Summary
Aquí, presentamos un protocolo para investigar los impactos de la fracturación hidráulica en arroyos cercanos mediante el análisis de sus comunidades microbianas de agua y sedimentos.
Abstract
La fracturación hidráulica (HF), comúnmente llamada "fracking", utiliza una mezcla de agua a alta presión, arena y productos químicos para fracturar rocas, liberando petróleo y gas. Este proceso revolucionó la industria energética de los Estados Unidos, ya que da acceso a recursos que antes no se pueden obtener y ahora produce dos tercios del gas natural total en los Estados Unidos. Aunque el fracking ha tenido un impacto positivo en la economía de los Estados Unidos, varios estudios han destacado sus efectos ambientales perjudiciales. De particular preocupación es el efecto del fracking en los arroyos de cabecera, que son especialmente importantes debido a su impacto desproporcionadamente grande en la salud de toda la cuenca. Las bacterias dentro de esas corrientes se pueden utilizar como indicadores de la salud de la corriente, ya que se esperaría que las bacterias presentes y su abundancia en una corriente perturbada difieran de las de una corriente comparable pero no perturbada. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo utilizar la comunidad bacteriana para determinar si las corrientes se han visto afectadas por el fracking. Con este fin, se deben recolectar muestras de sedimentos y agua de arroyos cercanos al fracking (potencialmente afectados) y aguas arriba o en una cuenca diferente de la actividad de fracking (sin impacto). Esas muestras se someten a extracción de ácido nucleico, preparación de bibliotecas y secuenciación para investigar la composición de la comunidad microbiana. Posteriormente, el análisis correlacional y los modelos de aprendizaje automático se pueden emplear para identificar qué características son explicativas de variación en la comunidad, así como la identificación de biomarcadores predictivos para el impacto del fracking. Estos métodos pueden revelar una variedad de diferencias en las comunidades microbianas entre las corrientes de cabecera, basadas en la proximidad al fracking, y servir como base para futuras investigaciones sobre el impacto ambiental de las actividades de fracking.
Introduction
La fracturación hidráulica (HF), o "fracking", es un método de extracción de gas natural, que se ha vuelto cada vez más frecuente a medida que la demanda de combustibles fósiles continúa aumentando. Esta técnica consiste en utilizar equipos de perforación de alta potencia para inyectar una mezcla de agua, arena y productos químicos en depósitos de esquisto ricos en metano, generalmente para liberar gases atrapados1.
Debido a que estas técnicas de cosecha no convencionales son relativamente nuevas, es importante investigar los efectos de tales prácticas en las vías fluviales cercanas. Las actividades de fracking exigen la limpieza de grandes extensiones de tierra para el transporte de equipos y la construcción de plataformas de pozos. Aproximadamente 1.2-1.7 hectáreas de tierra deben ser despejadas para cada pozo de la plataforma2,lo que podría afectar la escorrentía y la calidad del agua del sistema3. Existe una falta de transparencia en torno a la composición química exacta del fluido de fracking, incluidos los biocidas que se utilizan. Además, las aguas residuales del fracking tienden a ser altamente salinas2. Además, las aguas residuales pueden contener metales y sustancias radiactivas naturales2. Por lo tanto, la posibilidad de fugas y derrames de fluido de fracking debido a un error humano o mal funcionamiento del equipo es preocupante.
Se sabe que los ecosistemas de arroyos son muy sensibles a los cambios en los paisajes circundantes4 y son importantes para mantener la biodiversidad5 y el ciclo adecuado de nutrientes6 dentro de toda la cuenca. Los microbios son los organismos más abundantes en las corrientes de agua dulce y, por lo tanto, son esenciales para el ciclo de nutrientes, la biodegradación y la producción primaria. La composición y función de la comunidad microbiana sirven como grandes herramientas para obtener información sobre el ecosistema debido a su sensibilidad a la perturbación, y la investigación reciente ha demostrado distintos cambios en los ensamblajes bacterianos observados en función de la proximidad a la actividad de fracking7,8. Por ejemplo, Beijerinckia, Burkholderiay Methanobacterium se identificaron como enriquecidos en arroyos cercanos al fracking, mientras que Pseudonocardia, Nitrospiray Rhodobacter se enriquecieron en los arroyos no cerca del fracking7.
La secuenciación de próxima generación del gen 16S de ARN ribosómico (ARNr) es un método asequible para determinar la composición de la comunidad bacteriana que es más rápido y más barato que los enfoques de secuenciación del genoma completo9. Una práctica común dentro del campo de la ecología molecular es utilizar la región V4 altamente variable del gen 16S rRNA para la resolución de secuenciación, a menudo hasta el nivel de género con un amplio alcance de identificación9,ya que es ideal para muestras ambientales impredecibles. Esta técnica se ha implementado ampliamente en estudios publicados y se ha utilizado con éxito para identificar el impacto de las operaciones de fracking en los ambientes acuáticos7,8. Sin embargo, vale la pena señalar que las bacterias tienen números de copias variables del gen 16S rRNA, lo que afecta sus abundancias detectadas10. Hay algunas herramientas para explicar esto, pero su eficacia es cuestionable10. Otra práctica que está creciendo rápidamente en prevalencia y carece de esta debilidad es la secuenciación metatranscriptómica, en la que se secuencia todo el ARN, lo que permite a los investigadores identificar tanto las bacterias activas como la expresión de sus genes.
