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Genetics

एंट हार्पेग्नाथोस साल्टेटर में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस के लिए भ्रूण इंजेक्शन

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/61930
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 1,4
1Department of Biology, University of Florida, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology, Columbia University Medical Center, 4Center for Smell and Taste, University of Florida

Summary

कीट सामाजिकता की कई विशेषताएं कॉलोनी के भीतर संचार और श्रम के विभाजन पर निर्भर करती हैं। माइक्रोइंजेक्शन और सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस के माध्यम से चींटी भ्रूण में प्रमुख नियामक जीन का आनुवंशिक हेरफेर यूसोशल कीड़ों में परोपकारी व्यवहार की प्रकृति में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

Abstract

यूसोशल कीटों के अद्वितीय लक्षण, जैसे कि सामाजिक व्यवहार और श्रम का प्रजनन विभाजन, उनकी आनुवंशिक प्रणाली द्वारा नियंत्रित होते हैं। यह पता लगाने के लिए कि जीन सामाजिक लक्षणों को कैसे नियंत्रित करते हैं, हमने अपने समकालिक चरण के दौरान युवा भ्रूण में सीआरआईएसपीआर कॉम्प्लेक्स के वितरण के माध्यम से उत्परिवर्ती चींटियों को विकसित किया है। यहां, हम हार्पेग्नाथोस साल्टेटर में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस का एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो एक पोनेरिन चींटी प्रजाति है जो हड़ताली फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करती है। एच साल्टेटर चींटियों को प्रयोगशाला सेटिंग में आसानी से पाला जाता है। भ्रूण को कैस 9 प्रोटीन के साथ माइक्रोइंजेक्शन के लिए एकत्र किया जाता है और इन विट्रो संश्लेषित छोटे गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को घर-निर्मित क्वार्ट्ज सुइयों का उपयोग करके एकत्र किया जाता है। पोस्ट-इंजेक्शन भ्रूण कॉलोनी के बाहर पाले जाते हैं। पहले लार्वा के उद्भव के बाद, सभी भ्रूण और लार्वा को आगे के विकास के लिए कुछ नर्सिंग श्रमिकों के साथ घोंसले के बॉक्स में ले जाया जाता है। यह प्रोटोकॉल चींटियों में जाति-विशिष्ट शरीर विज्ञान और सामाजिक व्यवहार के विश्लेषण के लिए म्यूटेनेसिस को प्रेरित करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन हाइमनोप्टेरान और अन्य कीड़ों के व्यापक स्पेक्ट्रम पर भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

कीटों में यूसोशलिटी का विकास, अर्थात् हाइमनोप्टेरा और ब्लाटोडिया (पूर्व में आइसोप्टेरा) के आदेशों के परिणामस्वरूप अद्वितीय और अक्सर परिष्कृत व्यवहार लक्षण सामने आए हैं जो व्यक्तिगत और कॉलोनी दोनों स्तरों पर प्रकट होते हैं। श्रम का प्रजनन विभाजन, सामाजिक कीटों के सबसे उन्नत समूहों की विशेषता वाला एक लक्षण, अक्सर कई व्यवहारिक और अक्सर रूपात्मक रूप से विशिष्ट समूहों से बना जाति प्रणालियां शामिल होती हैं। जातियों के बीच इस तरह की व्यवहार और रूपात्मक विविधता न केवल उनकी आनुवंशिक प्रणाली द्वारा नियंत्रित की जाती है, बल्कि अक्सर पर्यावरण 1,2,3,4 द्वारा भी नियंत्रित होती है, जिससे यूसोशल कीड़े आनुवंशिक और एपिजेनेटिक अनुसंधान के लिए आकर्षक विषय बन जाते हैं।

यूसोशल कीटों की आनुवंशिक प्रणाली में हेरफेर करने की क्षमता चुनौतीपूर्ण साबित हुई है क्योंकि कई प्रजातियां प्रयोगशाला सेटिंग्स में संभोग और प्रजनन नहीं करती हैं। अधिकांश यूसोशल कीटों में एक कॉलोनी में बहुत कम प्रजनन व्यक्ति होते हैं, जो पैदा होने वाली संतानों की संख्या को सीमित करते हैं और परिणामस्वरूप, आनुवंशिक हेरफेर के लिए नमूना आकार को सीमित करतेहैं। इसके अतिरिक्त, कई यूसोशल कीटों में आमतौर पर आनुवंशिक अध्ययन (जैसे ड्रोसोफिला) के लिए उपयोग किए जाने वाले कीड़ों की तुलना में लंबी पीढ़ी का समय होता है, जिससे आनुवंशिक लाइनों को स्थापित करने में कठिनाई होतीहै। हालांकि, कुछ यूसोशल प्रजातियां एक कॉलोनी में प्रजनन रूप से सक्रिय व्यक्तियों का एक बड़ा अनुपात उत्पन्न कर सकती हैं, जो चुनौतियों को कम करती हैं और उत्परिवर्ती या ट्रांसजेनिक लाइनों को स्थापित करने के अवसर प्रदान करती हैं।

