Evaluering af virkningen af hydraulisk frakturering på vandløb ved hjælp af mikrobielle molekylære signaturer

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at undersøge virkningerne af hydraulisk frakturering på nærliggende vandløb ved at analysere deres vand- og sedimentmikrobielle samfund.

Abstract

Hydraulisk frakturering (HF), almindeligvis kaldet "fracking", bruger en blanding af højtryksvand, sand og kemikalier til at fraktur klipper, frigive olie og gas. Denne proces revolutionerede den amerikanske energiindustri, da den giver adgang til ressourcer, der tidligere var uopnåelige og nu producerer to tredjedele af den samlede naturgas i USA. Selv om fracking har haft en positiv indvirkning på den amerikanske økonomi, flere undersøgelser har fremhævet dens skadelige miljømæssige virkninger. Af særlig bekymring er virkningen af fracking på hovedvandsstrømme, som er særligt vigtige på grund af deres uforholdsmæssigt store indvirkning på sundheden for hele vandskel. Bakterierne i disse vandløb kan bruges som indikatorer for strøm sundhed, som bakterierne til stede og deres overflod i en forstyrret strøm forventes at afvige fra dem i en ellers sammenlignelig, men uforstyrret strøm. Derfor har denne protokol til formål at bruge bakteriesamfundet til at afgøre, om vandløb er blevet påvirket af fracking. Med henblik herpå skal der opsamles sediment- og vandprøver fra vandløb nær fracking (potentielt påvirket) og opstrøms eller i et andet vandskel af frackingaktivitet (upimpacted). Disse prøver er derefter udsat for nukleinsyre udvinding, bibliotek forberedelse, og sekventering at undersøge mikrobielle samfund sammensætning. Korrelationsanalyse- og maskinlæringsmodeller kan efterfølgende anvendes til at identificere, hvilke funktioner der er explanative af variation i samfundet, samt identifikation af prædiktive biomarkører for frackings virkning. Disse metoder kan afsløre en række forskelle i de mikrobielle samfund blandt headwater vandløb, baseret på nærheden til fracking, og tjene som grundlag for fremtidige undersøgelser af de miljømæssige konsekvenser af fracking aktiviteter.

Introduction

Hydraulisk frakturering (HF), eller "fracking", er en metode til udvinding af naturgas, som er blevet mere og mere udbredt, da efterspørgslen efter fossile brændstoffer fortsætter med at stige. Denne teknik består i at bruge høj-drevne boreudstyr til at injicere en blanding af vand, sand og kemikalier i metan-rige skifer aflejringer, normalt at frigive fanget gasser¹.

Da disse ukonventionelle høstteknikker er relativt nye, er det vigtigt at undersøge virkningerne af en sådan praksis på nærliggende vandveje. Fracking aktiviteter mandat clearing af store skår af jord til transport af udstyr og brønd pad konstruktion. Ca. 1,2-1,7 hektar jord skal ryddes for hver brønd pad², potentielt påvirker afstrømning og vandkvalitet af systemet³. Der er mangel på gennemsigtighed omkring den nøjagtige kemiske sammensætning af frackingvæske, herunder hvilke biocider der anvendes. Derudover har fracking spildevand tendens til at være meget saltvand². Desuden kan spildevandet indeholde metaller og naturligt forekommende radioaktive stoffer². Derfor er muligheden for lækager og spild af frackingvæske på grund af menneskelige fejl eller udstyrsfejl bekymrende.

Vandløbsøkosystemer er kendt for at være meget følsomme over for ændringer i de omkringliggende landskaber⁴ og er vigtige for at bevare^{biodiversiteten 5} og korrekt næringsstofcykling⁶ inden for hele vandskel. Mikrober er de mest rigelige organismer i ferskvandsstrømme og er derfor afgørende for næringsstofcykling, bionedbrydning og primærproduktion. Mikrobielle samfund sammensætning og funktion tjene som gode værktøjer til at få oplysninger om økosystemet på grund af deres følsomhed over for forstyrrelser, og nyere forskning har vist forskellige skift i observerede bakterielle assemblages baseret på nærhed til fracking aktivitet^7,8. For eksempel blev Beijerinckia, Burkholderiaog Methanobacterium identificeret som beriget i vandløb nær fracking, mens Pseudonocardia, Nitrospiraog Rhodobacter blev beriget i vandløbene ikke i nærheden af fracking⁷.

Næste generation sekventering af 16S ribosomal RNA (rRNA) genet er en overkommelig metode til bestemmelse af bakterielle samfund sammensætning, der er hurtigere og billigere end hele genom sekventering tilgange⁹. En almindelig praksis inden for molekylær økologi er at bruge den meget variable V4-region i 16S rRNA-genet til sekventeringsopløsning, ofte ned til slægtsniveauet med et bredt identifikationsområde⁹, da det er ideelt til uforudsigelige miljøprøver. Denne teknik er blevet implementeret bredt i offentliggjorte undersøgelser og er med succes blevet udnyttet til at identificere virkningen af fracking operationer på vandmiljøer^7,8. Det er dog værd at bemærke, at bakterier har varierende kopinumre af 16S rRNA-genet, som påvirker deres påviste overflod¹⁰. Der er et par værktøjer til at tage højde for dette, men deres effektivitet er tvivlsom¹⁰. En anden praksis, der hurtigt vokser i prævalens og mangler denne svaghed er metatranscriptom sekventering, hvor alle RNA er sekventeret, så forskerne kan identificere både aktive bakterier og deres gener udtryk.

I modsætning til metoder i tidligere offentliggjorte undersøgelser^7,8,11,12omfatter denne protokol derfor også prøvesamling, konservering, behandling og analyse til undersøgelse af mikrobiel fællesskabsfunktion (metatranscriptomics). De trin, der er beskrevet heri, gør det muligt for forskere at se, hvilken indvirkning, hvis nogen, fracking har haft på de gener og veje udtrykt af mikrober i deres vandløb, herunder antimikrobielle resistensgener. Desuden forbedres detaljeringsniveauet for prøveindsamling. Selv om flere af de trin og noter kan synes indlysende for erfarne forskere, de kunne være uvurderlige for dem, der lige er begyndt forskning.

