Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות של שבירה הידראולית על נחלים סמוכים על ידי ניתוח קהילות המים והמשקעים שלהם.
Abstract
שבירה הידראולית (HF), המכונה בדרך כלל "fracking", משתמש בתערובת של מים בלחץ גבוה, חול, וכימיקלים לשבור סלעים, שחרור נפט וגז. תהליך זה חולל מהפכה בתעשיית האנרגיה האמריקאית, שכן הוא מעניק גישה למשאבים שבעבר לא ניתן היה להשיגם וכיום מייצר שני שלישים מכלל הגז הטבעי בארצות הברית. למרות סדיקה יש השפעה חיובית על כלכלת ארה"ב, מספר מחקרים הדגישו את ההשפעות הסביבתיות המזיקות שלה. מדאיג במיוחד הוא ההשפעה של סדיקה על נחלי מי ראש, אשר חשובים במיוחד בשל השפעתם הגדולה באופן לא פרופורציונלי על בריאות קו פרשת המים כולו. החיידקים בתוך זרמים אלה יכולים לשמש כאינדיקטורים לבריאות הזרם, שכן החיידקים הקיימים והשפע שלהם בזרם מופרע צפויים להיות שונים מאלה בזרם דומה אך ללא הפרעה. לכן, פרוטוקול זה נועד להשתמש בקהילת החיידקים כדי לקבוע אם נחלים הושפעו על ידי fracking. עד לכאן, יש לאסוף משקעים ודגימות מים, מזרמים הסמוכים לפיצוח (שעלול להיות מושפע) ומעלה או בקו פרשת מים שונה של פעילות סדיקה (חד-צבעית). דגימות אלה כפופות לאחר מכן להפקת חומצת גרעין, הכנת ספריה, ורצף לחקור הרכב הקהילה מיקרוביאלית. לאחר מכן ניתן להשתמש בניתוח קורלציה ומודלים של למידת מכונה כדי לזהות אילו תכונות מסבירות את השונות בקהילה, כמו גם זיהוי סמנים ביולוגיים חזויים להשפעת הסדיקה. שיטות אלה יכולות לחשוף מגוון הבדלים בקהילות המיקרוביות בין נחלי מי ראש, בהתבסס על הקרבה לפיצוח, ולשמש בסיס לחקירות עתידיות על ההשפעה הסביבתית של פעילויות סדיקה.
Introduction
שבירה הידראולית (HF), או "סדיקה", היא שיטה להפקת גז טבעי, שהפכה נפוצה יותר ויותר ככל שהביקוש לדלקים פוסיליים ממשיך לעלות. טכניקה זו מורכבת משימוש בציוד קידוח רב עוצמה כדי להזריק תערובת של מים, חול וכימיקלים למרבצי פצלי שמן עשירים במתאן, בדרך כלל כדי לשחרר גזים לכודים1.
מכיוון שטכניקות קציר לא קונבנציונליות אלה חדשות יחסית, חשוב לחקור את ההשפעות של פרקטיקות כאלה על נתיבי מים סמוכים. פעילויות סדיקה מחייבות פינוי של חלקות גדולות של קרקע להובלת ציוד ובניית רפידות היטב. יש לפנות כ-1.2-1.7 דונם של קרקע עבור כל כרית באר2, מה שעלול להשפיע על נגר ואיכות המים של המערכת3. יש חוסר שקיפות סביב ההרכב הכימי המדויק של נוזל fracking, כולל מה biocides משמשים. בנוסף, שפכים סדוקים נוטים להיות מלוחים מאוד2. יתר על כן, השפכים עשויים להכיל מתכות וחומרים רדיואקטיביים טבעיים2. לכן, האפשרות של דליפות ושפיכות של נוזל fracking עקב טעות אנוש או תקלה בציוד הוא מדאיג.
ידוע כי מערכות אקולוגיות של נחלים רגישות מאוד לשינויים בנופים הסובביםאת 4 וחשובות לשמירה על המגוון הביולוגי5 ועל רכיבה נכונה על אופניים מזינים6 בתוך קו פרשת המים כולו. חיידקים הם האורגניזמים הנפוצים ביותר בנחלי מים מתוקים ולכן חיוניים לרכיבה על אופניים מזינים, להתכלות ולייצור ראשוני. הרכב ותפקוד קהילתי מיקרוביאלי משמשים ככלים מעולים להשגת מידע על המערכת האקולוגית בשל רגישותם להטרדות, ומחקרים שנערכו לאחרונה הראו שינויים ברורים במכלולים חיידקיים שנצפו בהתבסס על קרבה לפעילות סדיקה7,8. לדוגמה, בייג'רינקיה, Burkholderia, ומתנובקטריום זוהו כמועשרים בנחלים ליד fracking בעוד פסאודונוקרדיה, Nitrospira, ו Rhodobacter הועשרו בנחלים לא ליד fracking7.
הדור הבא של רצף ה-RNA ריבוזומלי 16S (rRNA) הוא שיטה סבירה לקביעת הרכב קהילת חיידקים מהיר וזול יותר מאשר רצף גנום שלם מתקרב9. מנהג נפוץ בתחום האקולוגיה המולקולרית הוא להשתמש באזור V4 המשתנה מאוד של גן 16S rRNA לרזולוציה רצף, לעתים קרובות עד לרמת הסוג עם היקף רחב של זיהוי 9 , כפי שהוא אידיאלי עבורדגימותסביבתיות בלתי צפויות. טכניקה זו יושמה באופן נרחב במחקרים שפורסמו ונוצלה בהצלחה כדי לזהות את ההשפעה של פעולות fracking על סביבות מימיות7,8. עם זאת, ראוי לציין כי חיידקים יש מספרי העתקה שונים של הגן 16S rRNA, אשר משפיע על השפע שזוההשלהם 10. ישנם כמה כלים להסביר את זה, אבל היעילות שלהם מוטלת בספק10. פרקטיקה נוספת הגדלה במהירות בשכיחות וחסרה חולשה זו היא רצף מטטרני, שבו כל הרנ"א רצף, ומאפשר לחוקרים לזהות הן חיידקים פעילים והן את ביטוי הגנים שלהם.
