Chemistry

Neutron krystallografi Dataindsamling og behandling til modellering hydrogenatomer i proteinstrukturer

Published: December 1, 2020 doi: 10.3791/61903

Gabriela C. Schröder^1,2, Flora Meilleur^1,2

¹Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, ²Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Neutronproteinkrystallografi er en strukturel teknik, der tillader lokalisering af hydrogenatomer og derved giver vigtige mekanistiske detaljer om proteinfunktionen. Vi præsenterer her arbejdsgangen for montering af en proteinkrystal, neutron diffraktion dataindsamling, struktur raffinement og analyse af neutron spredning længde tæthed kort.

Abstract

Neutronkrystallografi er en strukturel teknik, der gør det muligt at bestemmes hydrogenatotompositioner inden for biologiske makromolekyler, hvilket giver mekanistisk vigtige oplysninger om protonation og hydreringstilstande, mens de ikke fremkalder strålingsskader. X-ray diffraktion, derimod, giver kun begrænset information om placeringen af lysatomer og X-ray stråle hurtigt inducerer stråling skader af lysfølsomme cofaktorer og metalcentre. Præsenteret her er arbejdsgangen ansat til IMAGINE og MaNDi strålelinjer på Oak Ridge National Laboratory (ORNL) for at opnå en neutron diffraktion struktur, når en protein krystal af passende størrelse (> 0,1 ^mm3) er blevet dyrket. Vi demonstrerer montering af hydrogenerede proteinkrystaller i kvarts kapillærer til indsamling af neutron diffraktionsdata. Også præsenteret er damp udveksling proces af de monterede krystaller med _D2O-holdige buffer for at sikre udskiftning af hydrogenatomer på udskiftelige steder med deuterium. Inkorporeringen af deuterium reducerer baggrunden som følge af den usammenhængende spredning af hydrogenatomer og forhindrer tæthedsreduktion forårsaget af deres negative sammenhængende spredningslængde. Prøvejustering og strategier for indsamling af rumtemperaturdata illustreres ved hjælp af kvasi-Laue dataindsamling hos IMAGINE at the High Flux Isotope Reactor (HFIR). Desuden demonstreres krystalmontering og hurtig frysning i flydende nitrogen til indsamling af kryodata for at fange labile reaktions mellemprodukter på MaNDi-flyvetidspunktets instrument ved Spallation Neutron Source (SNS). Forberedelse af modelkoordinat- og diffraktionsdatafiler og visualisering af SLD-kortene (neutronspredningslængdetætheden) vil også blive behandlet. Struktur raffinement mod neutrondata-only eller mod fælles X-ray / neutron data for at opnå en all-atom struktur af protein af interesse vil endelig blive drøftet. Processen med at bestemme en neutronstruktur vil blive demonstreret ved hjælp af krystaller af lytic polysaccharid monooxygenase Neurospora crassa LPMO9D, en kobberholdig metalloprotein involveret i nedbrydningen af genstridige polysaccharider via oxidativ kavalergang af den glykosidic obligation.

Introduction

Neutron makromolektær krystallografi er en teknik, der giver et unikt vindue ind i strukturen og underliggende kemi af proteiner. Begrebsmæssigt ligner X-ray diffraktion, neutron diffraktion giver atomistiske detaljer om makromolekylær struktur, men samspillet mellem neutroner med kerner muliggør lokalisering af lysatomer, ofte vanskeligt at opdage med X-ray ^diffraction1. Under X-ray diffraktion spredes røntgenstråler fra elektronskyen, hvilket gør lette atomer som brint (H) dårligt synlige i elektrontæthedskort, der ikke har nær sub-Ångström-opløsning2. I modsætning hertil afhænger spredningsintensiteten af neutroner af komplekse interaktioner med kernen, hvor isotoper af samme element viser forskellige spredningslængder. Derfor har lette atomer og deres isotoper, såsom hydrogen (^1H) og deuterium (^2H eller D), sammenlignelig synlighed til rygraden kulstof, kvælstof og ilt atomer i neutron spredning længdetæthed (SLD) kort. Da størrelsen af neutronspredningen er uafhængig af antallet af elektroner, skjules spredning fra lyselementer ikke af tunge grundstoffer, når de er i tæt nærhed med hinanden, som det ses i røntgenspredning. Den forbedrede synlighed af H og dets isotop D, når der anvendes neutron diffraktion giver værdifulde oplysninger om protonation tilstand af katalytisk vigtige rester, cofaktorer og ligands og hjælper orienteringen af vandmolekyler, afslører vigtige oplysninger om katalytiske mekanismer og protein ^kemi3. Neutron diffraktion giver også den fordel at være en ikke-destruktiv teknik, der er særligt velegnet til biologiske prøver, der er følsomme over for ionisering, såsom proteiner med metalcentre eller lysfølsomme redox ^cofactors2. Det primære fokus i denne artikel er at give et overblik over arbejdsgangen for at opnå en høj kvalitet neutronprotein krystal struktur. Vi henviser den interesserede læser til Podjarny et ^al.4, ^Blakeley5, Blakeley et ^al.6 og O'Dell et ^al.3 for et glimrende overblik over neutronprotein diffraktion og Ashkar et ^al.7 til yderligere anvendelser af neutronspredning.

Neutroner genereres primært under nukleare reaktioner, der anvender en af to processer: nuklear fission ved reaktorkilder eller spallation på acceleratorbaserede ^kilder8. Reaktorkilder giver en kontinuerlig neutronstråle ved at anvende nuklear fission af ^{235U-isotopen}, mens spallation neutronkilder producerer en pulserende neutronstråle ved at bombardere et mål, for eksempel et flydende metal som kviksølv, med ^protoner9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) i Oak Ridge, Tennessee, er vært for både en steady-state neutron kilde på High Flux Isotope Reactor (HFIR) og en 60 Hz pulserende kilde på Spallation Neutron Source (SNS). IMAGINE beamline, der er placeret på HFIR, er et neutron diffraktometer optimeret til biologiske makromolekyler (supplerende figur 1)¹⁰. IMAGINE anvender en neutronbilledpladedetektor til at måle kvasi-Laue-data ved hjælp af en smal båndføring i intervallet 2,8 – 4,5 Å fra enkelte krystaller med blokcellekanter <150 Å. Det makromolekylære neutron diffraktometer (MaNDi), der er placeret på SNS, er et flyvetid (TOF) Laue neutron diffraktometer udstyret med en sfærisk detektor array ramme (DAF) (supplerende figur 2)¹¹. MaNDi måler data fra enkelte krystaller med enhedscellekanter i intervallet 10 – 300 Å ved at anvende en tunable 2 Å-bølgelængde båndbredde mellem 2,0 – 6,0 ^Å12.

Processen med at generere neutroner er meget energiintensiv, hvilket resulterer i relativt svage neutronstråle fluxes, når de står i kontrast til røntgenstråle fluxes på ^{synkrotronkilder13}. For at sikre tilstrækkelige signal-til-støj-forhold under dataindsamlingen er det nødvendigt at dyrke krystaller af passende størrelse og ^kvalitet14. Typisk er krystaller med volumener > 0,1 ^mm3 nødvendige for at indsamle data med tilstrækkelig ^statistik15. Ud over lavere fluxer skal der tages hensyn til iboende egenskaber ved samspillet mellem neutroner og ^{prøvekernerne16}. Spredningslængden af neutroner adskiller sig for isotoper af samme grund, en egenskab, der med fordel kan udnyttes i lille vinkel neutronspredning (SANS) til at maskere eller fremhæve områder af en prøve - en proces kendt som kontrast ^matching17. I diffraktionsforsøg kan den negative sammenhængende neutronspredningslængde af H (-3.741 fm til ^1H) føre til annullering af neutronspredningstæthedskortfunktioner siden de sammenhængende neutronspredningslængder af andre biologisk relevante atomer, herunder kulstof (6,6511 fm for ^12C), nitrogen (9,37 fm for ^14N), ilt (5.803 fm for ^16O), fosfor (5,13 fm for ^31P) og svovl (2,804 fm for ^32S), er positive (tabel 1)^12,14. Desuden øger den store usammenhængende spredningslængde på H (25.274 fm) baggrunden under dataindsamlingen, hæmmer kvaliteten af datasættet og kompromitterer ^{dataopløsning7}. For at omgå disse begrænsninger, der er indført af H, er det for neutron diffraktion nødvendigt at udskifte H for dets isotopdeuterium, ^2H(D), som har en positiv sammenhængende neutronspredningslængde (6.671 fm) og betydeligt lavere usammenhængende spredningslængde (4,04 fm)¹⁹. Dette kan opnås ved perdeuteration, en proces, hvor proteinet udtrykkes af organismer dyrket i fuldt deuterated medier, der sikrer fuldstændig inkorporering af D på H ^sites20. Det er også muligt delvist at deutere protein ved at erstatte H med D udelukkende på de udskiftelige steder (titratable grupper), mens de ikke-udskiftelige kulstofbundne steder forbliver ^{hydrogenerede21}. Dette kan opnås ved vækst af hydrogenerede proteinkrystaller i deuterated ^moderlud22. Oftest dog, H / D udveksling af hydrogenerede proteiner udføres af damp udveksling efter vækst af passende store krystaller i _H2O-baserede ^buffer23. I sådanne tilfælde er krystaller monteret i en kvarts kapillær og damp-ekvilibreret med en _D20-baseret moderlud.