Por lo tanto, a diferencia de los métodos en estudios publicados anteriormente7,8,11,12, este protocolo también cubre la recolección de muestras, preservación, procesamiento y análisis para investigar la función de la comunidad microbiana (metatranscriptómica). Los pasos detallados en este documento permiten a los investigadores ver qué impacto, si lo hay, ha tenido el fracking en los genes y las vías expresadas por los microbios en sus corrientes, incluidos los genes de resistencia a los antimicrobianos. Además, se mejora el nivel de detalle presentado para la recolección de muestras. Aunque varios de los pasos y notas pueden parecer obvios para los investigadores experimentados, podrían ser invaluables para aquellos que recién comienzan la investigación.
Aquí, describimos métodos para la recolección y procesamiento de muestras para generar datos genéticos bacterianos como un medio para investigar el impacto del fracking en arroyos cercanos basados en los varios años de experiencia de nuestros laboratorios. Estos datos se pueden utilizar en aplicaciones posteriores para identificar las diferencias correspondientes al estado del fracking.
Protocol
1. Recogida de muestras de sedimentos para la extracción de ácidos nucleicos
- Sumergir un tubo cónico estéril de 50 ml en el agua de la corriente. Use guantes durante la recolección de muestras para evitar la introducción de contaminación humana no deseada. Realice este paso ya sea desde la orilla o mirando río arriba si está en el agua.
- Mientras el tubo cónico está sumergido, retire la tapa y úselo para recoger aproximadamente 3 ml de sedimento de una profundidad de 1 a 3 cm en el tubo cónico.
- Retire el tubo cónico del agua y vierta toda el agua, excepto una capa delgada que cubra la muestra de sedimento (aproximadamente 1 ml).
- Utilizando una pipeta de 1000 μL y puntas de pipeta apropiadas, agregue 3 ml de conservante de ADN/ARN (consulte la Tabla de materiales para las especificaciones del conservante) a la muestra recolectada. Mantenga las puntas de la pipeta en una caja de punta de pipeta estéril y solo conéctelas inmediatamente antes de su uso y deséchelas después de su uso. Invierta el tubo cónico tapado 10 veces para garantizar que el conservante y la muestra se mezclen a fondo.
NOTA El paso 1.4 no es necesario, pero se recomienda encarecidamente si el ARN se va a extraer de los sedimentos más adelante. - Coloque las muestras en hielo para el resto de la recolección de muestras. Al regresar de la recolección, almacenar en un congelador a -20 °C si las muestras se van a utilizar para el análisis 16S (ADN), o -70 °C, si se van a utilizar para el análisis metatranscriptómico (ARN).
2. Recolección de filtros para la extracción de ácidos nucleicos
- Retire la tapa de una botella estéril de 1 L. Mientras mira río arriba o desde la orilla, llene la botella con agua de arroyo hasta la parte superior y luego vásquela. Repita este proceso dos veces más para acondicionar la botella. Llene toda la botella por cuarta vez y colmo.
NOTA: Si reutiliza una botella de 1 L, se puede esterilizar enjuagando con lejía al 10% durante 2 min, seguido de enjuagar tres veces con agua desionizada y luego una vez con etanol al 70%, y finalmente en autoclave con ajustes: 30 min de tiempo de exposición a 121.1 ° C y 15 min de tiempo de secado. Durante el autoclave, la tapa de la botella debe estar muy suelta para evitar que la botella se comprima en el proceso. - Una vez en una superficie estable, use una jeringa de bloqueo Luer estéril y extraiga un volumen completo. Luego conecte la jeringa a un filtro de polietersulfona estéril y libre de ADN / ARN de 1,7 cm de diámetro con un tamaño de poro de 0,22 μm y empuje todo el volumen a través del filtro presionando el émbolo hacia abajo. Repita este proceso hasta que el volumen total recogido en la botella (1 L) se empuje a través del filtro.
NOTA: El volumen de la jeringa puede ser variable, si se rastrea la cantidad total de agua empujada a través del filtro. Sin embargo, en general, se prefieren 60 ml. Si bien 1 L es ideal, anecdóticamente, un volumen de al menos 200 ml probablemente aún recolectaría suficiente biomasa (suponiendo ~ 20,000 células por ml) para la extracción de ADN y ARN. - Elimine el exceso de agua del filtro extrayendo aproximadamente 20 ml de aire en la jeringa y empujándola a través del filtro.
NOTA: Esto ayudará a prevenir la pérdida del conservante si se realiza el paso 2.4. - Usando una micropipeta P1000, agregue 2 ml de un conservante de ADN / ARN descargándolo a través de la abertura más grande del filtro (donde estaba unido a la jeringa) mientras sostenía el filtro horizontalmente. La punta de la pipeta debe estar dentro del barril del filtro cuando la pipeta se presiona para garantizar que el conservante entre en el filtro. Cambie la punta después de cada uso.
NOTA: Al igual que con la recolección de sedimentos, este paso no es necesario, pero se recomienda encarecidamente para aumentar el rendimiento de ácidos nucleicos más adelante, especialmente para el ARN. - Despegue un cuadrado de película de parafina y envuélvalo firmemente alrededor de cada abertura / extremo del filtro para sellar. Coloque el filtro envuelto en película de parafina en una bolsa de muestra estéril y luego coloque toda la bolsa sobre hielo durante la recolección.
