Summary
昆虫真社会性的许多特征依赖于殖民地内的交流和分工。通过显微注射和CRISPR介导的诱变对蚂蚁胚胎中关键调控基因的遗传操作为真社会昆虫利他行为的本质提供了见解。
Abstract
真社会性昆虫的独特性状，如社会行为和生殖分工，受其遗传系统控制。为了解决基因如何调节社会性状的问题，我们通过在合胞阶段将CRISPR复合物递送到年轻胚胎中来开发突变蚂蚁。在这里，我们提供了Harpegnathos saltator中CRISPR介导的诱变方案， Harpegnathos盐酸盐是一种具有显着表型可塑性的ponerine ant物种。 盐蚂蚁 很容易在实验室环境中饲养。收集胚胎用于用Cas9蛋白显微注射，并使用自制石英针在 体外 合成小向导RNA（sgRNA）。注射后胚胎在菌落外饲养。在第一批幼虫出现后，所有胚胎和幼虫都被运送到一个巢箱中，由一些护理人员进行进一步发育。该协议适用于诱导诱变，以分析蚂蚁的种姓特异性生理和社会行为，但也可以应用于更广泛的膜翅目动物和其他昆虫。
Introduction
昆虫的真社会性进化，即膜翅目和Blottodea目（以前称为等翅目）的进化，导致了独特且通常复杂的行为特征，这些特征在个体和群体水平上都表现出来。生殖分工是最先进的社会昆虫群体的特征，通常涉及由几个行为上和通常形态上不同的群体组成的种姓系统。种姓之间的这种行为和形态多样性不仅受其遗传系统的控制，而且通常受环境控制1，2，3，4，使真社会昆虫成为遗传和表观遗传研究的有吸引力的对象。
操纵真社会昆虫遗传系统的能力已被证明具有挑战性，因为许多物种不在实验室环境中交配和繁殖。大多数真社会昆虫在一个群体中的生殖个体也很少，限制了可以产生的后代数量，从而限制了遗传操作的样本量5。此外，与通常用于遗传研究的昆虫（如 果蝇）相比，许多真社会昆虫的生成时间较长，增加了建立遗传系的难度5。然而，一些真社会物种可以在殖民地中产生很大比例的生殖活跃个体，这减轻了挑战并为建立突变或转基因系提供了机会。
就蚂蚁种类Harpegnathos saltator而言，所有女性工人都可以在蜂王死亡或社会孤立时变得生殖活跃。这些工人被称为“玩家门”，可用于生成新的殖民地6。此外，一个群体中可能存在多个玩家门，从而增加后代产量5，7，8。到目前为止，已经在欧洲蜜蜂Apis mellifera和蚂蚁物种H. saltator，Ooceraea biroi和Solenopsis invicta9，10，11，12，13，14，15中开发了突变和/或转基因品系。.对群居蜜蜂和蚂蚁的遗传分析为更好地理解真社会性铺平了道路，为研究基因及其对真社会昆虫行为和种姓特定生理学的影响提供了一系列机会。
在这里，我们提供了一个通过H . saltator中的CRISPR / Cas9系统进行基因修饰的方案。具体来说，该技术用于在orco中产生种系突变， orco是编码所有气味受体（OR）的专性共受体的基因10。 OR 基因在膜翅目真社会昆虫中显著扩增16， orco 在昆虫嗅觉中起重要作用;如果没有它，手术室不会正常组装或运行。因此， orco 基因的突变会破坏嗅觉，神经发育和相关的社会行为9，10。
在该协议中，使用显微注射将Cas9蛋白和小向导RNA（sgRNA）引入蚂蚁胚胎中，以诱导靶基因的诱变。在这里，我们将详细描述显微注射程序以及有关菌落和注射胚胎护理的说明。这些方法适用于诱导 盐蚂 蚁中各种不同基因的诱变，并且可以应用于更广泛的膜翅目昆虫。
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Protocol
1. 定期维护 哈伯纳索斯盐菌 菌落
- 在22-25°C和12小时光照：12小时黑暗（12L：12D）照明时间表的蚂蚁饲养室的透明塑料盒中保持H . saltator 的野生型菌落。