De begrænsede neutronfluxer ved neutronkilder resulterer i længere dataindsamlingstider, der spænder fra dage til flere ^uger24. Hos ORNL anvender både IMAGINE og MaNDi en smal bølgelængdebåndpass i 2-6 Å-serien for at optimere ^{dataindsamlingen25}. Data kan indsamles ved stuetemperatur eller ved kryotemperatur. Indsamling af kryodata kan potentielt forbedre datakvaliteten og åbner mulighed for frysefangst af katalytiske mellemprodukter. Efter indsamling af neutron diffraktionsdata indsamles der typisk et røntgendatasæt på samme krystal ved samme temperatur eller på en krystal, der dyrkes under identiske ^forhold26. Dataindsamling ved samme temperatur gør det muligt at foretage strukturraffinering i forhold til både røntgen- og neutrondata, hvilket forhindrer eventuelle temperaturinducerede genstande såsom ændringer i vandets synlighed og position eller belægninger af restkoncentrationer med alternative ^{konformationer27}. Fælles X-ray neutron data raffinement øger data-til-parameter-forholdet og giver den fordel, at protein rygrad koordinater, der skal raffineres mod X-ray data, mens neutron diffraktion data bruges til at forfine placeringen af H / D ^atomer28. Dette er især nyttigt ved brug af delvist deutererede prøver, hvor densitetsannullering på grund af H-atomer på ikke-udskiftelige steder på proteinet er til stede. Selv om antallet af røntgenstrukturer langt overstiger antallet af neutronstrukturer deponeret i Protein Data Bank (FBF), softwarepakker oprindeligt designet til raffinement af røntgendata er blevet udvidet til at omfatte neutrondata samt3,29,30. Efter dataindsamling kan modeller raffineres ved hjælp af raffinementspakker som phenix.forfine, CNSsolve (nCNS) eller SHELXL28,31,32,33. Under raffinementsprocessen kan neutronspredningstæthedskort visualiseres til manuel montering ved hjælp af ^COOT34. Efter strukturløsning kan koordinaterne og neutron- og/eller røntgen diffraktionsdatafilerne indsendes til FBF, som validerer og deponerer modellen, hvilket gør den tilgængelig for offentlig adgang18,29,30.

Strukturel analyse af proteiner er en mangesidet tilgang, hvor mange teknikker bruges til at sondere deres funktion og ^mekanisme35. Neutronproteinkrystallografi giver værdifuld kemisk indsigt til at uddybe og supplere resultaterne fra yderligere undersøgelser såsom røntgen diffraktion, spektroskopi, nuklear magnetisk resonans (NMR) eller mikrokrystalelektron diffraktion (microED)³⁶. Neutronprotein diffraktion er unikt positioneret til at give indsigt i enzymatiske mekanismer, da H-atomer er centrale for deres kemi. Fraværet af strålingsskader forårsaget af neutroner gør dem til en sonde, der er usædvanligt egnet til studiet af ^{metalloproteiner37}. Vi præsenterer her et repræsentativt eksempel på processen med neutronprotein diffraktion fra prøvepræparat til dataindsamling, raffinement og analyse (figur 1). Krystaller af tilstrækkelig størrelse til neutron diffraktionsforsøg er blevet dyrket af metalloproteinet Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D er et kobberholdigt metalloprotein, der er involveret i nedbrydningen af genstridig cellulose ved iltatomer ved indsættelse af glykogsidic ^bond38,39. NcLPMO9D's aktive sted indeholder et mononuklear kobbercenter inden for en karakteristisk "histidin-brace" bestående af N-terminal histidin og en anden bevaret histidin (supplerende figur 3)⁴⁰. N-terminalen af svampe-LPMOs er methyleret, men den post-overgangsmodifikation forekommer ikke under rekombinant udtryk i gær. I NcLPMO9D hviletilstand er kobbercentret til stede i En ^Cu2+ oxidationstilstand og aktiveres ved enkelt elektronreduktion til ^Cu1+, hvilket gør det muligt for molekylær ilt at binde og aktiveres ved hurtigt at blive reduceret til en superoxidart41,42. Den samlede NcLPMO9D-reaktion kræver yderligere tilsætning af en elektron og to protoner for at danne det hydroxylerede polysaccharidprodukt43. Identiteten af de aktiverede iltarter, der er ansvarlige for indvinding af brintatomer (HAA) fra polysaccharidsubstratet, er ikke blevet identificeret, og der er i øjeblikket intensive strukturelle og beregningsmæssige undersøgelser i ^gang44,45. I betragtning af redox-kemien på NcLPMO9D's aktive sted er afhjælpning af strålingsskader særlig relevant. Vi illustrerer her rumtemperatur og kryotemperatur dataindsamling på NcLPMO9D krystaller til at bestemme NcLPMO9D struktur i hviletilstand og i aktiveret reduceret form, ^{henholdsvis46}. Der vil blive lagt vægt på protein krystal montering, beamline instrument setup for dataindsamling, udarbejdelse af data og koordinere filer og raffinement skridt er nødvendige for at modellere en all-atom neutron struktur.

Protocol

1. Evaluering af krystalstørrelse

Mål størrelsen af krystallerne ved hjælp af et mikroskop udstyret med normalt og polariseret lys. Vælg krystaller med et minimumvolumen på ~0,1 ^mm3 (supplerende figur 4).
Mærk brønde med tilstrækkeligt store krystaller og bemærk krystalliseringsbetingelserne, der bruges til at generere disse krystaller.

2. Udarbejdelse af deuterated krystallisering buffer

Opløs krystalliseringsbufferkomponenter i _D2O for at generere deuterated krystalliseringsbuffer.
Juster bufferens pH-pc ved at beregne opløsningens pD ved hjælp af følgende ligning:
(1)
hvor _pHmeas er pH-målt med en standardglaselektrode. Den oprindelige pH af NcLPMO9D krystallisering buffer var 6,0, derfor vil vi bruge en _pHmeas på 5,6 for deuterated krystallisering buffer på pD 6,0.
Fordyb pH-målerelektroden i _D2O i ti minutter før brug (supplerende figur 5).
_pHmeas justeres til 5,6 ved brug af basen NaOD eller syren DCl.

3. Krystalhøst

Placer silikone 22 mm runde glasrutschebaner ved siden af krystalliseringsbakken, hvorfra krystaller vil blive høstet. Brug en ren glasrutschebane pr. krystal (figur 2A).
Åbn den forseglede sandwichkasse, der indeholder proteinkrystallerne i den 9-brønd store volumen silikone glasplade.
10-20 μL fjernes fra krystalliseringsbeholderopløsningen med en mikropipette, og sæt opløsningen på glasrutsjebanen (figur 2B).
Høst krystallen ved hjælp af en mikroloop af passende størrelse, og læg krystallen i reservoiropløsningsdråbet på glasrutschebanen for at fjerne snavs, der ofte høstes sammen med krystallen (Figur 2C og Figur 2D).
BEMÆRK: Det vil være nødvendigt at arbejde hurtigt, da de små dråber kan fordampe. Høstede krystaller er også i fare for at tørre ud, når de udsættes for atmosfæren. Det kan være nødvendigt at tilføje nogle reservoiropløsning til proteindråben for at forhindre krystaller i at tørre ud i små krystalliseringsfaldsmængder.

4. Krystalmontering

BEMÆRK: Kapillær montering protokoller varierer med experimentalist præferencer. For at forhindre skader på krystaller skal kapillærer, der skal forkortes, scores med en skæresten eller sandpapir for at sikre en glat pause.

Fyld den ene ende af en 50 mm længde kvarts kapillær med reservoirbuffer ved kapillær handling eller ved direkte at pipetter ~10 μL reservoirbuffer ind i kapillæren (figur 3A).
BEMÆRK: Brugere opfordres til at gøre brug af kvarts kapillær rør, fordi, ud over sin mekaniske styrke, er det vigtigt at begrænse neutron stråle absorption og lavere baggrundsbidrag fra kapillær. Glas kapillærer indføre høj baggrund og absorbere neutroner, kompromittere datakvaliteten.
Placer forsigtigt krystallen i reservoirbufferen i kvartskapillæren ved hjælp af monteringsløkken (figur 3B og figur 3C).
Tryk forsigtigt på røret for at flytte reservoirbufferen og deri nedsænket krystal ned i kapillæren (figur 3D).
Krystallen må ikke være tættere på 13,5 mm og højst 27,5 mm fra den ene ende af kapillæren. dette vil være monteringsafslutningen (supplerende figur 6).
Aspirere bufferopløsningen omkring krystallen ved hjælp af en lang tynd pipettespids, så krystallen er lidt våd. Rør ikke ved krystallen (supplerende figur 7A).
Kapillærvæggene tørres med en tynd papirtransport (supplerende figur 7B).
Pipette 20-50 μL af deutereret bufferopløsning ind i enden af kapillæren overfor monteringsden (figur 4A).
Smelt bivoks med en varme "tryllestav" og indsæt forsigtigt kapillæren i denne smeltede bivoks. Gentag indtil der dannes en lufttæt forsegling (figur 4B og figur 4C).
Pipette en meget lille mængde deuterated buffer, ca. 5 μL i monteringsden af kapillæren til at fungere som en "køleplade" for den varme bivoks. Dyp denne ende i smeltet bivoks for at generere en lufttæt forsegling som beskrevet tidligere for at danne en kapillær forseglet i begge ender (Figur 4D).
Undersøg den monterede krystal ved hjælp af et mikroskop efter montering for at sikre lufttæthed (figur 4E).
Fastgør forsigtigt de monterede krystaller med Kim klude i en beholder som en 15-ml Falcon rør eller Petri Dish og opbevares vandret ved den temperatur, hvor krystallerne blev dyrket (Figur 4F).

5. Damp udveksling

Udskift den deutererede buffer med frisk buffer to dage efter krystalmontering.
Smelt voksforseglingen længst fra krystallen med en varmesløjfe, og brug en pipette og papirtransporter til at fjerne bufferen.
Genopfyld kapillæren med 20-50 μL deutereret bufferopløsning, og forsegling med voks.
Gentag den deutererede buffer udskiftning to gange mere med fire dages mellemrum for at sikre, at deuterated buffer damp udveksling er færdig og tillade damp udveksling i mindst to uger.

6. Diffraktion med neutronprotein

BEMÆRK: Læsere interesseret i IMAGINE beam line specifics opfordres til at konsultere Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47.