לכן, בניגוד לשיטות במחקרים שפורסמו בעבר7,8,11,12, פרוטוקול זה מכסה גם איסוף מדגמים, שימור, עיבוד וניתוח לחקירת פונקציית הקהילה המיקרוביאלית (metatranscriptomics). השלבים המפורטים כאן מאפשרים לחוקרים לראות איזו השפעה, אם בכלל, הייתה לפיצוח על הגנים והמסלולים שבאים לידי ביטוי על ידי חיידקים בזרמים שלהם, כולל גנים של התנגדות מיקרוביאלית. יתר על כן, רמת הפירוט המוצגת עבור איסוף מדגם משופרת. למרות כמה צעדים הערות עשוי להיראות ברור לחוקרים מנוסים, הם יכולים להיות לא יסולא בפז לאלה רק מתחילים מחקר.
כאן, אנו מתארים שיטות לאיסוף ועיבוד דגימות כדי ליצור נתונים גנטיים חיידקיים כאמצעי לחקור את ההשפעה של fracking על נחלים סמוכים בהתבסס על המעבדות שלנו כמה שנות ניסיון. ניתן להשתמש בנתונים אלה ביישומים במורד הזרם כדי לזהות הבדלים המתאימים למצב fracking.
Protocol
1. אוסף דגימות משקעים להפקת חומצת גרעין
- תטביע צינור חרוט סטרילי 50 מ"ל לתוך מי הנחל. ללבוש כפפות במהלך איסוף מדגם כדי למנוע החדרת זיהום אנושי לא רצוי. בצע את הצעד הזה מהחוף או עם הפנים במעלה הזרם אם במים.
- בעוד הצינור החרוט הוא שקוע, להסיר את המכסה, ולהשתמש בו כדי כ כ 3 מ"ל של משקעים מעומק של 1 עד 3 ס"מ לתוך הצינור חרוט.
- מוציאים את הצינור החרוט מהמים וזורקים את כל המים, למעט שכבה דקה המכסה את דגימת המשקעים (כ-1 מ"ל).
- באמצעות פיפטה 1000 μL וטיפים פיפטה מתאימים, להוסיף 3 מ"ל של חומר משמר DNA / RNA (ראה טבלה של חומרים עבור מפרטים משמרים) לדגימה שנאספה. שמור את קצות הפיפטה בקופסת טיפים סטרילית של פיפטה וצרף אותם רק מיד לפני השימוש ומושלך לאחר השימוש. הפוך את הצינור החרוט capped 10 פעמים כדי להבטיח את החומר המשמר ואת המדגם מעורבבים ביסודיות.
הערה שלב 1.4 אינו הכרחי, אך מומלץ מאוד אם יש לחלץ RNA מהמ משקעים מאוחר יותר. - מניחים את הדגימות על קרח לשאר איסוף הדגמים. עם החזרה מהאוסף, יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה של -20 °C (20 °F) אם יש להשתמש בדגימות לניתוח 16S (DNA), או -70 °C (70 °F), אם ישמש לניתוח metatranscriptomics (RNA).
2. אוסף מסננים להפקת חומצת גרעין
- הסר את המכסה של בקבוק סטרילי 1 L. בעת הפנייה במעלה הזרם או מהחוף, מלאו את הבקבוק במי נחל לפסגה ואז זרקו אותו. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות כדי להתנות את הבקבוק. מלאו את כל הבקבוק בפעם הרביעית וכסו אותו.
הערה: אם שימוש חוזר בבקבוק 1 L, זה יכול להיות מעוקר על ידי שטיפה עם 10% אקונומיקה במשך 2 דקות, ואחריו שטיפה שלוש פעמים עם מים deionized ולאחר מכן פעם אחת עם 70% אתנול, ולבסוף autoclaving עם הגדרות: 30 דקות זמן חשיפה ב 121 °C (121 °F) ו 15 דקות זמן ייבוש. במהלך autoclaving, המכסה על הבקבוק צריך להיות רופף מאוד כדי למנוע את הבקבוק להיות דחוס בתהליך. - פעם על משטח יציב, להשתמש מזרק מנעול Luer סטרילי לצייר נפח מלא. לאחר מכן חבר את המזרק למסנן פוליאתרסולפון סטרילי ונטול DNA/RNA בקוטר 1.7 ס"מ עם גודל נקבובית של 0.22 מיקרומטר ודחוף את כל הנפח דרך המסנן על ידי לחיצה על הבוכנה כל הדרך למטה. חזור על תהליך זה עד שהנפח הכולל שנאסף בבקבוק (1 L) נדחף דרך המסנן.
הערה: מתבצע מעקב אחר עוצמת המזרק, אם כמות המים הכוללת הנדחפת דרך המסנן. עם זאת, בדרך כלל, 60 מ"ל הוא מועדף. בעוד 1 L הוא אידיאלי, אנקדוטי, נפח של לפחות 200 מ"ל סביר עדיין לאסוף מספיק ביומסה (בהנחה ~ 20,000 תאים למ"ל) להפקת DNA ו- RNA. - הסר מים עודפים מהמסנן על ידי ציור בערך 20 מ"ל שווה של אוויר לתוך המזרק ודוחף אותו דרך המסנן.
הערה: פעולה זו תסייע במניעת אובדן החומר המשמר אם מתבצע שלב 2.4. - באמצעות מיקרופיפט P1000, הוסף 2 מ"ל של חומר משמר DNA/RNA על-ידי פריקתו דרך הפתח הגדול יותר של המסנן (שם הוא היה מחובר למזרק) תוך החזקת המסנן אופקית. קצה הפיפטה צריך להיות בתוך החבית של המסנן כאשר הפיפטה מדוכאת כדי להבטיח את החומר המשמר נכנס המסנן. שנה את הקצה לאחר כל שימוש.
הערה: כמו עם אוסף משקעים, שלב זה אינו הכרחי, אבל מומלץ בחום עבור תשואה חומצת גרעין מוגברת מאוחר יותר, במיוחד עבור RNA. - מקלפים ריבוע אחד של סרט פרפין ועוטפים אותו בחוזקה סביב כל פתח / קצה של המסנן כדי לאטום. מניחים את פילם הפרפין עטוף מסנן לתוך שקית מדגם סטרילי ולאחר מכן מניחים את כל השקית על קרח במהלך האיסוף.
הערה: ודא שהצד המשמש לעטוף את המסנן סטרילי, כלומר, לא נחשף בעבר לסביבה. - עם החזרה מדגימה, יש לאחסן מסננים ב-20 °C (70 °F) עבור 16S או -70 °C (70 °F) עבור meta-transcriptomics.
3. מיצוי וכימות של חומצות גרעין
- נקו את פינת העבודה עם 10% אקונומיקה ו-70% אתנול לפני תחילת העברת הדגימה.
