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Biology

माइक्रोएल्गे के मॉडल शोधन के लिए उच्च-थ्रूपुट मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग

Published: December 4, 2021 doi: 10.3791/61913
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 3, 3, 3,4, 1, 1, 1,3
1Center for Genomics and Systems Biology (CGSB), New York University Abu Dhabi Research Institute, 2Department of Biology, United Arab Emirates University, 3Laboratory of Algal, Systems, and Synthetic Biology (LASSB), Division of Science and Math, New York University Abu Dhabi, 4Department of Marine Science, Ocean College, Zhejiang University

Summary

यह प्रोटोकॉल क्लैमाइडोमोनास रेनहार्टी, एक हरे माइक्रोल्गा की मेटाबॉलिक आवश्यकताओं को परिभाषित करने और एक मौजूदा मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल को परिष्कृत करने के लिए एक फेनोटाइप माइक्रोएरी (पीएम) प्रौद्योगिकी मंच के उपयोग को दर्शाता है।

Abstract

मेटाबोलिक मॉडल को एक जीव के उपलब्ध जीनोम एनोटेशन के आधार पर खंगाला जाता है और सिस्टम-स्तर पर मेटाबोलिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भविष्य कहनेवाला उपकरण प्रदान करता है। जीनोम-स्केल मेटाबोलिक मॉडल में अंतराल के साथ-साथ प्रतिक्रियाएं शामिल हो सकती हैं जो प्रयोगात्मक रूप से असत्यापित हैं। नए अलग माइक्रोअगल प्रजातियों के पुनर्निर्मित मॉडल इन अंतरालों के कारण कमजोरियों में परिणाम होगा, क्योंकि आमतौर पर इस तरह के आइसोले के चयापचय के लिए विरल जैव रासायनिक सबूत उपलब्ध होते हैं । फेनोटाइप माइक्रोएरे (पीएम) तकनीक एक प्रभावी, उच्च थ्रूपुट विधि है जो कार्यात्मक रूप से प्रवेश मेटाबोलाइट्स की एक विस्तृत श्रृंखला के जवाब में सेलुलर मेटाबोलिक गतिविधियों को निर्धारित करती है। मेटाबोलिक मॉडलिंग के साथ उच्च थ्रूपुट फेनोटाइपिक परख का संयोजन मौजूदा मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल को जीनोमिक साक्ष्य का समर्थन और विस्तार करने के लिए जैव रासायनिक साक्ष्य प्रदान करके तेजी से खंगाला या अनुकूलित करने की अनुमति दे सकता है। इस काम में एक उदाहरण के तौर पर ग्रीन माइक्रोल्गल मॉडल प्रजाति क्लैमिडोमोनास रेनहार्टी का इस्तेमाल कर माइक्रोल्गा के अध्ययन के लिए पीएम परख का इस्तेमाल दिखाया जाएगा। प्रधानमंत्री द्वारा प्राप्त 254 से अधिक प्रतिक्रियाओं के लिए प्रायोगिक साक्ष्य का उपयोग इस अध्ययन में जीनोम-स्केल सी रेनहार्टी मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल, आईआरसी1080 को लगभग 25 प्रतिशत तक बढ़ाने और परिष्कृत करने के लिए किया गया था। यहां बनाए गए प्रोटोकॉल का उपयोग ज्ञात माइक्रोएल्गे म्यूटेंट और नए आइसोलेट सहित अन्य माइक्रोएल्गे के मेटाबोलिज्म को कार्यात्मक रूप से प्रोफाइल करने के लिए एक आधार के रूप में किया जा सकता है।

Introduction

लक्षित मेटाबोलाइट्स के उन्नत और स्थिर उत्पादन के लिए शैवाल चयापचय का अनुकूलन मेटाबोलिक नेटवर्क के सिस्टम-स्तर विश्लेषण के माध्यम से जटिल मेटाबोलिक इंजीनियरिंग रणनीतियों के विकास की आवश्यकता होती है। मेटाबॉलिक नेटवर्क मॉडल अनुकूलन रणनीतियों के तेजी से विकास के लिए तर्कसंगत डिजाइनों का मार्गदर्शन कर सकते हैं1,2,3,4. यद्यपि लगभग 160 माइक्रोलगल प्रजातियों को5अनुक्रमित किया गया है, लेकिन हमारे ज्ञान के लिए, केवल 44 शैवाल मेटाबोलिक मॉडल उपलब्ध हैं4,6,7। जीनोमिक जानकारी के प्रायोगिक सत्यापन के लिए उच्च-थ्रूपुट मेटाबोलिक फेनोटाइपिक डेटा प्राप्त करने में कठिनाई के कारण, उच्च गुणवत्ता वाले नेटवर्क मॉडल का पुनर्निर्माण शैवाल जीनोम अनुक्रमण के तेजी से विकास से पीछे है।

सी रेनहार्टी शैवाल आधारित अध्ययनों के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली है। यह प्रजातियां फोटोऑटोट्रोफिकली या विषम रूप से विकसित हो सकती हैं और बुनियादी और लागू अनुसंधान में एक मॉडल जीव के रूप में व्यापक रूप से उपयोग की जा सकती हैं। इसका जीनोम अनुक्रम 20078में प्रकाशित हुआ था, जिसमें जीनोम-स्केल मेटाबोलिक मॉडल बाद में9, 10,11प्रजातियों के लिए खंगाला गया था। सी रेनहार्टी (iRC1080) के लिए जीनोम-स्केल मॉडल को चांग एट अल द्वारा खंगाला गया था। 10 जीनोमिक और साहित्य साक्ष्य (~ 250 स्रोतों को आकर्षित करने) के आधार पर। इसमें 1,706 मेटाबोलाइट्स हैं, जिसमें 2,190 प्रतिक्रियाएंहैं 10; हालांकि, मॉडल की पूर्णता समय पर उपलब्ध प्रकाशित प्रयोगात्मक सबूत से परे सत्यापित नहीं किया जा सकता है ।

फेनोटाइप माइक्रोएरे (पीएमएस) तकनीक एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म है जो हेट्रोट्रोफिक सूक्ष्मजीवों के साथ-साथ ऊतक-संस्कृति कोशिकाओं के लिए मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग जानकारी प्रदान कर सकता है। विशेष रूप से, इसका उपयोग माइक्रोल्गा में फेनोटाइप-टू-जीनोटाइप ज्ञान अंतर को संबोधित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले क्लैमिडोमोनास रेनहार्टी12 और बाद में क्लोरॉयडियम13 और क्लोरेला14 की प्रजातियों के लिए रिपोर्ट किया गया था। हजारों मेटाबोलाइट्स, संकेत अणुओं, ओस्मोलाइट्स और प्रभावक अणुओं के लिए सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करके, प्रधानमंत्री परख कार्यात्मक मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग प्रदान कर सकते हैं और कार्य, चयापचय, और पर्यावरण संवेदनशीलता15,16,17में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । विशेष रूप से, प्रधानमंत्री ने प्रत्येक कुएं में निहित विभिन्न पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स या ओस्मोलाइट्स के साथ 96-वेल माइक्रोप्लेट में कोशिकाओं मेटाबोलाइट उपयोग का पता लगाया है। इसके अलावा, एंटीबायोटिक दवाओं और हार्मोन जैसे बायोएक्टिव अणुओं को परखना भी संभव है। टेट्राजोलियम आधारित रेडॉक्स डाई की एनएचएच कमी द्वारा रंग उत्पादन की तीव्रता से निर्धारित, सब्सट्रेट्स के मेटाबॉलिक उपयोग का मूल्यांकनसेलश्वसन 15,16, 17के संदर्भ में कियाजाताहै। 96-वेल माइक्रोप्लेट में प्रयोगों की निगरानी की जा सकती है और फेनोटाइप माइक्रोएरे इंस्ट्रूमेंट (पीएमआई) प्लेटफॉर्म के साथ समय के साथ स्वचालित रूप से निर्धारित की जा सकती है। बीस 96-वेल माइक्रोप्लेट को विभिन्न ऑस्मोटिक/आयन और पीएच प्रभावों के साथ-साथ कार्बन, नाइट्रोजन, सल्फर और फास्फोरस स्रोतों का उपयोग करने के लिए सेलुलर फेनोटाइप का अध्ययन करने के लिए आम सेट मेटाबोलाइट्स का प्रतिनिधित्व करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। पीएम तकनीक का इस्तेमाल सूक्ष्मजीवों15 , 16 , 17,18के लिए कई मौजूदा जीनोम-स्केल मेटाबोलिक मॉडल को अद्यतन और उन्नत करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है ।