Indsamling af rumtemperaturdata på IMAGINE-beamline på HFIR
1. Prøvemontering
  1. Fastgør kapillærmonteret krystal på goniometeret med kit.
  2. Monter goniometeret på prøvepinden, og centrer krystallen i strålen ved hjælp af off-line justeringsstationen.
  3. Prøvepinden fastgøres på instrumentprøvestadiet (supplerende figur 1B).
  4. Sørg for, at det eksperimentelle hutch er fraflyttet, og åbn strålelindderen til indsamling af neutrondata.
2. Dataindsamling
  1. Åbn dataindsamlingsprogrammet på beamline control-computeren, og klik på fanen Installation for at konfigurere dataindsamlingsstrategien. Skriv eksempelnavnet ud for Eksempelnavn under Eksperimentparametre, og angiv forslagsnummeret ud for Forslag. Vælg mappeskabelon under Billedudnævning, og angiv destinationen for de hentede data, der skal gemmes, og vælg Billedpræfiks, og skriv relevant rammenavn (supplerende figur 8).
  2. Åbn brugs-brugs-gui'en for optik, og klik på 2,78 for _λmin og 4,78 for _λmax for at indstille kvasi-Laue-området for dataindsamling (supplerende figur 9).
  3. Slå eksponeringstiden til under fanen Indsaml, og indsæt eksponeringstiden i sekunder under Eksponering, antallet af rammer under N Frames og vinklerne for dataindsamling under Δ φ/Frame under Næste scanningsparametre. Navngiv den ramme, der skal indsamles under Billedpræfiks, og start dataindsamlingen ved at klikke på knappen Start scanning (supplerende figur 10).
  4. De diffrakterede neutroner vil blive detekteret af billedpladedetektoren. Ved afslutningen af hver eksponering læses billedpladen og det mønster, der vises på dataindsamlings-GUI(supplerende figur 11).
  5. Rammer indekseres, integreres, bølgelængde normaliseres og skaleres ved hjælp af Lauegen, ^Lscale50 og Scala af den ansvarlige beamline videnskabsmand, som vil give brugeren den fusionerede refleksion fil efter dataindsamling (supplerende figur 12).
    BEMÆRK: Dataindsamling på både IMAGINE og MaNDi vil blive udført i kvasi-Laue mode, ved hjælp af metode og software udviklet til Laue diffraction dataindsamling som udviklet af Helliwell et ^al.48 og Nieh et ^al.49.
  6. Indsamle et tilsvarende røntgendatasæt på samme krystal ved samme temperatur efter indsamling af neutron diffraktionsdata (supplerende figur 13).
    BEMÆRK: En krystal dyrket fra samme dråbe eller under de samme krystalliseringsforhold kan også bruges til indsamling af røntgen diffraktionsdata til fælles neutron/røntgenfinement.
Cryo dataindsamling på MaNDi beamline på SNS
BEMÆRK: Læsere interesseret i strålelinjens specifikationer opfordres til at konsultere Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11.
1. Prøvemontering
  1. Forbered den deuterated ascorbate iblødsætning løsning til reduktion af krystaller og deuterated kryobeskyttende middel. Placer 20 μL dråber af hver af disse opløsninger i siddende drop brønde i en krystallisering plade.
    BEMÆRK: Den kryobeskyttende løsning er normalt den kryobeskyttende middel, der har vist sig effektiv til kryo-temperatur X-ray diffraktion dataindsamling udarbejdet i _D2O. Dette kryobeskyttende middel kan optimeres yderligere (f.eks. koncentration) til indsamling af neutrondata, hvis det er nødvendigt.
  2. Vælg sløjfer til prøvemontering, og fastgør dem til en magnetisk kryobase efter MaNDi-retningslinjerne (supplerende figur 14).
  3. Fyld en skum cryo-Dewar med flydende nitrogen. Anbring et metal kryobeskyttelsesærme i det flydende nitrogen for at afkøle (supplerende figur 15A).
  4. Fjern voksstikkene fra begge ender af kapillæren, og tryk på kapillæren for at flytte bufferstikket, så den monterede krystal nedsænkes i bufferen. Krystallen skylles ud i 20 μL-reservoiropløsningsfaldet i siddedråbebrølen (supplerende figur 15B og supplerende figur 15C).
    BEMÆRK: Dette trin er ikke nødvendigt, hvis H/D-udvekslingen blev udført ved ekvilibrering af krystalliseringsdråberne mod deuterated buffer eller ved direkte iblødsætning af krystallen i deuterated buffer.
  5. Fordyb krystallen i ascorbate iblødsætningsopløsningen i to timer. Monter krystallen i et mikroloop fastgjort til en magnetisk kryo-base. Fordyb den monterede krystal i kryobeskyttende middel i 10 sekunder og dyk krystal og kryo mount i flydende nitrogen til at fryse (supplerende figur 15D).
  6. Når krystallen er frosset, skal du bruge forkølet kryo pin tang og montere krystal på MaNDi prøve fase udstyret med en cryo-stream. Åbn forsigtigt kryostiftens tang, og sørg for, at krystallen forbliver i kryostrømmen (supplerende figur 2C).
2. Dataindsamling
  1. Åbn den dataindsamlingssoftware, hvor eksperimentoplysningerne automatisk udfyldes.
  2. Klik på midten af krystallen for at centrere den med det computerstyrede goniometer (supplerende figur 16).
  3. Under tabel skal dataindsamlingsstrategien fastlægges ved at indtaste vinklerne for dataindsamling under "phi" samt den samlede neutronstråleeksponering pr. ramme under Værdi (supplerende figur 17).
  4. Klik på Send for at starte dataindsamlingen.
  5. Efterhånden som data indsamles, vil diffrakteret neutron være synlig (supplerende figur 17). Diffraktionspunkterne vil blive tydeligere, efterhånden som eksponeringstiden øges, hvilket forbedrer forholdet mellem signal og støj (figur 5).
  6. Rammer vil blive indekseret, integreret, bølgelængde normaliseret og skaleret ved hjælp af Mantid og Lauenorm af den ansvarlige beamline videnskabsmand, der vil give brugeren den fusionerede intensitet fil efter ^{dataindsamling51}.

