Summary
Detta protokoll isolerar högkvalitativt totalt RNA från fekala prover av djur och människor. Ett kommersiellt miRNA-isoleringssats används med betydande anpassning för att isolera rent RNA med optimerad kvantitet och kvalitet. RNA-isolaten är bra för de flesta nedströms RNA-analyser såsom sekvensering, mikromatris och RT-PCR.
Abstract
Det blir tydligt att RNA finns i tarmlumen och avföring hos djur och människor. Protokollet som beskrivs nedan isolerar totalt RNA inklusive mikroRNA från fekala prover av djur och människor. Målet är att isolera totalt RNA med hög renhet och kvantitet för nedströmsanalyser såsom RNA-sekvensering, RT-PCR och mikromatris. Fördelarna med detta optimerade protokoll i miRNA-isoleringen är förmågan att isolera högrenade RNA-produkter med ytterligare tvättsteg beskrivna, ökad mängd RNA erhållen med en förbättrad metod vid resuspension av prov och viktiga tips för dekontaminering. En begränsning är oförmågan att bearbeta och rena större prov på mer än 200 mg eftersom dessa provstorlekar skulle orsaka svårigheter vid klar bildning av interfasen. Följaktligen kan den stora provstorleken förorena den vattenfas som ska extraheras enligt beskrivningen i protokollet med organiska ämnen som påverkar kvaliteten på RNA som isoleras i slutändan. RNA-isolat från ett prov på upp till 200 mg är dock tillräckliga för de flesta nedströmsanalyser.
Introduction
Extracellulärt RNA blir erkänt som en viktig faktor som förmedlar många biologiska processer1. Extracellulärt RNA i avföring rapporterades först 2008 som en markör för tjocktarmscancer och aktiv ulcerös kolit2, och det avslöjades nyligen som en normal komponent i tarmlumen och avföring och förmedlar värd-mikrobkommunikation 3,4,5. Syftet med detta RNA-isoleringsprotokoll är att extrahera extracellulärt RNA av hög kvalitet från fekala prover som samlats in från djur och människor. Protokollet anpassades från ett kommersiellt miRNA Isolation Kit. Det förvärvade RNA används för nedströmsanalyser såsom RNA-sekvensering, RT-PCR och mikromatris. Protokollet innehåller flera viktiga och användbara tips för att maximera kvantiteten och kvaliteten på RNA som finns i avföring från djur och människor. Anledningen till att utveckla och optimera denna metod för RNA -isolering (inklusive mikroRNA) är att minska mikrobiellt RNA i avföringen, begränsa variablerna i forskningsstudierna och analysera RNA -kompositionen i tarmen utan att redovisa olika förvirrande faktorer och föroreningskällor. Observera att denna RNA-isolering minimerar frisättningen av RNA från levande celler och levande mikrober (cellulärt RNA). Det fokuserar på extracellulära RNA som har släppts av tarmceller eller förvärvats via matintag. I huvudsak är denna metod inte lämplig för studier där det mikrobiella transkriptomet undersöks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som involverar försöksdjur som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.
Alla metoder som involverar mänskliga forskningsämnen som beskrivs här är i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Partners Human Research Committee.
1. Fekal provsamling
- Autoklav eller förbered ett sterilt och nukleasfritt 2 ml mikrocentrifugrör med ett skruvlock för varje djur som utsätts för ett experiment.
- För människor, tillhandahålla en lämplig, nukleasfri och steril avföringsprovuppsamlingsanordning för varje försöksperson.
- Samla 25-100 mg (cirka 1-4 fekala pellets för musfekala prover) av fekala prover från varje djurämne i en steril miljö.
OBS: Två eller flera fekala pellets (~ 50 mg eller tyngre) föredras för att erhålla RNA av högsta renhet.- Använd all nödvändig personlig skyddsutrustning (PPE) och material, till exempel: ett par laboratoriehandskar, en desinfektionsspray och en steril pappershandduk, för att sterilisera arbetsområdet, där djurförsökspersonen placeras på, för att undvika fekal provförorening.
- För människor, instruera varje forskningsperson / samlare att samla in 100-200 mg avföringsprover i en miljö som är så steril som möjligt. Använd standard steril drift och undvik förorening av avföringsprovet.