Heri beskriver vi metoder til indsamling og behandling af prøver til at generere bakterielle genetiske data som et middel til at undersøge virkningen af fracking på nærliggende vandløb baseret på vores laboratoriers mange års erfaring. Disse data kan bruges i downstream-applikationer til at identificere forskelle svarende til fracking status.

Protocol

1. Indsamling af sedimentprøver til nukleinsyreudvinding

1. Dyk et sterilt 50 mL konisk rør ned i åvandet. Brug handsker under prøveopsamling for at undgå at indføre uønsket menneskelig forurening. Udfør dette trin enten fra kysten eller vender opstrøms, hvis i vandet.
2. Mens det koniske rør er nedsænket, skal du fjerne hætten og bruge den til at scoop ca. 3 mL sediment fra en dybde på 1 til 3 cm ind i det koniske rør.
3. Fjern det koniske rør fra vandet, og dumper alt vand ud, bortset fra et tyndt lag, der dækker sedimentprøven (ca. 1 mL).
4. Ved hjælp af en 1000 μL-pipette og passende pipettespidser tilsættes 3 mL DNA/RNA-konserveringsmiddel (se Materialetabel for konserveringsspecifikationer) til den indsamlede prøve. Opbevar pipettespidserne i en steril pipettespidskasse, og fastgør dem kun umiddelbart før brug og kasseres efter brug. Vend det udjævnede koniske rør 10 gange for at sikre, at konserveringsmidlet og prøven blandes grundigt.
   BEMÆRK Trin 1.4 er ikke nødvendigt, men det anbefales på det kraftigste, hvis RNA skal udvindes fra sedimenterne senere.
5. Læg prøverne på is resten af prøvesamlingen. Når prøverne vender tilbage fra indsamlingen, opbevares de i en fryser ved -20 °C, hvis prøverne skal anvendes til 16S-analyse (DNA) eller -70 °C, hvis de skal anvendes til metatranscriptomics-analyse (RNA).

2. Filterindsamling til nukleinsyreudvinding

1. Fjern hætten af en steril 1 L flaske. Når du vender opstrøms eller fra kysten, skal du fylde flasken med strømvand til toppen og derefter dumpe den ud. Gentag denne proces to gange mere for at konditionering flasken. Fyld hele flasken en fjerde gang og hætte den.
   BEMÆRK: Hvis der genbruges en 1 L-flaske, kan den steriliseres ved at skylle med 10% blegemiddel i 2 min, efterfulgt af skylning tre gange med deioniseret vand og derefter en gang med 70% ethanol og endelig autoklavering med indstillinger: 30 min eksponeringstid ved 121,1 °C og 15 min tørretid. Under autoklavering skal hætten på flasken være meget løs for at undgå, at flasken komprimeres i processen.
2. Når du er på en stabil overflade, skal du bruge en steril Luer-låsesprøjte og udarbejde et fuldt volumen. Tilslut derefter sprøjten til et sterilt og DNA/RNA-frit polyethersulfonfilter med en porestørrelse på 0,22 μm, og skub hele volumen gennem filteret ved at trykke stemplet helt ned. Gentag denne proces, indtil den samlede mængde, der er opsamlet i flasken (1 L), skubbes gennem filteret.
   BEMÆRK: Sprøjtens volumen kan være variabelt, hvis den samlede mængde vand, der skubbes gennem filteret, spores. Generelt foretrækkes 60 mL dog. Mens 1 L er ideel, anekdotisk, et volumen på mindst 200 mL vil sandsynligvis stadig indsamle nok biomasse (under forudsætning af ~ 20.000 celler pr. ML) til udvinding af DNA og RNA.
3. Fjern overskydende vand fra filteret ved at trække luft til en værdi af ca. 20 mL ind i sprøjten og skubbe det gennem filteret.
   BEMÆRK: Dette vil hjælpe med at forhindre tab af konserveringsmidlet, hvis trin 2.4 udføres.
4. Ved hjælp af en P1000-mikropipette tilsættes 2 mL af et DNA/RNA-konserveringsmiddel ved at aflade det gennem filterets større åbning (hvor det var fastgjort til sprøjten), mens filteret blev holdt vandret. Spidsen af pipetten skal være inden for filterets tønde, når pipetten trykkes ned, for at sikre, at konserveringsmidlet kommer ind i filteret. Skift spidsen efter hver brug.
   BEMÆRK: Som med sedimentsamlingen er dette trin ikke nødvendigt, men det anbefales kraftigt til øget nukleinsyreudbytte senere, især til RNA.
5. Skræl en firkant af paraffinfilm og pak den tæt omkring hver åbning / ende af filteret for at forsegle. Placer paraffinfilmen indpakket filter i en steril prøvepose og derefter placere hele posen på is under indsamling.
   BEMÆRK: Sørg for, at den side, der bruges til at ombryde filteret, er steril, dvs.
6. Ved returnering fra prøveudtagning skal filtrene opbevares ved -20 °C for 16S eller -70 °C for metatransskription.

