons, um conjunto de dados de raios-X é tipicamente coletado no mesmo cristal na mesma temperatura ou em um cristal cultivado em condições ^idênticas26. A coleta de dados na mesma temperatura permite que o refinamento da estrutura seja realizado em relação aos dados de raios-X e nêutrons, evitando possíveis artefatos induzidos pela temperatura, como mudanças na visibilidade e posição das águas ou nas ocupações de resíduos com conformações ^{alternativas27}. O refinamento de dados de nêutrons de raios-X conjunto aumenta a relação dados-parâmetro e oferece a vantagem de permitir que as coordenadas de backbone de proteína sejam refinadas contra os dados de raios-X, enquanto os dados de difração de nêutrons são usados para refinar a posição dos átomos de H/^D28. Isso é particularmente útil quando se usa amostras parcialmente desuteradas, onde o cancelamento da densidade devido a átomos de H em locais não-trocáveis na proteína está presente. Embora o número de estruturas de raios-X exceda em muito o número de estruturas de nêutrons depositadas no Protein Data Bank (PDB), pacotes de software inicialmente projetados para o refinamento de dados de raios-X foram expandidos para abranger dados de nêutrons, bem como ^3,29,30. Após a coleta de dados, os modelos podem ser refinados usando pacotes de refinamento como phenix.refine, CNSsolve (nCNS) ou SHELXL28,31,32,33. Durante o processo de refinamento, mapas de densidade de dispersão de nêutrons podem ser visualizados para montagem manual usando ^COOT34. Seguindo a solução da estrutura, as coordenadas e os arquivos de dados de difração de raios-X e nêutrons e/ou raios-X podem ser submetidos ao PDB, que validará e depositará o modelo, tornando-o disponível para acesso público18,29,30.

A análise estrutural das proteínas é uma abordagem multifacetada na qual inúmeras técnicas são usadas para sondar sua função e ^mecanismo35. A cristalografia da proteína de nêutrons fornece informações químicas valiosas para expandir e complementar os achados de estudos adicionais como difração de raios-X, espectroscopia, ressonância magnética nuclear (RMN) ou difração de elétrons microcristas (microED)³⁶. A difração de proteína de nêutrons está posicionada exclusivamente para fornecer insights sobre mecanismos enzimáticos, uma vez que os átomos H são centrais para sua química. A ausência de danos causados por radiação induzido por nêutrons faz deles uma sonda excepcionalmente adequada ao estudo de metaloproteínas37. Apresentamos aqui um exemplo representativo do processo de difração de proteína de nêutrons desde a preparação da amostra até a coleta, refinamento e análise de dados (Figura 1). Cristais de tamanho suficiente para experimentos de difração de nêutrons foram cultivados da metaloproteína Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D é uma metaloproteína contendo cobre envolvida na degradação da celulose recalcitrante pela inserção de átomos de oxigênio na ligação ^{glicósdica38,39}. O local ativo NcLPMO9D contém um centro de cobre mononuclear dentro de uma característica "histidina-brace" composta da histidina n-terminal e uma segunda histidina conservada (Figura Suplementar 3)⁴⁰. O terminal N de LPMOs fúngicos é metilado, mas a modificação pós-transição não ocorre durante a expressão recombinante na levedura. No estado de repouso NcLPMO9D, o centro de cobre está presente em um estado de oxidação ^Cu2+ e é ativado por uma única redução de elétrons para ^Cu1+, permitindo que o oxigênio molecular se ligue e seja ativado por ser rapidamente reduzido a uma espécie de ^{superóxido41,42}. A reação geral do NcLPMO9D requer a adição adicional de um elétron e dois prótons para formar o produto de polissacarídeo hidroxilálado43. A identidade das espécies de oxigênio ativadas responsáveis pela abstração do átomo de hidrogênio (HAA) a partir do substrato de polissacarídeo não foi identificada e estudos estruturais e computacionais intensivos estão atualmente em ^curso44,45. Dada a química redox no local ativo NcLPMO9D, a mitigação de danos causados por radiação é particularmente pertinente. Ilustramos aqui a coleta de dados de temperatura ambiente e crio-temperatura em cristais NcLPMO9D para determinar a estrutura NcLPMO9D no estado de repouso e na forma reduzida ativada, ^{respectivamente46}. Destaque para a montagem de cristais proteicos, configuração de instrumentos de feixe para coleta de dados, a elaboração dos dados e arquivos de coordenação e as etapas de refinamento necessárias para modelar uma estrutura de nêutrons de todos os átomos.

Protocol

1. Avaliação do tamanho do cristal

1. Meça o tamanho dos cristais usando um microscópio equipado com luz normal e polarizada. Selecione cristais com um volume mínimo de ~0,1 ^mm3 (Figura Suplementar 4).
2. Rotule poços com cristais suficientemente grandes e observe as condições de cristalização utilizadas para gerar esses cristais.

2. Preparação do tampão de cristalização deuterado

1. Dissolver componentes tampão de cristalização em _D2O para gerar tampão de cristalização deuterado.
2. Ajuste o pH do buffer calculando o pD da solução usando a seguinte equação:
   (1)
   onde _pHmeas é o pH medido com um eletrodo de vidro padrão. O pH original do tampão de cristalização NcLPMO9D foi de 6.0, portanto usaremos um _pHmeas de 5.6 para o tampão de cristalização deuterado em pD 6.0.
3. Mergulhe o eletrodo do medidor de pH em _D2O por dez minutos antes do uso (Figura Suplementar 5).
4. Ajuste o _pHmeas para 5,6 por uso da base NaOD ou do ácido DCl.

3. Colheita de cristal

1. Coloque lâminas de vidro redondas de 22 mm ao lado da bandeja de cristalização da qual os cristais serão colhidos. Use uma lâmina de vidro limpa por cristal (Figura 2A).
2. Abra a caixa de sanduíche selada contendo os cristais de proteína na placa de vidro siliconada de 9 grandes volumes.
3. Remova 10-20 μL da solução do reservatório de cristalização com uma micropipette e coloque a solução no slide de vidro (Figura 2B).
4. Retire o cristal usando um microloop de tamanho apropriado e coloque o cristal na solução do reservatório cair sobre a lâmina de vidro para remover detritos que muitas vezes são colhidos junto com o cristal (Figura 2C e Figura 2D).
   NOTA: Será necessário trabalhar rapidamente, pois as gotículas de pequeno volume podem evaporar. Cristais colhidos também correm o risco de secar quando expostos à atmosfera. Pode ser necessário adicionar alguma solução de reservatório à queda de proteína para evitar que cristais sequem em pequenos volumes de queda de cristalização.

4. Montagem de cristal

NOTA: Os protocolos de montagem capilar variam de acordo com as preferências experimentalistas. Para evitar danos aos cristais, os capilares que precisam ser encurtados devem ser pontuados com uma pedra de corte ou lixa para garantir uma ruptura suave.

1. Encha uma extremidade de um capilar de quartzo de 2 mm de diâmetro de 50 mm de comprimento com tampão de reservatório por ação capilar ou por tubos diretamente ~10 μL de tampão de reservatório no capilar (Figura 3A).
   NOTA: Os usuários são encorajados a fazer uso de tubos capilares de quartzo porque, além de sua resistência mecânica, é essencial limitar a absorção de feixe de nêutrons e menores contribuições de fundo do capilar. Capilares de vidro introduzem alto fundo e absorvem nêutrons, comprometendo a qualidade dos dados.
2. Coloque suavemente o cristal no tampão do reservatório no capilar de quartzo usando o laço de montagem (Figura 3B e Figura 3C).
3. Bata suavemente no tubo para mover o tampão do reservatório e o cristal imerso na culação (Figura 3D).
4. Coloque o cristal não mais próximo de 13,5 mm e não mais 27,5 mm de uma extremidade do capilar; este será o final da montagem (Figura Suplementar 6).
5. Aspire a solução tampão ao redor do cristal usando uma ponta de pipeta longa e fina, deixando o cristal ligeiramente molhado. Não toque no cristal (Figura Suplementar 7A).
6. Seque as paredes capilares com um pavio de papel fino (Figura Suplementar 7B).
7. Pipeta 20-50 μL de solução tampão deuterado na extremidade do capilar oposto à extremidade de montagem (Figura 4A).
8. Derreta a cera de abelha com uma "varinha" de calor e insira suavemente o capilar nesta cera de abelha derretida. Repita até formar um selo hermético (Figura 4B e Figura 4C).
9. Pipeta uma quantidade muito pequena de tampão deuterado, aproximadamente 5 μL na extremidade de montagem do capilar para agir como um "dissipador de calor" para a cera de abelha quente. Mergulhe esta extremidade em cera de abelha derretida para gerar um selo hermético como descrito anteriormente para formar um capilar selado em ambas as extremidades (Figura 4D).
10. Inspecione o cristal montado usando um microscópio após a montagem para garantir a hermeste (Figura 4E).
11. Proteja cuidadosamente os cristais montados com lenços kim em um recipiente como um tubo Falcon de 15 ml ou placa de Petri e armazene horizontalmente na temperatura em que os cristais foram cultivados (Figura 4F).