- Använd all nödvändig personlig skyddsutrustning (PPE) och material, till exempel: ett par laboratoriehandskar, en desinfektionsspray och en steril pappershandduk, för att sterilisera arbetsområdet, där djurförsökspersonen placeras på, för att undvika fekal provförorening.
- Samla fekala prover från varje djurförsöksperson direkt i ett 2 ml mikrocentrifugrör med skruvlock utan att vidröra några andra ytor för att undvika kontaminering.
- För människor, instruera varje försöksperson att göra avföring direkt i en tillämplig insamlingsanordning som tillhandahålls (t.ex. ett sterilt avföringsprovuppsamlingssats) för att undvika kontaminering.
OBS: Instruera ämnet att undvika kontaminering av toalettytor, vatten, urin eller andra icke-sterila ytor / föremål.
- För människor, instruera varje försöksperson att göra avföring direkt i en tillämplig insamlingsanordning som tillhandahålls (t.ex. ett sterilt avföringsprovuppsamlingssats) för att undvika kontaminering.
- Frys fekala prover som samlats in i 2 ml mikrocentrifugrör omedelbart vid -80 °C eller placera i en hink med torris för bättre kvantitet och kvalitet av RNA innan avföring återsuspensioneras enligt beskrivningen i stegen nedan.
- För avföringsprover från människa, alikvotera varje färskt prov på 200 mg i 2 ml mikrocentrifugrör med skruvkorkar och frys dem vid -80 °C före avföring som återsuspensioner enligt beskrivningen nedan.
- För förvaring av avföringsprover som inte finns i 2 ml mikrocentrifugrör med skruvkorkar, väg och överför 100-200 mg vardera frysta prover till separata 2 ml mikrocentrifugrör med skruvlock innan avföring återsuspension enligt beskrivningen nedan.
OBS: För humana avföringsprover, undvik att ta mer än 200 mg avföringsprover för RNA-isolering eftersom det kan orsaka svårigheter i följande steg. Med ett överbelastat prov i ett 2 ml mikrocentrifugrör kan det hända att vattenfasen, den organiska fasen och interfasen inte bildas och separeras tydligt. Proceduren kan pausas här.
- För förvaring av avföringsprover som inte finns i 2 ml mikrocentrifugrör med skruvkorkar, väg och överför 100-200 mg vardera frysta prover till separata 2 ml mikrocentrifugrör med skruvlock innan avföring återsuspension enligt beskrivningen nedan.
- För avföringsprover från människa, alikvotera varje färskt prov på 200 mg i 2 ml mikrocentrifugrör med skruvkorkar och frys dem vid -80 °C före avföring som återsuspensioner enligt beskrivningen nedan.
2. Beredningar av tvättlösningar
- Tillsätt 21 ml 100% etanol av American Chemical Society (ACS) till tvättlösningen 1 som tillhandahålls i miRNA-isoleringssatsen (se materialtabell) för att nå den slutliga volymen på 30 ml, som visas på flaskan. Vortex tills allt löser sig i flaskan.
- Tillsätt 40 ml ACS-kvalitet 100% etanol till tvättlösningen 2/3 som tillhandahålls för att nå den slutliga volymen på 50 ml, som visas på flaskan. Vortex i 5 s eller tills den slutliga blandningen är väl blandad.
3. Förberedelser av utrustning och material
- Spraya arbetsområdet och utrustningen, till exempel: laboratoriebänken, arbetsområdet i den kemiska dragskåpan och mikrocentrifugrörställen, med en Ribonuclease (RNase) dekontamineringslösning (t.ex. kommersiellt tillgänglig RNas-dekontamineringslösning). För att undvika kontaminering, applicera med RNase-dekontamineringslösningen på ytorna där och när det anses nödvändigt.
- Ta på dig en ren laboratorierock, ta på dig en ansiktsmask och använd lämpliga laboratoriehandskar för att skydda RNA i fekala prover från nukleaser som finns på människans hud. Spraya handskar med en RNase-dekontamineringslösning och byt handskar ofta för att undvika kontaminering.
- Förbered en hink med torris för fekala prover som förvaras vid -80 °C för att förhindra upptining innan avföring återsuspensioneras och en hink med is för material, till exempel: Syra-fenol: Kloroform, för att förlänga hållbarheten.