यहां दिखाए गए प्रोटोकॉल और डेटा चैबूनचो एट अल द्वारा पहले प्रकाशित काम पर आधारित हैं। 12 प्रस्तुत कार्य में माइक्रोएल्गे के मेटाबॉलिक फेनोटाइप की विशेषता और सी रेनहार्ट्टी के मौजूदा शैवाल मेटाबॉलिक मॉडल का विस्तार करने के साथ-साथ नए मेटाबॉलिक मॉडल के पुनर्निर्माण का मार्गदर्शन करने के लिए पीएम परख विधि का विवरण दिया गया है ।

Protocol

1. फेनोटाइप माइक्रोएरे प्रयोग

  1. मिनेसोटा विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका (https://www.chlamycollection.org) में क्लैमाइडोमोनास रिसोर्स सेंटर से सी रेनहार्टी स्ट्रेन सीसी-503 प्राप्त करें।
  2. 400 μg/mL timentin की अंतिम सांद्रता के साथ ताजा Tris-Acetate-फॉस्फेट (नल) मीडिया19 में कोशिकाओं को बढ़ाएं, 50 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम/एमएल कानमामाइसिन (बैक्टीरियल ग्रोथ को बाधित करने के लिए) 400 माइक्रोमोल फोटॉन/एम 2 एस के तहत,25डिग्री सेल्सियस पर, दो दिनों के लिए मिड-लॉग चरण के लिए।
  3. 22 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर संस्कृति को स्पिन करें और गोली को परेशान किए बिना सुपरनैंट को त्याग दें।
  4. 0.1% टेट्राजोलियम वायलेट डाई "डी" वाले ताजा टैप मीडिया तैयार करें।
    नोट: प्रत्येक प्लेट में परीक्षण मेटाबोलाइट श्रेणी के आधार पर कुछ पोषक तत्वों को बाहर करने के लिए इस चरण में टैप मीडिया को संशोधित करें (उदाहरण के लिए, नाइट्रोजन स्रोत प्लेटों के लिए अमोनियम क्लोराइड को बाहर करें)।
  5. ताजा नल मीडिया में गोली को फिर से खर्च करें (चरण 1.2 से) 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार किया गया है।
  6. रासायनिक यौगिक सरणी परख प्लेटों (कार्बन स्रोतों, नाइट्रोजन स्रोतों, फास्फोरस और सल्फर स्रोतों प्लेटों, और पेप्टाइड नाइट्रोजन स्रोतों) का उपयोग करें।
  7. परख प्लेटों के प्रत्येक कुएं में सेल युक्त मीडिया के 100 माइक्रोन एलिकोट को टीका लगाएं।
    नोट: परख की नकल करना सुनिश्चित करें।
  8. खमीर निकालने/पेप्टोन प्लेटों पर लकीर कोशिकाओं और ग्राम धुंधला प्रदर्शन, स्मिथ एट अल में के रूप में । 20 बैक्टीरिया संदूषण की निगरानी करने के लिए परख से पहले और बाद में।
  9. माइक्रोप्लेट रीडर सिस्टम में केमिकल कंपाउंड सरणी परख प्लेट्स डालें।
  10. 7 दिनों तक 30 डिग्री सेल्सियस पर सभी प्लेटों को इनक्यूबेट करें और हर 15 मिनट में डाई कलर चेंज को पढ़ने के लिए माइक्रोप्लेट रीडर सिस्टम प्रोग्राम करें।
    नोट: जैसा कि अधिकांश माइक्रोप्लेट पाठक इनक्यूबेशन के दौरान निरंतर प्रकाश का स्रोत प्रदान नहीं करते हैं, शैवाल को हेट्रोट्रोफिक श्वसन करने में सक्षम होना चाहिए।

2. डेटा विश्लेषण

  1. माइक्रोप्लेट रीडर से कच्चे गतिज डेटा को सीएसवी फाइलों के रूप में निर्यात करें, जिसे बाद में आर में ओमनीलॉग फेनोटाइप माइक्रोएरी (ओपीएम) पैकेज में इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। मेटाडेटा (जैसे, तनाव पदनाम, विकास मीडिया, तापमान, आदि) के रूप में जैविक जानकारी जोड़ें।
    1. प्रधानमंत्री काइनेटिक डेटा कनवर्टर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना; D5E डेटा फ़ाइलों को लोड करें, और प्रधानमंत्री गतिज विश्लेषण सॉफ्टवेयर में निम्नलिखित कमांड लाइनों का उपयोग करके उन्हें ओका फ़ाइलों में परिवर्तित करें:
      लोड | आयात (ओका फ़ाइलों के फ़ोल्डर का पता लगाना) | | फिल्टर पॉप्युलेट करें आयात | सभी प्लेटें | जोड़ें बंद करना।
      निर्यात | पढ़ें डेटा (काइनेटिक), प्रारूप (सीएसवी) (Tabulate हेडर)चुनें, और प्लेटें (हर प्लेट (व्यक्तिगत फ़ाइलें)) | चुनें निर्यात डेटा | रक्षा कर।
    2. फेनोटाइप माइक्रोएरे (पीएम) डेटा विश्लेषण करने के लिए, आर सॉफ्टवेयर वातावरण के भीतर चलने वाले ओपीएम सॉफ्टवेयर पैकेज21,22 का उपयोग करें। पैकेज, ट्यूटोरियल और संदर्भ दस्तावेज उपलब्ध हैं: http://www.goeker.org/opm/। आर के लिए एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस, आरएफटीयूडियो में, निम्नलिखित आदेशों का उपयोग करके ओपीएम पैकेज और इसकी निर्भरता स्थापित करें:
      स्रोत (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R)
      पुस्तकालय (ओपीएम)
    3. निर्देशिका पर नेविगेट करें जिसमें गतिज डेटा की सीएसवी फाइलें शामिल हैं और read_ओपीएम फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा आयात करते हैं:
      x <- read_opm ("", कन्वर्ट ="जीआरपी", = सूची में शामिल हैं ("सीएसवी:"))
    4. वक्र-पैरामीटर अनुमान का उपयोग करके गतिज डेटा को कुल और असंरित करें।
      के लिए (मैं 1 में:लंबाई (x)) {
      x [i]] <मैं _aggre करता हूं [x[i], बूट = 0 एल, कोर = 1 एल, विधि = "स्प्लाइन", विकल्प = set_spline_options ("smooth.spline"))
      x [i]] <- do_disc (एक्स [i], कटऑफ = झूठी)
      }
      मेटाडेटा का #Collection
      मेटाडेटा <- collect_template ("))
      मेटाडेटा $स्ट्रेन <-सी ("ब्लैंक", सीसी-503")
      के लिए (मैं 1 में:लंबाई (x)) {x [[i]] <-include_metadata (x[i]], एमडी = मेटाडेटा, बदलें = ट्रू)}
    5. 96-अच्छी प्लेटों के लिए समय (एक्स-एक्सिस) के एक समारोह के रूप में श्वसन (या विकास) माप (वाई-एक्सिस) को मैप करने के लिए xy_plot कार्य का उपयोग करें।
      प्रिंट (xy_plot (x[[1]], शामिल हैं = "तनाव", सिद्धांत.max = झूठी))
    6. काइनेटिक डेटा के त्वरित तुलनात्मक अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए फ़ंक्शन का उपयोग करके डेटा को हीट मैप के रूप में कल्पना करें level_plot।
      level_plot (एक्स, मुख्य = सूची (), रंग = opm_opt ("color.borders"), panel.हेडर = मेटाडेटा $तनाव, cex = NULL, strip.fmt = सूची (), legend.sep =" ", अंतरिक्ष ="लैब", पूर्वाग्रह = 0.7, num.colors = 200 L)
    7. महत्वपूर्ण जैविक जानकारी निकालें, वक्र मापदंडों, कच्चे गतिज घटता से और अंतराल चरण (λ), विकास दर (μ), अधिकतम सेल श्वसन (ए), और वक्र (AUC)21के तहत क्षेत्र शामिल हैं । सकारात्मक मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए, नकारात्मक नियंत्रण के ए मानों का उपयोग करें, जो पृष्ठभूमि घटाव मूल्यों के रूप में प्रत्येक माइक्रोवेल प्लेट के खाली होने के अलावा माध्यम के साथ डाई की अजैविक प्रतिक्रियाशीलता का प्रतिनिधित्व करता है। निकालने समारोह एक पैरामीटर प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
      opm_opt ("वक्र.परम")
      परम <-निकालने (एक्स, as.labels = सूची ("तनाव"))