7. Strukturforbedring

Fælles røntgen- og neutrondataforbedring
1. Strukturforberedelse
  1. Forfin røntgendata for at opnå en proteinstruktur ved hjælp af phenix.forfin softwarepakken og Coot til manuel bygning for at opnå en afsluttet struktur.
  2. Åbn CCP4, og vælg programmet Konverter til/rediger/udvid, så det svarer til neutrondataenes R-fri dataflag med røntgendataenes. Markeres, hvis du vil importere refleksionsfilen i MTZ-format . Under Upload den opnåede neutron MTZ-fil, og overfør X-ray mtz-filen under Import FreeR MTZ (supplerende figur 18). Giv et navn til den nye MTZ-fil under Ud, og klik på Kør.
  3. Åbn Phenix-softwarepakken, og klik på ReadySet under Raffineringsværktøjer. Ved siden af FBF-filen uploade PDB koordinat fil raffineret mod X-ray data. Vælg at føje brint til model, hvis de ikke er fraværende , og vælg H/D på udskiftelige steder, H et andet sted i rullemenuen. Vælg Tilføj deuterium til opløsningsmiddelmolekyler , og lad de resterende indstillinger stå på standardværdierne (supplerende figur 19A).
    BEMÆRK: Hvis der anvendes et perdeutereret protein, skal du vælge indstillingen Tilføj brint til model, hvis de er fraværende , og vælg H/D på udskiftelige steder, D andre steder.
2. Struktur raffinement
  1. Åbn phenix.forfine programmet under fanen Raffinement for at konfigurere raffinementet ved hjælp af både røntgen- og neutrondata. Under fanen Konfigurer i inputfiler skal du indtaste PDB-filen fra røntgenstrukturen, som er blevet behandlet med ReadySet, og den nødvendige CIF-begrænsningsfil for alle relevante ligands. Overfør MTZ-filen fra neutrondataene med de Rfree-flag, der er tildelt ved hjælp af CCP4, og tildel den som "Neutrondata" og "Neutron R-fri" under overskriften Datatype. Overfør MTZ-filen fra røntgendataene, og tildel den som "røntgendata" og "X-ray R-free" under overskriften Datatype. Gruppen Rum og Dataetiketter udfyldes automatisk, når dataene er overført (supplerende figur 19B).
    BEMÆRK: Når du udfører raffinementet og indtaster krystaloplysningerne, skal du bruge den enhedscelle, der bestemmes ud fra røntgendataene.
  2. Under fanen Konfigurer i indstillingerne for forbedring af forfining skal du holde standardforbedringsstrategien. Øge antallet af cyklusser til fem (supplerende figur 20)
  3. Vælg Alle parametre, klik på Avanceret , og vælg Brint.... Skift hydrogenraffineringsmodellen til den enkelte , og sluk for Force riding adp (supplerende figur 20).
  4. Vælg Alle parametre , og åbn indstillingen Søg efter parametre . Søg efter ordet nuklear og vælg at bruge de nukleare afstande til X-H/D (supplerende figur 20).
  5. Vælg Kør for at starte raffinementet.
3. Modelbygning
  1. Efter raffinement i Phenix, skal du klikke på Åbn i Coot i fanen Resultater for at visualisere X-ray elektrontæthed og neutron SLD kort. Klik på fanen Skærmstyring, og klik på Slet kort ud for _neutron kort ved siden af _neutron for at fjerne neutronkortene (supplerende figur 21). Klik på Fil > Åbn MTZ, mmCIF fcf eller phs.... Vælg de aktuelle raffinementsfiler, og åbn .mtz-filen. For både indstillingen Amplituder og Faser skal du vælge 2FOFC WT_no_fill_neutron data i rullemenuen. Gentag dette, og åbn _FOFC WT_neutron-dataene. Åbn Display Manager og til/fra til Scroll for både neutron- og røntgen 2FOFCWT-kortene, rul derefter for at reducere rmsd af 2FOFCWT-kortene til 1,00 (supplerende figur 21). Skift til Rul for både neutron- og røntgen-FOFCWT-kort, og rul for at reducere rmsd af FOFCWT-kortene til 3,00.
  2. Udfør visuel inspektion af resterne for at afgøre, om modellen passer til dataene. Bestem den korrekte retning og H / D belægning af alle udskiftelige steder ved at analysere forskel tæthed kort toppe. Dette omfatter hydroxyl grupper af seriner, threonines og tyrosiner; nitrogen af histidin, glutamin, asparagin og lysin; sulhydryl af cystein carboxylgrupper af aspartat og glutamat amidegrupper; ligands; cofaktorer og eventuelle funktionaliserede restkoncentrationer (figur 6).
  3. Omlægge vandmolekyler i henhold til neutrontæthed og hydrogenbindingsinteraktioner ved at rotere dem ved hjælp af funktionen Roter oversæt zone/kæde/molekyle (supplerende figur 22A og supplerende figur 22B). Juster placeringen af proteinrester H/D-udskiftelige steder ved hjælp af værktøjet Edit Chi Angles og funktionen Roter oversæt zone/kæde/molekyle (supplerende figur 22C og supplerende figur 22D).
Struktur raffinement – neutron data-only raffinement
1. Strukturforberedelse
  1. Åbn Phenix og vælg "Molekylær udskiftning" og vælg "Phaser-MR (fuld featured)" at udlede den fase af de skalerede intensiteter, som instrumentet videnskabsmand ved molekylær udskiftning til at generere en start koordinat fil i FBF format. Indtast start fbf struktur i "Input og generelle indstillinger fanen og fuldføre Ensembler, ASU indhold og søgeprocedure muligheder.
  2. Åbn modelværktøjer , og vælg PDB-værktøjer. Indsæt pdb-filen som inputfilen. Gå til fanen Indstillinger, og vælg navnene på opløsningsmidlet, liganderne, cofaktorerne og metallerne under Fjern atomvalg . Dette fjerner alle vandmolekyler, cofaktorer, ligands og metalioner for at generere en minimal model. Derudover skal du vælge at fjerne alternative konforme fra modellen (supplerende figur 23).
  3. Vælg Raffinering i Phenix, og åbn ReadySet. Indtast den redigerede pdb-koordinatfil ud for PDB-filen. Vælg at føje brint til model, hvis de ikke er fraværende , og vælg H/D på udskiftelige steder, H et andet sted i rullemenuen med indstillinger for neutronraffinering (supplerende figur 23).
2. Struktur raffinement
  1. Åbn phenix.forfiner programmet under fanen Raffinement i Phenix. Angiv den PDB-fil, der er blevet behandlet med ReadySet under feltet Inputfiler, under fanen Konfigurer. I feltet Inputfiler uploade MTZ-filen fra neutrondata og tildele dette som røntgendata og X-ray R-fri under datatype kolonne, selv om det er neutrondata. Den raffinementskonfiguration, der er konfigureret i næste trin, vil blive brugt til at behandle refleksionsfilen som neutrondata. Gruppen Rum og Dataetiketter udfyldes automatisk, når dataene er blevet overført (supplerende figur 24A).
  2. Under fanen Konfigurer i indstillingerne for forbedring af forfining skal du holde standardforbedringsstrategien. Forøg antallet af cyklusser til fem. Vælg neutron i rullemenuen Punktopretur i tabellen Spredningstabel under Andre indstillinger. Fravælg muligheden for at opdatere vande (supplerende figur 24B).
  3. Vælg Alle parametre>Tilvans>Hydrogens. I det nye vindue skal du vælge Individuel i rullemenuen Brintraffineringsmodel og slå Force riding adp fra (supplerende figur 20).
  4. Vælg Alle parametre > Søgeparametre... valgmulighed. Søg efter ordet nuklear og vælg at bruge de nukleare afstande til X-H/D (supplerende figur 20).
  5. Vælg For at køre for at starte raffinementet.
    BEMÆRK: Efter den indledende raffinement vil det være nødvendigt visuelt at inspicere neutron SLD-kortene og udføre manuel modelbygning i Coot. Det kan være nødvendigt at indsætte ligands/cofactors til stede i modellen. Efterfølgende forbedringer vil kræve den nødvendige CIF begrænsninger fil for alle relevante ligands og disse bør uploades i Configure fanen phenix.forfine.
3. Modelbygning
  1. Efter raffinement i Phenix, skal du klikke på Åbn i Coot i fanen Resultater for at visualisere neutron SLD kort og struktur. Klik på fanen Skærmstyring, og klik på Slet kort under Kort for at slette både 2FOFCWT- og FOFCWT-kortene (supplerende figur 25). Klik på Fil > Åbn MTZ, MMCIF fcf eller phs.... Vælg den aktuelle raffinementsmappe, og vælg .mtz-filen. For både amplituder og faser skal du vælge 2FOFC WT_no_fill data i rullemenuen. Gentag ved at klikke på Fil > Åbn MTZ, mmCIF fcf eller phs... og vælg FOFCWT-dataene i rullemenuen for både indstillingen Amplituder og faser. Åbn Displaystyring, og skift til Rul for _2FOFC WT_no_fill-kortet, og rul derefter for at reducere rmsd af _2FOFC WT_no_fill data til 1,00 (supplerende figur 25). Skift til Rul for FOFCWT-kortet, og rul for at reducere rmsd af FOFCWT-dataene til 3,00.
  2. Udfør visuel inspektion af proteinstrukturen for at afgøre, om modellen passer til neutron-SLD-kortet.
  3. Som beskrevet i 7.1.3.2 bestemmes den korrekte orientering og H/D belægning af restkoncentrationer og grupper med H/D udskiftelige steder. Juster restpositioner ved hjælp af værktøjet Roter oversæt og Rediger Chi Vinkler (figur 6). Hvis det er nødvendigt, kan Real Space Refine Zone bruges. Ret D-atomer, der eksploderer fra restproduktet manuelt ved hjælp af teksteditoren til at indsætte de korrekte atomkoordinater
    BEMÆRK: Real Space Refine Zone er ikke optimeret til neutron SLD-kort i Coot og kan resultere i uregelmæssige bindingslængder for atomer bundet til D, der kaldes eksploderende rester (supplerende figur 26). Det er at foretrække at manuelt redigere de nødvendige atomkoordinater og undgå brug af Real Space Refine Zone.
  4. Indsæt og omorienter vandmolekyler i henhold til neutrontætheden. Hvis du vil tilføje vand i Coot, skal du vælge Place atom ved markøren og vælge at indsætte et vandmolekyle (supplerende figur 27A). Coot indsætter som standard et O-atom på denne position.
  5. For at tilføje D atomer til O atomer af vand indsat i Coot bruge Phenix. Åbn menuen Forfining, og klik på ReadySet. Ved siden af Neutron Raffinement Options vælge kun mulighed for at tilføje deuteriums til opløsningsmiddel molekyler. Fravælg Tilføj brint til model, hvis de ikke er til stede (supplerende figur 27B og supplerende figur 27C).
    BEMÆRK: Modelbygning ved hjælp af data, der kun er for neutron, adskiller sig fra modelopbygningen af en fælles røntgen-/neutronstruktur, fordi der ikke er røntgendata, der kan bidrage til forfinelsen af koordinaterne for rygraden og tungere atomer. I en fælles raffinement bruges elektrontæthedskortet oprindeligt til at bestemme protein rygraden og sidechainkoordinaterne. Denne model anvendes efterfølgende i en fælles X-ray/neutron data raffinement, hvor orientering og belægning af H / D atomer er afledt af neutron SLD kort. I en raffinement, der kun er for neutron, er hele strukturen afledt af analyse af neutronSLD-kort, der kræver opbygning af vandmolekyler, rygrad, sidekæder og ligands ud over H/D-atomer (figur 6). Data-til-parameter-forholdet er lavt i forbedringer mod neutrondata alene, og der bør udvises forsigtighed for ikke at overfite dataene.

Representative Results

Neutron diffraktionsdata om krystaller af en lytisk polysaccharid monooxygenase fra Neurospora crassa (NcLPMO9D) blev indsamlet på IMAGINE på HFIR ved stuetemperatur og på MaNDi på SNS under kryo-betingelser efter protokollen beskrevet ovenfor. Krystaller af det hydrogenerede protein, der dyrkes i _H2O-baseret buffer med volumen på over 0,1 ^mm3, blev anvendt (illustrativt eksempel på store krystaller er vist i supplerende figur 4 og derefter tal). Krystaller blev monteret i kvarts kapillærer og damp udveksling med _D2O-baserede buffer blev udført i tre uger før dataindsamling (Figur 4).

Dataindsamlingen om stuetemperatur blev udført på IMAGINE-beamlinen (figur 1). En fire timers hvid stråle test førte til høj opløsning diffraktion tyder på, at krystallen var af passende størrelse og kvalitet for en fuld datasæt, der skal indsamles. Ud over at give foreløbige oplysninger om diffraktionskvaliteten af krystallen, kan den oprindelige brede båndeksponering bruges til at indeksere diffraktionsmønsteret og bestemme krystalorienteringsmatrixen. I betragtning af _{P21-rumgruppen} i krystallen blev der implementeret en dataindsamlingsstrategi på 18 rammer med en indsamlingstid på 20 timer pr. ramme. Som med dataindsamling af røntgen diffraktion kræver højere symmetrirumsgrupper færre rammer (dvs. mindre kantet dækning) for at indsamle et komplet datasæt. Dataene blev indsamlet i kvasi-Laue mode ved hjælp af en bølgelængde på 2,8 – 4,0 Å. Efter dataindsamlingen blev dataene indekseret, integreret skaleret og flettet for at give en neutron SLD-fil i MTZ-format med en opløsning på 2,14 Å. Data blev vurderet til at være af tilstrækkelig kvalitet efter lignende retningslinjer for røntgendataanalyse, selv om en fuldstændighed på 80 % og en _CC1/2 på mindst 0,3 blev anset for acceptabel, da diffraktion med neutronprotein er en fluxbe begrænset teknik.