पोनेरिन चींटी प्रजाति, हार्पेग्नाथोस साल्टेटर के मामले में, सभी महिला श्रमिक रानी की मृत्यु या सामाजिक अलगाव पर प्रजनन रूप से सक्रिय हो सकती हैं। इन श्रमिकों को "गेमरगेट्स" के रूप में जाना जाता है और इसका उपयोग नई कॉलोनियों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकताहै। इसके अलावा, एक कॉलोनी में एक से अधिक गेमरगेट मौजूद हो सकते हैं, इस प्रकार संतान उत्पादन 5,7,8 बढ़ सकता है। अब तक, उत्परिवर्ती और / या ट्रांसजेनिक लाइनें यूरोपीय मधुमक्खी, एपिस मेलिफेरा, और चींटी प्रजातियों में विकसित की गई हैं, एच साल्टेटर, ओसेरिया बिरोई, और सोलेनोसिस इनविक्टा 9,10,11,12,13,14,15 . सामाजिक मधुमक्खियों और चींटियों में आनुवंशिक विश्लेषण ने यूसोशलिटी की बेहतर समझ की ओर मार्ग प्रशस्त किया है, जो जीन और यूसोशल कीट व्यवहार और जाति-विशिष्ट शरीर विज्ञान पर उनके प्रभावों का अध्ययन करने के अवसरों की एक सरणी प्रदान करता है।

यहां, हम एच साल्टेटर में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली के माध्यम से आनुवंशिक संशोधन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, इस तकनीक का उपयोग ऑर्को में जर्मलाइन म्यूटेशन उत्पन्न करने के लिए किया गया था, जीन सभी ओडोरेंट रिसेप्टर्स (ओआरएस) 10 के सह-रिसेप्टर को एन्कोडिंग करता है। हाइमनोप्टेरान यूसोशल कीड़ों16 में जीन का उल्लेखनीय रूप से विस्तार किया गया है, और ऑर्को कीट ओलफैक्शन में एक आवश्यक भूमिका निभाता है; इसकी अनुपस्थिति में, ओआर सामान्य रूप से इकट्ठा या कार्य नहीं करते हैं। इसलिए ऑर्को जीन के उत्परिवर्तन घ्राण संवेदना, तंत्रिका विकास और संबंधित सामाजिक व्यवहार 9,10 को बाधित करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, कैस 9 प्रोटीन और छोटे गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) को एक लक्ष्य जीन के म्यूटेनेसिस को प्रेरित करने के उद्देश्य से माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके चींटी भ्रूण में पेश किया जाता है। यहां, हम कॉलोनियों और इंजेक्शन भ्रूण की देखभाल के बारे में निर्देशों के साथ माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करेंगे। ये विधियां एच साल्टेटर चींटियों में विभिन्न जीनों में म्यूटेनेसिस को प्रेरित करने के लिए उपयुक्त हैं और हाइमनोप्टेरान कीटों के व्यापक स्पेक्ट्रम पर लागू की जा सकती हैं।