5. Troca de vapor

1. Substitua o tampão deuterado por um tampão fresco dois dias após a montagem do cristal.
2. Derreta o selo de cera mais distante do cristal com um laço de aquecimento, e use uma pipeta e pavios de papel para remover o tampão.
3. Rechee o capilar com 20-50 μL de solução tampão deuterado e vedação com cera.
4. Repita a substituição do buffer deuterado mais duas vezes em intervalos de quatro dias para garantir que a troca de vapor tampão deuterado esteja completa e permita a troca de vapor por pelo menos duas semanas.

6. Difração de proteína de nêutrons

NOTA: Os leitores interessados nas especificidades da linha de feixe IMAGINE são encorajados a consultar Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47.

1. Coleta de dados de temperatura ambiente na linha de feixe IMAGINE no HFIR
   1. Montagem da amostra
      1. Fixar o cristal capilar no goniômetro com massa.
      2. Monte o goniômetro na vara de amostra e centralizar o cristal na viga usando a estação de alinhamento off-line.
      3. Fixar a vara amostral no estágio da amostra do instrumento (Figura Suplementar 1B).
      4. Certifique-se de que a cabana experimental seja desocupada e abra o obturador de linha de vigas para coleta de dados de nêutrons.
   2. Recolha de dados
      1. Abra o programa de aquisição de dados no computador de controle de linha de vigas e clique na guia Configuração para configurar a estratégia de coleta de dados. Em Parâmetros de Experimento digite o nome da amostra ao lado do Nome da Amostra e insira o número da proposta ao lado da Proposta. Em Imagem Nomeando modelo de pasta selecionada e definir o destino para que os dados adquiridos sejam salvos e selecione Prefixo de imagem e digite nome do quadro relevante (Figura Complementar 8).
      2. Abra a GUI óptica e clique em 2,78 para _λmin e 4,78 para _λmax para definir a faixa quase-Laue para coleta de dados (Figura Suplementar 9).
      3. Alternar para a guia Coletar e em Parâmetros de varredura seguintes insira o tempo de exposição em segundos sob exposição, o número de quadros em N Frames e os ângulos para coleta de dados em Δ φ/Frame. Nomeie o quadro a ser coletado em Prefixo de imagem e inicie a coleta de dados clicando no botão Iniciar varredura (Figura Complementar 10).
      4. Os nêutrons difrracados serão detectados pelo Detector de Placas de Imagem. Ao final de cada exposição, a placa de imagem será lida e o padrão exibido na GUI de aquisição de dados (Figura Suplementar 11).
      5. Os quadros são indexados, integrados, de comprimento de onda normalizados e dimensionados usando Lauegen, ^Lscale50 e Scala pelo cientista responsável da linha de luz, que fornecerá ao usuário o arquivo de reflexão mesclado após a coleta de dados (Figura Suplementar 12).
         NOTA: A coleta de dados tanto na IMAGINE quanto na MaNDi será realizada no modo quase Laue, utilizando metodologia e software desenvolvidos para coleta de dados de difração laue, desenvolvidos por Helliwell et ^al.48 e Nieh et ^al.49.
      6. Colete um conjunto de dados de raios-X correspondente no mesmo cristal na mesma temperatura após a coleta de dados de difração de nêutrons (Figura Suplementar 13).
         NOTA: Um cristal cultivado a partir da mesma gota ou sob as mesmas condições de cristalização também pode ser usado para coletar dados de difração de raios-X para refinamento de nêutrons/raios-X articulares.
2. Coleta de dados cryo na linha de feixe MaNDi no SNS
   NOTA: Os leitores interessados nas especificidades da linha de vigas são incentivados a consultar Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11.
   1. Montagem da amostra
      1. Prepare a solução de imersão desatada para a redução dos cristais e do crioprotetor deuterado. Coloque 20 gotas de μL de cada uma dessas soluções em poços de queda sentados em uma placa de cristalização.
         NOTA: A solução crioprotetora é geralmente o crioprotetor que tem se mostrado eficaz para a coleta de dados de difração de raios-X crio-temperatura preparado em _D2O. Este crioprotetor pode ser ainda mais otimizado (por exemplo, concentração) para coleta de dados de nêutrons, se necessário.
      2. Selecione loops para montagem de amostras e conecte-os a uma base crio-básica magnética seguindo as diretrizes do MaNDi (Figura Suplementar 14).
      3. Encha uma crio-de-de guerra de espuma com nitrogênio líquido. Coloque uma manga de proteção crio-de-metal dentro do nitrogênio líquido para esfriar (Figura Suplementar 15A).
      4. Remova os plugues de cera de ambas as extremidades do capilar e toque no capilar para mover o plugue tampão para que o cristal montado esteja imerso em tampão. Lave o cristal na queda da solução do reservatório de 20 μL no poço de queda sentada (Figura Suplementar 15B e Figura Suplementar 15C).
         NOTA: Esta etapa não é necessária se a troca de H/D foi realizada pelo equilíbrio das gotas de cristalização contra o buffer deuterado ou pela imersão direta do cristal no buffer deuterado.
      5. Mergulhe o cristal na solução de imersão de ascorbate por duas horas. Monte o cristal em um microloop ligado a uma crio-base magnética. Mergulhe o cristal montado no crioprotetor por 10 segundos e mergulhe o cristal e o monte de crio no nitrogênio líquido para congelar (Figura Suplementar 15D).
      6. Uma vez que o cristal esteja congelado, use pin criofiado pré-resfriado e monte o cristal no estágio de amostra maNDi equipado com um crio-stream. Abra suavemente o pin crioglique e certifique-se de que o cristal permaneça no crio-fluxo (Figura Suplementar 2C).
   2. Recolha de dados
      1. Abra o software de coleta de dados no qual as informações do experimento terão preenchido automaticamente.
      2. Clique no centro do cristal para centralizar-o com o goniômetro controlado pelo computador (Figura Suplementar 16).
      3. Em Tabela, configure a estratégia de coleta de dados inserindo os ângulos para coleta de dados em "phi", bem como a exposição total de feixe de nêutrons por quadro sob Valor (Figura Suplementar 17).
      4. Clique em Enviar para iniciar a coleta de dados.
      5. À medida que os dados coletam, o nêutron difrucionado será visível (Figura Suplementar 17). As manchas de difração ficarão mais claras à medida que o tempo de exposição aumentar, melhorando a relação sinal-ruído (Figura 5).
      6. Os quadros serão indexados, integrados, de comprimento de onda normalizados e dimensionados usando Mantid e Lauenorm pelo cientista responsável da linha de trave, que fornecerá ao usuário o arquivo de intensidade mesclado após a coleta de ^dados51.