Efter indsamling af neutron diffraktionsdata med stuetemperatur blev den samme krystal brugt til at indsamle et røntgen diffraktionsdatasæt for rumtemperatur ved 1,90 Å-opløsning (supplerende figur 13). Røntgendataene blev brugt til at bestemme positionerne af de "tungere" atomer, herunder C, N, O og S. Strukturen raffineret mod røntgendata alene blev derefter brugt som startmodel til at udføre en fælles raffinement mod røntgen- og neutrondata. Phenix ReadySet blev brugt til at tilføje H-atomer på ikke-udskiftelige steder, H og D atomer på udskiftelige steder og D-atomer til vandmolekyler af start røntgenmodellen. Efter denne modelforberedelse blev der udført iterative forbedringer i forhold til begge datasæt (supplerende figur 19 og supplerende figur 20). Interaktiv modelbygning blev udført i Coot ved visuelt at inspicere tætheden kort til orientere sidekæder og vandmolekyler i overensstemmelse hermed (supplerende figur 22). Neutrondataene blev primært brugt til at bestemme protonationstilstande og vandmolekyleretninger. Sammenligning af elektrontæthedskortet over rester som serin og tryptofan og det tilsvarende neutron-SLD-kort illustrerer de oplysninger, der kan opnås om protonationstilstande på H/D-udskiftelige steder fra neutronprotein diffraktion (Figur 7). Et kort overlejring af elektron og neutron SLD kort for vandmolekyler viser også, at mens hydrogenbinding interaktioner kan udledes fra X-ray data, neutroner giver klare oplysninger om orienteringen af disse hydrogenbindinger (Figur 8). Neutron SLD _FO-FC udelade kort blev genereret for at bestemme protonation tilstande og H / D orientering af side-kæder. Illustreret er neutron SLD kort opnået for tyrosin og threonine rester, hvor neutron _Fo-FC kort tydeligt angiver positive toppe, der betyder tilstedeværelsen af H / D (Figur 9). De indsamlede neutron diffraktionsdata gav også værdifulde oplysninger om flere protoneringstilstande, såsom -_ND3^+-gruppen af Lys (Figur 10). Raffinement statistik (_Rwork og _Rfree) blev nøje overvåget under model optimering for at forhindre over-montering. De endelige statistikker gav et røntgen _{R-værk på} 12,77 % og en _Rfree på 18,21 % og et neutron _R-værk på 14,48 % og en _Rfree på 21,41 % med 389 vandmolekyler til stede (supplerende figur 28).

Der blev indsamlet kryotemperaturdata på NcLPMO9D efter en ascorbat-blød for at reducere kobberaktivstedet fra ^CuII til ^CuI på MaNDi-strålelinjen (supplerende figur 2 og supplerende figur 15)⁴⁵. Data blev indsamlet ved hjælp af TOF Laue-tilstand efter en neutron diffraktionstest ved hjælp af en 4 timers eksponering for at kontrollere kvaliteten af diffraktion. I betragtning af krystallens rumgruppe blev der udtænkt en dataindsamlingsstrategi på 18 rammer med en indsamlingsdosis på 80 Coulombs pr. ramme. Dataene blev indsamlet i TOF-Laue mode på en bølgelængde på 2,0 – 4,0 Å. Efter dataindsamlingen blev dataene indekseret, integreret, skaleret og flettet for at give en refleksionsfil i MTZ-format med en opløsning på 2,40 ^Å51,52.

Efter dataindsamlingen blev 2,40 Å kryotemperatur NcLPMO9D neutron diffraktion datasæt brugt til neutron-only data raffinement. Neutrondataene blev indfaset ved molekylær udskiftning ved hjælp af PDB 5TKH som startmodel. Phenix ReadySet blev brugt til at tilføje H-atomer på ikke-udskiftelige steder og H / D atomer med delvise belægninger på udskiftelige steder. Vandmolekyler blev fjernet fra startmodellen med FBF-værktøjer (supplerende figur 23). Modelpræparatet blev efterfulgt af raffinement med phenix.forfining ved hjælp af neutronspredningstabellen (supplerende figur 24). Interaktiv modelbygning blev udført i Coot, hvor vandmolekyler blev tilføjet ved hjælp af de positive toppe af FO-Fc-kortet og placeret i henhold til potentielle hydrogenbindingsinteraktioner (figur 11A og figur 11B). Ved analyse af neutron SLD-kort er vandmolekyler tydeligt synlige, hvis de er meget bestilte, men deres tæthed kan være sfærisk eller ellipsoid, hvis de ikke er velordnede (figur 11C-E). Neutron SLD kort blev brugt til at give værdifulde oplysninger om orienteringen af restkoncentrationer såsom asparagine, hvor differentiering mellem carbonyl og aminogrupper kan være udfordrende, når du bruger X-ray diffraktion data alene (Figur 12A og figur 12B). Toppe i _FO-FC neutron SLD udelade kort var også meget informativ i fastsættelsen af protonation tilstande af histidin rester på N _δ- eller N _ε-position (Figur 12C og figur 12D). Protoneringstilstanden for rester med flere H/D udskiftelige steder kan også bestemmes ved hjælp af neutron SLD-kort. Dette blev tydeligt illustreret med en _FO-FC neutron SLD udelade kort over arginin, som er kendt for at have en positiv ladning (Figur 12E og figur 12F). Som tidligere blev overmontering forhindret ved at overvåge _Rwork og _Rfree. De endelige statistikker gav et _{R-værk på} 22,58% og et _{R-frit beløb på} 30,84% (supplerende figur 29). Da diffraktionen af neutronprotein er en flux begrænset teknik, hvor H's negative spredningslængde og store usammenhængende spredningsfaktor skal tages i betragtning, kan det forventes, at en neutrondata-raffinement ville have dårligere statistikker end en fælles røntgen-/neutrondata-raffinement med færre synlige vandmolekyler (supplerende figur 28 og supplerende figur 29).

Ved analyse af neutron SLD-kort vil det blive klart, at tæthedsreduktion på grund af den negative neutronspredningslængde af H vil forekomme for hydrogenerede proteiner, der blev udsat for dampudveksling med _D2O-holdige krystalliseringsbuffer. Af denne grund forekommer neutron-SLD-kort, hvor ikke-udskiftelige H-atomer er fastgjort til kulstof, ufuldstændige sammenlignet med deres modstykke til elektrontæthedskort (figur 13A). Virkningen af aflysning er ofte mere tydelig ved dårligere beslutninger, hvilket gør det bydende nødvendigt at opnå proteinkrystaller af høj kvalitet. Det er derfor at foretrække at udføre en fælles raffinement af en prøve med både røntgen- og neutrondata, hvor røntgendataene kan bruges til at bestemme proteinhets backbones position (figur 13B). Desuden kan svovlatomer i cystein og methionin være dårligt synlige, hvilket kræver røntgendata for nøjagtig atomplacering (figur 13C og figur 13D). Metaller med svage neutronspredningslængder kan også være udfordrende at modellere i neutron SLD-kort, som det fremgår af vores LPMO9D-kort. Indsamling af en lav dosis (fri for strålingsskader) Røntgendatasæt på samme krystal er derfor nyttigt, da det tillader metalatompositionering ved hjælp af elektrontæthedskort (figur 13E og figur 13F).

Figur 1: Flow diagram over neutronprotein krystallografi workflow. Proteinproduktion. For at opnå en neutronstruktur udtrykkes protein først. Bakteriel udtryk i _H2O- eller _D2O-baserede medier bruges typisk til at producere et højt udbytte af henholdsvis hydrogeneret eller perdeutereret rekombinant protein. Proteinet renses i _H2O-baseret buffer og krystalliseres derefter i enten _H2O- eller _D2O-baseret krystalliseringsbuffer for at vokse krystaller til en minimumsstørrelse på 0,1 ^mm3. Prøveforberedelse: Forud for indsamling af dataindsamling af neutron diffraktion gennemgår _H2O-dyrkede krystaller H/D-udveksling for at udveksle de protein titratable H-atomer med D. H/D-udveksling kan gøres ved direkte iblødsætning af krystallerne i deuterated krystalliseringsbuffer, ekvilibrering af krystalliseringsdråben med et _D2O-baseret reservoir eller ved at montere krystallerne i kvartskapillærer til dampudveksling med deuteret krystalliseringsbuffer. Indsamling af neutrondata: Efter H /D udveksling, potentielle krystaller screenes for at bestemme diffraktion kvalitet. Krystaller med en opløsning på mindst 2,5 Å anses for egnede til indsamling af et fuldt datasæt. Krystaller er monteret i kvarts kapillærer til dataindsamling ved stuetemperatur eller flash frosset i en kryo-loop til dataindsamling ved kryogen temperatur. Et røntgendatasæt indsamles på den samme (eller en identisk) krystal ved samme temperatur. Modelbygning: Raffinement udføres ved hjælp af phenix.forfine mod både neutron-og røntgendata eller mod neutrondata alene. Manuel modelbygning af proteinstrukturen udføres i Coot ved hjælp af neutron SLD-kortene. Komplet struktur: Efter færdiggørelsen af proteinstrukturen valideres og deponeres koordinatmodellen i Protein Data Bank. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Høst af proteinkrystaller. (A) Krystaller håndteres under et mikroskop. B) Den forseglede sandwichkasse, der indeholder den silikoneglasplade, åbnes. Reservoirbuffer ledes på silikoneglasschebaner. (C) En krystal høstes med et mikroloop. (D) Krystallen er placeret i en dråbe moderlud for at vaske affald, der ofte høstes sammen med krystallen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Overførsel af krystal til kvarts kapillær. (A) Enden af en kvarts kapillær fyldes med reservoirbuffer. (B) Krystallen overføres til kvarts kapillær og (C) nedsænket i reservoir buffer. (D) Krystallen føres ned kapillær ved hjælp af reservoir buffer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Forsegling af kvarts kapillær. (A) Deuterated buffer tilføjes i slutningen af kapillæren for at danne et "stik". (B) Voks smeltes med en "tryllestav". (C) Kapillæren anbringes i den smeltede voks for at forsegle. (D) Vokspropper dannes i begge ender for at forsegle kapillæren. (E) Krystallen efter montering. (F) Den forseglede kapillær anbringes i en petriskål og holdes på plads med kit. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Øget signal-til-støj af neutron diffraktion mønster. Efterhånden som dataindsamlingen skrider frem, bliver diffrakterede pletter mere intense. (BEMÆRK: de levende diffraktion billeder præsenteret her er til illustration og blev taget fra forskellige krystaller.) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Interaktiv modelbygning ved hjælp af neutrondata i Coot. A) En positiv _FO-FC neutron SLD-tæthedstop (grøn), der angiver serin, skal omlægges ved at redigere chi-vinkler. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla og _2FO-FC elektrontæthedskort vises med blåt. (B) Korrekt placeret serin. (C) Positive og negative _FO-FC neutron SLD-tæthedstoppe (henholdsvis grøn og rød), der angiver, at tryptofan skal roteres/oversættes for at matche forskellens tætheds peak. (D) Korrekt orienteret tryptofan. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Yderligere oplysninger fra neutron SLD kort. (A) 2FO-FC elektrontæthed kort (blå) viser placeringen af de "tungere" atomer i serin. (B) 2FO-FC neutron SLD kort (lilla) viser tydeligt placeringen af den "lettere" D atom i serin. (C) 2FO-FC elektrontæthed kort (blå) viser placeringen af de "tungere" atomer i tryptofan. (D) 2FO-FC neutron SLD kort (lilla) viser tydeligt placeringen af den "lettere" D atom i tryptofan. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: Placering af vandmolekyler. (A) Den sfæriske form af en 2FO-FC elektron tæthed kort (blå) funktion for vand. (B) _2FO-FC neutron SLD kort (lilla) giver oplysninger om vand orientering og hydrogenbinding interaktion. (C) Kort overlejring af elektron og neutron SLD kort over vand. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla og _2FO-FC elektrontæthedskort vises med blåt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9: Neutron SLD FO-FComit kort. (A) _FO-FC neutron SLD-kortet (grønt) giver klare oplysninger om H/D-orienteringen af tyrosinrester. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla og _2FO-FC elektrontæthedskort vises med blåt. B) Tyrosinrester med korrekt H/D-orientering. (C) _FO-FC neutron SLD kort (grøn) giver klare oplysninger om H / D orientering af threonine rester. D) Threonine-rester med korrekt H/D-orientering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 10: Flere protoneringstilstande, der vises med neutron-SLD-kort. (A) _2FO-FC elektrontæthed kort (blå) kun giver placeringen af N atom af lysin ε-ammonium gruppe. (B-E) _FO-FC neutron SLD udelade kort (grøn) klart viser positivt ladede -_NH3 gruppe. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla og _2FO-FC elektrontæthedskort vises med blåt. (F) Overlejring af elektrontæthed og neutron SLD kort. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 11: Udseende af vandmolekyler i neutron SLD kort. (A) Vandmolekyler er placeret i henhold til _FO-FC neutron SLD kort (grøn) og potentielle hydrogenbindinger. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla. (B) Korrekt placeret vandmolekyle. (C-E) De forskellige former af neutron SLD kort for vandmolekyler afhængigt af B-faktorer og hydrogenbinding interaktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 12: Oplysninger om aminosyre orientering og protonation fra neutron SLD kort. (A) Neutron SLD _FO-FC korttoppe (grøn) angiver forkert orientering af en asparagin rest. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla og _2FO-FC elektrontæthedskort vises med blåt. (B) 2FO-FC neutron SLD kort (lilla) af den korrekte asparagin orientering. (C) Neutron SLD _FO-FC kort peak (grøn) angiver enkelt protonation af histidin på N _ε. (D) 2FO-FC neutron SLD kort (lilla) af histidin N _ε -protonation. (E) Neutron SLD _FO-FC udelade kort toppe (grøn) bekræfte den positive ladning af arginin. (F) 2FO-FC neutron SLD kort (lilla) af positivt ladet arginin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 13: Diskontinuerlige neutron SLD-kort. (A) 2FO-FC neutron SLD kort (lilla) af en hydrogeneret, damp H / D udvekslet protein. Glutaminsyre viser neutron SLD kort annullering på grund af den negative spredning længde af ikke-udskiftelige H-atomer. (B) Et overlejret 2FO-FC elektrontæthedskort (blåt) viser tydeligt glutaminsyrens massefylde. (C) Svovlatomet i methionin er dårligt synligt i _2FO-FC neutron SLD kort (lilla). (D) Et overlejret elektrontæthedskort viser tydeligt methioninens massefylde. (E) Metalatomer, her kobber, er dårligt synlige i neutron _2FO-FC SLD kort (lilla). (F) Et overlejret 2FO-FC elektrontæthedskort (blåt) viser tydeligt tætheden af det koordinerede kobberatom. Klik her for at se en større version af dette tal.