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Protocol

1. हार्पेग्नाथोस साल्टेटर कॉलोनियों का नियमित रखरखाव

  1. 22-25 डिग्री सेल्सियस पर एक चींटी पालन कमरे में पारदर्शी प्लास्टिक के बक्से में एच साल्टेटर की जंगली प्रकार की कॉलोनियों को बनाए रखें और 12 घंटे प्रकाश की एक फोटोअवधि: 12 घंटे अंधेरे (12 एल: 12 डी) प्रकाश अनुसूची।
    1. व्यक्तिगत श्रमिकों या छोटी कॉलोनियों को पालने के लिए छोटे बक्से (9.5 x 9.5 सेमी2) का उपयोग करें। बड़ी कॉलोनियों को पीछे करने के लिए मध्यम बक्से (19 x 13.5सेमी 2) या बड़े बक्से (27 x 19 सेमी2) का उपयोग करें (चित्र 1)।
    2. घोंसले के बक्से बनाने के लिए, बक्से के लिए फर्श बनाने के लिए प्लास्टर का उपयोग करें। चूंकि गीला प्लास्टर मध्यम और बड़े बक्से में सूख रहा है, इसलिए निचले घोंसले के क्षेत्र को नामित करने के लिए बॉक्स के पीछे से कुछ सेंटीमीटर गहरे और कुछ सेंटीमीटर प्लास्टर में एक फोम ब्लॉक दबाएं। एक बार प्लास्टर सूख जाने के बाद, नामित घोंसले के क्षेत्र को कांच के एक चौकोर टुकड़े से कवर करें।
      नोट: छोटे बक्से में, निचले घोंसले के क्षेत्र को नामित करने की कोई आवश्यकता नहीं है। यदि चींटियां निर्दिष्ट निचले घोंसले क्षेत्र का उपयोग करने की उपेक्षा कर रही हैं, तो यह लाल सेलोफेन के वर्ग टुकड़े के साथ ग्लास को कवर करने में मदद कर सकता है। यह घोंसले के समान एक अंधेरे भूमिगत स्थान का आभास देता है जो एच साल्टेटर जंगली में उपयोग करता है और उन्हें अपने ब्रूड को निर्दिष्ट क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए प्रोत्साहित कर सकता है।
  2. प्रति सप्ताह दो बार लाइव झींगुर के साथ कॉलोनियों को खिलाएं।
    नोट: कॉलोनियों को पर्याप्त खिलाया जाना चाहिए कि वे अपने अगले भोजन से पहले सभी झींगुर का उपभोग करें। किसी भी अलग-थलग चींटियों और उत्परिवर्ती चींटियों को हर हफ्ते 2-3 बार नियमित कॉलोनी के श्रमिकों द्वारा पहले से डंक मारने वाले झींगुर के साथ खिलाएं।
  3. वॉश बोतल का उपयोग करके प्लास्टर नेस्ट बॉक्स फर्श पर नियमित रूप से पानी लागू करें।
    नोट: प्लास्टर को इतना नम होना चाहिए कि यह स्पर्श के लिए धूल महसूस न करे, लेकिन यह पर्याप्त सूखा होना चाहिए कि सभी अतिरिक्त पानी प्लास्टर द्वारा अवशोषित हो जाएं। यह महत्वपूर्ण है कि घोंसले को अत्यधिक पानी नहीं दिया जाता है। औसतन, घोंसले के बक्से को प्रति सप्ताह एक बार पानी की थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होगी।
  4. जब भी भोजन होता है, कचरा और मृत व्यक्तियों को हटा दें। इन सामग्रियों को नियमित कचरे के रूप में निपटाने से पहले -30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सभी अपशिष्ट और मृत चींटियों को फ्रीज करें।
  5. समय-समय पर कॉलोनियों में सूखे चूरा की एक चुटकी जोड़ें; यह लार्वा की मदद करता है क्योंकि वे प्यूपेशन से गुजरते हैं और श्रमिकों को घोंसले के बॉक्स को साफ रखने में मदद करते हैं।

2. क्वार्ट्ज ग्लास माइक्रोइंजेक्शन सुइयों की तैयारी

  1. ग्लास माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को खींचने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें।
  2. खींचने के लिए ग्लास का चयन करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जा रहे ग्लास को धूल मुक्त और स्वच्छ वातावरण में संग्रहीत किया गया है।
    नोट: यहां, 1.0 मिमी के बाहरी व्यास, 0.5 मिमी के आंतरिक व्यास और 7.5 सेमी की लंबाई के साथ पतली दीवार वाले फिलामेंटस क्वार्ट्ज ग्लास का उपयोग माइक्रोइंजेक्शन सुइयों का उत्पादन करने के लिए किया गया है। यदि नरम शरीर वाले भ्रूण को इंजेक्ट किया जाता है, तो बोरोसिलिकेट सुई भी लागू हो सकती है, लेकिन बोरोसिलिकेट सुई कठोर कोरियन को भेदने में सक्षम नहीं हैं।
  3. पुलर की पैरामीटर सेटिंग्स सेट करें। साल्टेटर भ्रूण के लिए माइक्रोइंजेक्शन सुइयों को खींचने के लिए दो-चरण यी प्रक्रिया का उपयोग करें: पहले चरण के मापदंडों में 575 की गर्मी, 3 का फिलामेंट, 35 का वेग, 145 की देरी और 75 का खिंचाव शामिल है; दूसरे चरण के मापदंडों में 425 की गर्मी, 0 का फिलामेंट, 15 का वेग, 128 की देरी और 200 का खिंचाव शामिल है। दूसरे चरण के बाद, सुनिश्चित करें कि परिणामी सुई में 2 मिमी टेपर और 0.5 μm की नोक है (चित्रा 2)।
    नोट: अन्य सुई प्रकारों के मापदंडों के साथ मापदंडों का यह सेट, ऑपरेशन मैनुअल17 में पाया जा सकता है। पिपेट पुलर्स के लिए मैनुअल अक्सर विभिन्न तकनीकों के लिए अनुशंसित पैरामीटर प्रदान करते हैं। यह निर्धारित करने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है कि कौन से पैरामीटर विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए सबसे अच्छी सुइयां उत्पन्न करते हैं। एक छोटा टेपर एच साल्टेटर इंजेक्शन के लिए आदर्श है, क्योंकि यह एच साल्टेटर भ्रूण के कठोर कोरियन में प्रवेश कर सकता है। यदि एक नरम भ्रूण को इंजेक्ट करना, जैसे कि एक जिसे डिकोरियोनेटेड किया गया है (उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला), 10 मिमी के आसपास एक लंबा पतला बेहतर परिणाम दे सकता है। पिपेट खींचने वालों के लिए ऑपरेशन मैनुअल आमतौर पर विभिन्न आवश्यकताओं के लिए उपयुक्त सुइयों को खींचने के लिए विशिष्ट पैरामीटर प्रदान करते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि ग्लास फिलामेंट्स को संभालते समय और सुइयों को खींचते समय दस्ताने पहने जाएं। यदि दस्ताने नहीं पहने जाते हैं तो नंगे हाथों से तेल कांच में स्थानांतरित हो सकते हैं।
  4. एक बार पैरामीटर सेट हो जाने के बाद, माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुइयों को खींचने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि सुइयों को धूल मुक्त और स्वच्छ वातावरण में रखा जाता है जब तक कि उपयोग नहीं किया जाता है।
    नोट: ताजा खींची गई माइक्रोइंजेक्शन सुइयों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यदि पहले से खींची गई सुइयों का उपयोग किया जाता है, तो उन्हें सुई युक्तियों और संभावित संदूषण के नुकसान को रोकने के लिए एक बॉक्स में ठीक से संग्रहीत किया जाना चाहिए। लंबे समय तक भंडारण से गुजरने वाली सुइयों को भ्रूण इंजेक्शन के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है।