7. Refinamento de estrutura

1. Refinamento de dados de raios-X e nêutrons
   1. Preparação da estrutura
      1. Refine os dados de raios-X para obter uma estrutura proteica usando o pacote de software phenix.refine e Coot para construção manual para obter uma estrutura completa.
      2. Abra o CCP4 e selecione o programa Converter para/modificar/estender MTZ para corresponder às bandeiras de dados sem R dos dados de nêutrons com as dos dados de raios-X. Selecione para importar o arquivo de reflexão no formato MTZ . Em upload do arquivo MTZ de nêutrons obtido e upload do arquivo mtz de raios-X em Import FreeR MTZ (Figura Suplementar 18). Dê um nome para o novo arquivo MTZ em Out e clique em Executar.
      3. Abra o pacote de software Phenix e clique em ReadySet em Ferramentas de Refinamento. Ao lado do arquivo PDB , carregue o arquivo de coordenadas PDB refinado contra os dados de raios-X. Selecione adicionar hidrogênios ao modelo se ausente e selecionar H/D em locais de troca, H em outro lugar do menu suspenso. Selecione Adicionar deutérios a moléculas solventes e deixar as opções restantes em seus valores padrão (Figura Suplementar 19A).
         NOTA: Se uma proteína perdidoterada for usada, selecione a opção Adicione hidrogênios para modelar se ausente e selecione H/D em locais de troca, D em outros lugares.
   2. Refinamento de estrutura
      1. Abra o programa phenix.refine sob a guia Refinamento para configurar o refinamento usando dados de raios-X e nêutrons. Na guia Configurar em arquivos de entrada, o arquivo PDB da estrutura de raios-X que foi processada com ReadySet e o arquivo de restrições CIF necessário para quaisquer ligantes relevantes. Carregue o arquivo MTZ a partir dos dados de nêutrons com as bandeiras Rfree atribuídas usando CCP4 e atribua-os como "dados de nêutrons" e "Neutron R-free" sob o título do tipo Data. Carregue o arquivo MTZ a partir dos dados de raios-X e atribua isso como "dados de raios-X" e "Sem R de raios-X" sob o título do tipo Dados. Os rótulos Space e Data irão preencher automaticamente assim que os dados foram carregados (Figura Suplementar 19B).
         NOTA: Ao realizar o refinamento e inserir as informações de cristal, use a célula da unidade determinada a partir dos dados de raios-X.
      2. Sob a guia Configurar nas configurações Refinamento, mantenha a estratégia de refinamento padrão. Aumentar o número de ciclos para cinco (Figura Suplementar 20)
      3. Selecione Todos os parâmetros, clique em Avançado e selecione Hidrogênios.... Altere o modelo de refinamento de hidrogênio para individual e desligue a Força montando a adp (Figura Suplementar 20).
      4. Selecione Todos os parâmetros e abra a opção Parâmetros de pesquisa . Procure a palavra nuclear e selecione usar as distâncias nucleares para X-H/D (Figura Suplementar 20).
      5. Selecione Executar para iniciar o refinamento.
   3. Construção de modelo
      1. Seguindo o refinamento em Phenix, clique em Abrir em Coot na guia Resultados para visualizar a densidade de elétrons de raios-X e mapas SLD de nêutrons. Clique na guia Gerenciador de exibição e em Mapas clique em Excluir mapa ao lado dos mapas _neutron para remover os mapas de nêutrons (Figura Complementar 21). Clique em Arquivo > Open MTZ, mmCIF fcf ou phs.... Selecione os arquivos de refinamento atuais e abra o arquivo .mtz. Para a opção Amplitudes e Fases, selecione os dados 2FOFC WT_no_fill_neutron do menu suspenso. Repita isso e abra os dados WT_neutron _FOFC. Abra o Gerenciador de exibição e alterne para rolar para os mapas de nêutrons e raios-X 2FOFCWT e, em seguida, role para diminuir o rmsd dos mapas 2FOFCWT para 1,00 (Figura Suplementar 21). Alternar para Rolar para os mapas FOFCWT de nêutrons e raios-X e rolar para diminuir o rmsd dos mapas _FOFCWT para 3,00.
      2. Realizar inspeção visual dos resíduos para determinar se o modelo se encaixa nos dados. Determine a orientação correta e a ocupação de H/D de todos os locais trocaveis analisando picos de mapa de densidade de diferença. Isso inclui os grupos hidroxis de serinas, threonines e tyrosines; o nitrogênio da histidina, glutamina, asparagina e lise; o sulfhydryl da cisteína; os grupos carboxílicos de aspartato e glutamato; grupos de amida espinha dorsal; ligantes; cofatores e eventuais resíduos funcionalizados (Figura 6).
      3. Reoriente as moléculas de água de acordo com a densidade de nêutrons e interações de ligação de hidrogênio, girando-as usando o recurso Rotate Translate Zone/Chain/Molecule (Figura Suplementar 22A e Figura Suplementar 22B). Ajuste as posições dos locais de troca de resíduos proteicos H/D utilizando a ferramenta Editar ângulos de chi e o recurso Rotate Translate Zone/Chain/Molecule (Figura Suplementar 22C e Figura Suplementar 22D).
2. Refinamento de estrutura – refinamento somente de dados de nêutrons
   1. Preparação da estrutura
      1. Abra o Phenix e selecione "Substituição Molecular" e selecione "Phaser-MR (em destaque completo)" para derivar a fase das intensidades dimensionadas fornecidas pelo cientista do instrumento por substituição molecular para gerar um arquivo de coordenada inicial no formato pdb. Insira a estrutura inicial do PDB na guia "Entrada e opções gerais e complete as opções Desarmes, conteúdos ASU e Procedimento de Pesquisa .
      2. Abra as ferramentas do Modelo e selecione ferramentas PDB. Insira o arquivo pdb como o arquivo De entrada. Navegue até a guia Opções e, em Remover a seleção de átomos , selecione os nomes dos solventes, ligantes, cofatores e metais. Isso remove todas as moléculas de água, cofatores, ligantes e íons metálicos para gerar um modelo mínimo. Além disso, selecione remover conformadores alternativos do modelo (Figura Suplementar 23).
      3. Selecione Refinamento em Phenix e abra ReadySet. Insira o arquivo de coordenadas pdb editado ao lado do arquivo PDB. Selecione adicionar hidrogênios ao modelo se ausente e selecionar H/D em locais de troca, H em outro lugar do menu suspenso de opções de refinamento neutron (Figura Suplementar 23).
   2. Refinamento de estrutura
      1. Abra o programa phenix.refine sob a guia Refinamento em Phenix. Na entrada da guia Configurar o arquivo PDB que foi processado com ReadySet sob a caixa de arquivos 'Entrada '. Na caixa de arquivos de entrada , carregue o arquivo MTZ a partir dos dados de nêutrons e atribua isso como dados de raios-X e R-ray sem raios-X sob a coluna tipo Dados , mesmo que seja dados de nêutrons. A configuração de refinamento configurada no próximo passo será usada para tratar o arquivo de reflexão como dados de nêutrons. Os rótulos Space group e Data serão preenchidos automaticamente assim que os dados foram carregados (Figura Suplementar 24A).
      2. Sob a guia Configurar nas configurações Refinamento, mantenha a estratégia de refinamento padrão. Aumente o número de ciclos para cinco. Em Outras opções selecione nêutrons no menu suspenso da tabela Dispersão . Desmarque a opção de Atualização das Águas (Figura Suplementar 24B).
      3. Selecione Todos os parâmetros>Advanced>Hidrogênios. Na nova janela selecione Individual do menu suspenso do modelo de refinamento de hidrogênio e desligue a ADP (Figura Complementar 20).
      4. Selecione Todos os parâmetros > parâmetros de pesquisa... opção. Procure a palavra nuclear e selecione usar as distâncias nucleares para X-H/D (Figura Suplementar 20).
      5. Selecione executar para iniciar o refinamento.
         NOTA: Após o refinamento inicial, será necessário inspecionar visualmente os mapas SLD de nêutrons e executar o edifício manual do modelo em Coot. Pode ser necessário inserir ligantes/cofatores presentes no modelo. Os refinamentos subsequentes exigirão o arquivo de restrições CIF necessário para quaisquer ligantes relevantes e estes devem ser carregados na guia Configurar de phenix.refine.
   3. Construção de modelo
      1. Seguindo o refinamento em Phenix, clique em Abrir em Coot na guia Resultados para visualizar os mapas e estrutura SLD de nêutrons. Clique na guia Gerenciador de exibição e em Mapas clique em Excluir mapa para excluir os mapas 2FOFCWT e _FOFCWT (Figura Complementar 25). Clique em Arquivo > Open MTZ, mmCIF fcf ou phs.... Selecione a pasta de refinamento atual e selecione o arquivo .mtz. Para a opção Amplitudes e Fases, selecione os dados 2FOFC WT_no_fill do menu suspenso. Repita clicando em Arquivo > Open MTZ, mmCIF fcf ou phs... e selecione os dados FOFCWT do menu suspenso para a opção Amplitudes e Fases. Abra o Gerenciador de tela e alterne para rolar para o mapa 2FOFC WT_no_fill, em seguida, role para diminuir o rmsd dos dados _2FOFC WT_no_fill para 1,00 (Figura Suplementar 25). Alternar para rolar para o mapa _FOFCWT e rolar para diminuir o rmsd dos dados _FOFCWT para 3.00.
      2. Realize a inspeção visual da estrutura proteica para determinar se o modelo se encaixa no mapa SLD de nêutrons.
      3. Conforme descrito em 7.1.3.2, determine a orientação correta e a ocupação de H/D de resíduos e grupos com locais de troca de H/D. Ajuste as posições de resíduos usando a ferramenta Traduzir rotativo e edite ângulos de chi (Figura 6). Se necessário, a Zona de Refino de Espaço Real pode ser usada. Corrigir átomos D que explodem manualmente do resíduo usando o editor de texto para inserir as coordenadas corretas do átomo
         NOTA: A Zona de Refino de Espaço Real não é otimizada para mapas SLD de nêutrons em Coot e pode resultar em comprimentos irregulares de ligação para átomos ligados a D, denominados resíduos explosivos (Figura Suplementar 26). É preferível editar manualmente as coordenadas atômicas necessárias e evitar o uso da Zona de Refino Espacial Real.
      4. Insira e reoriente moléculas de água de acordo com a densidade de nêutrons. Para adicionar águas em Coot selecione o átomo de lugar no ícone do ponteiro e selecione inserir uma molécula de água (Figura Suplementar 27A). Coot inserirá um átomo O nesta posição por padrão.
      5. Para adicionar átomos D aos átomos O das águas inseridas em Coot use Phenix. Abra o menu Refinement e clique em ReadySet. Ao lado das opções de refinamento de neutron selecione apenas a opção de Adicionar deutérios a moléculas solventes. Desmarque Adicione hidrogênios ao modelo se ausente (Figura Suplementar 27B e Figura Suplementar 27C).
         NOTA: A construção de modelos usando dados somente de nêutrons difere da construção do modelo de uma estrutura de raios-X/nêutrons articular porque não há dados de raios-X para contribuir para o refinamento das coordenadas da espinha dorsal e átomos mais pesados. Em um refinamento conjunto, o mapa de densidade de elétrons é inicialmente usado para determinar as coordenadas de espinha dorsal e sidechain da proteína. Este modelo é posteriormente usado em um refinamento de dados de raios-X/nêutrons articulares no qual a orientação e ocupação dos átomos de H/D é derivada do mapa SLD de nêutrons. Em um refinamento somente de nêutrons, toda a estrutura é derivada da análise dos mapas de SLD de nêutrons, exigindo a construção das moléculas de água, espinha dorsal, cadeias laterais e ligantes, além dos átomos de H/D (Figura 6). A relação dados-parâmetro é baixa em refinamentos apenas contra dados de nêutrons e deve-se ter cuidado para não sobrequadentar os dados.