- עבור משקעים (בשלב 1.5), בדרך כלל, השתמש ~ 0.25 גרם של מדגם. הלהבה מחטאת כלי מתכת על ידי טבילתו בכוס של 70% אתנול ושריפת האתנול בין הדגימות.
- עבור מסננים (בשלב 2.6), להעביר את נייר המסנן לתוך צינור סטרילי לחילוץ. כדי לעשות זאת בצע את השלבים הבאים.
- צור משטח סטרילי, DNA ו- RNA חופשי על ידי קיפול רדיד אלומיניום כך שהחלק הפנימי של הקיפול לא ייחשף לסביבה החיצונית ויעבד אוטומטית את החתיכה המקופלת עם ההגדרות: 121 °C (5 דקות) וזמן ייבוש של 5 דקות.
- לחטא אחיזת גוז עם 70% אתנול ולהבה פתוחה. לאחר מכן השתמש באחיזת המגף כדי לשבור את מעטפת המסנן על המשטח הסטרילי ולהסיר את הליבה מהמעטפת.
- השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את נייר המסנן הרחק מהליבה על ידי חיתוך בחלק העליון והתחתון ולאחר מכן לאורך התפר. מקפלים את נייר הסינון באמצעות פינצטה סטרילית ואז חותכים את המסנן לחתיכות קטנות באמצעות האזמל.
- מניחים את חתיכות המסנן בצינור microcentrifuge לחילוץ. ודא כי נייר המסנן אינו בא במגע עם משטחים שאינם מעוקרים או שיכולים להיות חומצת גרעין נוכח, כמו זה יוביל זיהום לא רצוי של המדגם.
- בצע בידוד DNA כמתואר קודם לכן13 או באמצעות ערכה מבוססת עמודה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). השלבים עבור הערכה המסחרית המפורטים מתוארים בקצרה להלן.
- Lyse התאים בתוך המדגם על ידי העברתו לצינור חרוזים וכפפתו לשבש תא במהירות גבוהה לפחות 5 דקות. צנטריפוגה ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי.
- הוסף מאגר תמיסת לסופר-נט (נפח 1:1) והעבר למסנן שסופק (צהוב). צנטריפוגה המסנן.
- מעבירים את המסנן לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש. הוסף את מאגר ההכנה (400 μL), צנטריפוגה, ולהשליך את הזרימה דרך.
- הוסף חוצץ כביסה (700 μL), צנטריפוגה, ולהשליך את הזרימה דרך. לאחר מכן להוסיף חוצץ לשטוף (400 μL), צנטריפוגה, ולהשליך את הזרימה דרך שוב.
- מעבירים את המסנן לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש. יש לברוח עם 50 μL של מים חינם DNase / RNase ולתת לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לפני centrifuging.
- במהלך זה בתקופת הקובייה, להכין את מסנן III-HRC על ידי הצבתו בצינור איסוף והוספת פתרון ההכנה HRC (600 μL) אליו, ואחריו שלב צנטריפוגה של 3 דקות ב 8,000 x g.
- מעבירים את המסנן המוכן לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. העבר את הדנ"א הנבה מהשלב 3.4.5 למסנן וצנטריפוגה זה ב 16,000 x g במשך 3 דקות. הזרימה דרך מכילה את ה- DNA שחולץ.
- לאחסן תמציות DNA עבור משקעים ומסננים ב -20 °C (70 °F).
הערה: תמציות DNA ניתן לאחסן במשך כ 8 שנים ב -20 °C (50 °F) בהנחה טמפרטורה יציבה, חשיפה לאור מוגבלת, ואין מזהמים מזיקים14. - בצע בידוד RNA בהתאם לפרוטוקול היצרן. יש לאחסן תמציות RNA ב- -80 °C (70 °F).
- ללקק את התאים בתוך המדגם על ידי העברתו לצינור חרוזים וכפפתו לשבש תא במהירות גבוהה במשך חמש דקות לפחות. צנטריפוגה ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי.
- הוסף מאגר תמיסת לסופר-טבעי (אמצעי אחסון 1:1) והעבר לעמודה שסופקה (צהוב). צנטריפוגה בעמודה.
- מוסיפים נפח שווה של 95-100% אתנול לזרימה פנימה ומערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים.
- הנח את עמוד IICG (ירוק) על צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. העבר את הפתרון המעורב לעמודה ולצנטריפוגה.
- הוסף חוצץ כביסה (400 μL), צנטריפוגה, ולהשליך את הזרימה דרך.
- הוסף 5 μL של DNase I ו 75 μL של מאגר עיכול DNA לעמוד ודגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
- הוסף מאגר הכנה (400 μL), צנטריפוגה, ולהשליך את הזרימה דרך.
- הוסף חוצץ כביסה (700 μL), צנטריפוגה, ולהשליך את הזרימה דרך. לאחר מכן להוסיף חוצץ לשטוף (400 μL), צנטריפוגה, ולהשליך את הזרימה דרך שוב.
- העבר את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש. יש לברוח עם 50 μL של מים חינם DNase / RNase ולתת לשבת במשך 5 דקות לפני centrifuging.
- במהלך תקופת הדגירה, הכינו את מסנן III-HRC על ידי הצבתו בצינור איסוף והוספת פתרון ההכנה של HRC (600 μL) אליו, ואחריו שלב צנטריפוגה של 3 דקות ב 8,000 x g.
- מעבירים את המסנן המוכן לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי. העבר את ה- RNA הנבה מהשלב 3.6.9 למסנן זה וצנטריפוגה ב- 16,000 x g למשך 3 דקות. הזרימה דרך מכילה את הרנ"א שחולץ.
הערה: ניתן לאחסן תמציות RNA רק שנה אחת לפני שהן מתחילות לבזות15. הן תמציות DNA והן RNA מושפלים על ידי הפשרת הקפאה חוזרת ונשנית. פרוטוקולים מסוימים מאפשרים הפקת DNA ו- RNA מאותה דגימה16,17.
- לכמת את דגימות הדנ"א והרנ"א שחולצו באמצעות פלואורומטר או ספקטרופוטומטר. ראה טבלה 1 לדוגמה ערכי ריכוז DNA פלואורומטר. לקבלת פרוטוקול כימות ספקטרופוטומטר לדוגמה, ראה הפניה18. ערכי ריכוז DNA משקעים עם הערכה המפורטת בטבלת החומרים נעים בדרך כלל בין 1 ל 40 ng/μL, בעוד ערכי ריכוז DNA מסנן נוטים לנוע בין 0.5 ל 10 ng/ μL. ערכי ריכוז RNA משקעים עם הערכה המפורטת בטבלת החומרים בדרך כלל נע בין סביב 1 עד 20 ng/ μL, בעוד ערכי ריכוז RNA מסנן נוטים להיות נמוכים יותר, בדרך כלל נע בין 0.5 ל 5 ng / μL.