3. नई मेटाबोलाइट्स से जुड़े प्रतिक्रियाओं और जीन की पहचान

  1. रासायनिक यौगिक सरणी से पाए जाने वाले मेटाबोलाइट्स का उपयोग करके प्रतिक्रियाओं के लिए एंजाइम आयोग संख्या (आईसी) की पहचान करने के लिए जीन और जीनोमके क्योटो विश्वकोश (http://www.genome.jp/kegg/) (http://www.genome.jp/kegg/) और मेटासाइक (http://metacyc.org/) खोजें।
  2. संयुक्त जीनोम संस्थान (जेजीआई), फाइटोज़ोम (http://www.phytozome.net), और सहकर्मी-समीक्षाप्रकाशन23, 25, 26,27जैसे कई उपलब्ध शैवाल एनोटेशन संसाधनों में खोज के आधार के रूप में पहचाने गए ईसी नंबरोंकाउपयोग करें।
  3. यदि कोई क्वेरी किसी दिए गए ईसी नंबर के लिए कोई आनुवंशिक सबूत नहीं देती है, तो सी रेनहार्टीके निकटतम प्रजातियों से शुरू करने वाले अन्य जीवों में प्रासंगिक संबद्ध प्रोटीन की पहचान करें, फिर एनसीबीआई पीएसआई-ब्लास्ट सर्वर का उपयोग करके डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ एक प्रोफ़ाइल आधारित खोज करें और प्रतिक्रिया 12 से जुड़े उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए सी रेनहर्टी (टैक्सीड:3055) में गैर-अनावश्यक प्रोटीन (एनआर) का उपयोग करें।
  4. मैन्युअल रूप से ईएमबी-ईबीआई पीएफएएम (http://pfam.xfam.org/search), या इंटरप्रो (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) प्रोटीन डोमेन भविष्यवाणी सर्वर के माध्यम से उन ब्लास्ट हिट क्वेरी के माध्यम से खोजा गया ईसी नंबर के लिए प्रासंगिकता के लिए < 0.05 के ई मूल्यों के साथ पीएसआई-ब्लास्ट हिट को मैन्युअल रूप से क्यूरेट करें। ध्यान दें कि प्रोटीन के लिए सही एंजाइमेटिक गतिविधि की पहचान सुनिश्चित करने के लिए बाद के दो स्कैन महत्वपूर्ण कदम हैं।