NOTA: Asegúrese de que el lado utilizado para envolver el filtro sea estéril, es decir, no expuesto previamente al medio ambiente. - A la vuelta del muestreo, almacene los filtros a -20 °C para 16S o -70 °C para meta-transcriptómica.
3. Extracción y cuantificación de ácidos nucleicos
- Limpie el área de trabajo con 10% de lejía y 70% de etanol antes de comenzar la transferencia de muestras.
- Para sedimentos (a partir del paso 1.5), generalmente, use ~ 0.25 g de muestra. Esterilizar con llama una herramienta de metal sumergiéndola en un beaker de etanol al 70% y quemando el etanol entre muestras.
- Para los filtros (a partir del paso 2.6), mueva el papel de filtro a un tubo estéril para su extracción. Para hacerlo, siga los pasos a continuación.
- Cree una superficie libre de ADN y ARN estéril doblando papel de aluminio para que la parte interna del pliegue no esté expuesta al entorno exterior y autoclave la pieza plegada con los ajustes: 121.1 ° C y 5 min de tiempo de secado.
- Esterilizar un vise-grip con etanol al 70% y una llama abierta. A continuación, utilice la empuñadura para abrir la carcasa del filtro en la superficie estéril y retire el núcleo de la carcasa.
- Use un bisturí estéril para cortar el papel de filtro lejos del núcleo cortando en la parte superior e inferior y luego a lo largo de la costura. Doble el papel de filtro con pinzas estériles y luego corte el filtro en trozos pequeños con el bisturí.
- Coloque las piezas del filtro en un tubo de microcentrífuga para su extracción. Asegúrese de que el papel de filtro no entre en contacto con ninguna superficie que no esté esterilizada o que pueda tener ácido nucleico presente, ya que esto conduciría a una contaminación no deseada de la muestra.
- Realizar el aislamiento de ADN como se describió anteriormente13 o mediante el uso de un kit basado en columnas disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales). Los pasos para el kit comercial enumerados se describen brevemente a continuación.
- Lise las células dentro de la muestra transfirísquela a un tubo de perlas y sometándola a un disruptor celular a alta velocidad durante al menos 5 minutos. Centrifugar y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril.
- Agregue el tampón de lisis al sobrenadante (volumen 1: 1) y transfiéralo al filtro proporcionado (amarillo). Centrifugar el filtro.
- Transfiera el filtro a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Agregue el tampón de preparación (400 μL), centrífuga y deseche el flujo.
- Agregue el tampón de lavado (700 μL), centrífuga y deseche el flujo. Luego agregue el tampón de lavado (400 μL), centrífuga y deseche el flujo nuevamente.
- Transfiera el filtro a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Elute con 50 μL de agua libre de DNasa/RNasa y dejar reposar durante 5 min a temperatura ambiente antes de centrifugar.
- Durante ese período de cubación, prepare el filtro III-HRC colocándolo en un tubo de recolección y agregándole la solución de preparación HRC (600 μL), seguido de un paso de centrifugación de 3 min a 8,000 x g.
- Mueva el filtro preparado a un tubo de microcentrífuga estéril. Transfiera el ADN eluido del paso 3.4.5 a este filtro y centrífuga a 16.000 x g durante 3 min. El flujo a través contiene el ADN extraído.
- Almacene extractos de ADN tanto para sedimentos como para filtros a -20 °C.
NOTA: Los extractos de ADN se pueden almacenar durante unos 8 años a -20 °C asumiendo una temperatura estable, una exposición limitada a la luz y sin contaminantes dañinos14. - Realice el aislamiento de ARN según el protocolo del fabricante. Conservar los extractos de ARN a -80 °C.
- Lise las células dentro de la muestra transfirísquela a un tubo de perlas y sometúyla a un disruptor celular a alta velocidad durante al menos cinco minutos. Centrifugar y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril.
- Agregue el búfer de lisis al sobrenadante (volumen 1:1) y transfiéralo a la columna proporcionada (amarillo). Centrifugar la columna.
- Agregue un volumen igual de etanol 95-100% al flujo y mezcle canalizando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.
- Coloque la columna IICG (verde) sobre un tubo de microcentrífuga estéril. Transfiera la solución mixta a la columna y la centrífuga.
- Agregue el tampón de lavado (400 μL), centrífuga y deseche el flujo.
- Añadir 5 μL de DNasa I y 75 μL de tampón de digestión de ADN a la columna e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Agregue el búfer de preparación (400 μL), centrífuga y deseche el flujo.
- Agregue el tampón de lavado (700 μL), centrífuga y deseche el flujo. Luego agregue el tampón de lavado (400 μL), centrífuga y deseche el flujo nuevamente.
- Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Elute con 50 μL de agua libre de DNasa/RNasa y dejar reposar durante 5 min antes de centrifugar.
- Durante ese período de incubación, prepare el filtro III-HRC colocándolo en un tubo de recolección y agregándole la solución de preparación HRC (600 μL), seguido de un paso de centrifugación de 3 min a 8,000 x g.
- Mueva el filtro preparado a un tubo de microcentrífuga estéril. Transfiera el ARN eluido del paso 3.6.9 a este filtro y centrífuga a 16.000 x g durante 3 min. El flujo a través contiene el ARN extraído.