4. יצירת ספריית rRNA 16S
- נקו את פינת העבודה עם 10% אקונומיקה ו-70% אתנול. אזור העבודה צריך להיות חלל סגור המסוגל לייצר תנאי זרימה למינאריים (מכסה המנוע של זרימת למינאר).
- השתמש בתמציות הדנ"א (החל בשלב 3.5) והכן דגימות לרצף אמפליקון 16S rRNA עם פרוטוקול PCR סטנדרטי, כגון זה המתואר באתר האינטרנט של המיקרוביום של כדור הארץ המגביר את האזור V4 hypervariable של 16S rRNA19 בתנאי זרימה למינאר.
- הכן ג'ל אגרוז 2% כפי שתואר קודם לכן ולתת לו להתמצק17. לערבב 7 μL של מוצר PCR ו 13 μL של מים חינם DNase. מוסיפים צבע טעינת ג'ל לריכוז סופי של 1x. לאחר אגרוז הוא מוצק, לטעון את זה מוצרי PCR לערבב על ג'ל אגרוז 2%.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בג'ל טרום יצוק במקום זאת, שכן ג'לים אלה פועלים מהר יותר ומגיעים מראש. - הפעל את הג'ל ב 90 V במשך 60-90 דקות כדי לבדוק את גודל הלהקה של 386 כהגברה מוצלחת עבור 16S rRNA V4 אמפליקולסון, באמצעות הפרוטוקול של כדור הארץ Microbiome.
5. טיהור ספריית RRNA DNA 16S
- בריכה 10 μL של מוצרי PCR עבור הדגימות שהניבו רצועות בהירות ו 13 μL עבור הדגימות שהניבו רצועות חלשות בצינור microcentrifuge סטרילי בגודל המתאים.
- בדוק את הריכוז של הבריכה המתקבלת באמצעות פלואורומטר או ספקטרופוטומטר ולהכין ג'ל אגרוז 2% כמו קודם. באופן אידיאלי, הבריכה צריכה להיות ריכוז של לפחות 10 ננוגרם / μL, ורוב הדגימות היו צריכות להיות ריכוז של סביב 25 ננוגרם / μL.
- ריכוז ונפח מאפשר, לטעון סביב 150-200 ננוגרם בבאר של 2% ג'ל אגרוז.
- הפעל את הג'ל במשך 60-90 דקות ב 90 וולט.
- לטהר את הספרייה במאגר על ידי הפעלת ג'ל אגרוז 2%.
- Excise את רצועת ה- DNA 386 bp מן הג'ל לטהר את הספרייה המאגדת באמצעות ערכה זמינה מסחרית כמתואר בעבר20. אלים את ה- DNA המטוהר עם 30 μL של 10 mM Tris-Cl (pH 8.5). בצע שלב זה באזור שונה מאשר DNA או מיצוי RNA כדי למנוע זיהום עתידי, כמו חיתוך הג'ל תפיץ amplicons PCR הן על הנסיין ואת הסביבה.
- בדוק את הריכוז של הבריכה המטוהרת באמצעות פלואורומטר או ספקטרופוטומטר. אם הטיהור הלך טוב, הריכוז שלו צריך להיות לפחות חצי מהבריכה הלא מנויה. בדרך כלל, הריכוז הסופי צריך לנוע בין 5 ל 20 ng / μL.
- שלח את הספריות המטוהרות עבור רצף הדור הבא. ודא כי הם נשמרים קרים במהלך ההובלה על ידי הכללת קרח יבש במיכל המשלוח.
6. יצירה וטיהור של ספריית RNA
- ניתן להשתמש במספר ערכות מסחריות ליצירת ספריות RNA. עבור כל אחד מהם משמש, בצע את פרוטוקול היצרן כפי שנכתב בעת עבודה בסביבת זרימת למינאר סטרילית. גירסה מסוכמת מאוד של הפרוטוקול לערכה בטבלת החומרים מוצגת מתחתל- 21.
- הפוך את הגדיל הראשון cDNA סינתזה תערובת מאסטר (8 μL של מים ללא נוקלאז ו 2 μL של הראשון סטרנד סינתזה Enyzme תערובת) ולהוסיף אותו לדגימה. מקם את המדגם בתרמוציקלר עם התנאים שצוינו בפרוטוקול.
- הפוך את הגדיל השני cDNA סינתזה תערובת מאסטר (8 μL של חוצץ תגובה סינתזת גדיל שני, 4 μL השני גדיל סינתזה תערובת אנזים, ו 48 μL של מים ללא נוקלאז) על קרח ולהוסיף אותו לדגימה. מניחים בתרמו-מחזור ל-16 מעלות צלזיוס למשך שעה.
- לטהר את התגובה על ידי הוספת החרוזים שסופקו (144 μL) וביצוע שני 80% שטיפה אתנול (200 μL).
- האלגנטי עם מאגר TE שסופק (53 μL) והעבר 50 μL של supernatant לצינור PCR נקי. הנח את צינור ה- PCR על קרח.
- הפוך את סוף prep תערובת מאסטר (7 μL של סוף הכנה תגובה חוצת חוצת חוצות ו 3 μL של סוף הכנה אנזימים לערבב) על קרח ולהוסיף אותו לצינור PCR. מקם את צינור ה- PCR בתרמוסקלר עם התנאים שצוינו בפרוטוקול.
- ערבבו את המתאם מדולל (2.5 μL), תערובת מאסטר קשירה (30 μL) ומשפר קשירה (1 μL) פתרונות על קרח. מוסיפים את הפתרונות המעורבים לדגימה ומניחים בתרמוציקלר למשך 15 דקות ב 20 °C (70 °F).
- לטהר את התגובה על ידי הוספת החרוזים שסופקו (87 μL) וביצוע שטיפה אתנול (200 μL) ואלוטציה כמו קודם, למעט רק להוסיף 17 μL של TE.
- הוסף מדדים (10 μL) ואת פתרון Q5 Master Mix (25 μL) והצב תרמוציקלר עם התנאים המתוארים בפרוטוקול.