4. मॉडल शोधन और मूल्यांकन

  1. नवीनतम कोबरा टूलबॉक्स v.3.0 का उपयोग करें28मटलैब में29,30मॉडल शोधन के लिए निम्नलिखित चरणों को पूरा करने के लिए मंच। कोबरा टूलबॉक्स में कदम का पालन करके स्थापित किया जा सकता है: https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html । वैकल्पिक रूप से, ध्यान दें कि कोबरा टूलबॉक्स को अन्य ओपन-सोर्स प्रोग्रामिंग भाषाओं में भी लागू किया गया है, जैसे पायथन (COBRApy31) और पर उपलब्ध है: https://opencobra.github.io/cobrapy/ ।
    1. कोबरा टूलबॉक्स v.3.0 स्थापित करने के बाद, MATLAB खोलें और टूलबॉक्स को शुरू करने के लिए निम्नलिखित कमांड निष्पादित करें:
      initCobraToolbox;
    2. कोबरा टूलबॉक्स कार्यों ऐडरक्शन और चेंजजेनोसिएशनका उपयोग करके मेटाबोलिक मॉडल मेंउनके संबंधित जीन के साथ पहचानी गई प्रतिक्रियाओं को जोड़ें। आई RC1080 मॉडल में शामिल निर्देशिका पर नेविगेट करें, http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 से डाउनलोड किया गया और मॉडल को लोड करने, उसका नाम बदलने और एक नई प्रतिक्रिया और उससे जुड़े जीन को जोड़ने के लिए निम्नलिखित आदेशों को निष्पादित करें।
      लोड ('आईआरसी 1080 .mat')
      मॉडलन्यू = आईआरसी 1080;
      मॉडलन्यू = ऐडरिक्शन (मॉडलन्यू, 'डी-अला 2', ...
      {'d-ala [ग], 'एटीपी [सी]', ...
      'डी-अलाडेटा [सी]', 'एडीपी [सी]', 'पीआई [सी]', ' ...
      'एच [सी]' },[- 2 - 1 1 1 1 1 ], झूठा);
      modelNEW = changeGeneAssociation (modelNew, ...
      'डी-अला 2', 'au.g 14655 _t 1');
    3. कुछ मामलों में जब मेटाबोलाइट का उत्पादन इंट्रासेल्युलर रूप से नहीं किया जाता है लेकिन माध्यम से लिया जाता है, तो मॉडल में नए मेटाबोलाइट्स के लिए परिवहन प्रतिक्रियाएं जोड़ें। ये परिवहन प्रतिक्रियाएं एक्सट्रासेलुलर माध्यम से साइटोसोल तक मेटाबोलाइट के निष्क्रिय प्रसार का प्रतिनिधित्व करती हैं। इसके अलावा, एक्सपेरिमेंटल माध्यम में मेटाबोलाइट को इनपुट या आउटपुट करने के लिए ऐडएक्सचेंजरेक्सन फ़ंक्शन का उपयोग करके एक इसी कृत्रिम विनिमय प्रतिक्रिया जोड़ें।
      मॉडलन्यू = ऐडरिक्शन (मॉडलन्यू, 'सीईसीपीटी', ...
      {'cycp [e]', 'cycp [c]' },[-1 1], सच)'
      मॉडलन्यू = addExchangeRxn (मॉडलन्यू, 'साइकप [ई]',- 1000, 1000);
    4. नए परिणामी मॉडल के व्यवहार का परीक्षण करें, उदाहरण के लिए, मैंBD1106, उद्देश्य समारोह के रूप में बायोमास के अधिकतमीकरण के लिए प्रकाश और अंधेरे परिस्थितियों के तहत फ़ंक्शन ऑप्टिमाइज़ेशन सीबीमॉडल का उपयोग करके फ्लक्स बैलेंस विश्लेषण (एफबीए) का उपयोग करके। प्रकाश विकास के लिए, चश्मे सौर लिथो की हल्की प्रतिक्रियाओं की निचली और ऊपरी सीमा 646.07 (अधिकतम दर) पर निर्धारित करें। अंधेरे विकास के लिए, शून्य करने के लिए सभी चश्मे प्रकाश प्रतिक्रियाओं की सीमा निर्धारित करें। अंधेरे और प्रकाश की स्थिति में विकास के लिए पहले10 परिभाषित बायोमास फ़ंक्शन का उपयोग करें। एफबीए समाधान प्रतिक्रिया प्रवाह (समाधान.v) और कम लागत (solution.w) के साथ-साथ मेटाबोलाइट्स की छाया कीमतों (solution.y) के अनुरूप एक वेक्टर का उत्पादन करेगा।
      %प्रकाश की स्थिति के तहत विकास अनुकरण:
      मॉडलन्यू = चेंजरक्सनबाउंड्स (मॉडलन्यू,......
      % 'PRISM_solar_litho', ...
      'PRISM_solar_exo', ...
      'PRISM_incandescent_ 60 डब्ल्यू', ...
      'PRISM_fluorescent_cool_ 215 डब्ल्यू', ...
      'PRISM_metal_halide', ...
      'PRISM_high_pressure_sodium', ...
      'PRISM_growth_room', ...
      'PRISM_white_LED', ...
      'PRISM_red_LED_array_ 653 एनएम', ...
      'PRISM_red_LED_ 674 एनएम', ...
      'PRISM_fluorescent_warm_ 18 डब्ल्यू', ...
      'PRISM_design_growth', ...
      }, 0, 'बी' );
      मॉडलन्यू = चेंजऑब्जेक्टिव (मॉडलन्यू, 'BIOMASS_Chlamy_mixo');
      FBAsolutionNew = ऑप्टिमाइज़किबीमॉडल (मॉडलन्यू, 'मैक्स');
    5. मैंRC1080 के लिए प्राप्त FBA समाधान की तुलना करने के लिए मैंRC1080 के लिए प्राप्त FBA समाधान की तुलना करने केलिए कदम 4.1.4 दोहराएं।
    6. कोबरा विधियों की एक श्रृंखला उपलब्ध है जिसका उपयोग मॉडलों (उदाहरण के लिए, प्रवाह परिवर्तनशीलता विश्लेषण, जीन विलोपन अध्ययन, मजबूती विश्लेषण, प्रवाह विभाजन भविष्यवाणियों, एफबीए, नमूना, आदि) की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। विस्तृत ट्यूटोरियल https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html पर पाया जा सकता है। यहां, एक उदाहरण प्रदान किया जाता है जहां iRC1080 मॉडल की तुलना इसके परिष्कृत संस्करण, iBD1106 के साथ की जाती है, छाया मूल्य (बायोमास उद्देश्य समारोह की संवेदनशीलता सिस्टम चर में परिवर्तन करने के लिए) प्राप्त करके प्रत्येक मॉडल में हिसाब है।
      मेटाबोलाइट्स के लिए छाया की कीमतें प्राप्त करें:
      शैडोप्राइस = टेबल (मॉडलन्यू.मेट्स,...
      modelNew.metNames, FBAsolutionNew.y);

Representative Results

मॉडल शैवाल क्लैमाइडोमोनास रेनहार्टी की फेनोटाइप माइक्रोरे स्क्रीनिंग
प्रधानमंत्री ने शैवाल की क्षमता का परीक्षण करते हुए कार्बन, नाइट्रोजन, सल्फर और फास्फोरस के विभिन्न स्रोतों का न्यूनतम माध्यम में उपयोग किया । इस तरीके विवरण में, हमने दिखाया कि कैसे पीएम परख का उपयोग कार्बन और नाइट्रोजन चयापचय की पहचान करने के लिए किया गया था। कार्बन और नाइट्रोजन उपयोग काइनेटिक्स को माइक्रोप्लेट रीडर के साथ मापा गया था। पीएमआई सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया। चयनित पीएम परख प्लेट्स (पीएम01 और पीएम03) के सारांश काइनेटिक्स को चित्र 1में दिखाया गया है । "xy भूखंड" 96-अच्छी प्लेटों के परख के लिए प्लॉट किए गए समय के साथ श्वसन माप प्रदर्शित करते हैं, जहां वाई-एक्सिस और एक्स-एक्सिस क्रमशः कच्चे माप और समय के मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। काइनेटिक डेटा की असेंबली का तुलनात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए डेटा को हीट-मैप पैटर्न में बदल दिया गया था।

प्रधानमंत्री डेटा(चित्रा 2)का उपयोग करके जीनोम-स्केल मेटाबोलिक नेटवर्क को परिष्कृत करने की पाइपलाइन उच्च-थ्रूपुट पीएम के एकीकरण को दर्शाती है, जीनोमिक खोजों द्वारा प्रदान किए गए प्रायोगिक साक्ष्यों के साथ एक मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल का विस्तार कर सकती है ।

पीएम01-04 और पीएम 10 प्लेटों से प्राप्त पीएम डेटा की प्रजनन क्षमता का निर्धारण करने के लिए, एक दूसरे के खिलाफ दो स्वतंत्र प्रतिकृति प्रयोगों(चित्रा 3)से डेटा को प्लॉट करने के लिए एक रैखिक प्रतिगमन का विश्लेषण किया गया था । चित्रा 3 से पता चलता है कि डेटा के बहुमत लगभग समान थे के रूप में वे ४५ ° लाइन पर गिर जाते हैं, केवल कुछ outliers के साथ मौजूद किया जा रहा है, और दृढ़ संकल्प आर2 के अपने गुणांक ०.९ था । शैवाल के लिए प्रयोगों की स्थिरता और प्रजनन क्षमता इस साजिश द्वारा सत्यापित की जाती है।

नए मेटाबोलाइट्स की पहचान
प्रधानमंत्री की परख ने सात प्लेटों में ६६२ मेटाबोलाइट्स की पहचान की; पीएम01-पीएम04 और पीएम06-पीएम08, जबकि गैस क्रोमेटोग्राफी टाइम-ऑफ-फ्लाइट (जीसी-TOF) ने ७७ मेटाबोलाइट्स३२ (चित्रा 4)की पहचान की थी । आई RC1080 में १०६८ मेटाबोलाइट्स के साथ इन दो सेटों की तुलना करते समय,केवल छह मेटाबोलाइट्स तीन सेटों के बीच छा गए, और १४९ आईRC1080 और पीएम के बीच छा गए । यह परिणाम दर्शाता है कि मेटाबॉलिक प्रोफाइलिंग प्लेटफॉर्म नई मेटाबॉलिक जानकारी का एक महत्वपूर्ण स्रोत हो सकता है।