NOTA: Los extractos de ARN solo se pueden almacenar durante un año antes de que comiencen adegradarse 15. Tanto los extractos de ADN como los de ARN se degradan por congelación y descongelación repetida. Algunos protocolos permiten la extracción tanto de ADN como de ARN de la misma muestra16,17.
- Cuantificar las muestras de ADN y ARN extraídas utilizando un fluorómetro o un espectrofotómetro. Véase la Tabla 1, por ejemplo, los valores de concentración de ADN del fluorómetro. Para un ejemplo de protocolo de cuantificación de espectrofotómetros, véase la referencia18. Los valores de concentración de ADN de sedimentos con el kit enumerados en la Tabla de materiales generalmente varían de 1 a 40 ng / μL, mientras que los valores de concentración de ADN de filtro tienden a variar de 0.5 a 10 ng / μL. Los valores de concentración de ARN de sedimentos con el kit enumerado en la Tabla de materiales generalmente varían de alrededor de 1 a 20 ng / μL, mientras que los valores de concentración de ARN de filtro tienden a ser más bajos, típicamente oscila entre 0,5 y 5 ng/μL.
4. Creación de la biblioteca 16S rRNA
- Limpie el área de trabajo con 10% de lejía y 70% de etanol. El área de trabajo debe ser un espacio cerrado capaz de producir condiciones de flujo laminar (campana de flujo laminar).
- Utilice los extractos de ADN (del paso 3.5) y prepare muestras para la secuenciación de amplicones de ARNr 16S con un protocolo de PCR estándar, como el descrito en el sitio web del Microbioma de la Tierra que amplifica la región hipervariable V4 de 16S rRNA19 en condiciones de flujo laminar.
- Prepare un gel de agarosa al 2% como se describió anteriormente y deje que se solidifique17. Mezclar 7 μL de producto de PCR y 13 μL de agua libre de DNasa. Agregue un tinte de carga de gel a una concentración final de 1x. Una vez que la agarosa esté solidificada, cargue esta mezcla de productos de PCR en un gel de agarosa al 2%.
NOTA: Alternativamente, se puede usar un gel pre-fundido en su lugar, ya que estos geles funcionan más rápido y vienen pre-hechos. - Ejecute el gel a 90 V durante 60-90 minutos para verificar el tamaño de la banda de 386 como amplificación exitosa para amplicones 16S rRNA V4, utilizando el protocolo del Microbioma de la Tierra.
5. Purificación de la biblioteca de ARNr ADN 16S
- Agrupar 10 μL de productos de PCR para las muestras que produjeron bandas brillantes y 13 μL para las muestras que produjeron bandas débiles en un tubo de microcentrífuga estéril de tamaño adecuado.
- Verifique la concentración de la piscina resultante con un fluorómetro o espectrofotómetro y prepare un gel de agarosa al 2% como antes. Idealmente, la piscina debería tener una concentración de al menos 10 ng/μL, y la mayoría de las muestras deberían haber tenido una concentración de alrededor de 25 ng/μL.
- Si la concentración y el volumen lo permiten, cargue alrededor de 150-200 ng en un pozo de gel de agarosa al 2%.
- Ejecute el gel durante 60-90 minutos a 90 voltios.
- Purifique la biblioteca agrupada ejecutando un gel de agarosa al 2%.
- Elimine la banda de ADN de 386 pb del gel y purifique la biblioteca agrupada utilizando un kit disponible comercialmente como se describió anteriormente20. Elute el ADN purificado con 30 μL de 10 mM Tris-Cl (pH 8.5). Realice este paso en un área diferente a la extracción de ADN o ARN para evitar futuras contaminaciones, ya que cortar el gel extenderá los amplicones de PCR tanto en el experimentador como en el área circundante.
- Compruebe la concentración de la piscina purificada utilizando un fluorómetro o espectrofotómetro. Si la purificación fue bien, su concentración debe ser al menos la mitad de la de la piscina no purificada. Generalmente, la concentración final debe oscilar entre 5 y 20 ng/μL.
- Envíe las bibliotecas purificadas para la secuenciación de próxima generación. Asegúrese de que se mantengan fríos durante el transporte incluyendo hielo seco en el contenedor de envío.
6. Creación y purificación de bibliotecas de ARN
- Se pueden utilizar varios kits comerciales para crear bibliotecas de ARN. Para cualquiera que sea el que se utilice, siga el protocolo del fabricante tal como está escrito mientras trabaja en un entorno de flujo laminar estéril. Una versión muy resumida del protocolo para kit en la Tabla de Materiales se presenta a continuación21.
- Haga la primera mezcla maestra de síntesis de CDNA de hebra (8 μL de agua libre de nucleasa y 2 μL de First Strand Synthesis Enyzme Mix) y agréguela a la muestra. Coloque la muestra en el termociclador con las condiciones especificadas en el protocolo.
- Haga la mezcla maestra de síntesis de ADNc de la segunda hebra (8 μL de tampón de reacción de síntesis de segunda hebra, mezcla de enzimas de síntesis de segunda hebra de 4 μL y 48 μL de agua libre de nucleasa) en hielo y agréguela a la muestra. Colocar en un termociclador a 16 °C durante una hora.
- Purificar la reacción añadiendo las perlas proporcionadas (144 μL) y realizando dos lavados de etanol al 80% (200 μL).