- לטהר את התגובה על ידי הוספת החרוזים שסופקו (45 μL) וביצוע תוספת שתי שטיפת אתנול (200 μL) ולחמוק עם 23 μL של TE. העבר 20 μL לצינור PCR נקי.
- בדוק את הספריות עבור ריכוזים לגילוי של RNA באמצעות Bioanalyzer, פלואורומטר, או ספקטרופוטומטר.
- איחדו את הספריות המטטרניות ביחס שווימולרי בערך.
- נקה את הספריה בהתאם לאותו פרוטוקול עבור טיהור ספריית 16S, למעט מקטעי excise בין 250 ל- 400 bp. בעוד שבספריית 16S הייתה להקה נפרדת המייצגת את האזור המוגבר, התוצאה כאן היא מריחה.
- בדוק את הריכוז של הספרייה המטוהרת כמו קודם.
- שלח את הספרייה המטוהרת עם קרח יבש למתקן רצף.
הערה: לחלופין, ניתן לשלוח תמציות RNA לאוניברסיטה או לחברה פרטית להכנת הספרייה ולרצף.
7. ניתוח קהילתי מיקרוביאלי
- לאחר השלמת הרצף, גש לנתונים לדוגמה. הורד אותו למחשב שמיש.
הערה: באופן אידיאלי, המכשיר צריך להיות לפחות 16 ג'יגה בייט של זיכרון RAM. לדיון בדרישות המחשוב (עבור Qiime2), ראה https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808. - השתמש בתוכנה, כגון mothur, QIIME2 ו- R, כדי לנתח נתוני rRNA של 16S. ראה כאן https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ לקבלת ערכת לימוד לדוגמה לניתוח QIIME2 16S.
- עבור נתוני metatranscriptomics (RNA), השתמש ב- HUMAnN2 וב- ATLAS כדי לקבוע אילו גנים ומסלולים נמצאים בדגימות.
הערה: צינור metatranscriptomics לדוגמה שהגיע לשיאו בגיוון וניתוח יער אקראי מוצג בקובץ מידע משלים. כל הפקודות מופעלות באמצעות שורת פקודה, למשל, משתמשי מסוף עבור Mac.
Representative Results
ניתן להעריך את ההצלחה של עקירות DNA ו- RNA באמצעות מגוון רחב של ציוד ופרוטוקולים. בדרך כלל, כל ריכוז ניתן לזיהוי של אחד מהם נחשב מספיק כדי להסיק כי החילוץ היה מוצלח. בחינת טבלה 1 אז, כל החילוצים, למעט אחד, ייקרא מוצלח. כישלון בשלב זה נובע לעתים קרובות ביומסה ראשונית נמוכה, שימור מדגם לקוי, או טעות אנוש במהלך החילוץ. במקרה של מסננים, החילוץ עשוי להיות מוצלח גם אם הריכוז הוא מתחת לזיהוי. אם תמציות אלה אינן מניבות רצועות עבור PCR (אם עושים 16S) או ריכוז ניתן לזיהוי לאחר הכנת הספרייה (metatranscriptomics), אז הם ככל הנראה באמת להיכשל.
אם מתבצע פרוטוקול 16S, רצועות בהירות בעקבות הגברת PCR, כפי שניתן לראות בבארות 4 ו -6 באיור 1, מצביעות על הצלחה, בעוד מחסור בלהקות, כפי שניתן לראות בבארות האחרות בשורה העליונה, מצביע על כישלון. יתר על כן, פס בהיר בנתיב הג'ל המכיל בקרת PCR שלילית יצביע גם על כשל שכן זה יהיה מסוכן להניח כי הזיהום המשפיע על פקדים שליליים(ים) לא השפיע על הדגימות.
הן עבור 16S והן עבור metatranscriptomics, ניתן להעריך את הצלחת הרצף על ידי התבוננות במספר הרצפים שהושגו (איור 2). דגימות 16S צריכות למינימום של 1,000 רצפים, כאשר לפחות 5,000 הם אידיאליים(איור 2A). כמו כן, דגימות metatranscriptomics צריך להיות מינימום של 500,000 רצפים, עם לפחות 2,000,000 להיות אידיאלי(איור 2B). דגימות עם פחות רצפים מאשר מינימום אלה לא צריך לשמש עבור ניתוחים, כפי שהם לא יכולים לייצג במדויק את הקהילה החיידקית שלהם. עם זאת, דגימות הנופלות בין המינימום לאידיאל עדיין ניתן להשתמש אם התוצאות יש לפרש בזהירות רבה יותר אם דגימות רבות נופלות בטווח זה.
ההצלחה של ניתוח במורד הזרם הבא ניתן לקבוע פשוט על בסיס אם קבצי הפלט הצפויים הושגו או לא. בכל מקרה, תוכניות, כגון QIIME2 ו-R (איור 3),אמורות לאפשר הערכה של הבדלים משמעותיים פוטנציאליים בין קהילות החיידקים המבוססות על סדיקה. הנתונים עבור איור 3 התקבלו על ידי איסוף דגימות משקעים מעשרים ואחד אתרים שונים ב-13 זרמים שונים עבור 16S וניתוח מטטרן-ראת-ראולוגי. מתוך אותם עשרים ואחד אתרים, 12 מהם היו במורד הזרם של פעילות fracking מסווג HF +, ותשעה מהם היו גם במעלה הזרם של פעילות fracking או בקו פרשת מים שבו סדיקה לא התרחשה; נחלים אלה סווגו כ- HF-. מלבד נוכחות של פעילות fracking, הנחלים היו דומים אחרת.
הבדלים אלה יכולים ללבוש צורה של משמרות קומפוזיציה עקביות המבוססות על מצב סדיקה. אם זה היה המקרה, דגימות HF+ ו- HF היו צפויות להתקבץ זו מזו בחלקת PCoA, כפי שקורה באיור 3A ובאיור 3B. כדי לאשר כי משמרות לכאורה אלה אינם רק חפץ של שיטת ההסמכה, ניתוח סטטיסטי נוסף נדרש. לדוגמה, בדיקת PERMANOVA22 במטריצת המרחק שאיור 3A ואיור 3B מבוססות עליהן התגלתה קיבוץ משמעותי בהתבסס על מצב הסדיקה, כלומר ההפרדה שנצפו בעלילה עולה בקנה אחד עם הבדלים בין קהילות החיידקים של הדגימות, במקום חפץ של הסמכה. תוצאה משמעותית PERMANOVA או ANOSIM היא אינדיקציה חזקה של הבדלים עקביים בין HF + ו- HF - דגימות, אשר יצביעו על כך דגימות HF + הושפעו על ידי fracking, בעוד ערך p גבוה יצביע על כך הדגימות לא הושפעו. ניתן גם לדמיין ולהעריך נתונים מטטרניים באמצעות אותן שיטות.