Representative Results

Dados de difração de nêutrons sobre cristais de um monooxigênio de polissacarídeo lítico da Neurospora crassa (NcLPMO9D) foram coletados no IMAGINE no HFIR à temperatura ambiente e no MaNDi no SNS sob condições crio-crio-continuaram seguindo o protocolo descrito acima. Foram utilizados cristais da proteína hidrogenada cultivada em tampão à base de _H2O com volume superior a 0,1 ^mm3 (exemplo ilustrativo de cristais grandes são mostrados na Figura Suplementar 4 e figuras posteriores). Os cristais foram montados em capilares de quartzo e a troca de vapor com o buffer baseado em _D2O foi realizada durante três semanas antes da coleta de dados (Figura 4).

A coleta de dados de temperatura ambiente foi realizada na linha de feixe IMAGINE (Figura 1). Um teste de quatro horas de feixe branco levou a uma difração de alta resolução sugerindo que o cristal era de tamanho e qualidade adequados para um conjunto de dados completo a ser coletado. Além de fornecer informações preliminares sobre a qualidade da difração do cristal, a exposição inicial de bandpass largo pode ser usada para indexar o padrão de difração e determinar a matriz de orientação cristalina. Dado o grupo espacial _P21 do cristal, foi implementada uma estratégia de coleta de dados de 18 quadros com tempo de coleta de 20 horas por quadro. Assim como na coleta de dados de difração de raios-X, grupos espaciais de simetria mais elevados requerem menos quadros (ou seja, cobertura menos angular) para coletar um conjunto de dados completo. Os dados foram coletados no modo quase-Laue usando uma faixa de comprimento de onda de 2,8 – 4.0 Å. Após a coleta de dados, os dados foram indexados, integrados dimensionados e fundidos para dar um arquivo SLD de nêutrons em formato MTZ em uma resolução de 2,14 Å. Os dados foram avaliados como de qualidade suficiente seguindo diretrizes semelhantes para análise de dados de raios-X, embora uma completude de 80 % e um _CC1/2 de pelo menos 0,3 foram considerados aceitáveis, uma vez que a difração de proteína de nêutrons é uma técnica limitada de fluxo.

Após a coleta de dados de difração de nêutrons de temperatura ambiente, o mesmo cristal foi usado para coletar um conjunto de dados de difração de raios-X de temperatura ambiente a 1,90 Å (Figura Suplementar 13). Os dados de raios-X foram usados para determinar as posições dos átomos "mais pesados", incluindo C, N,O e S. A estrutura refinada apenas contra os dados de raios-X foi então usada como modelo inicial para realizar um refinamento articular contra os dados de raios-X e nêutrons. Phenix ReadySet foi usado para adicionar átomos H em locais não-trocáveis, átomos H e D em locais de troca e átomos D a moléculas de água do modelo de raio-X inicial. Após a elaboração desse modelo, foram realizados refinamentos iterativos em relação aos dois conjuntos de dados (Figura Suplementar 19 e Figura Suplementar 20). O edifício de modelos interativos foi realizado em Coot inspecionando visualmente os mapas de densidade para orientar as cadeias laterais e moléculas de água em conformidade (Figura Suplementar 22). Os dados de nêutrons foram usados principalmente para determinar estados de prótonação e orientações de moléculas de água. A comparação do mapa de densidade eletrônica de resíduos como serino e triptofano e o mapa SLD de nêutrons correspondente ilustram as informações que podem ser obtidas em estados de protonação em locais de troca de H/D a partir da difração de proteína de nêutrons (Figura 7). Uma sobreposição de mapas de mapas de elétrons e nêutrons SLD para moléculas de água também indicam que, embora as interações de ligação de hidrogênio possam ser inferidas a partir de dados de raios-X, os nêutrons fornecem informações claras sobre a orientação dessas ligações de hidrogênio (Figura 8). Mapas de omitição de neutron SLD _FO-FC foram gerados para determinar estados de protonação e orientação H/D de cadeias laterais. Ilustrados são os mapas SLD de nêutrons obtidos para resíduos de tyrosina e threonina, nos quais os mapas de nêutrons _Fo-FC indicam claramente picos positivos que significam a presença de H/D (Figura 9). Os dados coletados de difração de nêutrons também forneceram informações valiosas sobre vários estados de protonação, como o grupo -_ND3⁺ de Lys (Figura 10). As estatísticas de refinamento (_Rwork e _Rfree) foram acompanhadas de perto durante a otimização do modelo para evitar o excesso de montagem. As estatísticas finais deram um _Rwork de raio-X de 12,77 % e um _Rfree de 18,21%, e um _Rwork de nêutrons de 14,48% e um _Rfree de 21,41% com 389 moléculas de água presentes (Figura Suplementar 28).

Os dados de crio-temperatura foram coletados em NcLPMO9D após um mergulho de ascorbate para reduzir o local ativo de cobre de ^CuII para ^CuI na linha de feixe MaNDi (Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 15)⁴⁵. Os dados foram coletados utilizando o modo TOF Laue após um teste de difração de nêutrons usando uma exposição de 4 horas para verificar a qualidade da difração. Dado o grupo espacial do cristal, foi elaborada uma estratégia de coleta de dados de 18 quadros com uma dose de coleta de 80 Coulombs por quadro. Os dados foram coletados no modo TOF-Laue em uma faixa de comprimento de onda de 2.0 – 4.0 Å. Após a coleta de dados, os dados foram indexados, integrados, dimensionados e fundidos para dar um arquivo de reflexão no formato MTZ a uma resolução de 2,40 ^Å51,52.