- Elute con el tampón TE proporcionado (53 μL) y transfiera 50 μL del sobrenadante a un tubo de PCR limpio. Coloque el tubo de PCR sobre hielo.
- Haga la mezcla maestra de preparación final (7 μL de End Prep Reaction Buffer y 3 μL de End Prep Enzyme Mix) sobre hielo y agréguela al tubo de PCR. Coloque el tubo de PCR en un termociclador con las condiciones especificadas en el protocolo.
- Mezcle las soluciones de adaptador diluido (2,5 μL), mezcla maestra de ligadura (30 μL) y potenciador de ligadura (1 μL) sobre hielo. Añadir las soluciones mixtas a la muestra y colocar en un termociclador durante 15 min a 20 °C.
- Purifique la reacción agregando las perlas proporcionadas (87 μL) y realizando lavados de etanol (200 μL) y elución como antes, excepto solo agregar 17 μL de TE.
- Añadir índices (10 μL) y la solución Q5 Master Mix (25 μL) y colocar en un termociclador con las condiciones descritas en el protocolo.
- Purificar la reacción añadiendo las perlas proporcionadas (45 μL) y realizando una adición de dos lavados de etanol (200 μL) y elute con 23 μL de TE. Transfiera 20 μL a un tubo de PCR limpio.
- Verifique las bibliotecas para detectar concentraciones detectables de ARN usando un bioanalizador, fluorómetro o espectrofotómetro.
- Acondicione las bibliotecas metatranscriptómicas en una proporción aproximadamente equimolar.
- Purificar la biblioteca siguiendo el mismo protocolo para la purificación de la biblioteca 16S, excepto los fragmentos de impuestos especiales entre 250 y 400 pb. Mientras que la biblioteca 16S tenía una banda distinta que representaba la región amplificada, el resultado aquí es una mancha.
- Compruebe la concentración de la biblioteca purificada como antes.
- Envíe la biblioteca purificada con hielo seco a una instalación de secuenciación.
NOTA: Alternativamente, los extractos de ARN se pueden enviar a una universidad o empresa privada para la preparación y secuenciación de la biblioteca.
7. Análisis de la comunidad microbiana
- Una vez completada la secuenciación, acceda a los datos de muestra. Descárguelo a una computadora utilizable.
NOTA: Idealmente, el dispositivo debe tener al menos 16 gigabytes de RAM. Para obtener una discusión sobre los requisitos informáticos (para Qiime2), consulte https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808. - Utilice software, como mothur, QIIME2 y R, para analizar los datos de ARNr 16S. Consulte aquí https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ para ver un tutorial de análisis QIIME2 16S de ejemplo.
- Para los datos de metatranscriptómica (ARN), utilice HUMAnN2 y ATLAS para determinar qué genes y vías están presentes en las muestras.
NOTA: En el archivo de información suplementaria se presenta un ejemplo de canalización de metatranscriptómica que culmina en diversidad y análisis aleatorio de bosques. Todos los comandos se ejecutan a través de la línea de comandos, por ejemplo, Terminal para usuarios de Mac.
Representative Results
El éxito de las extracciones de ADN y ARN se puede evaluar utilizando una variedad de equipos y protocolos. En general, cualquier concentración detectable de cualquiera de los dos se considera suficiente para concluir que la extracción fue exitosa. Examinando la Tabla 1 entonces, todas las extracciones, excepto una, se denominarían exitosas. La falla en este paso a menudo se debe a una baja biomasa inicial, una mala conservación de la muestra o un error humano durante la extracción. En el caso de los filtros, la extracción puede haber sido exitosa incluso si la concentración está por debajo de la detección. Si esos extractos no producen bandas para PCR (si se hace 16S) o una concentración detectable después de la preparación de la biblioteca (metatranscriptómica), entonces es probable que realmente fallen.
Si se sigue el protocolo 16S, las bandas brillantes después de la amplificación por PCR, como se ve en los pozos 4 y 6 en la Figura 1,indican éxito, mientras que la falta de bandas, como se ve en los otros pozos en la fila superior, indica fracaso. Además, una banda brillante en el carril de gel que contenga un control de PCR negativo también indicaría una falla, ya que sería arriesgado suponer que la contaminación que afecta a los controles negativos no afectó a las muestras.
Tanto para 16S como para metatranscriptómica, el éxito de la secuenciación se puede evaluar observando el número de secuencias obtenidas(Figura 2). Las muestras 16S deben tener un mínimo de 1.000 secuencias, siendo al menos 5.000 ideales(Figura 2A). Asimismo, las muestras de metatranscriptómica deben tener un mínimo de 500.000 secuencias, siendo ideal al menos 2.000.000(Figura 2B). Las muestras con menos secuencias que esos mínimos no deben utilizarse para los análisis, ya que pueden no representar con precisión su comunidad bacteriana. Sin embargo, las muestras que se encuentran entre el mínimo y el ideal aún se pueden usar, aunque los resultados deben interpretarse con más precaución si muchas muestras caen en ese rango.