- 使用小箱子（9.5 x 9.5 cm2）饲养个体工蜂或小蜂群。使用中等箱子（19 x 13.5 cm 2）或大箱子（27 x 19 cm2）来培养较大的菌落（图1）。
- 要创建巢箱，请使用石膏为巢箱铺地板。当湿石膏在介质和大盒子中干燥时，将泡沫块压入石膏中，深度为几厘米，距离盒子背面几厘米，以指定较低的巢穴区域。石膏干燥后，用一块方形玻璃覆盖指定的巢穴区域。
注意：在小盒子中，无需指定较低的巢穴区域。如果蚂蚁忽略了使用指定的下巢区域，则用一块方形的红色玻璃纸覆盖玻璃杯可能会有所帮助。这给人的印象是一个黑暗的地下空间，类似于 H. saltator 在野外使用的巢穴，并可能鼓励它们将育雏移动到指定区域。
- 每周两次用活蟋蟀喂养殖民地。
注意：菌落的喂食量应足以在下次喂食之前消耗掉所有蟋蟀。每周用常规蚁群的工人预先蜇伤的蟋蟀喂养任何孤立的蚂蚁和突变蚁群 2-3 次。 - 使用洗手瓶定期将水涂抹在石膏巢箱地板上。
注意：石膏应足够湿润，摸起来不会有灰尘，但应该足够干燥，以便所有添加的水都被石膏吸收。重要的是不要过度浇水。平均而言，巢箱每周需要添加一次少量水。 - 每当喂食时，清除垃圾和死人。将所有废物和死蚂蚁在-30°C下冷冻过夜，然后将这些材料作为普通垃圾处理。
- 定期向菌落中添加一小撮干锯末;这有助于幼虫化蛹，并帮助工人保持巢箱清洁。
2.石英玻璃显微注射针的制备
- 使用微量移液器拉拔玻璃显微注射针。
- 选择要拉动的玻璃杯。确保所使用的玻璃已存放在无尘和清洁的环境中。
注意：这里使用外径为1.0毫米，内径为0.5毫米，长度为7.5厘米的薄壁丝状石英玻璃来生产显微注射针。如果注射软体胚胎，硼硅酸盐针头也可能适用，但硼硅酸盐针头无法穿透硬绒毛膜。 - 设置拉拔器的参数设置。使用两步过程为盐 化嗜盐者 胚胎拉显微注射针：第一步的参数包括热量575，细丝3，速度35，延迟145和拉力75;第二步的参数包括425的热量，0的灯丝，15的速度，128的延迟和200的拉力。在第二步之后，确保所得针具有2 mm锥度和0.5μm的尖端（图2）。
注意：这组参数以及其他针型的参数可以在操作手册17 中找到。移液器拉拔器手册通常为各种技术提供推荐参数。可能需要进行一些试验和错误来确定哪些参数可以产生满足特定需求的最佳针头。短锥度是盐化嗜盐剂注射的理想选择，因为它可以穿透盐化嗜盐者胚胎的硬绒毛膜。如果注射软胚胎，例如已经去皮的胚胎（例如果蝇），大约 10 毫米的较长锥度可能会产生更好的结果。移液器拉拔器的操作手册通常提供适合不同需求的拉针的具体参数。在处理玻璃丝和拉针时戴手套很重要。如果不戴手套，裸手的油可能会转移到玻璃上。 - 设置参数后，使用微量移液器拉动用于显微注射的针头。确保针头在使用前保持在无尘和清洁的环境中。
注意：建议使用新鲜拉动的显微注射针。如果使用预拉针，应将其妥善存放在盒子中，以防止针尖损坏和潜在污染。不建议将经过长期储存的针头用于胚胎注射。
3.微量注射器的制备
- 使用显微注射器将所需的材料注射到蚂蚁胚胎中。
- 制备Cas9蛋白和 体外 合成的小向导RNA（sgRNA）的显微注射混合物10。将混合物放在冰上，直到需要装入显微注射针头。不使用时，将显微注射混合物储存在-80°C。
注意：不同物种的浓度不同。高浓度可能导致高死亡率，而低浓度可能会降低效率。我们使用 0.2 μg/μL Cas9 蛋白和 0.2 μg/μL sgRNA 进行 H. 盐剂 胚胎注射。我们的sgRNA的设计遵循先前建立的方案18。基因序列是从DNA数据库中获得的。 H. saltator 的基因组序列先前也报道过19，20。 - 调整 盐化杆菌 胚胎的注射参数：注射压力为140百帕（hPa），恒定压力为70 hPa，时间为0.4秒。调整恒定压力，使材料仅沿一个方向流动。仅当没有材料从针头流入胚胎时，才调整注射压力和时间。