OBS: Se till att material inklusive media som används i protokollet är sterila utan kontaminering av nukleaser.
4. Avföring resuspension
- Återsuspendera 25-100 mg fekala prover i 600 μL steril 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
VARNING: Fekalprover bör bearbetas omedelbart när de tinas från -80 ° C utan ens partiell upptining för att minimera frisättningen av RNaser och cellulärt RNA när iskristaller brister både inre och yttre cellulära fack när celler i provet tinar.- Tillsätt 600 μl 1x DPBS till 2 ml mikrocentrifugröret med ett skruvlock som innehåller fekala prover vid rumstemperatur (RT).
- Inkubera blandningen av fekala prover nedsänkta i 600 μl 1x DPBS i 2 ml mikrocentrifugröret som är täckt i 30 minuter vid RT.
- Återsuspendera blandningen genom att mosa med 1 ml pipettspets och virvelbrunn med 2 ml mikrocentrifugröret täckt. För att optimera och öka kvantiteten och kvaliteten på RNA, återsuspendera blandningen med en homogenisator med inställningen för en cykel vid S4000 (eller 4000 rpm) och 45 s.
5. Organisk extraktion
VARNING: Använd den farliga kemiska dragskåpet för följande steg fram till steg 6 med användning av syrafenol: kloroform och ACS-kvalitet 100% etanol på grund av deras toxicitet och brandfarlighet. Byt personlig skyddsutrustning efter behov och följ lämpliga standardåtgärder vid hantering av farligt material.
- Extrahera RNA med 600 μl syrafenol: kloroform (volymen syrafenol: kloroform som krävs är lika med den ursprungliga volymen av tillsatt 1x DPBS i steg 4.1).
- Tillsätt 600 μl syrafenol: kloroform till suspensionen från steg 4.1.
OBS: Dra upp syra-fenol: kloroform från den nedre fasen i flaskan när den övre fasen blandas med en vattenhaltig buffert. Om interfasen mellan dessa två faser störs, vänta och dra tillbaka syrafenol: kloroform endast när interfasen återupprättar sig för att undvika kontaminering.
- Tillsätt 600 μl syrafenol: kloroform till suspensionen från steg 4.1.
- Vortex blandningen i 60 s för att blanda noggrant. Alternativt, för att optimera och öka mängden RNA i utbytet, blanda med hjälp av en homogenisator med inställningen för en cykel vid S4000 och 45 s.
- Centrifugera i 15 minuter vid 10 000 x g vid rt för att separera de vattenhaltiga och organiska faserna med en mikrocentrifug. Efter centrifugering bör interfasen vara kompakt. Om inte, upprepa centrifugeringen.
OBS: Om interfasen inte kunde vara så kompakt som önskat möjligen på grund av ojämnt förhållande mellan den ursprungliga volymen och volymen av tillsatt syra-fenol: kloroform efter flera upprepningar av centrifugering, fortsätt att återställa vattenfasen med större försiktighet för att undvika kontaminering. - Återställ vattenfasen och överför den till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör med gångjärnslock (tillhandahålls inte av miRNA-isoleringssatsen).
- Ta bort den vattenhaltiga (eller övre) fasen försiktigt utan att störa den nedre fasen och överför den till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör med gångjärnslock. Notera den överförda volymen (t.ex. ~ 500 μL).
OBS: När interfasen är kompakt och den övre fasen är tydligt separerad, finns det möjligen några små kvarvarande partiklar som flyter på toppen av vattenfasen. Pipettera försiktigt för att undvika dessa rester och återvinn endast synligt och tydligt separerad vattenfas för att säkerställa ett kvalitets-RNA-utbyte, även om du bara kunde få en liten volym av vattenfasen.
- Ta bort den vattenhaltiga (eller övre) fasen försiktigt utan att störa den nedre fasen och överför den till ett nytt 2 ml mikrocentrifugrör med gångjärnslock. Notera den överförda volymen (t.ex. ~ 500 μL).
6. Slutlig RNA-isolering
- Tillsätt 1,25 volymer RT ACS-kvalitet 100% etanol till vattenfasen i 2 ml mikrocentrifugröret (tillsätt t.ex. 625 μL 100% etanol om 500 μl vattenfas återvinns från steg 5.4.). Vortex 3 s.