El éxito del análisis posterior puede determinarse simplemente sobre la base de si se obtuvieron o no los archivos de salida esperados. En cualquier caso, los programas, como QIIME2 y R(Figura 3),deberían permitir la evaluación de posibles diferencias significativas entre las comunidades bacterianas basadas en el fracking. Los datos de la Figura 3 se obtuvieron mediante la recolección de muestras de sedimentos de veintiún sitios diferentes en trece corrientes diferentes para el análisis 16S y metatranscriptómico. De esos veintiún sitios, doce de ellos estaban aguas abajo de la actividad de fracking y clasificados como HF +, y nueve de ellos estaban aguas arriba de la actividad de fracking o en una cuenca donde el fracking no estaba ocurriendo; estas corrientes se clasificaron como HF-. Además de la presencia de actividad de fracking, los arroyos eran comparables.
Esas diferencias podrían tomar la forma de cambios de composición consistentes basados en el estado del fracking. Si ese fuera el caso, se esperaría que las muestras HF+ y HF- se agruparan entre sí en una gráfica PCoA, como es el caso de la Figura 3A y la Figura 3B. Para confirmar que esos cambios aparentes no son solo un artefacto del método de ordenación, se necesita un análisis estadístico adicional. Por ejemplo, una prueba PERMANOVA22 en la matriz de distancia en la que se basan la Figura 3A y la Figura 3B reveló una agrupación significativa basada en el estado del fracking, lo que significa que la separación observada en la gráfica es consistente con las diferencias entre las comunidades bacterianas de las muestras, en lugar de un artefacto de ordenación. Un resultado significativo de PERMANOVA o ANOSIM es una fuerte indicación de diferencias consistentes entre las muestras HF+ y HF-, lo que indicaría que las muestras HF+ se vieron afectadas por el fracking, mientras que un alto valor p indicaría que las muestras no se vieron afectadas. Los datos metatranscriptómicos también se pueden visualizar y evaluar utilizando los mismos métodos.
El examen de las características diferenciales (microbios o funciones) puede revelar evidencia de que las muestras también se han visto afectadas. Un método para determinar las características diferenciales es crear un modelo de bosque aleatorio. El modelo de bosque aleatorio se puede utilizar para ver qué tan bien se puede clasificar correctamente el estado de fracking de las muestras. Si el modelo funciona mejor de lo esperado por casualidad, eso sería evidencia adicional de diferencias dependiendo del estado del fracking. Además, los predictores más importantes revelarían qué características eran las más importantes para diferenciar correctamente las muestras(Figura 3C). Esas características también habrían tenido valores consistentemente diferentes basados en el estado del fracking. Una vez que se determinan esas características diferenciales, se puede revisar la literatura para ver si se han asociado previamente con el fracking. Sin embargo, puede ser difícil encontrar estudios que determinen las funciones diferenciales, ya que la mayoría solo ha utilizado datos de composición de ARNr 16S. Por lo tanto, para evaluar las implicaciones de las funciones diferenciales, un método posible sería ver si se han asociado previamente con la resistencia potencial a los biocidas comúnmente utilizados en el fluido de fracking o si podrían ayudar a tolerar condiciones altamente salinas. Además, el examen del perfil funcional de un taxón de interés podría revelar evidencia del impacto del fracking(Figura 3D). Por ejemplo, si un taxón se identifica como diferencial por el modelo de bosque aleatorio, su perfil de resistencia a los antimicrobianos en muestras de HF + podría compararse con su perfil en muestras de HF y, si difieren mucho, eso podría sugerir que el fluido de fracking que contiene biocidas ingresó a la corriente.
| SampleID | Concentración (ng/μL) |
| 1 | 1.5 |
| 2 | 1.55 |
| 3 | 0.745 |
| 4 | 0.805 |
| 5 | 7.82 |
| 6 | 0.053 |
| 7 | 0.248 |
| 8 | 0.945 |
| 9 | 1.82 |
| 10 | 0.804 |
| 11 | 0.551 |
| 12 | 1.69 |
| 13 | 4.08 |
| 14 | Below_Detection |
| 15 | 7.87 |
| 16 | 0.346 |
| 17 | 2.64 |
| 18 | 1.15 |
| 19 | 0.951 |
Tabla 1: Ejemplo de concentraciones de ADN basadas en el ensayo de alta sensibilidad de ADN Fluorómetro 1x DS. Las extracciones para todas estas muestras, excepto 14, se considerarían exitosas debido a que tienen cantidades detectables de ADN.