注意：如果注射不同类型的胚胎，可能改变的主要参数是恒定压力，它负责确保胚胎中的液体不会流回针头。此协议中不控制音量。设置微量注射器的参数足以获得一致的注射。 - 使用微量加载器移液器吸头将显微注射针头装入 2 μL 混合物。慢慢地这样做，以确保混合物中不会形成气泡。
注意：如果形成气泡，可能难以保持一致的显微注射。 - 沿着胶带的边缘折断，仅折断针尖，使其仍保持窄锥度。确保针头断裂到足以打开尖端的程度，但不要太过严重，以至于锥度断裂。
注意：重要的是，如果针头断裂后开口太宽，则在施加注射压力之前，用户将看到液体在安装到加压微量注射器时从针头中流出。一些显微注射方案建议通过用剪刀剪断尖端来断针。不建议使用此方法，因为剪刀可能会导致针尖破碎。用破碎的针头注射胚胎将具有极大的破坏性。 - 将针头安装到显微操纵器上
4. 胚胎注射
- 从合胞期选择胚胎进行显微注射：细胞核分裂而没有细胞分裂的发育时间。
注意：这是通过显微注射进行基因组编辑开发过程中的理想时间，如之前在 果蝇21中发现的那样。 H. saltator 胚胎通过合胞期，并在卵子沉积10后约36小时达到细胞化。如果使用较年轻的胚胎进行注射，则可实现更高的效率。 - 将胚胎放在粘在玻璃显微镜载玻片上的一段双面胶带上。确保胚胎很好地固定在胶带上，以防止注射过程中移动。将胚胎垂直放置，使胚胎的侧侧位于胶带的边缘（图3）。将载玻片和衬里的胚胎放在指定的显微注射工作站的显微镜载物台上。
注意：建议将胚胎布置成可以通过在载物台上移动载玻片而不是每次注射时调整针头位置来进行连续注射。这样可以更有效地进行连续进样。 - 使用显微操纵器将针头与要注射的第一个胚胎对齐（图4a）。
- 在显微镜下沿其背/腹轴横向刺穿针头进入第一个胚胎。
- 注入显微注射混合物。寻找胚胎的轻微运动，表明由于注射的液体而导致内部压力增加。此外，注意胚胎外膜上含有可见组织和/或脂质痕迹的小液滴的形成（图4b）。
注意：液滴中存在微量组织和/或脂质表明针已成功刺穿胚胎的绒毛膜和卵黄膜。如果不存在这些材料的痕迹，则注射未成功进行，应重复注射。几秒钟后，液滴将被胚胎重新吸收，不再可见。 - 立即轻轻地从胚胎中取出针头，然后通过调整显微镜载玻片的位置进行下一个针头。重复直到所有胚胎都被注射。
- 成功注射载玻片上的所有胚胎后，将载玻片转移到潮湿的盒子中1小时，以使胚胎有时间从注射过程中恢复，然后再从载玻片中取出。
5. 注射胚胎的饲养
- 在潮湿的盒子中孵育1小时后，使用轻量级镊子轻轻地将注射的胚胎从胶带中取出，并将它们转移到装有少量70%乙醇的管中。将试管倒置几次，将胚胎转移到试管底部。重复乙醇洗涤一次，然后用高压灭菌的水洗涤三次。
- 使用小而柔软的画笔，将所有注射的胚胎转移到含有2%抗生素 - 抗真菌剂的1%琼脂平板上。倒入琼脂平板冷却后，通过使用细胞扩散器在平板表面铺展，施用抗生素 - 抗真菌剂。用封口膜密封琼脂平板以防止琼脂干燥。
注意：注射后不要试图将注射的胚胎返回菌落，因为工人可能会破坏大多数注射的胚胎。因此，通过允许胚胎在正常菌落环境之外的琼脂平板上发育来优化存活。 - 将琼脂平板在25°C孵育约4周。定期检查剖面线。
- 一旦第一个胚胎孵化成幼虫，将所有胚胎和幼虫放回巢箱，由一些年轻的护士来照顾幼崽。使用被较大的野生型菌落预先蜇伤的蟋蟀喂食，去除废物，并按照第 1 节中讨论的相同方案加水。
注意：小盒子（9.5 x 9.5 cm2）是此类菌落的理想选择。H. saltator 在圈养中繁殖良好。因此，突变胚胎可以养到成年。突变成虫的分离诱导过渡到生殖玩家门阶段。受控杂交用于与杂合或纯合个体建立突变菌落（图5）。