एसिटिक एसिड पृष्ठभूमि संकेत घटाना के बाद एक सहायक कार्बन के रूप में प्लेट पीएम01 में पाया गया एकमात्र कार्बन स्रोत था। यह निष्कर्ष साहित्य33 के अनुरूप है और यह पीएम की परख की विशिष्टता को दर्शाता है। प्रधानमंत्री की परख से पता चला है कि नए सल्फर, फास्फोरस और नाइट्रोजन स्रोतों से पता चला है कि सी reinhardtii विकास के लिए उपयोग कर सकते हैं । सल्फर मेटाबोलाइट्स सल्फेट, थियासुलफेट, टेट्राथिओनेट और डीएल-लिपोमाइड थे। फास्फोरस स्रोत थियाफोस्फेट, डायथिओफोस्फेट, डी-3-फास्फो-ग्लिसेरिक एसिड, और सिस्टेमाइन-एस-फॉस्फेट थे। नाइट्रोजन स्रोत मेटाबोलाइट्स एल-अमीनो और डी-अमीनो एसिड थे, जिनमें कम आम अमीनो एसिड शामिल थे; एल-होमोसेरीन, एल-पाइरोग्लूटामिक, मिथाइलामाइन, एथिलामाइन, इथेनॉलमाइन, और डी, एल-α-अमीनो-ब्यूटिरिक, और 108 डि-पेप्टाइड्स और पांच ट्राई-पेप्टाइड्स(टेबल 1)। सभी १२८ नए पहचाने गए मेटाबोलाइट्स को उनकी संबद्ध प्रतिक्रियाओं, चुनाव आयोग की संख्या और रास्तों के लिए केजीजी और मेटासाइक में खोजा गया था ।

नए १२८ मेटाबोलाइट्स ४९ यूनिक ईसी नंबरों से जुड़े थे । इनमें से, 15 ईसीएस को पांच स्रोतों का उपयोग करके उनके जीनोमिक साक्ष्य से जोड़ा गया था; फाइटोजोम संस्करण 10.0.234 जेजीआई संस्करण 435,ऑगस्टस 5.0, और मणिचिकुल एट अल से5.2 10 एनोटेशन। ३६ और KEGG13। जीनोमिक साक्ष्य के बिना मेटाबोलाइट्स यूनिवर्सल प्रोटीन संसाधन वेबसाइट (यूनिप्रॉट, http://www.uniprot.org/)37, 38 में दर्ज किए गए थे जहां उनके संबंधित दृश्य अन्य जीवों में पाए गए थे। सी रेनहार्टी में समरूप दृश्यों की पहचान एनसीबीआई वेबसाइट से स्थिति-विशिष्ट पुनरायुक्त ब्लास्ट (पीएसआई-ब्लास्ट, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) चलाकर की गई थी, जिसमें केवल उन दृश्यों पर विचार किया गया था जिन्होंने महत्वपूर्ण संरेखण (ई-मूल्य <0.005) का उत्पादन किया था।

मॉडल परिष्करण
नए 128 मेटाबोलाइट्स से जुड़ी प्रतिक्रियाओं, उनके एन्कोडेड जीन के साथ, iRC1080 मॉडल में जोड़ा गया, नेटवर्क का विस्तार। परिणामस्वरूप मॉडल मैंBD1106, 2,444 प्रतिक्रियाओं, 1,959 मेटाबोलाइट्स, और 1,106 जीन(तालिका 2)के लिए खातों। नई 254 अतिरिक्त प्रतिक्रियाएं 20 अमीनो एसिड ऑक्सीकरण प्रतिक्रियाएं थीं, 108 डी-पेप्टाइड हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाएं, पांच ट्राइपेप्टाइड हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाएं, और 120 परिवहन प्रतिक्रियाएं, चार जीन (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3) द्वारा एन्कोड किया गया।

कुल ११३ ने डी-पेप्टाइड्स और ट्राई-पेप्टाइड्स के हाइड्रोलिसिस के लिए नई प्रतिक्रियाओं को जोड़ा । डि-पेप्टाइड्स और ट्राई-पेप्टाइड्स के हाइड्रोलिसिस दो जीन, एक डि-पेप्टाइड्स (Cre02.g078650.t1.3) के लिए और एक त्रि-पेप्टाइड्स (Cre16.g675350.t1.3) के साथ जुड़े हुए हैं ।

फास्फोरस के स्रोतों के संबंध में, सिस्टेमाइन-एस-फास्फेट के हाइड्रोलिसिस के लिए सिस्टेमाइन और फॉस्फेट में एक प्रतिक्रिया जीन JLM_162926 से जुड़ी जोड़ी गई थी।

WoLF PSORT उपकरण39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) और परिणाम Ghmsari एट अल द्वारा रिपोर्ट. 35 सेलुलर डिब्बों की विशिष्टता प्राप्त करने के लिए लागू किए गए थे जहां नई प्रतिक्रियाएं होती हैं। नई प्रतिक्रियाओं से जुड़े प्रोटीन दृश्यों का विश्लेषण करके, WoLF PSORT प्रतिक्रियाओं के लिए सेलुलर डिब्बे के रूप में साइटोसोल की भविष्यवाणी की ।

बायोकेमिकल की जानकारी अधूरी होने पर एक उत्पन्न मेटाबोलिक मॉडल में अंतराल हो सकता है। ऐसे मामलों में, गैपफाइन,एक कोबरा कमांड का उपयोग किया जाता है। यह रूट अंतराल को सूचीबद्ध करता है और नए मॉडल में नए अंतराल परिचय की पहचान की अनुमति देता है । मेटाबोलाइट्स जिन्हें मेटाबॉलिक मॉडल में तैयार नहीं किया जा सकता , उन्हें रूट गैप40,41के रूप में संदर्भित किया जाता है । रूट गैप का विश्लेषण करने से संकेत मिलता है कि आईआरसी1080 और आईबीडी1106 मॉडल दोनों में एक ही 91 अंतराल होते हैं। इससे पता चलता है कि नए मेटाबोलाइट्स और उसके जुड़े प्रतिक्रियाओं को जोड़ने से कोई अतिरिक्त रूट अंतराल शुरू नहीं हुआ । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली फेनोटाइपिंग विधि रूट अंतराल को बंद नहीं करती है, क्योंकि मूल रूट गैप मेटाबोलाइट्स में परिवहन या उत्पादन तंत्र की कमी होती है, जिन्हें फेनोटाइपिंग परख में संबोधित नहीं किया गया था। प्रकाश और अंधेरे परिस्थितियों में आईबीडी1106 के मेटाबॉलिक व्यवहार का परीक्षण करने के लिए फ्लक्स बैलेंस विश्लेषण किया गया था; (कोई एसीटेट नहीं) और (एसीटेट के साथ), क्रमशः। एल्गोरिदम एक उद्देश्य कार्य (बायोमास विकास) के लिए बायोमास अग्रदूत प्रतिक्रियाओं को अधिकतम करता है। निर्धारित उद्देश्य समारोह में प्रत्येक मेटाबोलाइट की भागीदारी का मूल्यांकन करने के लिए, सभी मेटाबोलाइट्स के लिए "छाया मूल्य" की गणना की गई थी। मेटाबोलाइट के प्रवाह परिवर्तनों के संबंध में वस्तुनिष्ठ कार्य में परिवर्तन मेटाबोलाइट30,42की छाया मूल्य को परिभाषित करता है । इस बात का संकेत है कि क्या मेटाबोलाइट "अतिरिक्त" में है या उद्देश्य कार्य को "सीमित" कर रहा है, छाया मूल्य विश्लेषण, उदाहरण के लिए बायोमास उत्पादन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। नकारात्मक या सकारात्मक छाया मूल्य मूल्य मेटाबोलाइट्स को प्रकट करते हैं, जो इसके अलावा, उद्देश्य कार्य को कम या बढ़ा देंगे। छाया की कीमतों के शून्य मूल्य मेटाबोलाइट्स को प्रकट करते हैं जो उद्देश्य कार्य को प्रभावित नहीं करेंगे। चित्रा 5 में मैंBD1106 और i RC1080 के बीच छाया कीमतों की तुलना से पता चलता है कि, अधिकांश मेटाबोलाइट्स के लिए, एक महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा जाता है; हालांकि, मतभेद क्रमशः प्रकाश और अंधेरे विकास की स्थिति के तहत १०५ और ७० मामलों में पाए जाते हैं । तालिका 4 में ऐसे मेटाबोलाइट्स के उदाहरण शामिल हैं।