Após a coleta de dados, o conjunto de dados de difração de nêutrons NcLPMO9D de temperatura crio-temperatura de 2,40 Å foi usado para o refinamento de dados somente de nêutrons. Os dados de nêutrons foram gradualmente substituídos por substituição molecular usando PDB 5TKH como modelo inicial. Phenix ReadySet foi usado para adicionar átomos H em locais não-trocáveis e átomos de H/D com ocupações parciais em locais de troca. As moléculas de água foram removidas do modelo inicial com ferramentas PDB (Figura Suplementar 23). A preparação do modelo foi seguida por refinamento com phenix.refine utilizando a mesa de dispersão de nêutrons (Figura Suplementar 24). A construção de modelos interativos foi realizada em Coot, com moléculas de água sendo adicionadas usando os picos positivos do mapa _FO-Fc e posicionadas de acordo com possíveis interações de ligação de hidrogênio (Figura 11A e Figura 11B). Ao analisar mapas SLD de nêutrons, as moléculas de água são claramente visíveis se forem altamente ordenadas, no entanto sua densidade pode ser esférica ou elipsoidal se não forem bem ordenadas (Figura 11C-E). Mapas de SLD de nêutrons foram usados para fornecer informações valiosas sobre a orientação de resíduos como asparagine, nos quais a diferenciação entre os grupos carbonyl e amino pode ser desafiadora apenas ao usar dados de difração de raios-X (Figura 12A e Figura 12B). Os picos nos mapas de omitir odênitos de nêutrons _FO-FC também foram muito informativos na determinação dos estados de protonação dos resíduos de histidina na posição N _δ ou N _ε (Figura 12C e Figura 12D). O estado de protonação de resíduos com vários locais de troca de H/D também pode ser determinado usando mapas SLD de nêutrons. Isso foi claramente ilustrado com um mapa de omitir de nêutrons _FO-FC de arginina, que é conhecido por ter uma carga positiva (Figura 12E e Figura 12F). Como anteriormente, o excesso de encaixe foi impedido pelo monitoramento _Rwork e _Rfree. As estatísticas finais deram um _Rwork de 22,58% e um _Rfree de 30,84% (Figura Suplementar 29). Dado que a difração de proteína de nêutrons é uma técnica limitada de fluxo na qual o comprimento de dispersão negativo e o grande fator de dispersão incoerente de H devem ser levados em conta, pode-se esperar que um refinamento somente de dados de nêutrons teria estatísticas mais baixas do que um refinamento conjunto de raios-X/neutron-data com menos moléculas de água visível (Figura Suplementar 28 e Figura Suplementar 29).

Ao analisar mapas SLD de nêutrons, ficará evidente que o cancelamento da densidade devido ao comprimento negativo de dispersão de nêutrons de H ocorrerá para proteínas hidrogenadas que foram submetidas à troca de vapor com tampão de cristalização contendo _D2O. Devido a essa razão, mapas de SLD de nêutrons nos quais átomos H não-trocáveis são anexados ao carbono parecem incompletos quando comparados à sua contraparte do mapa de densidade eletrônica (Figura 13A). O efeito do cancelamento é muitas vezes mais evidente em resoluções mais pobres, tornando imperativo obter cristais proteicos de alta qualidade. Portanto, é preferível realizar um refinamento conjunto de uma amostra com dados de raios-X e nêutrons nos quais os dados de raios-X podem ser usados para determinar a posição da espinha dorsal da proteína (Figura 13B). Além disso, átomos de enxofre em cisteína e methionina podem ser pouco visíveis, exigindo dados de raios-X para colocação exata do átomo (Figura 13C e Figura 13D). Metais com comprimentos de dispersão de nêutrons fracos também podem ser desafiadores para modelar em mapas SLD de nêutrons, como é aparente em nossos mapas LPMO9D. A coleta de uma dose baixa (livre de danos à radiação) o conjunto de dados de raios-X no mesmo cristal é, portanto, útil, uma vez que permite o posicionamento do átomo de metal usando mapas de densidade eletrônica (Figura 13E e Figura 13F).

Figura 1: Fluxograma de fluxo de cristalografia de proteína de nêutrons. Produção de proteínas. Para obter uma estrutura de nêutrons, a proteína é expressa pela primeira vez. A expressão bacteriana na mídia baseada em _H2O ou _D2O é tipicamente usada para produzir um alto rendimento de proteína recombinante hidrogenada ou perdido, respectivamente. A proteína é purificada no tampão à base de _H2O e, em seguida, cristalizada em tampão de cristalização baseado em _H2O ou _D2O para cultivar cristais a um tamanho mínimo de 0,1 ^mm3. Preparação da amostra: Antes da coleta de dados de difração de nêutrons, os cristais cultivados em _H2O passam pela troca de H/D para trocar os átomos de H titratáveis de proteína com a troca de D. H/D podem ser feitos por imersão direta dos cristais em tampão de cristalização deuterado, equilíbrio da gota de cristalização com um reservatório baseado em _D2O, ou montando os cristais em capilares de quartzo para troca de vapor com tampão de cristalização deuterado. Coleta de dados de nêutrons: Após a troca de H/D, cristais potenciais são examinados para determinar a qualidade da difração. Cristais com resolução mínima de 2,5 Å são considerados adequados para um conjunto de dados completo a ser coletado. Os cristais são montados em capilares de quartzo para coleta de dados à temperatura ambiente ou flash congelados em um loop criogênico para coleta de dados à temperatura criogênica. Um conjunto de dados de raios-X é coletado no mesmo (ou um idêntico) cristal na mesma temperatura. Construção de Modelos: O refinamento é realizado usando phenix.refine contra dados de nêutrons e raios-X ou apenas contra os dados de nêutrons. A construção manual da estrutura proteica é realizada em Coot usando os mapas de SLD de nêutrons. Estrutura completa: Após a conclusão da estrutura proteica, o modelo de coordenadas é validado e depositado no Banco de Dados de Proteínas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Colhendo cristais proteicos. (A) Os cristais são manuseados sob um microscópio. (B) A caixa de sanduíche selada contendo a placa de vidro siliconada está aberta. O tampão do reservatório é canalizado em lâminas de vidro siliconadas. (C) Um cristal é colhido com um microloop. (D) O cristal é colocado em uma gota de licor materno para lavar quaisquer detritos que são frequentemente colhidos junto com o cristal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Transferência de cristal para capilar de quartzo. (A) A extremidade de um capilar de quartzo é preenchida com tampão de reservatório. (B) O cristal é transferido para o capilar de quartzo e (C) imerso em tampão de reservatório. (D) O cristal é transportado para baixo capilar usando tampão de reservatório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Vedação do capilar de quartzo. (A) O buffer deuterado é adicionado no final do capilar para formar um "plugue". (B) A cera é derretida com uma "varinha". (C) O capilar é colocado na cera derretida para selar. (D) Os plugues de cera são formados em ambas as extremidades para selar o capilar. (E) O cristal após a montagem. (F) O capilar selado é colocado em uma placa de Petri e mantido no lugar com massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Aumento do sinal para ruído do padrão de difração de nêutrons. À medida que a coleta de dados prossegue, as manchas difundidas tornam-se mais intensas. (NOTA: as imagens de difração ao vivo apresentadas aqui são para ilustração e foram tiradas de diferentes cristais.) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Construção de modelo interativo usando dados de nêutrons em Coot. (A) Um pico positivo de densidade de SLD de nêutrons _FO-FC (verde) indicando serina deve ser reorientada pela edição de ângulos chi. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo e o mapa de densidade de elétrons 2FO-FC é exibido em azul. (B) Serina posicionada corretamente. (C) Picos de densidade SLD de nêutrons de nêutrons _FO-FC positivos e negativos (verde e vermelho, respectivamente) indicando que o triptofano deve ser girado/traduzido para o pico de densidade da diferença de correspondência. (D) Triptofano corretamente orientado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Informações adicionais de mapas SLD de nêutrons. (A) O mapa de densidade de elétrons _2FO-FC (azul) exibe as posições dos átomos "mais pesados" em serina. (B) 2FO-FC mapa SLD de nêutrons (roxo) exibe claramente a posição do átomo D "mais leve" em serina. (C) 2FO-FC mapa de densidade de elétrons (azul) exibe as posições dos átomos "mais pesados" no triptofano. (D) 2FO-FC mapa SLD de nêutrons (roxo) exibe claramente a posição do átomo D "mais leve" no triptofano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Posicionamento da molécula de água. (A) A forma esférica de um mapa de densidade de elétrons _2FO-FC (azul) para a água. (B) O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC (roxo) fornece informações sobre a orientação da água e a interação com a ligação de hidrogênio. (C) Sobreposição de mapas de mapas de elétrons e sld de nêutrons de água. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo e o mapa de densidade de elétrons 2FO-FC é exibido em azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Mapas de FO-FComit de Neutron SLD. (A) O mapa de nêutrons SLD (verde) da _FO-FC fornece informações claras sobre a orientação H/D dos resíduos de tyrosina. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo e o mapa de densidade de elétrons 2FO-FC é exibido em azul. (B) Resíduo de tyrosina com orientação H/D correta. (C) O mapa SLD de nêutrons _FO-FC (verde) fornece informações claras sobre a orientação H/D dos resíduos de threonina. (D) Resíduo de threonina com orientação H/D correta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Vários estados de protonação exibidos com mapas SLD de nêutrons. (A) O mapa de densidade de elétrons _2FO-FC (azul) fornece apenas a posição do átomo N do grupo de ε-amônio. (B-E) O mapa omitido de nêutrons _FO-FC (verde) demonstra claramente o grupo _NH3 carregado positivamente. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo e o mapa de densidade de elétrons 2FO-FC é exibido em azul. (F) Sobreposição de densidade de elétrons e mapas SLD de nêutrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Aparecimento de moléculas de água em mapas de SLD de nêutrons. (A) As moléculas de água são posicionadas de acordo com mapas de SLD de nêutrons _FO-FC (verde) e potenciais ligações de hidrogênio. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo. (B) Molécula de água posicionada corretamente. (C-E) As várias formas de mapas SLD de nêutrons para moléculas de água, dependendo de fatores B e interações de ligação de hidrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Informações sobre orientação de aminoácidos e protonação fornecidas por mapas SLD de nêutrons. (A) Os picos de mapa SLD _FO-FC de nêutrons (verde) indicam orientação incorreta de um resíduo de asparagina. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo e o mapa de densidade de elétrons 2FO-FC é exibido em azul. (B) 2FO-FC mapa SLD de nêutrons (roxo) da orientação asparagina correta. (C) O pico do mapa de Nêutrons SLD _FO-FC (verde) indica uma protonação única da histidina em N _ε. (D) mapa de nêutrons de _2FO-FC (roxo) de histidina N _ε -protonação. (E) Neutron SLD _FO-FC omite picos de mapa (verde) confirmam a carga positiva da arginina. (F) mapa SLD de nêutrons _2FO-FC (roxo) de arginina carregada positivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Mapas SLD de nêutrons descontínuos. (A) Mapa de nêutrons de _2FO-FC (roxo) de uma proteína hidrogenada e vapor H/D trocada. O ácido glutamico exibe o cancelamento do mapa SLD de nêutrons devido ao comprimento de dispersão negativo de átomos H não trocáveis. (B) Um mapa de densidade de elétrons _2FO-FC sobreposto (azul) exibe claramente a densidade do ácido glutamico. (C) O átomo de enxofre na methionina é pouco visível em mapas de SLD de nêutrons _2FO-FC (roxo). (D) Um mapa de densidade de elétrons sobreposto exibe claramente a densidade da methionina. (E) Os átomos de metal, aqui de cobre, são pouco visíveis em mapas de SLD de nêutrons _2FO-FC (roxo). (F) Um mapa de densidade de elétrons _2FO-FC sobreposto (azul) exibe claramente a densidade do átomo de cobre coordenado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Isótopo	Comprimento de dispersão coerente (fm)	Comprimento de dispersão incoerente (fm)
1H	-3.741	25.274
2H	6.671	4.04
12C	6.6511	0
14N	9.37	2
16O	5.803	0
23Na	3.63	3.59
24Mg	5.66	0
31P	5.13	0.2
32S	2.804	0
35Cl	11.65	6.1
39K	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55Mn	-3.73	1.79
56Fe	9.94	0
63Cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