בחינת תכונות דיפרנציאליות (חיידקים או פונקציות) יכולה לחשוף ראיות לכך שגם דגימות הושפעו. שיטה אחת לקביעת תכונות דיפרנציאליות היא ליצור מודל יער אקראי. ניתן להשתמש במודל היער האקראי כדי לראות עד כמה ניתן לסווג כראוי את מצב הסדיקה של הדגימות. אם המודל מבצע טוב מהצפוי במקרה, זו תהיה עדות נוספת להבדלים התלויים במצב הסדיקה. יתר על כן, המנבאים החשובים ביותר יחשפו אילו תכונות היו החשובות ביותר להבחנה נכונה של דגימות (איור 3C). תכונות אלה גם אז היו ערכים שונים באופן עקבי המבוססים על מצב fracking. לאחר שתכונות דיפרנציאליות אלה נקבעות, ניתן לסקור את הספרות כדי לראות אם הן קושרו בעבר לפיצוח. עם זאת, זה עשוי להיות מאתגר למצוא מחקרים שקבעו פונקציות דיפרנציאליות, כמו רוב השתמשו רק 16S rRNA קומפוזיציה נתונים. לכן, להערכת ההשלכות של פונקציות דיפרנציאליות, שיטה אפשרית אחת תהיה לראות אם הם היו קשורים בעבר עם עמידות פוטנציאלית biocides נפוץ נוזל fracking או אם הם יכולים לסייע בסובלנות תנאים מלוחים מאוד. יתר על כן, בחינת הפרופיל התפקודי של טקסון של עניין יכולה לחשוף ראיות להשפעת הסדיקה (איור 3D). לדוגמה, אם טקסון מזוהה כדיפרנציאלי על ידי מודל היער האקראי, פרופיל ההתנגדות האנטי מיקרוביאלית שלו בדגימות HF + ניתן להשוות לפרופיל שלו בדגימות HF ואם הם שונים מאוד, זה יכול להציע כי נוזל fracking המכיל biocides נכנס לזרם.
| דוגמהID | ריכוז (ng/μL) |
| 1 | 1.5 |
| 2 | 1.55 |
| 3 | 0.745 |
| 4 | 0.805 |
| 5 | 7.82 |
| 6 | 0.053 |
| 7 | 0.248 |
| 8 | 0.945 |
| 9 | 1.82 |
| 10 | 0.804 |
| 11 | 0.551 |
| 12 | 1.69 |
| 13 | 4.08 |
| 14 | Below_Detection |
| 15 | 7.87 |
| 16 | 0.346 |
| 17 | 2.64 |
| 18 | 1.15 |
| 19 | 0.951 |
טבלה 1: ריכוזי DNA לדוגמה המבוססים על פלואורומטר 1x DS DNA רגישות גבוהה . עקירות עבור כל הדגימות האלה, למעט 14, ייחשב מוצלח בשל שיש כמויות לגילוי של DNA.
איור 1:ג'ל אלקטרוני לדוגמה עם מוצרי PCR. הג'ל היה מוכתם מראש ודמיינו תחת אור UV, מה שגרם לכל DNA הנוכחי עליו לזהור. PCR עבד עבור הדגימות בבארות 4 ו 6 בשורה הראשונה, שכן לשניהם הייתה רצועה בהירה אחת בגודל הצפוי (בהתבסס על הסולם). PCR עבור הדגימות בשש בארות האחרות נכשל, כפי שהם לא לייצר כל להקות. השליטה החיובית (טוב ראשונה, שורה שנייה) הייתה להקה בהירה, המציין כי PCR בוצע כראוי, ואת הפקדים השליליים (בארות 6 ו 7, שורה שנייה) לא היו כל רצועות, המציין כי דגימות לא היו מזוהמות. אם שלילי היה להקה בהירה כמו הדגימות, PCR היה נחשב כישלון שכן זה יהיה מסוכן להניח כי הדגימות היו amplicons כי לא היו רק תוצאה של זיהום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: רצף לדוגמה סופר. (A) 16S רצף דוגמאות נחשב. כמעט לכל דגימות 16S אלה היו מעל 1,000 רצפים. יש להחריג את המעטים שהיו להם פחות מ-1,000 רצפים מניתוחים במורד הזרם, מכיוון שלא היו להם רצפים מספיקים כדי לייצג במדויק את קהילות החיידקים שלהם. בכמה רצפים היו בין 1,000 ל-5,000 רצפים; אמנם לא אידיאלי, הם עדיין יהיו שמיש שכן הם עולים על המינימום החשוף, ורוב הדגימות עולה על המינימום האידיאלי של 5,000 גם כן. (ב)דוגמה של מטטרן- כתבות נחשבת. כל הדגימות חרגו הן ממספר הרצפים המינימלי (500,000) והן ממספר המינימום האידיאלי (2,000,000) של רצפים. לכן, הרצף הצליח עבור כולם, וכולם יכולים לשמש בניתוח במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח לדוגמה. (A)התוויית PCoA המבוססת על קואורדינטות שחושבו באמצעות מטריצת מרחק חד-גזעית משוקללת שנוצרה וחושאתה באמצעות QIIME2. (B)התוויית PCoA המבוססת על קואורדינטות שחושבו עם מטריצת המרחק המשוקלל של איחוד משוקלל שיוצאת מ- QIIME2. הקואורדינטות הוצגו באמצעות חבילות Phyloseq ו- ggplot2 בווקטורים R. Metadata הותקנו לחלקה באמצעות החבילה הטבעונית. כל נקודה מייצגת את קהילת החיידקים של הדגימה, עם נקודות קרובות יותר המצביעות על הרכבים קהילתיים דומים יותר. קיבוץ באשכולות בהתבסס על מצב fracking עבור דגימות משקעים אלה 16S נצפתה (PERMANOVA, p = 0.001). יתר על כן, הווקטורים חושפים כי דגימות HF + נטו להיות רמות גבוהות יותר של בריום, ברומיד, ניקל, ואבץ, אשר תואמים הרכב קהילת חיידקים שונים לעומת דגימות HF. (C)עלילה של המנבאים הטובים ביותר למודל יער אקראי שבדק היכן ניתן להשתמש בשפע חיידקי כדי לחזות מצב סדיקה בין הדגימות. מודל היער האקראי נוצר באמצעות R באמצעות חבילת היער האקראית. 