Figure 1
चित्र 1: सी रेनहार्टीकी फेनोटाइपिक माइक्रोएरी प्रोफाइलिंग । श्वसन XY-भूखंडों और पीएम01 के स्तर के भूखंडों (कार्बन स्रोत; ए, सी) और पीएम03 (नाइट्रोजन स्रोत; बी, डी) परख प्लेटें दिखाई जाती हैं। यह आंकड़ा एक 8x12 सरणी है जहां प्रत्येक कोशिका एक अच्छी तरह से प्लेट का प्रतिनिधित्व करता है और इस प्रकार, एक दिया गया मेटाबोलाइट या विकास वातावरण। प्रत्येक कोशिका या अच्छी तरह से प्रतिनिधित्व के भीतर, घटता समय (एक्स-एक्सिस) के एक समारोह के रूप में कमी (वाई-एक्सिस) द्वारा डाई रूपांतरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। सीसी-503 और खाली कुओं से पीएम श्वसन घटता प्रत्येक कोशिका में दिखाया जाता है और रंग द्वारा इंगित किया जाता है (चैती रंग खाली कुओं का प्रतिनिधित्व करता है और बैंगनी रंग सीसी-503 का प्रतिनिधित्व करता है)। स्तर-भूखंड प्रत्येक श्वसन वक्र को समय के साथ एक पतली क्षैतिज रेखा बदलने वाले रंग (या अपरिवर्तित शेष) के रूप में दर्शाता है। हीटमैप रंग परिवर्तन हल्के पीले रंग (थोड़ा से कोई श्वसन नहीं हुआ है) से गहरे नारंगी या भूरे रंग (महत्वपूर्ण श्वसन जगह ले ली है) से कर रहे हैं। सी रेनहार्डी (सीसी-503) द्वारा उपयोग किए जाने वाले मेटाबोलाइट्स और खाली प्लेटें दिखाई जाती हैं। यह आंकड़ा Chaiboonchoe एट अल द्वारा पहले से प्रकाशित काम से है । 12इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 2
चित्रा 2:प्रधानमंत्री डेटा का उपयोग कर जीनोम-स्केल मेटाबोलिक नेटवर्क शोधन पाइपलाइन। एक नए यौगिक परीक्षण के बाद एक प्रधानमंत्री परख में सकारात्मक, अपने एंजाइम आयोग संख्या (ईसी), प्रतिक्रिया, और मार्ग उपलब्ध डेटाबेस, जैसे, KEGG और MetaCyc से पहचाने जाते हैं । जीनोमिक साक्ष्य तब जीनोमिक और एनोटेशन संसाधनों से निकाला जाता है जब उपलब्ध होता है और जीनोटाइप और फेनोटाइप के बीच एक लिंक बनता है। जब प्रत्यक्ष जीनोमिक सबूत अनुपलब्ध है, प्रोटीन अनुक्रम चुनाव आयोग की संख्या से पहचान की है, और आनुवंशिक सबूत पीएसआई-ब्लास्ट के माध्यम से पहचान की है । पुनर्निर्मित मेटाबोलिक नेटवर्क को नए पहचाने गए यौगिकों के आधार पर परिष्कृत किया जाता है, लेकिन केवल एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम के बाद जो प्रासंगिक डेटाबेस का उपयोग करके प्रोटीन डोमेन को क्वेरी करने पर जोर देता है। इस आंकड़े को पहले से प्रकाशित काम से Chaiboonchoe एट अल द्वारा संशोधित किया गया है । 12इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 3
चित्र 3:पीएम परीक्षणों की पुन: उत्पन्न क्षमता। पीएमआई मूल्यों को 168 घंटे की अवधि में एकत्र किया गया था, और अधिकतम पीएमआई मूल्यों को दो दोहराने के अध्ययनों के लिए प्लॉट किया गया था। प्रत्येक धुरी प्रत्येक अध्ययन के लिए अधिकतम पीएमआई मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है (एक्स-एक्सिस एक दोहराने का अध्ययन और वाई-अक्ष एक और है)। पुन: पेश किए गए मान प्रत्येक धुरी से समान दूरी पर होते हैं। प्रत्येक बिंदु एक अधिकतम मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है। रैखिक प्रतिगमन एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर द्वारा किया गया था, और इसके परिणामस्वरूप दृढ़ संकल्प (आर2)का गुणांक दिखाया गया है। इस आंकड़े को पहले से प्रकाशित काम से Chaiboonchoe एट अल द्वारा संशोधित किया गया है । 12इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

Figure 4
चित्र 4:मेटाबोलाइट्स के वेन आरेख। वेन आरेख पीएम प्लेट्स, आईRC1080 मेटाबोलिक मॉडल और गैस क्रोमेटोग्राफी टाइम ऑफ फ्लाइट (जीसी-TOF) प्रयोगों द्वारा पहचाने गए मेटाबोलाइट्स की गणना करता है । प्रत्येक वृत्त अध्ययन की प्रत्येक संबंधित विधि में मौजूद मेटाबोलाइट्स की कुल संख्या को इंगित करता है। साथ ही, ओवरलैपिंग क्षेत्र उन तरीकों के बीच साझा मेटाबोलाइट्स की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। आईRC1080 मेटाबॉलिक मॉडल में कुल 1,068 यूनिक मेटाबॉलिज् म होते हैं। जीसी-टीएफ ने कुल 77 मेटाबॉलिज् मों की पहचान की32,जबकि पीएम प्लेट्स का इस्तेमाल कर कुल 662 मेटाबोलाइट्स की पहचान की गई है। यह आंकड़ा पहले से प्रकाशित काम से है Chaiboonchoe एट अल । 12इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:बायोमास अधिकतमीकरण के लिए विभिन्न परिस्थितियों में आईआरसी1080 और आईबीडी1106 मेंमेटाबोलाइट्स की छाया कीमतें। "रडार भूखंडों" पर प्रत्येक सर्कल एक छाया मूल्य मूल्य से मेल खाती है, जबकि प्रत्येक भूखंड के केंद्र से विस्तारित प्रत्येक पंक्ति एक मेटाबोलाइट इंगित करती है। (क) छाया की कीमतें और मेटाबॉलिकव्यवहार मैं RC1080 और मैंBD1106 एक प्रकाश विकास की स्थिति के तहत; (ख), मैंRC1080 के विभिन्न चयापचय व्यवहार और मैंBD1106 एक अंधेरे विकास की स्थिति के तहत । यह आंकड़ा पहले से प्रकाशित काम से है Chaiboonchoe एट अल । 12इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