- Ladda vattenfas-/etanolblandningen genom filterpatronen som finns i miRNA-isoleringssatsen.
- För varje prov, placera filterpatronen i ett av uppsamlingsrören som levereras av satsen.
- Överför med pipett och ladda 600 μl vattenfas/etanolblandning i filterpatronen.
OBS: Virvla blandningen kort för att noggrant blanda etanolen med vattenfas före pipettering. Högst 700 μl av vattenfas/etanolblandningen får laddas åt gången.
- Överför med pipett och ladda 600 μl vattenfas/etanolblandning i filterpatronen.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 90 s för att filtrera genom blandningen. Att snurra med högre hastighet kan skada filtret.
- Kassera filtratet och upprepa steg 6.2.1–6.2.2 tills hela blandningen filtrerats genom samma filtermembran i på varandra följande tillämpningar. Förvara och återanvänd samma uppsamlingsrör för tvättsteg nedan.
- Tvätta filtret med 700 μl miRNA Wash Solution 1.
VARNING: miRNA Wash Solution 1 innehåller guanidintiocyanat som kan orsaka hudirritation och allvarliga ögonskador. Använd nödvändig personlig skyddsutrustning, till exempel: handskar, ansiktsskydd, skyddande laboratorierock. Byt handskar ofta vid behov.- Applicera 700 μL miRNA Wash Solution 1, arbetslösningen framställd med ACS-kvalitet 100% etanol, i filterpatronen.
- Centrifugera i 60 s för att filtrera miRNA Wash Solution 1 genom filterpatronen.
- Kassera filtratet från uppsamlingsröret och placera samma filterpatron i samma uppsamlingsrör.
- Tvätta filtret med Wash Solution 2/3 en gång vardera med volymerna 700 μL, 500 μL och 250 μL i följd.
- Applicera 700 μL tvättlösning 2/3, arbetslösningen beredd med ACS-kvalitet 100% etanol, i filterpatronen.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 1 min.
- Kassera filtratet från uppsamlingsröret och placera samma filterpatron i samma uppsamlingsrör.
- Applicera 500 μL tvättlösning 2/3 i filterpatronen.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 1 min.
- Kassera filtratet från uppsamlingsröret och placera samma filterpatron i samma uppsamlingsrör.
- Applicera 250 μL tvättlösning 2/3 i filterpatronen.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 1 min.
- Kassera filtratet från uppsamlingsröret.
- Överför filterpatronen till ett nytt uppsamlingsrör och snurra enheten i 5 minuter för att ta bort kvarvarande vätska från filtret.
- Applicera 700 μL tvättlösning 2/3, arbetslösningen beredd med ACS-kvalitet 100% etanol, i filterpatronen.
- För varje prov, placera filterpatronen i ett av uppsamlingsrören som levereras av satsen.
7. Elut-RNA med 50 μL nukleasfritt vatten
- Överför filterpatronen till ett nytt uppsamlingsrör. Pipettera 50 μl nukleasfritt vatten till mitten av filtret och täck uppsamlingsröret.
- Inkubera vid RT i 10 min.
- Snurra i 5 min vid 8 000 x g för att återvinna RNA i det nya uppsamlingsröret.
- Bestäm koncentrationen och renheten hos återvunnet fekalt RNA med användning av en fluorometer. Återvunnet fekalt RNA kan lagras vid -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa RNA isolerades från 50 mg fekala musprover (2 fekala pellets för mus) respektive 100 mg humana avföringsprover och eluerades i 50 μl nukleasfritt vatten. Spektrofotometeranalys av koncentrationen tyder på att en total mängd av 49 μg respektive 16 μg RNA isolerades (tabell 1). RNA-renheten var hög, vilket indikeras av ett A260/A280-förhållande på ~2,0 och ett A260/A230-förhållande på ~1,8 (tabell 1). Som rapporterats3 är majoriteten av RNA i avföringen mikroRNA och dessa mikroRNA kan existera i exosomen. I överensstämmelse med detta föreslår en chipbaserad elektroforesanalys av RNA att representativa RNA-isolat från mus och mänsklig avföring är låga i eller saknar 18S och 28S rRNA-kompositioner, och storleken på RNA-isolat faller i den lilla RNA-regionen (Figur 1A). Ytterligare en liten RNA-elektrofores med den chipbaserade elektroforesen avslöjar att en stor del av RNA är av mikroRNA-storlek (figur 1B). Detta överensstämmer med observationen att kvantifieringen som slutförts med användning av en liten RNA-bioanalysator är jämförbar med den som erhållits med tidigare analyser6.