Figura 1: Ejemplo de e-gel con productos de PCR. El gel fue pre-teñido y visualizado bajo una luz UV, haciendo que cualquier ADN presente en él brille. La PCR funcionó para las muestras en los pozos 4 y 6 en la primera fila, ya que ambos tenían una sola banda brillante del tamaño esperado (según la escalera). La PCR para las muestras en los otros seis pozos falló, ya que no produjeron ninguna banda. El control positivo (primer pozo, segunda fila) tenía una banda brillante, lo que indica que la PCR se realizó correctamente, y los controles negativos (pozos 6 y 7, segunda fila) no tenían bandas, lo que indica que las muestras no estaban contaminadas. Si un negativo tuviera una banda tan brillante como las muestras, la PCR se habría considerado un fracaso, ya que sería arriesgado suponer que las muestras tenían amplicones que no eran solo el resultado de la contaminación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Recuentos de secuencias de ejemplo. (A) Recuentos de secuencias de ejemplo 16S. Casi todas estas muestras 16S tenían más de 1.000 secuencias. Los muy pocos que tenían menos de 1.000 secuencias deberían excluirse de los análisis posteriores, ya que no tenían secuencias suficientes para representar con precisión sus comunidades bacterianas. Varias secuencias tenían entre 1.000 y 5.000 secuencias; aunque no son ideales, seguirían siendo utilizables ya que exceden el mínimo desnudo, y la mayoría de las muestras también superan el mínimo ideal de 5,000. (B) Recuentos de ejemplos de metatranscriptómica. Todas las muestras superaron el número mínimo (500.000) y el mínimo ideal (2.000.000) de secuencias. Por lo tanto, la secuenciación fue exitosa para todos ellos, y todos ellos pudieron usarse en el análisis posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de análisis. (A) Diagrama PCoA basado en coordenadas calculadas con una matriz de distancia Unifrac Ponderada creada y visualizada a través de QIIME2. (B) Gráfico PCoA basado en coordenadas calculadas con la matriz de distancia Unifrac ponderada exportada desde QIIME2. Las coordenadas se visualizaron utilizando los paquetes Phyloseq y ggplot2 en R. Los vectores de metadatos se ajustaron a la gráfica utilizando el paquete Vegan. Cada punto representa la comunidad bacteriana de una muestra, con puntos más cercanos que indican composiciones de comunidad más similares. Se observó agrupamiento basado en el estado del fracking para estas muestras de sedimentos 16S (PERMANOVA, p=0,001). Además, los vectores revelan que las muestras de HF + tendían a tener niveles más altos de bario, bromuro, níquel y zinc, que correspondían a una composición de comunidad bacteriana diferente en comparación con las muestras de HF. (C) Gráfico de los mejores predictores para un modelo de bosque aleatorio que probó dónde se podrían usar las abundancias bacterianas para predecir el estado del fracking entre las muestras. El modelo de bosque aleatorio se creó a través de R utilizando el paquete randomForest. Se muestran los 20 predictores principales, así como las disminuciones resultantes en la impureza (medida del número de muestras HF + y HF- agrupadas) en forma de disminución media en el índice de Gini cuando se utilizan para separar muestras. (D) Gráfico circular que muestra el perfil de resistencia a los antimicrobianos del perfil de Burkholderiales basado en datos metatranscriptómicos. Las secuencias se anotaron por primera vez con Kraken2 para determinar a qué taxones pertenecían. BLAST se utilizó con esas secuencias anotadas y la base de datos MEGARes 2.0 para determinar qué genes de resistencia a los antimicrobianos (en forma de "MEG_#") se expresaban activamente. Los genes de resistencia a los antimicrobianos expresados por los miembros de Burkholderiales se extrajeron para ver cuáles eran los más prevalentes entre esos taxones. Si bien es más costosa y requiere más tiempo, la metatranscriptómica permite análisis funcionales, como este, que no se puede hacer con datos 16S. En particular, kraken2 se utilizó para este análisis de ejemplo, en lugar de HUMAnN2. Kraken2 es más rápido que HUMAnN2; sin embargo, solo produce información compositiva, en lugar de composición, contribución y funciones (genes) y vías como lo hace HUMAnN2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario: Un ejemplo de canalización de metatranscriptómica. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
Los métodos descritos en este artículo han sido desarrollados y refinados a lo largo de varios estudios publicados por nuestro grupo entre 2014 y 20187,8,10 y se han empleado con éxito en un proyecto colaborativo para investigar los impactos del fracking en las comunidades acuáticas en un proyecto de tres años que pronto presentará un documento para su publicación. Estos métodos seguirán utilizándose en el transcurso del resto del proyecto. Además, otra literatura actual que investiga el impacto del fracking en arroyos y ecosistemas describe métodos similares para la recolección, procesamiento y análisis de muestras7,8,10,11. Sin embargo, ninguno de esos documentos utilizó el análisis metatranscriptómico, lo que lo convierte en el primero en describir cómo se pueden usar esos análisis para dilucidar el impacto del fracking en los arroyos cercanos. Además, los métodos presentados aquí para la recolección de muestras son más detallados, al igual que los pasos tomados para evitar la contaminación.
Uno de los pasos más importantes de nuestro protocolo es la recolección y preservación inicial de muestras. El muestreo y la recolección en el campo conllevan ciertos desafíos, ya que mantener un ambiente aséptico o estéril durante la recolección puede ser difícil. Durante este paso, es vital evitar la contaminación de las muestras. Para hacer esto, se deben usar guantes, y solo se debe permitir que los recipientes y herramientas estériles entren en contacto con las muestras. Las muestras también deben colocarse inmediatamente en hielo después de la recolección para mitigar la degradación de ácidos nucleicos. La adición de un conservante comercial de ácido nucleico en la recolección también puede aumentar el rendimiento de ácido nucleico y permitir que las muestras se almacenen durante períodos de tiempo más largos después de la recolección. Siempre que se realiza la extracción de ácidos nucleicos, es importante utilizar la cantidad adecuada de muestra, demasiado puede obstruir los filtros de espín utilizados para la extracción (para aquellos protocolos que hacen uso de ellos) pero muy poco puede resultar en bajos rendimientos. Asegúrese de seguir las instrucciones para cualquier kit que se utilice.