3. Udvinding og kvantificering af nukleinsyre

1. Rengør arbejdsområdet med 10% Bleach og 70% Ethanol før du begynder prøveoverførsel.
2. For sediment (fra trin 1.5) anvendes der generelt ~0,25 g prøve. Flamme sterilisere et metalværktøj ved at dyppe det i et bægerglas på 70% ethanol og brænde ethanolen af mellem prøverne.
3. For filtre (fra trin 2.6) flyttes filterpapiret ind i et sterilt rør til udsugning. Det kan du gøre ved at følge nedenstående trin.
   1. Opret en steril, DNA og RNA-fri overflade ved at folde aluminiumsfolie, så den indre del af folden ikke udsættes for det udvendige miljø og autoklaver det foldede stykke med indstillingerne: 121,1 °C og 5 min tørretid.
   2. Steriliser et skruestikgreb med 70% ethanol og åben ild. Brug derefter skruestikken til at åbne filterhuset på den sterile overflade og fjerne kernen fra kabinettet.
   3. Brug en steril skalpel til at skære filterpapiret væk fra kernen ved at skære i toppen og bunden og derefter langs sømmen. Fold filterpapiret ved hjælp af sterile pincet og skær derefter filteret i små stykker ved hjælp af skalpellen.
   4. Placer filterstykkerne i et mikrocentrifugrør til udsugning. Sørg for, at filterpapiret ikke kommer i kontakt med overflader, der ikke er steriliseret, eller som kan have nukleinsyre til stede, da dette ville føre til uønsket kontaminering af prøven.
4. Udfør DNA-isolation som beskrevet tidligere¹³ eller ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kolonnebaseret sæt (se Materialetabel). Trinnene til det viste kommercielle sæt er kort beskrevet nedenfor.
   1. Lyse cellerne i prøven ved at overføre det til en perle rør og udsætte det for en celle disruptor ved høj hastighed i mindst 5 min. Centrifuge og overføre supernatant til en steril mikrocentrifuge rør.
   2. Føj lysisbufferen til supernatanten (1:1 diskenhed), og overfør til det medfølgende filter (gult). Centrifugere filteret.
   3. Overfør filteret til et nyt sterilt mikrocentrifugerør. Tilsættes præparatet buffer (400 μL), centrifuge, og kassér strømmen igennem.
   4. Tilsæt vaskebuffer (700 μL), centrifuge, og kassér strømmen igennem. Tilsæt derefter vaskebuffer (400 μL), centrifuge, og kassér strømmen igennem igen.
   5. Overfør filteret til et nyt sterilt mikrocentrifugerør. Eluter med 50 μL DNase/RNase frit vand og lad sidde i 5 min ved stuetemperatur før centrifugering.
   6. I løbet af denne i kubationsperioden skal III-HRC-filteret forberedes ved at placere det i et opsamlingsrør og tilføje HRC-prepopløsningen (600 μL) til det efterfulgt af et centrifugeringstrin på 3 min ved 8.000 x g.
   7. Flyt det forberedte filter på et sterilt mikrocentrifugrør. Overfør det eluterede DNA fra trin 3.4.5 til dette filter og centrifuge ved 16.000 x g i 3 min. Strømmen gennem indeholder det ekstraherede DNA.
5. Opbevar DNA-ekstrakter til både sedimenter og filtre ved -20 °C.
   BEMÆRK: DNA-ekstrakter kan opbevares i ca. 8 år ved -20 °C under forudsætning af stabil temperatur, begrænset lyseksponering og ingen skadelige forurenende stoffer¹⁴.
6. Udfør RNA-isolering i henhold til producentens protokol. Opbevar RNA-uddrag ved -80 °C.
   1. Opsy cellerne i prøven ved at overføre dem til et perlerør og udsætte det for en celleforstyrrende ved høj hastighed i mindst fem minutter. Centrifuge og overføre supernatant til en steril mikrocentrifuge rør.
   2. Føj lysisbufferen til supernatanten (1:1 diskenhed), og overfør til den medfølgende kolonne (gul). Centrifugere kolonnen.
   3. Tilføj et lige volumen på 95-100% ethanol til strømmen igennem og blandes ved pipetter op og ned fem gange.
   4. Placer IICG-kolonnen (grøn) på et sterilt mikrocentrifugrør. Overfør den blandede opløsning til kolonnen og centrifugen.
   5. Tilsæt vaskebuffer (400 μL), centrifuge, og kassér strømmen igennem.
   6. Der tilsættes 5 μL DNase I og 75 μL DNA-fordøjelsesbuffer til kolonnen og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
   7. Tilsæt prep buffer (400 μL), centrifuge, og kassér strømmen igennem.
   8. Tilsæt vaskebuffer (700 μL), centrifuge, og kassér strømmen igennem. Tilsæt derefter vaskebuffer (400 μL), centrifuge, og kassér strømmen igennem igen.
   9. Overfør kolonnen til et nyt sterilt mikrocentrifugerør. Eluter med 50 μL DNase/RNase frit vand og lad sidde i 5 min før centrifugering.
   10. I denne inkubationsperiode skal III-HRC-filteret forberedes ved at placere det i et opsamlingsrør og tilsætte HRC-forberedelsesopløsningen (600 μL) til det efterfulgt af et centrifugeringstrin på 3 min ved 8.000 x g.
   11. Flyt det forberedte filter på et sterilt mikrocentrifugrør. Den eluterede RNA overføres fra trin 3.6.9 til dette filter og centrifuge ved 16.000 x g i 3 min. Gennemstrømningen indeholder det ekstraherede RNA.
       BEMÆRK: RNA-ekstrakter kan kun opbevares i et år, før de begynder at^{nedbrydes 15}. Både DNA- og RNA-ekstrakter nedbrydes ved gentagen fryse-optøning. Nogle protokoller giver mulighed for udvinding af både DNA og RNA fra samme prøve^16,17.
7. Kvantificer de ekstraherede DNA- og RNA-prøver ved hjælp af et fluorometer eller et spektrofotometer. Se tabel 1 for eksempel fluorometer DNA-koncentrationsværdier. Du kan se et eksempel på spektrofotometerkvantificeringsprotokol under reference¹⁸. Sediment-DNA-koncentrationsværdierne med det kit, der er anført i Materialetabel, varierer generelt fra 1 til 40 ng/μL, mens filter-DNA-koncentrationsværdierne har tendens til at variere fra 0,5 til 10 ng/μL. Sediment RNA-koncentrationsværdierne med det sæt, der er anført i Materialetabel, varierer generelt fra ca. 1 til 20 ng/μL, mens filter RNA-koncentrationsværdierne har tendens til at være lavere typisk fra 0,5 til 5 ng/μL.