20 המנבאים המובילים מוצגים, כמו גם את הירידה המתקבלת בזומאה (מדד של מספר HF + ו- HF - דגימות מקובצים יחד) בצורה של ירידה ממוצעת במדד ג'יני כאשר הם מנוצלים לדגימות נפרדות. (D)תרשים עוגה המציג את פרופיל ההתנגדות האנטי-מיקרוביאלית של פרופיל Burkholderiales המבוסס על נתונים metatranscriptomic. רצפים היו תחילה ביאורים עם Kraken2 כדי לקבוע לאיזה מסה הם שייכים. BLAST שימש אז עם רצפים מבואורים אלה ואת מסד הנתונים MEGARes 2.0 כדי לקבוע אילו גנים התנגדות מיקרוביאלית (בצורה של "MEG_#") היו מבוטאים באופן פעיל. גנים של התנגדות מיקרוביאלית שבאו לידי ביטוי על ידי חברי Burkholderiales חולצו אז כדי לראות אילו מהם היו הנפוצים ביותר בקרב מסה זו. בעוד יקר יותר וגוזל זמן רב יותר, metatranscriptomics מאפשר ניתוחים פונקציונליים, כגון זה אשר לא ניתן לעשות עם נתונים 16S. ראוי לציין, Kraken2 שימש לניתוח לדוגמה זו, במקום HUMAnN2. Kraken2 מהיר יותר מ HUMAnN2; עם זאת, הוא מפיק רק מידע קומפוזיציה, במקום קומפוזיציה, תרומה ופונקציות (גנים) ומסלולים כמו HUMAnN2 עושה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים: דוגמה לצינור metatranscriptomics. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
השיטות המתוארות במאמר זה פותחו ושוכללו במהלך מספר מחקרים שפרסמה הקבוצה שלנו בין השנים 2014-20187,8,10 והועסקו בהצלחה בפרויקט שיתופי כדי לחקור את ההשפעות של סדיקה על קהילות מימיות בפרויקט בן שלוש שנים שיגיש בקרוב מאמר לפרסום. שיטות אלה ימשיכו להיות מנוצלות במהלך המשך הפרויקט. בנוסף, ספרות עדכנית אחרת החוקרת את ההשפעה של סדיקה על נחלים ומערכות אקולוגיות מתארות שיטות דומות לאיסוף, עיבוד וניתוח מדגם7,8,10,11. עם זאת, אף אחד מהניירות הללו לא השתמש בניתוח metatranscriptomic, מה שהופך את המאמר הזה הראשון לתאר כיצד ניתן להשתמש בניתוחים אלה כדי להבהיר את השפעת הסדיקה על נחלים סמוכים. יתר על כן, השיטות המוצגות כאן לאיסוף דוגמאות מפורטות יותר, כמו גם הצעדים שננקטו כדי למנוע זיהום.
אחד הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקול שלנו הוא איסוף ושימור מדגמים ראשוניים. דגימת שטח ואיסוף מגיע עם אתגרים מסוימים, כמו שמירה על סביבה אספטית או סטרילית במהלך האיסוף יכול להיות קשה. במהלך שלב זה, זה חיוני כדי למנוע דגימות מזהמות. כדי לעשות זאת, כפפות צריך להיות משוחק, ורק מכולות סטריליות וכלים צריך להיות מותר לבוא במגע עם דגימות. דגימות צריך גם להיות ממוקם מיד על קרח לאחר איסוף כדי להקל על השפלת חומצת גרעין. הוספת חומר משמר חומצת גרעין מסחרי על גבי האוסף יכול גם להגדיל את תפוקת חומצת גרעין ולאפשר דגימות להיות מאוחסן לתקופות ארוכות יותר של זמן לאחר האיסוף. בכל פעם מיצוי חומצת גרעין מבוצע, חשוב להשתמש בכמות המתאימה של מדגם, יותר מדי יכול לסתום מסנני ספין המשמשים לחילוץ (עבור אותם פרוטוקולים שעושים בהם שימוש) אבל מעט מדי יכול לגרום לתפוקות נמוכות. הקפד לבצע את ההוראות עבור כל ערכה בשימוש.
בדומה לאיסוף שדה, הימנעות או מזעור זיהום חשוב גם במהלך מיצוי חומצת גרעין והכנת מדגם, במיוחד כאשר עובדים עם דגימות תפוקת חומצת גרעין נמוכה, כגון דגימות משקעים תת-אופטימליים (דגימות המכילות כמות גדולה של חצץ או סלעים) או דגימות מים. לכן, כמו עם איסוף מדגם, כפפות יש ללבוש במהלך כל השלבים האלה כדי להפחית את הזיהום. בנוסף, כל משטחי העבודה המשמשים במהלך הליכי מעבדה צריך להיות מעוקר מראש על ידי ניגוב עם פתרון אקונומיקה 10%, ואחריו פתרון אתנול 70%. עבור צעדי צנרת (3-6), יש להשתמש בטיפים לסינון כדי למנוע זיהום עקב הפיפטה עצמה, עם טיפים משתנים בכל פעם שהם נוגעים במשטח לא סטרילי. יש לנגב את כל הכלים המשמשים לעבודות מעבדה, כולל פיפטות, לפני ואחרי עם פתרונות אקונומיקה ואתנול. כדי להעריך זיהום, ריקים מיצוי ושליליות (נוזל סטרילי) צריך להיכלל במהלך כל קבוצה של עקירות חומצת גרעין ותגובות PCR. אם כימות לאחר עקירות חושף כמות ניתנת לזיהוי של DNA / RNA בשליליות, עקירות ניתן לחזור על אם יש מדגם מספיק עזב. אם דגימות שליליות עבור PCR להראות הגברה, פתרון בעיות צריך להתבצע כדי לקבוע את המקור ולאחר מכן הדגימות יש להפעיל מחדש. כדי להסביר רמות נמוכות של זיהום, מומלץ כי ריקים החילוץ ו PCR שלילי להיות רצף, כך המזהמים ניתן לזהות ולהסיר, במידת הצורך, במהלך ניתוח חישובי. לעומת זאת, הגברה PCR יכול להיכשל גם בשל מגוון רחב של סיבות. עבור דגימות סביבתיות, עיכוב תגובת PCR הוא לעתים קרובות האשם, אשר יכול להיות בשל מגוון רחב של חומרים מפריעים טאק פולימראז23. אם יש חשד לעיכוב, ניתן להשתמש במים בדרגתPCR (ראה טבלת חומרים) כדי לדלל את תמציות ה- DNA.
לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות בולטות וקשיים פוטנציאליים. איסוף דוגמאות יכול להיות מאתגר הן עבור דגימות מים והן עבור משקעים. על מנת לקבל מספיק ביומסה, באופן אידיאלי 1 ליטר של מי נחל צריך להידחף דרך מסנן. הנקבוביות של המסנן צריכות להיות קטנות כדי ללכוד חיידקים, אך יכולות גם ללכוד משקעים. אם הרבה משקעים הוא במים בשל הגשמים האחרונים, המסנן יכול לסתום מה שמקשה לדחוף את כל הנפח דרך המסנן. עבור איסוף משקעים, זה יכול להיות מאתגר להעריך את עומק המ משקעים במהלך האיסוף. יתר על כן, חשוב לוודא כי המשקעים שנאספו הוא בעיקר אדמה, כמו חלוקי נחל וסלעים יוביל תשואה נמוכה יותר של חומצת גרעין ולא יכול להיות ייצוג מדויק של הקהילה המיקרוביאלית. לבסוף, זה חיוני גם כי דגימות נשמרים על קרח לאחר איסוף, במיוחד אם חומר משמר אינו בשימוש.
למרות פרוטוקול זה מכסה הן metatranscriptomics ו 16S פרוטוקולי מעבדה, יש להדגיש כי שתי שיטות אלה שונות מאוד הן בתהליך והן בסוג הנתונים שהם מספקים. הגן 16S rRNA הוא אזור ממוקד בדרך כלל, שמור מאוד בחיידקים ו archaea, ושימושי לאפיון הקהילה החיידקית במדגם. למרות גישה ממוקדת וספציפית, רזולוציית רמת המינים היא לעתים קרובות בלתי מושגת, ואפיון מינים או זנים חדשים שהתפצלו קשה. לעומת זאת, metatranscriptomics היא גישה רחבה יותר הלוכדת את כל הגנים והמיקרואורגניזמים הפעילים הקיימים בתוך מדגם. בעוד ש- 16S מספק נתונים בלבד לזיהוי, metatranscriptomics יכול לספק נתונים פונקציונליים כגון גנים מבוטאים ומסלולים מטבוליים. שניהם בעלי ערך וכאשר הם משולבים, הם יכולים לחשוף אילו חיידקים קיימים ובאיו גנים הם מבטאים.
מאמר זה מתאר שיטות לאיסוף שדות ועיבוד מדגמי עבור ניתוחי 16S rRNA ו- metatranscriptomic בהקשר של לימוד fracking. בנוסף, הוא מפרט שיטות איסוף עבור DNA / RNA באיכות גבוהה מדגימות ביומסה נמוכה לאחסון לטווח ארוך. השיטות המתוארות כאן הן שיאן של החוויות שלנו עם איסוף ועיבוד דגימות במאמצינו ללמוד כיצד סדיקה משפיעה על נחלים סמוכים באמצעות בחינת המבנה והתפקוד של קהילות המיקרואורגניזמים שלהם. חיידקים מגיבים במהירות להפרעות, וכתוצאה מכך, אילו חיידקים קיימים והגנים שהם מבטאים יכולים לספק מידע על ההשפעות של סדיקה על מערכות אקולוגיות. באופן כללי, שיטות אלה יכולות להיות יקרות ערך בהבנתנו כיצד סדיקה משפיעה על מערכות אקולוגיות חשובות אלה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר במקורות המימון של הפרויקטים שהובילו לפיתוח שיטות אלה, כאשר מקורות אלה הם: המכון הרפואי הווארד יוז (http://www.hhmi.org) באמצעות תוכנית חינוך מדעית Precollege ותואר ראשון, כמו גם על ידי הקרן הלאומית למדע (http://www.nsf.gov) באמצעות פרסי NSF DBI-1248096 ו- CBET-1805549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
| Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
| DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
| DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
| DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
| Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
| PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
| TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
| 1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
| 2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
| 50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
| 500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
| Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
| Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
| Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
| Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
| Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
| Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
| Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
| Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
| Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
| Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
| Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
| Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
| Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
| Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
| Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
| Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
| Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
| Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
| Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
| Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
| PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
| Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
| Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
| Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
| PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
| Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
| Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
| Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
| Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
| Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
| WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
| ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |
References
- The process of unconventional natural gas production. US EPA. , Available from: https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production (2013).
- Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats. Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).
- McBroom, M., Thomas, T., Zhang, Y. Soil erosion and surface water quality impacts of natural gas development in East Texas, USA. Water. 4 (4), 944-958 (2012).
- Maloney, K. O., Weller, D. E. Anthropogenic disturbance, and streams: land use and land-use change affect stream ecosystems via multiple pathways. Freshwater Biology. 56 (3), 611-626 (2011).
- Meyer, J. L., et al. The contribution of headwater streams to biodiversity in river networks1. JAWRA Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 86-103 (2007).
- Alexander, R. B., Boyer, E. W., Smith, R. A., Schwarz, G. E., Moore, R. B. The role of headwater streams in downstream water quality. Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 41-59 (2007).
- Ulrich, N., et al. Response of aquatic bacterial communities to hydraulic fracturing in Northwestern Pennsylvania: A five-year study. Scientific Reports. 8 (1), 5683 (2018).
- Chen See, J. R., et al. Bacterial biomarkers of Marcellus shale activity in Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 9, 1697 (2018).
- Rausch, P., et al. Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms. Microbiome. 7 (1), 133 (2019).
- Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem. Microbiome. 6 (1), 41 (2018).
- Trexler, R., et al. Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 5, 522 (2014).
- Mumford, A. C., et al. Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).
- JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/cn/science-education/10814/dna-isolation (2020).
- Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT. , Available from: https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality (2011).
- ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html (2020).
- QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation (2020).
- ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research. , Available from: https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit (2020).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- 16S Illumina amplicon protocol: Earth microbiome project. Earth microbiome project. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2018).
- Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/5063/gel-purification (2020).
- New England Biolabs protocol for the use with NEBNext Poly(A) mRNA magnetic isolation module (E7490) and NEBNext Ultra II RNA library prep kit for Illumina (E7770, E7775). New England Biolabs. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki (2020).
- Anderson, M. J. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA). Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