Tabela 1: Comprimentos de dispersão de nêutrons e valores de dispersão incoerentes. Adaptado da Sears, 199216.

Figura suplementar 1: O Instrumento IMAGINE no Reator isótopo de alto fluxo. (A) O instrumento IMAGINE no corredor guia de nêutrons frio. (B) Amostra em montado em um capilar de quartzo ligado com massa ao goniômetro. A tabela de amostra e detector se fecha para posicionar o cristal e a placa de imagem cilíndrica no feixe de nêutrons. Modificado com permissão da União Internacional de ^{Cristalografia53}. Imagens fornecidas com permissão de Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 2: O Instrumento MaNDi na Fonte de Neutron Spallation. (A) O conjunto de detectores de câmeras MaNDi Anger. Reproduzido com a permissão da União Internacional de ^{Cristalografia11}. (B) Estágio amostral movevel maNDi. (C) Amostra montada em capilar de quartzo montada no goniômetro em MaNDi para coleta de dados de temperatura ambiente. Imagens fornecidas com permissão de Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 3: Estrutura do polissacarídeo lítico monooxicato monooxicato NcLPMO9D. O local ativo de cobre NCLPMO9D está localizado em uma superfície plana de ligação de polissacarídeo. O cobre é coordenado por dois resíduos de histidina em uma clássica "cinta histidina", bem como um resíduo de tyrosina axial. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 4: Cristal com volume suficiente na bandeja de cristalização de gota sentada. (A) Cristais grandes são cultivados em gotas sentadas montadas em placas de vidro siliconadas de 9 poços. (B e C) Os cristais são medidos para identificar aqueles com volume > 0,1 ^mm3. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 5: medidor de pH configurado para leituras de buffer deuteradas. O eletrodo pH está encharcado em _D2O antes de ser usado. NaOD e DCL são usados para ajustar o pH de buffers desuterados. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 6: Diretrizes de montagem da amostra maNDi. Dimensões máximas do capilar de quartzo e posição amostral para coleta de dados de temperatura ambiente.
Reproduzido a partir de: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 7: Remoção do excesso de tampão. (A) O excesso de tampão é aspirado do capilar de quartzo com pontas microcapilary. (B) O tampão restante é removido com um pavio de papel fino para secar completamente o capilar. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 8: A gui de aquisição de dados. Janela de entrada dos "Parâmetros de Experimento" para coleta de dados. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 9: A Gui óptica. Seleção da faixa quase-Laue para coleta e monitoramento de dados da taxa de contagem de nêutrons. Clique aqui para baixar este número.

Figura Suplementar 10: Coleta de dados na GUI de aquisição de dados. O tempo de exposição, o número de quadros e ângulos para coleta de dados são especificados na guia "Coletar". A coleta de dados é então iniciada usando "Start Scan". Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 11: Nêutrons difundidos detectados e exibidos. No final do tempo de exposição, o detector de placas de imagem sensível ao nêutrons é lido e o padrão de difração é exibido na GUI de aquisição de dados. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 12: Processamento de dados após difração de nêutrons. Os quadros são indexados, integrados, de comprimento de onda normalizados e dimensionados usando Lauegen, Lscale e Scala para gerar um arquivo de reflexão mesclado após a coleta de dados. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 13: coleta de dados de raios-X. Gerador de raios-X de origem doméstica configurado com cristal capilar de quartzo montado para coleta de dados de temperatura ambiente. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 14: Diretrizes de montagem para coleta de dados crio-datas maNDi. Dimensões de CrystalCaps e altura do pino para coleta de dados criográficos no MaNDi.
Reproduzido a partir de: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 15: Congelamento de flash para coleta de dados de difração de nêutrons crio-nêutrons. (A) Instalação para imersão de cristal, colheita com microloop e congelamento em nitrogênio líquido usando um recipiente compatível com crio, como uma espuma Dewar. O cristal montado é transferido diretamente para o goniômetro criometro de linha de feixe usando pin cryo pin pré-cozido. (B) O selo de cera é derretido para remoção de cristal. (C) O cristal é lavado até o final do capilar de quartzo para colheita. (D) O cristal é sequencialmente encharcado em tampão de imersão de ascorbate e, em seguida, crioprotetonte seguido de congelamento de flash em nitrogênio líquido. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 16: Interface de alinhamento de amostras. O alinhamento de cristal no feixe de nêutrons, representado pela cruz azul, é feito por ponto e centralizar cliques. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 17: O GUI do CSS para coleta de dados. A estratégia de coleta de dados, incluindo doses de exposição e ângulos, é carregada na GUI CSS. À medida que a coleta de dados prossegue, os nêutrons difruídos detectados no detector em tempo real serão exibidos no painel superior. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 18: Combinando bandeiras R-free em CCP4. As bandeiras livres de R dos dados de nêutrons são combinadas com as bandeiras livres de R de dados de raios-X coletados no mesmo ou um cristal idêntico para refinamento articular. Clique aqui para baixar este número.