Isotop	Sammenhængende spredningslængde (fm)	Usammenhængende spredningslængde (fm)
1H	-3.741	25.274
2H	6.671	4.04
12C	6.6511	0
14N	9.37	2
16O	5.803	0
23Na	3.63	3.59
24mg	5.66	0
31P	5.13	0.2
32S	2.804	0
35Cl	11.65	6.1
39K	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55Mn	-3.73	1.79
56Fe	9.94	0
63Cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

Tabel 1: Neutronspredningslængder og usammenhængende spredningsværdier. Tilpasset fra Sears, ¹⁹⁹²¹⁶.

Supplerende figur 1: IMAGINE-instrumentet ved højfluxisotopreaktoren. (A) IMAGINE-instrumentet i den kolde neutronguidehal. B) Prøve i monteret i en kvarts kapillær fastgjort med kit til goniometeret. Prøve- og detektortabellen lukker for at placere krystallen og den cylindriske billedplade i neutronstrålen. Ændret med tilladelse fra Den Internationale Union for ^{Krystallografi53}. Billeder forsynet med tilladelse fra Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 2: MaNDi-instrumentet ved Spallation Neutron Source. (A) MaNDi Anger kamera detektor array. Gengivet med tilladelse fra Den Internationale Union for ^{Krystallografi11}. (B) MaNDi bevægelige prøve fase. (C) Prøve monteret i kvarts kapillær monteret på goniometeret ved MaNDi for stuetemperatur dataindsamling. Billeder forsynet med tilladelse fra Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 3: Strukturen af lytic polysaccharid monooxygenase NcLPMO9D. NcLPMO9D kobberaktive sted er placeret på en flad polysaccharid bindende overflade. Kobberet koordineres af to histidinrester i en klassisk "histidin brace" samt en aksial tyrosinrester. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 4: Krystal med tilstrækkelig volumen i siddende dråbekrystalliseringsbakke. (A) Store krystaller dyrkes i siddedråber, der er sat op i 9-brønd silikoneglasplader. (B og C) Krystaller måles for at identificere dem med volumen > 0,1 ^mm3. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 5: pH-måler, der er sat op til deutererede bufferaflæsninger. pH-elektroden er gennemblødt i _D2O før brug. NaOD og DCl bruges til at justere pH af deuterated buffere. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 6: MaNDi-retningslinjer for montering af stikprøver. Maksimale dimensioner af kvarts kapillær og prøve position for stuetemperatur dataindsamling.
Gengivet fra: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 7: Fjernelse af overskydende buffer. (A) Overskydende buffer suges ud af kvarts kapillær med mikrokapillalære tips. (B) Den resterende buffer fjernes med en tynd papirtransport for helt at tørre kapillæren. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 8: Gui for dataindsamling. Inputvinduet i "Eksperimentparametre" for dataindsamling. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 9: Optik-GUI. Udvælgelse af kvasi-Laue-området til dataindsamling og overvågning af neutrontællingshastigheden. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 10: Dataindsamling i brugsstyringsforordningen for dataindsamling. Eksponeringstiden, antallet af rammer og vinkler til dataindsamling er angivet under fanen "Indsaml". Dataindsamlingen startes derefter ved hjælp af "Start scanning". Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 11: Diffrakterede neutroner, der er registreret og vist. I slutningen af eksponeringstiden aflæses neutronfølsom billedpladedetektor, og diffraktionsmønsteret vises i brugsstyrings-brugsstyringen. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 12: Databehandling efter neutron diffraktion. Rammer indekseres, integreres, nedtones og skaleres ved hjælp af Lauegen, Lscale og Scala til at generere en flettet refleksionsfil efter dataindsamlingen. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 13: Indsamling af røntgendata. Home kilde X-ray generator oprettet med kvarts kapillær monteret krystal til stuetemperatur dataindsamling. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 14: Montering af retningslinjer for MaNDi cryo-dataindsamling. Dimensioner af CrystalCaps og pin højde for kryo-dataindsamling på MaNDi.
Gengivet fra: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 15: Flashfrysning for indsamling af kryo neutron diffraktionsdata. (A) Opsætning til krystalblødning, høst med mikroloop og frysning i flydende nitrogen ved hjælp af en kryo kompatibel beholder, såsom skum Dewar. Den monterede krystal overføres direkte til beamline cryo goniometer ved hjælp af forkølede kryo pin tang. (B) Voksforseglingen smeltes til krystalfjernelse. (C) Krystallen skylles til enden af kvarts kapillær til høst. (D) Krystallen er sekventielt gennemblødt i ascorbat blød buffer og derefter kryobeskyttende efterfulgt af flash frysning i flydende nitrogen. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 16: Grænseflade til justering af stikprøver. Krystaljustering i neutronstrålen, repræsenteret ved det blå kors, udføres ved punkt- og klikcentrering. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 17: CSS GUI for dataindsamling. Dataindsamlingsstrategien, herunder eksponeringsdoser og vinkler, uploades i CSS GUI. Efterhånden som dataindsamlingen skrider frem, vil de diffrakterede neutroner, der registreres på realtidsdetektoren, blive vist i det øverste panel. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 18: Matchende R-fri flag i CCP4. Neutrondataenes R-frie flag matches med de R-fri røntgendata, der indsamles på samme eller identiske krystal til fælles raffinement. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 19: Strukturforberedelse og raffinement. (A) Phenix ReadySet-værktøjet bruges til at tilføje dobbelt H/D-belægning på udskiftelige steder. (B) Både neutrondata og røntgendata anvendes til en fælles raffinement, mens den oprindelige inputmodel blev raffineret i forhold til røntgendatasættet indsamlet på samme krystal eller en identisk krystal. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 20: Konfiguration af raffinementsindstillinger. Raffinement model samt de nukleare afstande er konfigureret til fælles X-ray / neutron data raffinement. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 21: Datavalg til Coot modelbygning. Phenix MTZ-filudgangen, der indeholder røntgen- og ubesatte neutrondata, åbnes i Coot for at generere elektron- og neutron-SLD-kort til interaktiv modelbygning. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 22: Interaktiv modelbygning i Coot under en fælles raffinement. A) En positiv og negativ _FO-FC neutron SLD-tæthedstop (henholdsvis grøn og rød), der angiver, at vandet skal omlægges ved rotation/oversættelse. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla og _2FO-FC elektrontæthedskort vises med blåt. (B) Korrekt placeret vand. (C) En positiv _FO-FC neutron SLD kort peak (grøn) viser, at threonine skal roteres til at matche forskellen tæthed peak ved at redigere chi vinkler. (D) Korrekt orienteret threonine. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 23: Strukturforberedelse til dataraffinering, der kun er beregnet til neutron. Startkoordinatfilen er forberedt til raffinement ved fjernelse af vandatomer i PDBTools og ved tilsætning af dobbelt H/D-belægning på udskiftelige steder. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 24: Raffinement kun for neutrondata. (A) Neutrondata uploades såvel som den forberedte startmodel. (B) Indstillingerne for neutrondata raffinement bruge neutron spredning tabel.