जीव विज्ञान रसायन ईसी* जीन एनोटेशन पीएसआई-ब्लास्ट
सिस्टीमाइन-एस-फॉस्फेट 3.1.3.1 JLM_1629261,2,3,4
टेट्राथियोनेट 1.8.2.2 महत्वहीन ई-मूल्य
1.8.5.2 महत्वहीन ई-मूल्य
डी-एलेनिन 1.4.1.1 XP_001700222.1
1.5.1.22 असफल मैनुअल क्यूसी
2.1.2.7 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
2.3.2.10 महत्वहीन ई-मूल्य
2.3.2.14 महत्वहीन ई-मूल्य
2.3.2.16 महत्वहीन ई-मूल्य
2.3.2.17 महत्वहीन ई-मूल्य
2.3.2.18 महत्वहीन ई-मूल्य
2.6.1.21 असफल मैनुअल क्यूसी
3.4.13.22 XP_001698572.1, XP_001693532.1, XP_001701890.1, XP_001700930.1
3.4.16.4 Chlre2_kg.पाड़_ 140000391,2,3
3.4.17.8 असफल मैनुअल क्यूसी
3.4.17.13 महत्वहीन ई-मूल्य
3.4.17.14 महत्वहीन ई-मूल्य
4.5.1.2 महत्वहीन ई-मूल्य
6.1.1.13 असफल मैनुअल क्यूसी
6.1.2.1 असफल मैनुअल क्यूसी
6.3.2.4 au.g14655_t11,2,3
6.3.2.10 असफल मैनुअल क्यूसी
6.3.2.16 महत्वहीन ई-मूल्य
6.3.2.35 महत्वहीन ई-मूल्य
डी-शतावरी 1.4.5.1 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
3.1.1.96 महत्वहीन ई-मूल्य
2.3.1.36 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.99.1 XP_001692123.1
3.5.1.77 e_gwW.1.243.11,2
3.5.1.81 महत्वहीन ई-मूल्य
5.1.1.10 असफल मैनुअल क्यूसी
डी-एस्पार्टिक एसिड 6.3.1.12 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
डी-ग्लूटामिक एसिड 1.4.3.7 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.3.3 महत्वहीन ई-मूल्य
डी-Lysine 5.4.3.4 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
6.3.2.37 असफल मैनुअल क्यूसी
डी-सेरीन 2.7.11.8 महत्वहीन ई-मूल्य
2.7.11.17 Cre12.g486350.t1.31,2,3,4
3.4.21.78 असफल मैनुअल क्यूसी
3.4.21.104 असफल मैनुअल क्यूसी
4.3.1.18 g6244.t14 असफल मैनुअल क्यूसी
6.3.2.35 महत्वहीन ई-मूल्य
6.3.3.5 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
डी-वलिन 1.21.3.1 असफल मैनुअल क्यूसी
6.3.2.26 असफल मैनुअल क्यूसी
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
एल-पाइरोग्लूटामिक एसिड
थिओफोस्फेट
डायथिओफोस्फेट
एथिलमाइन 6.3.1.6
D,L-a-Amino-Butyric एसिड 2.1.1.49 महत्वहीन ई-मूल्य
1.4.3.3 Cre02.g096350.t1.35
डि-पेप्टाइड 3.4.13.18 Cre02.g078650.t1.31
त्रि-पेप्टाइड 3.4.11.4 Cre16.g675350.t1.31

तालिका 1: आईआरसी1080 मेटाबोलिक मॉडल में मौजूद नहीं पहचाने गए सकारात्मक सब्सट्रेट उपयोग मेटाबोलाइट्स (सी, पी, एस, एन) की सूची।   * यदि किसी जीन की पहचान नहीं की गई तो प्रतिक्रिया को शामिल नहीं किया गया था।  1 फाइटोजोम संस्करण 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii)।   2 JGI संस्करण 4 35.  3 ऑगस्टस संस्करण 510।  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html) ।  5 JGI संस्करण 3.136।  यह तालिका पहले से प्रकाशित काम से है Chaiboonchoe एट अल। 12

नमूना प्रतिक्रियाओं चयापचयों जीन
आईआरसी1080 2,191 1,706 1,086
आईबीडी1106 2,445 1,959 1,106

तालिका 2:आईआरसी1080 और आईबीडी1106की सामग्री।   यह तालिका पहले से प्रकाशित काम से है Chaiboonchoe एट अल। 12

प्रतिक्रियाओं की श्रेणी या वर्ग प्रतिक्रियाओं की संख्या
अमीनो एसिड 20
डिपेप्टाइड्स 108
ट्रिपेप्टाइड्स 5
परिवहन प्रतिक्रिया 120

तालिका 3: आईबीडी1106 में नई प्रतिक्रियाओं का सारांश। यह तालिका पहले से प्रकाशित काम से है Chaiboonchoe एट अल। 12

विकास की स्थिति मेटाबोलाइट नाम आईआरसी1080 आईबीडी1106
4r5au 4-(1-डी-रिसिटीलामिनो) -5-अमीनोरासिल 0 0.168
5अप्रू 5-अमीनो-6-(5'-फॉस्फोरिबिलीलामिनो) uracil -0.009 0.158
प्रकाश pa1819Z18111Z 1-(9Z)- ऑक्टेसेनोइल, 2- (11Z) -ऑक्टेसेनोइल-एसएन-ग्लिसरोल3-फॉस्फेट -0.009 -0.65
अंधेरा 4आबट 4-अमीनोबुटानेट 0.18 -0.05

तालिका 4:आईआरसी1080 और आईबीडी1106 के लिए महत्वपूर्ण छाया कीमतों काउदाहरण। यह तालिका पहले से प्रकाशित काम से है Chaiboonchoe एट अल। 12

Discussion

ग्रीन माइक्रोल्गा, सी रेनहार्डीके मेटाबॉलिक फेनोटाइपिंग को यहां हाई थ्रूपुट पीएम परख प्लेटों और एक असंशोधित पीएमआई का उपयोग करके वर्णित किया गया था । परख का उपयोग पेप्टाइड नाइट्रोजन स्रोतों (पीएम06-08) के साथ कुल 190 कार्बन स्रोतों (पीएम01 और पीएम02), 95 नाइट्रोजन स्रोतों (पीएम03), 59 फास्फोरस स्रोतों और 35 सल्फर स्रोतों (पीएम04) के लिए किया गया था। सकारात्मक श्वसन 148 पोषक तत्वों के लिए मनाया गया था (सी-स्रोत उपयोग के लिए एक सकारात्मक परख, प्रत्येक एस-स्रोत और पी-स्रोत उपयोग के लिए चार सकारात्मक परख, और एन-स्रोत उपयोग के लिए 139 सकारात्मक परख)। मीडिया के सब्सट्रेट्स या पोषक तत्वों (कार्बन, नाइट्रोजन, फास्फोरस, या सल्फर) घटक को परिभाषित माध्यम में नहीं जोड़ा जाना चाहिए जब प्रासंगिक पीएम माइक्रोप्लेट्स पर लागू किया जाता है जो उन स्रोतों में से प्रत्येक के लिए परीक्षण करता है।

यहां दिखाई गई विधि मेटाबोलिक माइक्रोअल्गा फेनोटाइप की विशेषता के लिए प्रभावी है जिसका उपयोग मौजूदा मेटाबोलिक नेटवर्क मॉडल का विस्तार करने या नए मॉडलों के पुनर्निर्माण को निर्देशित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि अधिकांश माइक्रोशैगे की पोषण आवश्यकताओं का पता नहीं है, इसलिए इस मंच का उपयोग इन्हें तेजी से परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है। नेल्सन एट अल। 43 ने इन तरीकों को नए यौगिकों की पहचान करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया था जो माइक्रोएल्गे क्लोरॉइडियम एसपी यूटेक्स 3007 के विकास का समर्थन करते हैं और प्रजातियों के प्रवेश मेटाबोलाइट्स को परिभाषित करने के लिए प्राप्त जानकारी का उपयोग किया, जो क्लैमाइडोमोनास के विपरीत, 40 विभिन्न कार्बन स्रोतों को शामिल करता है।