4. 16S rRNA bibliotek oprettelse

1. Rengør arbejdsområdet med 10% Bleach og 70% Ethanol. Arbejdsområdet skal være et lukket rum, der kan producere laminar flowforhold (laminar flow hood).
2. Brug DNA-ekstrakterne (fra trin 3.5) og forbered prøver til 16S rRNA amplicon sekventering med en standard PCR-protokol, som den, der er beskrevet på Earth Microbiomes hjemmeside, der forstærker V4 hypervariable region 16S rRNA¹⁹ under laminar flow betingelser.
3. Forbered en 2% agarose gel som beskrevet tidligere og lad det størkne¹⁷. Bland 7 μL PCR-produkt og 13 μL DNasefrit vand. Tilsæt en gel loading farvestof til en endelig koncentration af 1x. Når agarose er størknet, indlæse denne PCR produkter blandes på en 2% agarose gel.
   BEMÆRK: Alternativt kan en præ-cast gel bruges i stedet, da disse geler løber hurtigere og kommer pre-made.
4. Kør gelen på 90 V i 60-90 min for at kontrollere for båndets størrelse på 386 som vellykket forstærkning for 16S rRNA V4 amplikoner, ved hjælp af Earth Microbiome protokol.

5. DNA 16S rRNA bibliotek rensning

1. Pulje 10 μL PCR-produkter til de prøver, der gav lyse bånd, og 13 μL til prøverne, der gav svage bånd i et sterilt mikrocentrifugrør i passende størrelse.
2. Kontroller koncentrationen af den resulterende pulje ved hjælp af et fluorometer eller spektrofotometer og forberede en 2% agarose gel som før. Ideelt set bør puljen have en koncentration på mindst 10 ng/μL, og de fleste prøver skulle have haft en koncentration på ca. 25 ng/μL.
3. Koncentration og volumen tillader det, belastning omkring 150-200 ng i en brønd på 2% agarose gel.
4. Kør gelen i 60-90 min ved 90 volt.
5. Rense det poolede bibliotek ved at køre en 2% agarose gel.
   1. Punktafgifter 386 bp DNA-båndet fra gelen og rense det poolede bibliotek ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit som beskrevet tidligere²⁰. Eluter det rensede DNA med 30 μL på 10 mM Tris-Cl (pH 8.5). Udfør dette trin i et andet område end DNA- eller RNA-ekstraktion for at forhindre fremtidig forurening, da skæring af gelen vil sprede PCR-ampliconer på både eksperimentatoren og det omkringliggende område.
6. Kontroller koncentrationen af den rensede pulje ved hjælp af et fluorometer eller spektrofotometer. Hvis rensning gik godt, bør koncentrationen være mindst halvdelen af den ugjorte pool. Generelt bør den endelige koncentration variere fra 5 til 20 ng/μL.
7. Send de rensede biblioteker til næste generations sekventering. Sørg for, at de holdes kolde under transport ved at inkludere tøris i skibscontaineren.

6. Oprettelse og rensning af RNA-bibliotek

1. Flere kommercielle kits kan bruges til at oprette RNA biblioteker. For uanset hvilken der anvendes, skal du følge producentens protokol som skrevet, mens du arbejder i et sterilt laminar flow miljø. En meget opsummeret version af protokollen til kit i tabellen af materialer er præsenteret nedenfor²¹.
   1. Lav den første cDNA-syntesemasterblanding (8 μL nucleasefrit vand og 2 μL first strandsyntese enyzmeblanding), og tilsæt det til prøven. Sæt prøven i termocyklussen med de betingelser, der er angivet i protokollen.
   2. Lav den anden cDNA-syntesemasterblanding (8 μL af Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 4 μL Second Strand Synthesis Enzyme Mix og 48 μL nucleasefrit vand) på isen, og tilsæt det til prøven. Placer i en termocykel indstillet til 16 °C i en time.
   3. Rense reaktionen ved at tilsætte de medfølgende perler (144 μL) og udføre to 80% ethanolvask (200 μL).
   4. Eluter med den medfølgende TE-buffer (53 μL) og overfør 50 μL af supernatanten til et rent PCR-rør. Placer PCR-røret på is.
   5. Lav endeforberedelsesmasterblandingen (7 μL end prep reaction buffer og 3 μL end prepenzymblanding) på is og tilsæt den til PCR-røret. Placer PCR-røret i en termocykel med de betingelser, der er angivet i protokollen.
   6. Bland de fortyndede adapteropløsninger (2,5 μL), Ligation Master Mix (30 μL) og Ligationsforstærker (1 μL) på is. De blandede opløsninger til prøven tilsættes og anbringes i en termocykel i 15 min ved 20 °C.
   7. Rense reaktionen ved at tilsætte de medfølgende perler (87 μL) og udføre ethanolvask (200 μL) og elution som før, undtagen kun tilsættes 17 μL TE.
   8. Der tilsættes indeks (10 μL) og Q5 Master Mix (25 μL) opløsning og placeres i en termocykel med de betingelser, der er beskrevet i protokollen.
   9. Rense reaktionen ved at tilsætte de medfølgende perler (45 μL) og udføre to ethanolvaske (200 μL) og elute med 23 μL TE. Overfør 20 μL til et rent PCR-rør.
2. Kontroller bibliotekerne for påviselige koncentrationer af RNA ved hjælp af et bioanalyzer, fluorometer eller spektrofotometer.
3. Pulje metatranscriptomiske biblioteker i et stort set ækvimolar forhold.
4. Rense biblioteket efter samme protokol for 16S bibliotek rensning, undtagen punktafgifter fragmenter mellem 250 og 400 bp. Mens 16S-biblioteket havde et særskilt bånd, der repræsenterede den forstærkede region, er resultatet her en udtværing.
5. Kontroller koncentrationen af det rensede bibliotek som før.
6. Send det rensede bibliotek med tøris til et sekventeringsanlæg.
   BEMÆRK: Alternativt kan RNA-uddrag sendes til et universitet eller en privat virksomhed til biblioteksforberedelse og sekventering.