Supplerende figur 25: Datavalg til Coot modelbygning. De ubesatte neutrondata åbnes i Coot for interaktiv modelbygning. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 26: Raffinement i Coot for deutererede restkoncentrationer. A) Positive og negative _FO-FC neutron SLD-tæthedstoppe (henholdsvis grøn og rød), hvilket indikerer, at en argininrest skal flyttes, så den passer til _{FO-FC-tætheden}. _2FO-FC neutron SLD-kortet vises i lilla og _2FO-FC elektrontæthedskort vises med blåt. (B) Udnyttelse af Real Space Forfine resulterer i "eksploderende" D-atomer på grund af manglende Coot geometri tilbageholdenhed biblioteker. (C) D-atomer bevæger sig ikke sammen med resten af restatomer. (D) D-atompositionerne kan rettes manuelt ved hjælp af en teksteditor. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 27: Tilsætning af vandmolekyler. (A) Vandmolekyler kan manuelt føjes til de positive _FO-FC neutron SLD korttæthed toppe (grøn). De indsatte vandmolekyler vil i første omgang blive repræsenteret af et O-atom i Coot. (B) Phenix ReadySet bruges til at tilføje D-atomer til O-atomer for vandmolekyler. (C) Det deutererede vandmolekyle tilsættes med succes. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 28: Forfinelsesstatistik. Endelige dataforbedringsstatistikker efter fælles røntgen/neutronfinement. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur 29: Forfinelsesstatistik. Endelige dataforbedringsstatistikker efter raffinement af neutrondata. Klik her for at downloade dette tal.

Discussion

Neutronproteinkrystallografi er en meget følsom teknik til sonde protonationstilstande og vandmolekyleoriorientering i proteiner. Disse oplysninger kaster lys over proteinkatalytiske mekanismer, da ændringer i protonerings- og hydrogenbindingsinteraktioner ofte er centrale for ^enzymkemi10. Neutronproteinkrystallografi, omend en informativ teknik, har en række faktorer, der bør tages i betragtning, før man planlægger at gennemføre et neutron diffraktionseksperiment, nemlig:

Kravet om store proteinkrystaller til dataindsamling.
Spredningsegenskaberne for brint og andre elementer, såsom metalioner.
Begrænsninger i strukturen raffinement og model bygning software, når du arbejder med deuterated prøver.

Neutronproteinkrystallografi er en flux begrænset teknik. I modsætning til røntgen diffraktion datasæt, højere R-faktorer og lavere fuldstændighed, redundans og signal-til-støj nøgletal forventes for neutron datasæt på grund af teknikken iboende begrænsninger (flux begrænset, kvasi-Laue, længere bølgelængder). Dataindsamling af en enkelt ramme er typisk 12 - 18 timer. Succes af et eksperiment er meget afhængig af prøvestørrelse og kvalitet med krystaller på 0,1 ^mm3 ofte er ^{minimumskravet3}. Neutron diffraktion kræver produktion af store mængder protein til at oprette krystallisering dråber spænder fra 10 til 800 μL. Minimumsvolumen for dyrkning af tilstrækkeligt store krystaller kan estimeres ved hjælp af en volumenberegner i betragtning af krystal- og prøveparametrene (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Vækst af store krystaller er mest udbredt blevet udført af damp ^diffusion3. Hængende dråbe krystallisering tillader vækst af krystaller i store dråber fra 10-25 μL, mens større dråber spænder op til ~ 50 μL kan sættes op ved hjælp af kommercielt tilgængelige siddende drop ^udstyr14,54. Silikone ni-brønd glasplader kan bruges til at oprette meget store dråber, med mængder op til 800 μL. Disse glasplader er placeret i "sandwich kasser" kommercielt tilgængelige fra Hampton Research. Yderligere krystalliseringsteknikker omfatter batchkrystallisering, hvor grænsen for dråbestørrelsen dikteres af fartøjet. Batch crystallisering eksperiment oprettet kan variere fra mikroliter til ^milliliter55. Krystallisering kan også udføres ved hjælp af dialyse teknik, hvor proteinet er ekvilibreret med bundfald via en dialysemembran eller ved counter-diffusion langs en bundfald koncentration gradient eller gennem en porøs stik såsom agarose56,57. Såning tilbyder et andet alternativ til at opnå krystaller af det ønskede volumen. Mikro- og makroseeding er med succes blevet anvendt til stor krystalvækst, herunder stor krystal af NcLPMO9D45. En vis viden om protein fase diagram, herunder indflydelse af temperaturen på opløselighed, støtte i stor krystal vækst.

Når du planlægger en neutron diffraktion eksperiment, optimering af proteinpræparatet for at maksimere signal-til-støj-forholdet under diffraktion dataindsamling er ^afgørende7. For at omgå densitetsreduktion og høj usammenhængende spredning forårsaget af H-atomer kan neutron SLD-kort forbedres ved at udveksle H-atomer til dets isotop D, som har en positiv sammenhængende spredningslængde og lav usammenhængende spredningslængde. For at opnå dette udføres dampudveksling af den hydrogenerede proteinkrystal mod deuterated krystalliseringsbuffer. Dette sikrer H/D udveksling af opløsningsmiddelmolekyler og labile, titratable protein H ^atomer23. Damp udveksling udføres ved montering af hydrogenerede krystal i en kvarts kapillær med _D2O-baserede, deuterated krystallisering buffer "stik", og det repræsenterer en effektiv, blid teknik, der oftest anvendes14,23,35. Udvekslingen kan tage flere uger og kræver helst, at den deutererede buffer ofte ændres for at sikre maksimal H / D-udveksling. H/D-udveksling kan også udføres ved direkte at ibløde krystallen i deuterated buffer. For at undgå at sætte krystallen under pres på grund af _{D2O-eksponering} bør blødningsprocessen udføres gradvist ved gradvist at øge _D2O:H2O-forholdet58. Ud over dette, krystallisering af hydrogeneret protein kan også udføres i deuterated buffer for H / D udveksling på labile H ^sites22,59. Det skal dog bemærkes, at _D2O-baseret buffer har en effekt på proteinopløseligheden, hvilket kræver yderligere justering af de kendte _H2O-baserede ^{betingelser3,59}. D2O-baserede buffere er også blevet observeret for at føre til mindre krystaller i nogle ^tilfælde59. Fuld udveksling af titratable og kulstofbundne H-atomer til D kan opnås ved at udtrykke proteiner i deuterated medier for at generere en perdeutereret ^prøve20. De resulterende neutron SLD-kort over den perdeutererede prøve vil blive væsentligt forbedret, hvilket ikke længere viser densitetsannullering af det hydrogenerede prøvemodstykke. Dette er gavnligt, når man karakteriserer H/D bundet på ikke-udskiftelige steder i et protein eller en cofaktor. Men, udtryk for perdeuterated protein er både høj i omkostninger og lav i ^udbytte60. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) tilbyder en deuteration facilitet for brugere, der søger at generere en perdeuterated prøve (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Perdeuterated udtryk er typisk udføres i en bioreaktor på 1 L skala giver ~ 50 mg renset ^protein61.

Efter indsamling af neutron diffraktion data, raffinement og interaktiv model bygning udføres. Raffinement kan køres ved hjælp af flere softwarepakker, herunder phenix.forfine, nCNS eller SHELXL28,31,32,33. Den Phenix suite er den mest almindeligt anvendte software til raffinement af neutron diffraktion data i forbindelse med Coot, som bruges til manuelt at bygge modellen fra neutron SLD ^kort34. Selv om både Phenix og Coot giver mulighed for behandling af neutron diffraktion data, de kan mangle visse funktioner, der er nødvendige for at behandle idiosynkrasier forbundet med neutrondata og deuterated prøver. For eksempel indeholder Coot ikke geometrioptimering for deutererede rester, hvilket kan føre til komplikationer under modelopbygning, da funktionen "Real Space Refine" resulterer i "eksploderende" rester (supplerende figur 26)⁶². Dette kan løses ved at generere tilbageholdenhed filer for alle deuterated rester. Dette er imidlertid en intensiv proces, og sådanne biblioteker er i øjeblikket ikke offentligt tilgængelige. Når du udfører forbedringer i Phenix, vil udskiftelige H / D sites i første omgang blive indstillet til 0,50 belægning for H og D. Som forbedringer udføres, vil belægningen af H og D blive raffineret i henhold til neutron SLD kort. Under interaktiv modelbygning er forskelstæthed Fo-Fc-kort meget informative til vurdering af H / D-belægninger. Kort kan bruges til at bestemme, hvilke steder der besidder høj D belægning, hvilket er særligt informativt på det aktive sted, hvor protonationstilstande er katalytisk ^relevante63. Der opstår imidlertid tvetydige situationer, når H:D belægningen er tæt på 0.70:0.30, hvilket resulterer i fuldstændig signal annullering i neutron SLD ^kort64. Det bør også tages i betragtning, at kvasi-Laue neutron datasæt ofte har fuldstændighed omkring 80%, hvilket er lavere end den rutinemæssigt observerede ≥ 98% for X-ray diffraktion data. Ved raffinering neutron diffraktion data i Phenix, de manglende observerede amplituder (_Fo) er derfor beregnet ud fra modellen til at fuldføre refleksion listen, og dermed indføre model bias. For at tage højde for denne potentielle bias "no_fill" kort bør undersøges under interaktiv model bygning i modsætning til "fyldte" kort.