Al igual que en la recolección en el campo, evitar o minimizar la contaminación también es importante durante la extracción de ácidos nucleicos y la preparación de muestras, especialmente cuando se trabaja con muestras de bajo rendimiento de ácido nucleico, como muestras de sedimentos subóptimos (muestras que contienen una gran cantidad de grava o rocas) o muestras de agua. Por lo tanto, al igual que con la recolección de muestras, se deben usar guantes durante todos estos pasos para reducir la contaminación. Además, todas las superficies de trabajo utilizadas durante los procedimientos de laboratorio deben esterilizarse de antemano limpiando con una solución de lejía al 10%, seguida de una solución de etanol al 70%. Para los pasos de pipeteo (3-6), se deben usar puntas de filtro para evitar la contaminación debido a la pipeta en sí, y las puntas se cambian cada vez que tocan una superficie no estéril. Todas las herramientas utilizadas para el trabajo de laboratorio, incluidas las pipetas, deben limpiarse antes y después con las soluciones de lejía y etanol. Para evaluar la contaminación, se deben incluir espacios en blanco y negativos de extracción (líquido estéril) durante cada conjunto de extracciones de ácido nucleico y reacciones de PCR. Si la cuantificación después de las extracciones revela una cantidad detectable de ADN/ARN en los negativos, las extracciones se pueden repetir si queda suficiente muestra. Si las muestras negativas para PCR muestran amplificación, se debe realizar la solución de problemas para determinar la fuente y luego se deben volver a ejecutar las muestras. Para tener en cuenta los bajos niveles de contaminación, se recomienda que los espacios en blanco de extracción y los negativos de PCR se secuencian para que los contaminantes puedan identificarse y eliminarse, si es necesario, durante el análisis computacional. Por el contrario, la amplificación por PCR también podría fallar debido a una variedad de causas. Para muestras ambientales, la inhibición de la reacción de PCR es a menudo la culpable, que puede deberse a una variedad de sustancias que interfieren con la polimerasa Taq23. Si se sospecha inhibición, se puede utilizar agua de grado PCR (ver Tabla de Materiales)para diluir los extractos de ADN.
Este protocolo tiene algunas limitaciones notables y dificultades potenciales. La recolección de muestras puede ser un desafío tanto para las muestras de agua como para las de sedimentos. Para obtener suficiente biomasa, idealmente 1 L de agua de corriente debe ser empujada a través de un filtro. Los poros del filtro deben ser pequeños para capturar microbios, pero también pueden atrapar sedimentos. Si hay una gran cantidad de sedimentos en el agua debido a las lluvias recientes, el filtro puede obstruirse, lo que dificulta empujar todo el volumen a través del filtro. Para la recolección de sedimentos, puede ser difícil estimar la profundidad del sedimento durante la recolección. Además, es importante asegurarse de que el sedimento recolectado sea predominantemente suelo, ya que los guijarros y las rocas conducirán a un menor rendimiento de ácido nucleico y pueden no ser una representación precisa de la comunidad microbiana. Por último, también es vital que las muestras se mantengan en hielo después de la recolección, especialmente si no se usa un conservante.
Aunque este protocolo cubre tanto la metatranscriptómica como los protocolos de laboratorio 16S, debe enfatizarse que estos dos métodos son muy diferentes tanto en el proceso como en el tipo de datos que proporcionan. El gen 16S rRNA es una región comúnmente dirigida, altamente conservada en bacterias y arqueas, y útil para caracterizar la comunidad bacteriana en una muestra. Aunque es un enfoque específico y específico, la resolución a nivel de especie es a menudo inalcanzable, y la caracterización de especies o cepas recientemente divergentes es difícil. Por el contrario, la metatranscriptómica es un enfoque más amplio que captura todos los genes activos y microbios presentes dentro de una muestra. Mientras que 16S proporciona solo datos para la identificación, la metatranscriptómica puede proporcionar datos funcionales como genes expresados y vías metabólicas. Ambos son valiosos y, cuando se combinan, pueden revelar qué bacterias están presentes y qué genes están expresando.
Este artículo describe los métodos para la recolección de campo y el procesamiento de muestras para los análisis de ARNr 16S y metatranscriptómicos en el contexto del estudio del fracking. Además, detalla los métodos de recolección de ADN / ARN de alta calidad a partir de muestras de baja biomasa y para el almacenamiento a largo plazo. Los métodos descritos aquí son la culminación de nuestras experiencias con la recolección y el procesamiento de muestras en nuestros esfuerzos por aprender cómo el fracking afecta a los arroyos cercanos a través del examen de la estructura y función de sus comunidades microbianas. Los microbios responden rápidamente a las perturbaciones y, en consecuencia, qué microbios están presentes y los genes que expresan pueden proporcionar información sobre los efectos del fracking en los ecosistemas. En general, estos métodos podrían ser invaluables en nuestra comprensión de cómo el fracking afecta a estos importantes ecosistemas.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer las fuentes de financiamiento para los proyectos que condujeron al desarrollo de estos métodos, siendo esas fuentes: el Instituto Médico Howard Hughes (http://www.hhmi.org) a través del Programa de Educación Científica Preuniversitaria y de Pregrado, así como por la Fundación Nacional de Ciencias (http://www.nsf.gov) a través de los premios NSF DBI-1248096 y CBET-1805549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
| Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
| DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
| DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
| DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
| Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
| PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
| TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
| 1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
| 2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
| 50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
| 500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
| Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
| Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
| Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
| Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
| Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
| Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
| Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
| Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
| Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
| Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
| Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
| Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
| Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
| Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
| Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
| Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
| Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
| Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
| Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
| Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
| PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
| Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
| Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
| Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
| PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
| Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
| Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
| Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
| Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
| Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
| WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
| ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |
References
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