7. Mikrobielle samfundsanalyser

1. Når rækkefølgen er fuldført, skal du få adgang til eksempeldataene. Download det til en brugbar computer.
   BEMÆRK: Ideelt set skal enheden have mindst 16 GIGABYTE RAM. For en diskussion af computing krav (for Qiime2), se https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808.
2. Brug software, såsom mothur, QIIME2 og R, til at analysere 16S rRNA-data. Se her https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ for et eksempel QIIME2 16S analyse tutorial.
3. For metatranscriptomics (RNA) data, skal du bruge HUMAnN2 og ATLAS til at bestemme, hvilke gener og veje der er til stede i prøverne.
   BEMÆRK: Et eksempel metatranscriptomics pipeline kulminerer i mangfoldighed og tilfældig skov analyse præsenteres i supplerende informationsfil. Alle kommandoer køres via kommandolinjen, f.eks.

Representative Results

Succesen af DNA og RNA ekstraktioner kan evalueres ved hjælp af en række udstyr og protokoller. Generelt anses enhver påviselig koncentration af enten for at være tilstrækkelig til at konkludere, at udvindingen var vellykket. Ved at undersøge tabel 1 ville alle udvindinger, bortset fra en, blive kaldt vellykkede. Fejl ved dette trin skyldes ofte lav indledende biomasse, dårlig prøvebevarelse eller menneskelige fejl under udvinding. I tilfælde af filtre kan udvindingen have været vellykket, selvom koncentrationen er under påvisning. Hvis disse uddrag ikke giver bånd til PCR (hvis du gør 16S) eller en påviselig koncentration efter bibliotek forberedelse (metatranscriptomics), så de sandsynligvis gjorde virkelig mislykkes.

Hvis 16S-protokollen følges, indikerer lyse bånd efter PCR-forstærkning, som det ses i brønde 4 og 6 i figur 1, succes, mens mangel på bånd, som det ses i de andre brønde i den øverste række, indikerer fiasko. Desuden ville et lyst bånd i gelbanen, der indeholder en negativ PCR-kontrol, også indikere en fejl, da det ville være risikabelt at antage, at den eller de forureninger, der påvirkede den eller de negative kontroller, ikke påvirkede prøverne.

For både 16S og metatranscriptomics kan sekventeringens succes vurderes ved at se på antallet af opnåede sekvenser (figur 2). 16S-prøverne skal have mindst 1.000 sekvenser, og mindst 5 000 skal være ideelle (figur 2A). På samme måde skal metatranscriptomics-prøver have mindst 500.000 sekvenser, og mindst 2.000.000 er ideelle (figur 2B). Prøver med færre sekvenser end disse minimumskrav bør ikke anvendes til analyser, da de muligvis ikke præcist repræsenterer deres bakteriesamfund. Prøver, der falder mellem minimum og ideal, kan dog stadig anvendes, selv om resultaterne skal fortolkes mere forsigtigt, hvis mange prøver falder i dette interval.

Succesen af efterfølgende downstream-analyse kan bestemmes blot på grundlag af, om de forventede outputfiler blev opnået eller ej. Under alle omstændigheder bør programmer, såsom QIIME2 og R (Figur 3), give mulighed for evaluering af potentielle betydelige forskelle mellem de bakterielle samfund baseret på fracking. Dataene for figur 3 blev indhentet ved at indsamle sedimentprøver fra 21 forskellige steder ved tretten forskellige vandløb til 16S- og metatranscriptomics-analyse. Af disse 21 lokaliteter var 12 af dem nedstrøms frackingaktivitet og klassificeret som HF+, og ni af dem var enten opstrøms frackingaktivitet eller i et skelsættende sted, hvor der ikke fandt fracking sted; disse strømme blev klassificeret som HF-. Ud over tilstedeværelsen af fracking aktivitet var vandløbene ellers sammenlignelige.

Disse forskelle kunne tage form af konsekvente kompositoriske skift baseret på fracking status. Hvis det var tilfældet, ville HF+ og HF-prøver forventes at samle sig adskilt fra hinanden i et PCoA-plot, som det er tilfældet i figur 3A og figur 3B. For at bekræfte, at disse tilsyneladende skift ikke kun er en artefakt af ordinationsmetoden, er der behov for yderligere statistisk analyse. For eksempel er en PERMANOVA^22-test på afstandsmatrixen, som figur 3A og figur 3B er baseret på afsløret betydelig klyngedannelse baseret på fracking-status, hvilket betyder, at adskillelsen observeret i plottet er i overensstemmelse med forskellene mellem prøvernes bakteriesamfund i stedet for en artefakt af ordination. Et signifikant PERMANOVA- eller ANOSIM-resultat er en stærk indikation af konsekvente forskelle mellem HF+ og HF-prøver, hvilket tyder på, at HF+-prøverne blev påvirket af fracking, mens en høj p-værdi indikerer, at prøverne ikke blev påvirket. Metatranscriptomiske data kan ligeledes visualiseres og evalueres ved hjælp af de samme metoder.