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Representative Results
使用此处提供的协议，成功地在 Harpegnathos盐胚胎 中进行基因组编辑。这些结果通过聚合酶链反应和pGEM克隆从注射胚胎中提取的DNA进行验证，然后进行DNA测序。使用该协议的体细胞诱变效率达到约40%。F1突变雄性与野生型雌配以产生杂合的F2雌性，如果不交配，则产生F3雄性。突变的F3雄性与杂合雌配以产生F4纯合突变雌性。通过这些F4纯合子女性个体的质谱进一步确认了目标肽的缺失。用显微解剖剪刀从雄性身上剪下翅膀，用于基因分型目的。由于工人没有翅膀，他们通常在实验后被牺牲和基因分型。由于成功的诱变，观察到异常行为，这与靶基因的丢失有关。 orco 的丧失导致与信息素感应丧失，无法检测猎物，繁殖力受损以及从殖民地徘徊有关的异常行为。此外， orco 突变蚂蚁表现出气味受体神经元和触角叶肾小球的数量减少，这表明蚂蚁的神经解剖结构依赖于气味受体功能10。
图1：Harpegnathos盐巢。 （A） 包含盐化嗜血杆菌菌落的 19 x 13.5 cm2 巢箱的外部特征。 （B）包含H.盐菌菌落的19 x 13.5 cm2巢箱的内部特征。 请注意，在一块方形玻璃下存在较低的巢穴区域。（C）一个9.5 x 9.5 cm2巢箱的外部特征，其中包含一个小的H. saltator菌落。这样的巢箱也适用于孤立的工蚁和突变群体。（D）一个9.5 x 9.5 cm2巢箱的内部特征，其中包含一个小的H. saltator菌落。请点击此处查看此图的大图。
图2：用于Harpegnathos盐化胚胎显微注射 的针头。注意针的细锥度（用箭头标记）。可以通过稍微折断尖端来打开针头。请点击此处查看此图的大图。
图3：双面胶带上的胚胎对齐。 胚胎应对齐，使其长度与胶带的长边缘平行。这样就可以通过在载物台上移动载玻片来轻松进行连续注射。 请点击此处查看此图的大图。
图4：显微注射期间看到的胚胎和针头 。 （A）注射前针头与胚胎正确对齐。针头垂直于胚胎侧的中点，这是典型的注射部位。（B）成功注射后的胚胎和针头。一个小液滴从胚胎一侧突出（用箭头标记）。 请点击此处查看此图的大图。
图5：基本突变杂交图。 CRISPR可能会诱导F0女性靶基因突变，随后在成年后分离以诱导玩家门过渡。如果种系细胞发生突变，未交配的玩家门可能会产下突变的雄性卵。F1突变的成年雄性可以与野生型雌配以产生杂合后代，或者它们可以与杂合雌配以产生纯合或杂合后代。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
昆虫（包括蚂蚁，蜜蜂，黄蜂和白蚁）之间真社会性的进化导致了新的行为和形态特征的出现，其中许多被认为受到环境和遗传因素的组合影响1，2，3，4。不幸的是，真社会昆虫作为遗传学领域研究模型的吸引力和有用性受到与该群体中诱变相关的困难的阻碍。这种障碍是由于生殖分工而发生的，这是真社会昆虫的一个关键特征，其中只有少数群体成员可以繁殖。这种性状限制了突变后代的数量，并使遗传系的发展具有挑战性5。蚂蚁种类Harpegnathos saltator为这一困境提供了解决方案，因为所有雌性在隔离时都能够成为生殖游戏者5。在这里，我们提供了使用CRISPR / Cas9系统在H. saltator中诱变的方法，通过胚胎显微注射传递。
适当的菌落维持和在适当的发育阶段选择胚胎进行显微注射至关重要。先前的工作确定，昆虫发育的合胞阶段是基因组编辑的理想阶段21，但这个阶段在H . saltator 胚胎发育中的时间以前是未知的。通过对早期胚胎切片进行核染色，我们能够确定 H. saltator 胚胎的合胞体阶段持续到卵子沉积后36小时，使我们能够确定何时选择新胚胎进行显微注射10。