Figura Suplementar 19: Preparação e refinamento da estrutura. (A) A ferramenta Phenix ReadySet é usada para adicionar ocupação dupla de H/D em locais de troca. (B) Ambos os dados de nêutrons e os dados de raios-X são usados para um refinamento articular, enquanto o modelo de entrada inicial foi refinado em relação ao conjunto de dados de raios-X coletado no mesmo cristal ou um cristal idêntico. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 20: Configuração das configurações de refinamento. O modelo de refinamento, bem como as distâncias nucleares são configurados para refinamento de dados de raios-X/nêutrons articulados. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 21: Seleção de dados para construção de modelo Coot. A saída de arquivos PHENIX MTZ contendo raios-X e dados de nêutrons não preenchidos é aberta em Coot para gerar mapas SLD de elétrons e nêutrons para construção interativa de modelos. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 22: Construção de modelo interativo em Coot durante um refinamento conjunto. (A) Um pico de densidade SLD de nêutrons _FO-FC positivo e negativo (verde e vermelho, respectivamente) indicando que a água deve ser reorientada por rotação/tradução. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo e o mapa de densidade de elétrons 2FO-FC é exibido em azul. (B) Água bem posicionada. (C) Um pico positivo de mapa SLD de nêutrons _FO-FC (verde) indica que a threonina deve ser girada para corresponder ao pico de densidade de diferença editando ângulos de chi. (D) Threonine corretamente orientada. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 23: Preparação da estrutura para refinamento de dados somente de nêutrons. O arquivo de coordenada inicial é preparado para refinamento por remoção de átomos de água em PDBTools e adição de ocupação dupla de H/D em locais de troca. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 24: Refinamento somente de dados de nêutrons. (A) Os dados de nêutrons são carregados, bem como o modelo de partida preparado. (B) As configurações para refinamento de dados de nêutrons usam a tabela de dispersão de nêutrons. Por favor, clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 25: Seleção de dados para construção de modelo Coot. Os dados de nêutrons não preenchidos são abertos em Coot para construção de modelos interativos. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 26: Refinamento real do espaço em Coot para resíduos deutados. (A) Picos de densidade SLD de nêutrons _FO-FC positivos e negativos (verde e vermelho, respectivamente) indicando que um resíduo de arginina deve ser movido para se encaixar no pico de densidade _FO-FC. O mapa SLD de nêutrons _2FO-FC é exibido em roxo e o mapa de densidade de elétrons 2FO-FC é exibido em azul. (B) Utilizar o Refino Espacial Real resulta em átomos D "explodindo" devido à falta de bibliotecas de contenção de geometria coot. (C) Os átomos D não se movem com o resto dos átomos de resíduo. (D) As posições do átomo D podem ser corrigidas manualmente usando um editor de texto. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 27: Adição de moléculas de água. (A) As moléculas de água podem ser adicionadas manualmente aos picos positivos de densidade do mapa de nêutrons _FO-FC SLD (verde). As moléculas de água inseridas serão inicialmente representadas por um átomo de O em Coot. (B) Phenix ReadySet é usado para adicionar átomos D aos átomos O para moléculas de água. (C) A molécula de água deuterada é adicionada com sucesso. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 28: Estatísticas de refinamento. Estatísticas finais de refinamento de dados após o refinamento conjunto de raios-X/nêutrons. Clique aqui para baixar este número.

Figura suplementar 29: Estatísticas de refinamento. Estatísticas finais de refinamento de dados após o refinamento somente de dados de nêutrons. Clique aqui para baixar este número.

Discussion

A cristalografia de proteína de nêutrons é uma técnica altamente sensível para sondar estados de protonação e orientação de moléculas de água em proteínas. Essas informações lançam luz sobre mecanismos catalíticos proteicos, uma vez que mudanças nas interações de protonação e ligação de hidrogênio são muitas vezes centrais para a química ^{enzimática10}. A cristalografia da proteína de nêutrons, embora uma técnica informativa, tem uma série de fatores que devem ser levados em consideração antes de planejar realizar um experimento de difração de nêutrons, ou seja:

1. A exigência de cristais de proteínas grandes para coleta de dados.
2. As propriedades de dispersão de hidrogênio e outros elementos, como íons metálicos.
3. Limitações no refinamento da estrutura e software de construção de modelos ao trabalhar com amostras desuteradas.

Cristalografia de proteína de nêutrons é uma técnica limitada de fluxo. Em contraste com os conjuntos de dados de difração de raios-X, maiores fatores R e menor completude, redundância e razões de sinal-ruído são esperados para conjuntos de dados de nêutrons devido às limitações inerentes à técnica (fluxo limitado, quase-Laue, comprimentos de onda mais longos). A coleta de dados de um único quadro é tipicamente de 12 a 18 horas. O sucesso de um experimento é altamente dependente do tamanho da amostra e da qualidade com cristais de 0,1 ^mm3, sendo frequentemente o requisito ^mínimo3. A difração de nêutrons requer a produção de grandes quantidades de proteína para configurar gotas de cristalização variando de 10 a 800 μL. O volume mínimo para o cultivo de cristais suficientemente grandes pode ser estimado usando uma Calculadora de Volume, dado os parâmetros de cristal e amostra (https://neutrons.ornl.gov/imagine). O crescimento de cristais grandes tem sido mais prevalentemente realizado pela difusão de ^vapor3. A cristalização da queda de suspensão permite o crescimento de cristais em grandes gotas que variam de 10-25 μL, enquanto gotas maiores que variam até ~ 50 μL podem ser configurais usando equipamentos de queda de sessão disponíveis ^{comercialmente14,54}. Placas de vidro de nove poços siliconadas podem ser usadas para configurar gotas muito grandes, com volumes de até 800 μL. Estas placas de vidro são colocadas em "caixas de sanduíche" comercialmente disponíveis na Hampton Research. Outras técnicas de cristalização incluem cristalização em lote, na qual o limite do tamanho da gota é ditado pelo vaso. O experimento de cristalização em lote pode variar de microliters a ^mililitros55. A cristalização também pode ser realizada usando a técnica de diálise na qual a proteína é equilibrada com o precipitante através de uma membrana de diálise ou por contra-difusão ao longo de um gradiente de concentração precipitante ou através de um plugue poroso como ^agarose56,57. A semeadura oferece outra alternativa para obter cristais do volume desejado. Micro e macroseeding foram empregados com sucesso para um grande crescimento de cristais, incluindo grande cristal de NcLPMO9D45. Alguns conhecimentos do diagrama da fase proteica, incluindo a influência da temperatura sobre a solubilidade, auxiliam no grande crescimento cristalino.

Ao planejar um experimento de difração de nêutrons, a otimização da preparação da proteína para maximizar a relação sinal-ruído durante a coleta de dados de difração é ^essencial7. Para contornar o cancelamento de densidade e a alta dispersão incoerente causada por átomos H, os mapas de Nêutrons SLD podem ser melhorados trocando átomos de H por seu isótopo D, que possui um comprimento de dispersão coerente positivo e baixo comprimento de dispersão incoerente. Para isso, é realizada a troca de vapor do cristal de proteína hidrogenada contra o tampão de cristalização deuterado. Isso garante a troca de H/D de moléculas de solventes e os átomos de proteína labile e titratáveis ^H23. A troca de vapor é realizada pela montagem do cristal hidrogenado em um capilar de quartzo com "plugs" de cristalização desuterado baseado em _D2O e representa uma técnica eficaz e suave que é mais frequentemente aplicada14,23,35. A troca pode levar várias semanas e, preferencialmente, requer que o buffer deuterado seja frequentemente alterado para garantir a troca máxima de H/D. A troca de H/D também pode ser realizada encharcando diretamente o cristal em tampão desuterado. Para evitar colocar o cristal sob estresse devido à exposição ao _D2O, o processo de imersão deve ser realizado gradualmente aumentando gradualmente a razão _D2O:_H2O58. Além disso, a cristalização da proteína hidrogenada também pode ser realizada em tampão deuterado para troca de H/D em locais de laboratório ^H22,59. Deve-se notar, no entanto, que o buffer baseado em _D2O tem um efeito sobre a solubilidade da proteína que requer ajuste adicional das condições conhecidas baseadas em H2O3,59. Tampões baseados em _D2O também foram observados para levar a cristais menores em alguns ^casos59. A troca completa de átomos H titratáveis e ligados ao carbono para D pode ser alcançada expressando proteínas em mídia deuterada para gerar uma amostra ^{perdeuterated20}. Os mapas SLD de nêutrons resultantes da amostra perdidoterada serão significativamente melhorados, não mais exibindo o cancelamento de densidade da contraparte da amostra hidrogenada. Isso é benéfico ao caracterizar h/D vinculado em locais não-trombáveis em uma proteína ou cofator. No entanto, a expressão da proteína perdido é tanto alta em custo quanto baixa em ^rendimento60. O Centro nacional de Biologia Molecular Estrutural (CSMB) de Oak Ridge oferece uma facilidade de deuteração para usuários que procuram gerar uma amostra perdido (https://www.ornl.gov/facility/csmb). A expressão perdidoterada é tipicamente realizada em um bioreator na escala 1 L que produz ~50 mg de proteína ^purificada61.