Undersøgelse af differentiale (mikrober eller funktioner) kan afsløre beviser for, at prøver også er blevet påvirket. En metode til bestemmelse af differentialfunktioner er at skabe en tilfældig skovmodel. Den tilfældige skovmodel kan bruges til at se, hvor godt prøvernes fracking status kan klassificeres korrekt. Hvis modellen klarer sig bedre end forventet ved en tilfældighed, ville det være yderligere bevis for forskelle, der er afhængige af fracking status. Desuden ville de vigtigste prædiktorer afsløre, hvilke træk der var vigtigst for korrekt differentiering af prøver (Figur 3C). Disse funktioner ville også have haft konsekvent forskellige værdier baseret på fracking status. Når disse forskellige træk er bestemt, kan litteraturen gennemgås for at se, om de tidligere har været forbundet med fracking. Det kan dog være udfordrende at finde undersøgelser, der bestemte differentialfunktioner, da de fleste kun har brugt 16S rRNA-kompositoriske data. Til evaluering af konsekvenserne af forskellige funktioner ville en mulig metode derfor være at se, om de tidligere har været forbundet med potentiel resistens over for biocider, der almindeligvis anvendes i frackingvæske, eller om de kan hjælpe med at tolerere meget saltholdige forhold. En undersøgelse af den funktionelle profil af en takst af interesse kunne desuden afsløre tegn på frackings virkning (figur 3D). Hvis en takson f.eks. identificeres som differentieret efter den tilfældige skovmodel, kan dens antimikrobielle resistensprofil i HF+-prøver sammenlignes med dens profil i HF-prøver, og hvis de adskiller sig meget, kunne det tyde på, at frackingvæske indeholdende biocider kom ind i strømmen.

Eksempel-id	Koncentration (ng/μL)
1	1.5
2	1.55
3	0.745
4	0.805
5	7.82
6	0.053
7	0.248
8	0.945
9	1.82
10	0.804
11	0.551
12	1.69
13	4.08
14	Below_Detection
15	7.87
16	0.346
17	2.64
18	1.15
19	0.951

Tabel 1: Eksempel DNA-koncentrationer baseret på Fluorometer 1x DS DNA høj følsomhed assay. Ekstraktioner for alle disse prøver, bortset fra 14, ville blive betragtet som en succes på grund af at have påviselige mængder DNA.

Figur 1: Eksempel e-gel med PCR-produkter. Gelen var pre-plettet og visualiseret under et UV-lys, forårsager ethvert DNA til stede på det til at gløde. PCR arbejdede for prøverne i brønde 4 og 6 i første række, da de begge havde et enkelt lyst bånd af den forventede størrelse (baseret på stigen). PCR for prøverne i de øvrige seks brønde mislykkedes, da de ikke producerede nogen bånd. Den positive kontrol (første brønd, anden række) havde et lyst bånd, der indikerede, at PCR blev udført korrekt, og de negative kontroller (brønde 6 og 7, anden række) havde ingen bånd, hvilket indikerer, at prøver ikke var forurenet. Hvis et negativt havde et bånd så lyst som prøverne, ville PCR være blevet betragtet som en fiasko, da det ville være risikabelt at antage, at prøverne havde ampliconer, der ikke kun var resultatet af forurening. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Eksempelsekvens tæller. (A) 16S eksempelsekvens tæller. Næsten alle disse 16S prøver havde over 1.000 sekvenser. De meget få, der havde mindre end 1.000 sekvenser, bør udelukkes fra downstream-analyser, da de ikke havde tilstrækkelige sekvenser til præcist at repræsentere deres bakteriesamfund. Flere sekvenser havde mellem 1.000 og 5.000 sekvenser; selvom de ikke er ideelle, ville de stadig være brugbare, da de overstiger det absolutte minimum, og de fleste prøver overstiger også det ideelle minimum på 5.000. (B) Metatranscriptomics eksempel tæller. Alle prøver oversteg både minimum (500.000) og det ideelle minimum (2.000.000) antal sekvenser. Derfor var sekventering vellykket for dem alle, og de kunne alle bruges i downstream-analyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Eksempelanalyse. (A) PCoA plot baseret på koordinater beregnet med en vægtet Unifrac afstand matrix skabt og visualiseret gennem QIIME2. (B) PCoA-plot baseret på koordinater beregnet med den vægtede Unifrac-afstandsmatrix, der eksporteres fra QIIME2. Koordinaterne blev visualiseret ved hjælp af Phyloseq og ggplot2 pakker i R. Metadata vektorer blev monteret på plottet ved hjælp af Vegan pakke. Hvert punkt repræsenterer en prøve bakterielle samfund, med tættere punkter, der angiver mere lignende samfund kompositioner. Klyngedannelse baseret på fracking status for disse 16S sedimentprøver blev observeret (PERMANOVA, p=0,001). Desuden viser vektorerne, at HF+ prøverne havde en tendens til at have højere niveauer af Barium, Bromide, Nikkel og Zink, hvilket svarede til forskellige bakterielle samfund sammensætning i forhold til HF-prøver. (C) Plot af bedste prædiktorer for en tilfældig skovmodel, der testede, hvor bakterielle overflod kunne bruges til at forudsige fracking status blandt prøverne. Den tilfældige skovmodel blev skabt gennem R ved hjælp af randomForest-pakken. Top 20 prædiktorer er vist samt de deraf følgende fald i urenhed (måling af antallet af HF + og HF-prøver grupperet sammen) i form af Mean Decrease i Gini Index, når de udnyttes til at adskille prøver. (D) Cirkeldiagram, der viser burkholderialernes profils antimikrobielle resistensprofil baseret på metatranscriptomiske data. Sekvenser blev først kommenteret med Kraken2 for at afgøre, hvilken taxa de tilhørte. BLAST blev derefter brugt sammen med disse kommenterede sekvenser og MEGARes 2.0-databasen til at bestemme, hvilke antimikrobielle resistensgener (i form af "MEG_#") der blev udtrykt aktivt. Antimikrobielle resistens gener udtrykt af medlemmer af Burkholderiales blev derefter udvundet for at se, hvilke der var mest udbredt blandt denne taxa. Mens dyrere og tidskrævende, metatranscriptomics giver mulighed for funktionelle analyser, som dette, som ikke kan gøres med 16S data. Især, Kraken2 blev brugt til dette eksempel analyse, i stedet for HUMAnN2. Kraken2 er hurtigere end HUMAnN2; Men det kun output kompositorisk information, i stedet for sammensætning, bidrag, og funktioner (gener) og veje som HUMAnN2 gør. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil: Et eksempel metatranscriptomics pipeline. Klik her for at downloade denne fil. 