选择拉针和显微注射的参数可能具有挑战性。选择拔针参数时要考虑的因素包括（1）使用的玻璃类型，（2）针头的预期用途，（3）所需的尖端尺寸，（4）针头在注射过程中将经历的阻力量，（5）所需的锥度长度，以及（6）将要注射的细胞或生物体的类型。拉针类型的建议和指南可以在各种操作手册中找到17.同样，在选择显微注射参数时需要考虑一些因素，包括（1）所用针头的大小和（2）要注射的胚胎22。虽然该协议侧重于 盐化H. saltator 胚胎中的显微注射，但随着对这些参数的修改，该技术在其他昆虫中可能会有所不同。特别是，如果所讨论的胚胎是软的或去皮的，则拔针和注射的参数会有所不同。 盐化杆菌 胚胎具有坚韧的绒毛膜，当使用具有短锥度（约2毫米）的针时，注射效果最佳。绒毛膜硬度较低的胚胎可以注射锥度较长（约10毫米）的针头。
在 H. saltator中，注射的胚胎不能立即返回殖民地，因为这样做会有被护理人员破坏的风险。如果将此协议应用于其他社会昆虫物种，则情况可能并非如此。确定其他物种的最佳显微注射后饲养方法可能需要一些试验和错误。在 H. saltator的情况下，胚胎需要在琼脂平板上饲养直到孵化。孵化后，它们可以安全地返回一个小群体，有几个工人照顾注射的育雏10。在火蚁（Solenopsis invicta）和克隆掠夺蚁（Ooceraea biroi）中使用类似的胚胎护理方法，以提高注射胚胎的存活率9，15。成年后，成熟的突变雌性可以单独或成小群体饲养以开始其生殖周期。该协议中提供了H . saltator 突变体的护理方向，但如果使用不同的物种，则应修改注射胚胎和突变成虫的护理方向以适应物种的需求。
这里提供的协议针对诱变进行了优化，其中针对特定的非必需基因。在这种情况下， orco 基因被靶向， orco 的突变不会影响蚂蚁存活到成年期。类似地，该协议可用于靶向其他非必需基因，包括与其他感觉受体相关的基因。如果靶基因是必不可少的，则必须通过CRISPR或转座子产生转基因蚂蚁。转座子介导的转基因已用于蜜蜂13 ，可能适用于蚂蚁。如果期望的结果是转基因生物，则注射的材料必须不同。然而，注射后的过程将是相似的，因此尽管期望的结果不同，但该协议的某些方面将是有益的。
总体而言， H. saltator 是用作模式生物和遗传杂交性能的理想选择，因为它的塑料生殖系统，工人在分离后开始繁殖10。这使这种蚂蚁物种与已经建立CRISPR / Cas9技术的其他蚂蚁物种区分开来，例如O . biroi，一种所有雌性都克隆繁殖的物种。 H. saltator 在同类生物中提供了独特的研究机会，因为可以建立遗传谱系，并且可以在该物种中跨代维持突变。该系统的新颖性使研究人员不仅可以产生突变蚂蚁，还可以在未来开发转基因品系。这为研究高级真社会性的遗传控制提供了新研究的机会。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢纽约大学的Danny Reinberg和Claude Desplan实验室以及亚利桑那州立大学Jürgen Liebig实验室对蚂蚁遗传学的支持。华严感谢美国国家科学基金会I/UCRC、节肢动物管理技术中心（资助号IIP-1821914）和行业合作伙伴的支持。玛雅萨尔得到了美国 - 以色列两国农业研究与发展基金，Vaadia-BARD博士后奖学金编号FI-595-19的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
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