Brugere kan vælge at udføre en fælles X-ray / neutron data raffinement af deres struktur, eller en neutron-data kun raffinement. Visualisering neutron SLD kort, især ved lavere opløsning, kan i første omgang være foruroligende især for et hydrogeneret protein, hvor H stadig er til stede på ikke-udskiftelige steder på trods af H / D damp udveksling. Dette resulterer i neutrontæthed kort aflysninger, hvilket giver indtryk af diskontinuerlige ^kort65,66. Indsamling af et tilsvarende røntgendatasæt supplerer med fordel disse aflysninger i en fælles raffinement (figur 13A og figur 13B). En fælles raffinement strategi indebærer typisk raffinering af protein rygrad koordinater mod X-ray data, mens neutron diffraktion data bruges til at forfine position og belægning af H / D atomer på udskiftelige ^steder28. Da indførelsen af fælles H/D-belægning på udskiftelige steder øger antallet af parametre, der raffineres, øger en fælles raffinement med røntgendata også data-til-parameter-forholdet. En fælles raffinement kræver, at et tilsvarende røntgendatasæt indsamles ved samme temperatur på samme krystal eller en krystal, der dyrkes under de samme forhold. For neutron diffraktionsdata indsamlet ved stuetemperatur (300K) bør det tilsvarende røntgendatasæt indsamles ved stuetemperatur ved hjælp af en strategi for indsamling af lavdosisdata for at begrænse strålingsskader. Perdeutererede prøver giver derimod forbedrede og kontinuerlige neutron-SLD-kort, da de ikke har samme størrelse af H/D-signalaflysning. Neutronspredningslængden af visse elementer, herunder metaller og svovl, gør dem imidlertid dårligt synlige i neutron-SLD-kort, selv om proteinet er blevet perdeutereret (figur 13C-F)¹⁸. Hvis et metal skal karakteriseres, er det bedst at udnytte røntgen diffraktion i en fælles raffinement eller anvende spektroskopiske teknikker til at supplere diffraktion eksperimenter. Datajusteringer, der kun er for neutron, udføres ofte, når neutrondatasættet har høj opløsning, eller hvis der blev anvendt et perdeutereret protein. Desuden er dataraffinering kun for neutroner særlig nyttig, hvis et protein, der er meget følsomt over for strålingsskader, undersøges, da en røntgenafledt struktur kan besidde strålingsinducerede genstande. Hvis der skal udføres en raffinement, der kun er for neutrondata, skal det undersøges, om det tilsvarende neutrondatasæt har tilstrækkelig fuldstændighed og opløsning.

ORNL tilbyder to faciliteter til indsamling af neutron diffraktionsdata: IMAGINE-strålelinjen på HFIR samt MaNDi-strålelinjen ved ^SNS36,67. Mens begge instrumenter giver effektive midler til indsamling af en neutron diffraktion datasæt anvender lignende principper, hvert instrument har unikke specifikationer, der bør tages i betragtning, når der ansøges om stråletid. IMAGINE indsamler kvasi-Laue data og er optimeret til rumtemperatur dataindsamling på krystaller med enhedsceller op til ~ 100 Å. MaNDi kan bruges til indsamling af stuetemperatur og kryo-temperatur data anvender TOF-Laue indsamling på krystaller med enhed celler op til ~ 300 Å. Før der indsamles et komplet datasæt, udføres der en test på krystallen for at evaluere kvaliteten af det opnåede diffraktionsmønster, hvor krystallen udsættes for neutronstrålen for en enkelt ramme. Hvis krystallen er af tilstrækkelig kvalitet, vil et fuldstændigt neutron diffraktionsdatasæt blive indsamlet, indekseret, integreret, skaleret og flettet i en proces svarende til røntgendatabehandling. IMAGINE gør brug af Lauegen og Lscale og MaNDi udnytter Mantid-pakken og anvender tredimensionel profiltilpasning48,50,51,68,69,70. Forskere, der bliver brugere på et af disse faciliteter, vil blive forsynet med et datasæt i MTZ- eller HKL-format til yderligere analyse.

Neutron diffraktion er en ikke-destruktiv, meget følsom teknik til sondering protonation tilstand og hydrogenbinding interaktioner af biologiske makromolekyler. Det er især nyttigt til fotofølsomme proteiner og metalloproteiner. Der skal tages hensyn til flere overvejelser vedrørende teknikken samt behandlingen af dataene, før der gennemføres et eksperiment, men resultatet giver resultater, som kan give værdifuld indsigt i den katalytiske mekanisme af proteinet af interesse. Neutronproteinkrystallografi supplerer beregningsmæssige, strukturelle, biokemiske og spektroskopiske undersøgelser, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj i biologens værktøjskasse af teknikker, der bruges til at karakterisere biologiske makromolekyler.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Proteinekspression, rensning og krystallisering eksperimenter blev udført på Center for Structural Molecular Biology (CSMB), en amerikansk Department of Energy Biological and Environmental Research User Facility på Oak Ridge National Laboratory. Neutron diffraktion data blev indsamlet på BL-11B MaNDi på Spallation Neutron Source (SNS) på ORNL, som er sponsoreret af Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Forfatterne takker Brendan Sullivan for hjælp til datareduktion. X-ray diffraktion data blev indsamlet på Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) faciliteter på North Carolina State University, som er støttet af staten North Carolina. GCS anerkender støtte til dels fra National Research Foundation (NRF), Sydafrika og Graduate Opportunities (GO!) program på ORNL. FM anerkender støtte fra USDA NIFA Hatch 211001.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length	DiaDent/DiaVet	218-292
Capillary wax	Hampton	HR4-328
CCP4		Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Curved-Tip Forceps	Mitegen	TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Four Color Mounting Clay	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector	Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris	XtaLAB Synergy-R	Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.)	Eppendorf	930001007
Microtubes volume 1.5 mL	Eppendorf	Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL	Eppendorf Research	Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL	Eppendorf Research	Z683825
Pipette Volume 10-100 μL	Eppendorf Research	Z683809
Pipette Volume 20-200 μL	Eppendorf Research	Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder	Sigma-Aldrich	P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length	Hampton	HR6-146	Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System	Olympus	SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases	Mitegen	GB-B3-R
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length	VitroCom	CV1012	Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover	Hampton	HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate	Hampton	HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D	Sigma-Aldrich	176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)	Hampton	HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL	VWR	76322-528
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL	VWR	76322-136
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL	VWR	76322-154
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL	VWR	76322-150
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL	VWR	76322-134
Wax pen	Hampton	HR4-342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Neumann, P., Tittmann, K. Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).
Pynn, R. Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).
O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
Niimura, N., Podjarny, A. Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).
Blakeley, M. P. P. Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).
Blakeley, M. P., Cianci, M., Helliwell, J. R., Rizkallah, P. J. Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).
Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).
Teixeira, S. C. M., et al. New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).
Furrer, A., Mesot, J., Strässle, T. Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).
Meilleur, F., Coates, L., Cuneo, M. J., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).
Coates, L., et al. The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).
Coates, L., Stoica, A. D., Hoffmann, C., Richards, J., Cooper, R. The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).
Koetzle, T. F., Piccoli, P. M. B., Schultz, A. J. Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).
Ng, J. D., et al. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
Sears, V. F. Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).
Weik, M., Patzelt, H., Zaccai, G., Oesterhelt, D. Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).
Helliwell, J. R. Fundamentals of neutron crystallography in structural biology. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Niimura, N., Bau, R. Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).
Hazemann, I., et al. High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).
Niimura, N., Chatake, T., Ostermann, A., Kurihara, K., Tanaka, I. High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).
Meilleur, F., Contzen, J., Myles, D. A. A., Jung, C. Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).
Bennett, B. C., Gardberg, A. S., Blair, M. D., Dealwis, C. G. On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).
Meilleur, F., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. IMAGINE: The neutron protein crystallography beamline at the high flux isotope reactor. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Wang, X. P., et al. A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802 (2018).
Wlodawer, A., Hendrickson, W. A. A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).
Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
Adams, P. D., Mustyakimov, M., Afonine, P. V., Langan, P. Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).
Liebschner, D., Afonine, P. V., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).
Afonine, P. V., Mustyakimov, M., Grosse-Kunstleve, R. W., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).
Brünger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).
Gruene, T., Hahn, H. W., Luebben, A. V., Meilleur, F., Sheldrick, G. M. Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
Lakey, J. H. Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).
Halsted, T. P., et al. Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).
Meier, K. K., et al. Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).
Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., Marletta, M. A. Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).
Walton, P. H., Davies, G. J. On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).
Bertini, L., et al. Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).
Hedegård, E. D., Ryde, U. Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).
Hangasky, J. A., Detomasi, T. C., Marletta, M. A. Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).
Bacik, J. P., et al. Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).
O'Dell, W. B., Agarwal, P. K., Meilleur, F. Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).
O'Dell, W. B., Swartz, P. D., Weiss, K. L., Meilleur, F. Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).
Meilleur, F., et al. The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).
Helliwell, J. R., et al. The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).
Nieh, Y. P., et al. Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).
Arzt, S., Campbell, J. W., Harding, M. M., Hao, Q., Helliwell, J. R. LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).
Sullivan, B., et al. Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).
Sullivan, B., et al. BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).
Blum, M. M., et al. Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).
Tomanicek, S. J., et al. Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).
Metcalfe, C., et al. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).
Hughes, R. C., et al. Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).
Bennett, B. C., Meilleur, F., Myles, D. A. A., Howell, E. E., Dealwis, C. G. Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).
Snell, E. H., et al. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
Golden, E., Attwood, P. V., Duff, A. P., Meilleur, F., Vrielink, A. Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).
Munshi, P., et al. Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).
Logan, D. T. Interactive model building in neutron macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Koruza, K., Lafumat, B., Végvári,, Knecht, W., Fisher, S. Z. Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).
Fisher, S. J., et al. Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).
Chen, J. C. H., Hanson, B. L., Fisher, S. Z., Langan, P., Kovalevsky, aY. Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).
Cuypers, M. G., et al. Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).
Coates, L., Sullivan, B. The macromolecular neutron diffractometer at the spallation neutron source. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Ren, Z., Kingman, N. G., Borgstahl, G. E. O., Getzoff, E. D., Moffat, K. Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).
Campbell, J. W., Hao, Q., Harding, M. M., Nguti, N. D., Wilkinson, C. LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).
Arnold, O., et al. Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).

Chemistry

Neutron krystallografi Dataindsamling og behandling til modellering hydrogenatomer i proteinstrukturer

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.