| Exempel på ID | Elueringsvolym (μL) | RNA-koncentration (ng/μl) | A260/A280 | A260/A230 | Avkastning (ng) |
| Mus | 50 | 978.333 | 2.036 | 1.897 | 48916.65 |
| Mänsklig | 50 | 330.759 | 1.981 | 1.849 | 16537.95 |
Tabell 1: Representativ nanodroppanalys av RNA isolerat med detta protokoll. Representativa RNA isolerades från 2 fekala pellets på möss eller 100 mg humana avföringsprover, eluterade i 50 μL nukleasfritt vatten. RNA-koncentration, förhållandet mellan A260 / A280 och förhållandet mellan A260 / A230 mättes med nanodropp.
Figur 1: Representativa chipbaserade elektroforesanalyser av storleksfördelning av fekala RNA-isolat. (A) Representativa RNA isolerade från 2 fekala pellets för mus (vänster panel) och 100 mg humana avföringsprover (höger panel) med hjälp av protokollet som beskrivs här karakteriserades med hjälp av den chipbaserade elektroforesanalysen. Denna analys tyder på att majoriteten av RNA-isolat var små RNA. (B) Isolaten utsattes sedan för den lilla RNA-elektroforesen med det chipbaserade elektroforessystemet för att analysera isolatens storleksfördelning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att använda RNas-fri teknik för att förhindra RNas-kontaminering under isoleringen7. Efter centrifugering och bildandet av en kompakt interfas är det viktigt att undvika interfas, lägre fas och partikelföroreningen som flyter på toppen av vattenfasen när man återvinner vattenfasen. Dessutom tillsätts två tvättsteg med 500 μL och 250 μL Tvättlösning 2/3 för att eliminera föroreningar i filtermembranet för optimerad kvalitet. Dessutom rekommenderas inte ett startprovmaterial på mer än 200 mg eftersom det kan skapa svårigheter vid klar bildning av en interfas. På samma sätt rekommenderas inte ett provmaterial på mindre än 25 mg eftersom det kanske inte är tillräckligt för att extrahera tillräckligt med RNA-prover för nedströmsanalys.
Den otroliga tillväxten i mikrobiomstudien har drivit mätningarna av mikrobiella arter, gener till metatranskriptionella studier av den mikrobiella profilen8. MikroRNA i avföringen har studerats som markörer för sjukdomar 9,10,11. Sedan den första rapporten om fekalt mikroRNA som förmedlar värd-mikrobinteraktioner3 börjar ökande studier undersöka bidragen från värd och kost i tarmekosystemet12,13,14. Anmärkningsvärt, på grund av rikedomen av mikrober i tarmlumen och avföring, kräver studier som fokuserar på värdarmen för värd-mikrobinteraktionen minimal RNA-kontaminering från mikrober. Således är ett RNA-extraktionsprotokoll som inkluderar steg av celllysering15 inte idealiskt för studier av RNA som frigörs från värd och diet. Som sådan anpassade vi detta protokoll för att eliminera lyssteg för att minimera kontaminering av RNA från levande bakterier och levande värdceller i avföring.
Detta protokoll fungerar för studier där extracellulärt RNA i fekal- eller tarmlumeninnehållet är ett mål av intresse. RNA isolerat med användning av detta protokoll är totalt RNA, inklusive mikroRNA som huvudkomponent. Detta protokoll skiljer inte om RNA är i exosom, mikrovesiklar eller i en vesikelfri form.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga relevanta eller materiella ekonomiska intressen som är relaterade till den forskningsmetod som beskrivs i detta protokollpapper.
Acknowledgments
Vi fick teknisk hjälp från Biopolymers Facility vid Harvard Medical School för bioanalysator. Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society forskningsanslag RG-1707-28516 (H.L.W. och S.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
- Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
- Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
- Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
- Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
- Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
- Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
- Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
- Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers. Crohn's & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
- Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
- Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
- Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
- Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
- Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
- Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).