माइक्रोएल्गे प्रोफाइलिंग के लिए पीएम की एक बड़ी सीमा यह है कि पीएमआई के इनक्यूबेशन चैंबर में कोई रोशनी नहीं है, और माइक्रोएल्गे को विषमतापूर्ण चयापचय को अंजाम देने में सक्षम होने की जरूरत है । प्रकाश की अनुपस्थिति उन मॉडलों की व्याख्या को प्रभावित कर सकती है जो मेटाबोलिक फ्लक्स की गणना करने के लिए प्रकाश को शामिल करते हैं। मेटाबोलिक नेटवर्क हब का गठन करने के लिए समन्वय कार्यों के साथ जीन जोड़े सह-विकसित हुए हैं, और फोटोसिंथेटिक और गैर-फोटोसिंथेटिक नेटवर्क हब के बीच अंतर44बनाया जा सकता है। सामान्य तौर पर, फोटोसिंथेटिक नेटवर्क हब (यानी, मॉडल में अत्यधिक जुड़े नोड्स) हेट्रोट्रोफिक मॉडल से बाहर रह जाएंगे। व्यावहारिक उद्देश्यों के लिए, मिक्सोट्रोफिक प्रजातियों में मॉडलिंग हेट्रोफिज्म को प्रकाश द्वारा संचालित होने वाली प्रतिक्रियाओं को छोड़ देना चाहिए और स्थितियों के बीच ऊर्जा संतुलन मतभेदों के लिए खाते हैं। इस प्रकार, क्लैमिडोमोनास मेटाबोलिक मॉडलिंग6,45में हल्के-निर्भर और हल्के-स्वतंत्र मेटाबोलिज्म को मॉडलिंग करना मानक अभ्यास है।

ट्रेबोक्सियोफाइट्स जैसे कुछ हरे माइक्रोशैगे, विकास के लिए विभिन्न प्रकार के कार्बन अणुओं को आत्मसात करने के लिए जाने जाते हैं, और यह उनके लंबे विकासवादी इतिहास से लाइकेन46के सदस्यों के रूप में उत्पन्न हुआ माना जाता है। जबकि क्लोमायोमोनास जैसे क्लोरोफाइट्स विकास के लिए एसीटेट का उपयोग कर सकते हैं, ब्राउन मरीन माइक्रोल्गा तिसोक्रिसिस ल्यूटा, जो व्यावसायिक रूप से बहुत लंबी श्रृंखला पॉलीअनसैचुरेटेड फैटी एसिड (वीएलसी-पीयूएफए) का उत्पादन करने की क्षमता के लिए जाना जाता है, एसीटेट का उपयोग नहीं कर सकता है लेकिन विकास47के लिए ग्लिसरोल का उपयोग कर सकता है। क्लोरेला के साथ 100 ग्राम एल−1 ड्राई सेल वेट की बायोमास एकाग्रता हासिल की गई है, जिसमें फेड-बैच मोड48में कार्बनिक कार्बन स्रोतों के अनुकूलित जोड़ दिए गए हैं। इसके अलावा , क्लोरेलवुलगारिस में चीनी का जोड़ सीओ2के ज़ब्ती को ऊंचा कर सकता हैऔर इस प्रकार फोटोसिंथेटिक विकास49के दौरान एक योजक लाभ प्रदान करता है। अधिकांश हेट्रोट्रोफिक माइक्रोअल्गा भी मिक्सोट्रोफिक रूप से विकसित हो सकते हैं, लेकिन क्लोरोफाइट क्रोमोक्लोरिस ज़ोफिंगिनेन्सिस को चीनी50के अलावा प्रकाश संश्लेषण बंद करने के लिए दिखाया गया है।

डिवीजन बैकिलारियोफाइटा से संबंधित डायटोम्स, फाइटोप्लैंकटन का एक प्रमुख समूह हैं। यद्यपि अधिकांश डायटॉम केवल फोटोऑटोट्रोफिक रूप से विकसित हो सकते हैं, उनमें से कुछ को मिक्सोट्रोफिक रूप से या हेट्रोट्रोफिकली51की खेती की जा सकती है। उदाहरण के लिए, ग्लिसरोल को कुछ डायटॉम में सीओ2 की अनुपस्थिति में प्रकाश में वृद्धि का समर्थन करने के लिए पाया गया था, जिसमें मॉडल प्रजातियां फियोडाक्टिलम ट्राइकॉर्नुटम52शामिल थीं। इसके अलावा, नित्ज़स्चिया लिनेरिस जैसे कुछ बेंथिक डायटॉम अंधेरे53में कार्बोहाइड्रेट पर बढ़ सकते हैं। यह उपयुक्त कार्बनिक कार्बन स्रोतों के पूरक द्वारा डायटोम्स और अन्य शैवाल समूहों को प्रधानमंत्री की परख का विस्तार करने की संभावना है ताकि कोशिकाओं को विषम रूप से बढ़ने में सक्षम बनाया जा सके, और एक मिक्सोट्रॉफी रणनीति का उपयोग संभावित रूप से अनिवार्य ऑटोट्रोफिक माइक्रोएल्गे के लिए भी किया जा सकता है जो न्यूनतम आवश्यक प्रकाश आपूर्ति प्रदान करता है।

डेटा की प्रजनन क्षमता का आकलन करने के लिए, सभी प्लेटों के लिए डुप्लिकेट परख करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। एक परख को तभी सकारात्मक माना जा सकता है जब नकारात्मक नियंत्रण और संबंधित खाली कुओं से घटाव के बाद, अवशोषण (पीएमआई मूल्य) सकारात्मक हो। यह विवरण, परीक्षण यौगिक की उपस्थिति में, माध्यम के साथ डाई की अजैविक प्रतिक्रिया का प्रतिबिंब है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए प्रमुख समर्थन NYUAD सेंटर फॉर जीनोमिक्स एंड सिस्टम्स बायोलॉजी (सीजीएसबी) द्वारा प्रदान किया गया था, जो न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय अबू धाबी अनुसंधान संस्थान अनुदान (73 71210 सीजीबी9) और NYU अबू धाबी संकाय अनुसंधान कोष (AD060) के तहत Tamkeen द्वारा वित्त पोषित था। W.F. अतिरिक्त झेजियांग विश्वविद्यालय के सौ प्रतिभा कार्यक्रम द्वारा समर्थित था । हम वीडियो रिकॉर्ड करने में मदद के लिए आशीष जायसवाल को धन्यवाद देते हैं। हम मेटाबोलिक फेनोटाइप डेटा उत्पन्न करने के लिए हांग कै को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin VWR 97062-796
Biolog assay plates [ PM01-08] Biolog, Hayward, CA, USA
Biolog Omnilog Instrument Biolog, Hayward, CA, USA
Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503 Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA. Regents of the University of Minnesota
Kanamycin VWR 0408-EU-10G
Tetrazolium Violet Dye “D” Biolog, Hayward, CA, USA
Timentin GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd 42010012-2

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जीव विज्ञान अंक 178 माइक्रोशै क्लैमिडोमोनास रेनहार्डी,फेनोटाइप माइक्रोएरी फ्लक्स बैलेंस विश्लेषण मेटाबोलिक नेटवर्क पुनर्निर्माण मेटाबोलिक मॉडल शोधन
माइक्रोएल्गे के मॉडल शोधन के लिए उच्च-थ्रूपुट मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग
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Alzahmi, A., Daakour, S., El Assal,… More

Alzahmi, A., Daakour, S., El Assal, D. C., Dohai, B. S., Chaiboonchoe, A., Fu, W., Nelson, D. R., Mystikou, A., Salehi-Ashtiani, K. High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae. J. Vis. Exp. (178), e61913, doi:10.3791/61913 (2021).

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