Discussion

De metoder, der er beskrevet i dette papir, er udviklet og raffineret i løbet af flere undersøgelser offentliggjort af vores gruppe mellem 2014 og 2018^7,8,10 og er blevet anvendt med succes i et samarbejdsprojekt for at undersøge virkningerne af fracking på vandsamfund i et treårigt projekt, der snart vil indsende et papir til offentliggørelse. Disse metoder vil fortsat blive anvendt i løbet af resten af projektet. Derudover beskriver andre aktuelle litteraturer, der undersøger virkningen af fracking på vandløb og økosystemer, lignende metoder til indsamling, behandling og analyse af stikprøver^7,8,10,11. Men ingen af disse papirer udnyttet metatranscriptomic analyse, hvilket gør dette papir den første til at beskrive, hvordan disse analyser kan bruges til at belyse fracking indvirkning på nærliggende vandløb. Desuden er de metoder, der præsenteres her til prøveindsamling, mere detaljerede, og det samme gælder de skridt, der er taget for at undgå forurening.

Et af de vigtigste trin i vores protokol er indledende prøve indsamling og bevarelse. Feltudtagning og -indsamling kommer med visse udfordringer, da det kan være svært at opretholde et aseptisk eller sterilt miljø under indsamlingen. I løbet af dette trin er det vigtigt at undgå at forurene prøver. For at gøre dette skal handsker bæres, og kun sterile beholdere og værktøjer skal have lov til at komme i kontakt med prøver. Prøver bør også straks placeres på is efter indsamling for at afbøde nedbrydning af nukleinsyre. Tilføjelse af et kommercielt nukleinsyrebeskyttelsesmiddel ved indsamling kan også øge nukleinsyreudbyttet og tillade, at prøverne opbevares i længere tid efter indsamlingen. Når nukleinsyreudvinding udføres, er det vigtigt at bruge den passende mængde prøve, for meget kan tilstoppe spinfiltre, der bruges til ekstraktion (til de protokoller, der gør brug af dem), men for lidt kan resultere i lave udbytter. Sørg for at følge instruktionerne for det sæt, der bruges.

I lighed med feltindsamling er det også vigtigt at undgå eller minimere forurening under udvinding af nukleinsyre og prøveforberedelse, især når der arbejdes med prøver med lavt nukleinsyreudbytte, såsom suboptimal sedimentprøver (prøver, der indeholder en stor mængde grus eller sten) eller vandprøver. Derfor, som med prøveopsamling, handsker bør bæres under alle disse trin for at reducere forureningen. Derudover skal alle arbejdsflader, der anvendes under laboratorieprocedurer, steriliseres på forhånd ved at tørre med en 10% blegemiddelopløsning efterfulgt af en 70% ethanolopløsning. For pipetteringstrin (3-6) skal filterspidser anvendes for at undgå forurening på grund af selve pipetten, hvor spidserne ændres, hver gang de rører ved en ikke-steril overflade. Alle værktøjer, der anvendes til laboratoriearbejde, herunder pipetter, skal tørres ned før og efter med blegemiddel og ethanolopløsninger. For at vurdere kontaminering bør ekstraktionsemner og negativer (steril væske) medtages under hvert sæt nukleinsyreudtræk og PCR-reaktioner. Hvis kvantificering efter ekstraktioner afslører en påviselig mængde DNA/RNA i negativerne, kan ekstraktioner gentages, hvis der er tilstrækkelig prøve tilbage. Hvis negative prøver til PCR viser forstærkning, skal der foretages fejlfinding for at bestemme kilden, og derefter skal prøverne genvædes. For at tage højde for lave forureningsniveauer anbefales det, at ekstraktionsemner og PCR-negativer sekvenseres, så kontaminanterne om nødvendigt kan identificeres og fjernes under beregningsanalysen. Omvendt kan PCR-forstærkning også mislykkes på grund af en række årsager. For miljøprøver er hæmning af PCR-reaktionen ofte synderen, hvilket kan skyldes en række stoffer, der forstyrrer Taq polymerase²³. Hvis der er mistanke om hæmning, kan pcr-kvalitet vand (se Tabel over materialer)bruges til at fortynde DNA-ekstrakterne.

Denne protokol har et par bemærkelsesværdige begrænsninger og potentielle vanskeligheder. Prøveindsamling kan være udfordrende for både vand- og sedimentprøver. For at få nok biomasse skal der ideelt set skubbes 1 L strømvand gennem et filter. Porerne i filteret skal være små for at fange mikrober, men kan også fælde sediment. Hvis der er meget sediment i vandet på grund af nylig nedbør, kan filteret tilstoppe, hvilket gør det vanskeligt at skubbe hele volumen gennem filteret. For sediment indsamling, kan det være udfordrende at vurdere dybden af sediment under indsamling. Desuden er det vigtigt at sikre, at det indsamlede sediment overvejende er jord, da småsten og klipper vil føre til lavere nukleinsyreudbytte og måske ikke er en nøjagtig repræsentation af det mikrobielle samfund. Endelig er det også vigtigt, at prøver opbevares på is efter indsamling, især hvis der ikke anvendes et konserveringsmiddel.