Após a coleta de dados de difração de nêutrons, é realizado refinamento e construção de modelos interativos. O refinamento pode ser executado usando várias suítes de software, incluindo phenix.refine, nCNS ou SHELXL28,31,32,33. O pacote Phenix é o software mais utilizado para refinamento de dados de difração de nêutrons em conjunto com Coot, que é usado para construir manualmente o modelo a partir dos mapas SLD de nêutrons34. Embora tanto Phenix quanto Coot permitam o processamento de dados de difração de nêutrons, eles podem não ter certas características necessárias para processar as idiossincrasias associadas a dados de nêutrons e amostras deutadas. Por exemplo, Coot não contém otimização de geometria para resíduos deuterados, o que pode levar a complicações durante a construção do modelo, uma vez que o recurso "Real Space Refine" resulta em resíduos "explosivos" (Figura Suplementar 26)⁶². Isso pode ser resolvido gerando arquivos de contenção para todos os resíduos desuterados. No entanto, este é um processo intensivo e tais bibliotecas não estão disponíveis publicamente no momento. Ao realizar refinamentos em Phenix, os sites de H/D trocados serão inicialmente definidos como 0,50 de ocupação para H e D. À medida que os refinamentos são realizados, a ocupação de H e D será refinada de acordo com os mapas de SLD de nêutrons. Durante a construção interativa do modelo, os mapas _Fo-Fc de densidade de diferença são muito informativos na avaliação das ocupações de H/D. Mapas podem ser usados para determinar quais locais possuem alta ocupação D, o que é particularmente informativo no local ativo onde os estados de protonação são catalíticomente ^relevantes63. Situações ambíguas surgem, no entanto, quando o H:D a ocupação está próxima de 0,70:0.30, o que resulta em cancelamento completo de sinal em mapas SLD de nêutrons64. Também deve ser levado em conta que os conjuntos de dados de nêutrons quase-Laue geralmente têm completude em torno de 80%, o que é menor do que o observado rotineiramente ≥ 98% para dados de difração de raios-X. Ao refinar dados de difração de nêutrons em Phenix, as amplitudes observadas ausentes (_Fo) são, portanto, calculadas a partir do modelo para completar a lista de reflexão, introduzindo assim viés de modelo. Para explicar esse viés potencial, os mapas "no_fill" devem ser examinados durante a construção de modelos interativos em vez de mapas "preenchidos".

Os usuários podem optar por realizar um refinamento de dados de raios-X/nêutrons articulares de sua estrutura, ou um refinamento apenas de dados de nêutrons. Visualizar mapas SLD de nêutrons, particularmente em menor resolução, pode inicialmente ser desconcertante especialmente para uma proteína hidrogenada na qual H ainda está presente em locais não-periqueáveis, apesar da troca de vapor H/D. Isso resulta em cancelamentos de mapas de densidade de nêutrons, dando a impressão de mapas descontínuos65,66. A coleta de um conjunto de dados de raios-X correspondente complementa vantajosamente esses cancelamentos em um refinamento articular (Figura 13A e Figura 13B). Uma estratégia de refinamento conjunto normalmente envolve refinar as coordenadas de backbone de proteínas contra os dados de raios-X, enquanto os dados de difração de nêutrons são usados para refinar a posição e ocupação dos átomos de H/D em locais ^mutáveis28. Uma vez que a introdução da ocupação conjunta de H/D em locais percobráveis aumenta o número de parâmetros sendo refinados, um refinamento conjunto com dados de raios-X também aumenta a relação dados-parâmetros. Um refinamento articular requer que um conjunto de dados de raios-X correspondente seja coletado na mesma temperatura no mesmo cristal ou um cristal cultivado sob as mesmas condições. Para dados de difração de nêutrons coletados à temperatura ambiente (300K), o conjunto de dados de raios-X correspondente deve ser coletado à temperatura ambiente usando uma estratégia de coleta de dados de baixa dose para limitar os danos causados pela radiação. As amostras perdidoteradas, em contraste, fornecem mapas SLD de nêutrons melhorados e contínuos, uma vez que não possuem a mesma magnitude do cancelamento do sinal H/D. No entanto, o comprimento de dispersão de nêutrons de certos elementos, incluindo metais e enxofre, os tornam pouco visíveis em mapas de SLD de nêutrons, mesmo que a proteína tenha sido perdido (Figura 13C-F)¹⁸. Se um metal precisa ser caracterizado, é melhor utilizar a difração de raios-X em um refinamento articular ou aplicar técnicas espectroscópicas para complementar experimentos de difração. Refinamentos de dados somente de nêutrons são frequentemente realizados quando o conjunto de dados de nêutrons tem alta resolução ou se uma proteína perdeuterada foi usada. Além disso, o refinamento de dados somente de nêutrons é particularmente útil se uma proteína altamente sensível aos danos causados pela radiação estiver sendo estudada, uma vez que uma estrutura derivada de raios-X pode possuir artefatos induzidos por radiação. Se um refinamento somente de dados de nêutrons deve ser realizado, deve ser verificado se o conjunto de dados de nêutrons correspondente tem completação e resolução suficientes.

A ORNL oferece duas facilidades para coleta de dados de difração de nêutrons: a linha de luz IMAGINE no HFIR, bem como a linha de luz MaNDi no ^SNS36,67. Embora ambos os instrumentos forneçam meios eficazes para a coleta de um conjunto de dados de difração de nêutrons que emprega princípios semelhantes, cada instrumento tem especificações únicas que devem ser levadas em conta ao solicitar o tempo do feixe. IMAGINE coleta dados quase-Laue e é otimizado para coleta de dados de temperatura ambiente em cristais com células unitárias até ~100 Å. MaNDi pode ser usado para a coleta de dados de temperatura ambiente e crio-temperatura empregando a coleta tof-laue em cristais com células unitárias até ~ 300 Å. Antes de coletar um conjunto de dados completo, é realizado um teste no cristal para avaliar a qualidade do padrão de difração obtido no qual o cristal é exposto ao feixe de nêutrons para um único quadro. Se o cristal for de qualidade suficiente, um conjunto de dados de difração de nêutrons completo será coletado, indexado, integrado, dimensionado e fundido em um processo análogo ao processamento de dados de raios-X. IMAGINE faz uso de Lauegen e Lscale e MaNDi utiliza o pacote Mantid e emprega encaixe de perfil tridimensional48,50,51,68,69,70. Os cientistas que se tornarem usuários em qualquer uma dessas instalações serão fornecidos com um conjunto de dados em formato MTZ ou HKL para análise suplementar.

A difração de nêutrons é uma técnica não destrutiva e altamente sensível para sondar o estado de protonação e as interações de ligação de hidrogênio de macromoléculas biológicas. É particularmente útil para proteínas foto-sensíveis e metaloproteínas. Várias considerações sobre a técnica, bem como o processamento dos dados devem ser levadas em conta antes de realizar um experimento, no entanto, o resultado produz resultados que podem dar uma visão valiosa do mecanismo catalítico da proteína de interesse. A cristalografia de proteína de nêutrons complementa estudos computacionais, estruturais, bioquímicos e espectroscópicos, tornando-se uma ferramenta valiosa na caixa de ferramentas do biólogo de técnicas utilizadas para caracterizar macromoléculas biológicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length	DiaDent/DiaVet	218-292
Capillary wax	Hampton	HR4-328
CCP4		Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Curved-Tip Forceps	Mitegen	TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Four Color Mounting Clay	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector	Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris	XtaLAB Synergy-R	Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.)	Eppendorf	930001007
Microtubes volume 1.5 mL	Eppendorf	Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL	Eppendorf Research	Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL	Eppendorf Research	Z683825
Pipette Volume 10-100 μL	Eppendorf Research	Z683809
Pipette Volume 20-200 μL	Eppendorf Research	Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder	Sigma-Aldrich	P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length	Hampton	HR6-146	Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System	Olympus	SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases	Mitegen	GB-B3-R
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length	VitroCom	CV1012	Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover	Hampton	HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate	Hampton	HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D	Sigma-Aldrich	176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)	Hampton	HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL	VWR	76322-528
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL	VWR	76322-136
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL	VWR	76322-154
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL	VWR	76322-150
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL	VWR	76322-134
Wax pen	Hampton	HR4-342