Selvom denne protokol dækker både metatranscriptomics og 16S lab protokoller, Det skal understreges, at disse to metoder er meget forskellige i både processen og i den type data, de giver. 16S rRNA-genet er en almindeligt målrettet region, meget bevaret i bakterier og archaea, og nyttig til at karakterisere bakteriesamfundet i en prøve. Selv om en målrettet og specifik tilgang, artsniveau opløsning er ofte uopnåelig, og karakterisere nyligt divergerende arter eller stammer er vanskeligt. Contrarily, metatranscriptomics er en bredere tilgang, der fanger alle de aktive gener og mikrober til stede i en prøve. Mens 16S kun giver data til identifikation, kan metatranscriptomics give funktionelle data såsom udtrykte gener og metaboliske veje. Begge er værdifulde, og når de kombineres, kan de afsløre, hvilke bakterier der er til stede, og hvilke gener de udtrykker.

Dette papir beskriver metoder til feltindsamling og prøvebehandling for både 16S rRNA og metatranscriptomiske analyser i forbindelse med studier af fracking. Derudover beskriver den indsamlingsmetoder for DNA/RNA af høj kvalitet fra lav biomasseprøver og langtidsopbevaring. De metoder, der er beskrevet her, er kulminationen på vores erfaringer med prøveindsamling og -behandling i vores bestræbelser på at lære, hvordan fracking påvirker nærliggende vandløb ved at undersøge strukturen og funktionen af deres mikrobielle samfund. Mikrober reagerer hurtigt på forstyrrelser, og derfor, hvilke mikrober der er til stede, og de gener, de udtrykker, kan give oplysninger om virkningerne af fracking på økosystemer. Samlet set kan disse metoder være uvurderlige i vores forståelse af, hvordan fracking påvirker disse vigtige økosystemer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Proof Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A4094	400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits.
Agarose	Thermo Fisher Scientific	BP1356-100	100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel.
Disinfecting Bleach	Walmart (Clorox)	No catalog number	Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures
DNA gel loading dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample
DNA ladder	MilliporeSigma	D3937-1VL	A ladder should be run on every gel/e-gel
DNA/RNA Shield (2x)	Zymo Research	R1200-125	3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter)
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302-10	Used for staining user-made e-gels
Forward Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)	51-01-19-06	0.5 µL per PCR reaction
Isopropanol	MilliporeSigma	563935-1L	Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol).
PCR-grade water	MilliporeSigma	3315932001	13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used)
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)	Thermo Fisher Scientific	13000012	10 µL per PCR reaction
Reverse Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)	51-01-19-07	0.5 µL per PCR reaction
TBE Buffer (Tris-borate-EDTA)	Thermo Fisher Scientific	B52	1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel)
1 L bottle	Thermo Fisher Scientific	02-893-4E	One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses)
1.5 mL Microcentrifuge tubes	MilliporeSigma	BR780400-450EA	5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol)
2% Agarose e-gel	Thermo Fisher Scientific	G401002	Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel)
50 mL Conicals	CellTreat	229421	1 50 mL conical needed per sediment samples
500 mL Beaker	MilliporeSigma	Z740580	Only 1 needed (for flame sterilization)
Aluminum foil	Walmart (Reynolds KITCHEN)	No number	Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination)
Autoclave	Gettinge	LSS 130	Only one needed
Centrifuge	MilliporeSigma	EP5404000138-1EA	Only 1 needed
Cooler	ULINE	S-22567	Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling.
Disruptor Genie	Bio-Rad	3591456	Only one needed
Electrophoresis chamber	Bio-Rad	1664000EDU	Only 1 needed
Electrophoresis power supply	Bio-Rad	1645050	Only 1 needed
Freezer (-20 C)	K2 SCIENTIFIC	K204SDF	One needed to store DNA extracts
Freezer (-80 C)	K2 SCIENTIFIC	K205ULT	One needed to store RNA extracts
Gloves	Thermo Fisher Scientific	19-020-352	The catalog number is for Medium gloves.
Heat block	MilliporeSigma	Z741333-1EA	Only one needed
Lab burner	Sterlitech	177200-00	Only one needed
Laminar Flow Hood	AirClean Systems	AC624LFUV	Only 1 needed
Library purification kit	Qiagen	28704	One kit has enough for 50 reactions
Magnet Plate	Alpaqua	A001219	Only one needed
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004061	Only one needed
Micropipette (1000 µL volume)	Pipette.com	L-1000	Only 1 needed
Micropipette (2 µL volume)	Pipette.com	L-2	Only 1 needed
Micropipette (20 µL volume)	Pipette.com	L-20	Only 1 needed
Micropipette (200 µL volume)	Pipette.com	L-200R	Only 1 needed
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads	New England BioLabs Inc.	E7775S	One kit has enough reagents for 24 samples.
Parafilm	MilliporeSigma	P7793-1EA	2 1" x 1" squares are needed per filter
PCR Tubes	Thermo Fisher Scientific	AM12230	One tube needed per reaction
Pipette tips (for 1000 µL volume)	Pipette.com	LF-1000	Pack of 576 tips
Pipette tips (for 20 µL volume)	Pipette.com	LF-20	Pack of 960 tips
Pipette tips (for 200 µL volume)	Pipette.com	LF-250	Pack of 960 tips
PowerWulf ZXR1+ computer cluster	PSSC Labs	No number	This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed.
Qubit fluorometer starter kit	Thermo Fisher Scientific	Q33239	Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes
Scoopula	Thermo Fisher Scientific	14-357Q	Only one needed
Sterile blades	AD Surgical	A600-P10-0	One needed per filter
Sterivex-GP Pressure Filter Unit	MilliporeSigma	SVGP01050	1 filter needed per water sample
Thermocycler	Bio-Rad	1861096	Only one needed
Vise-grip	Irwin	2078500	Only one needed (for cracking open the filters)
Vortex-Genie 2	MilliporeSigma	Z258415-1EA	Only 1 needed
WHIRL-PAK bags	ULINE	S-22729	1 needed per filter
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2002	One kit has enough reagents for 50 samples.