3. माइक्रोइंजेक्टर की तैयारी

  1. चींटी भ्रूण में वांछित सामग्री इंजेक्ट करने के लिए एक माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करें।
  2. कैस 9 प्रोटीन और इन विट्रो संश्लेषित छोटे गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) 10 का माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण तैयार करें। मिश्रण को बर्फ पर रखें जब तक कि माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करने का समय न हो। जब उपयोग में नहीं हो, तो माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: सांद्रता विभिन्न प्रजातियों में भिन्न होती है। उच्च एकाग्रता उच्च मृत्यु दर का कारण बन सकती है, जबकि कम एकाग्रता दक्षता को कम कर सकती है। हम एच साल्टेटर भ्रूण इंजेक्शन के लिए 0.2 μg / μL Cas9 प्रोटीन और 0.2 μg / μL sgRNA का उपयोग करते हैं। हमारे एसजीआरएनए के डिजाइन ने पहले से स्थापित प्रोटोकॉल18 का पालन किया। जीन अनुक्रम डीएनए डेटाबेस से प्राप्त किए गए थे। एच साल्टेटर का जीनोम अनुक्रम भी पहले19,20 बताया गया था।
  3. साल्टेटर भ्रूण के लिए इंजेक्शन मापदंडों को समायोजित करें: 140 हेक्टोपास्कल (एचपीए) का एक इंजेक्शन दबाव, 70 एचपीए का निरंतर दबाव और 0.4 सेकंड का समय। निरंतर दबाव को समायोजित करें जैसे कि सामग्री केवल एक दिशा में बहती है। इंजेक्शन के दबाव और समय को केवल तभी समायोजित करें जब भ्रूण में सुई से कोई सामग्री नहीं बह रही हो।
    नोट: यदि एक अलग प्रकार के भ्रूण को इंजेक्ट किया जाता है, तो प्राथमिक पैरामीटर जो बदल सकता है वह निरंतर दबाव है, जो यह सुनिश्चित करने के लिए जिम्मेदार है कि भ्रूण से तरल पदार्थ सुई में वापस नहीं बहता है। वॉल्यूम इस प्रोटोकॉल में नियंत्रित नहीं है. लगातार इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए माइक्रोइंजेक्टर के मापदंडों को सेट करना पर्याप्त है।
  4. माइक्रोलोडर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके मिश्रण के 2 μL के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें। यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे करें कि मिश्रण में कोई बुलबुले नहीं बनते हैं।
    नोट: यदि बुलबुले बनते हैं, तो लगातार सूक्ष्म इंजेक्शन बनाए रखना मुश्किल हो सकता है।
  5. टेप के किनारे के साथ टूटकर सुई की नोक को तोड़ें ताकि एक संकीर्ण टेपर अभी भी बनाए रखा जाए। सुनिश्चित करें कि सुई सिर्फ इतनी टूट गई है कि नोक खुल गई है, लेकिन इतना नहीं कि टेपर टूट जाए।
    नोट: महत्वपूर्ण रूप से, यदि टूटने के बाद सुई का उद्घाटन बहुत चौड़ा है, तो उपयोगकर्ता इंजेक्शन दबाव के आवेदन से पहले दबाव वाले माइक्रोइंजेक्टर पर चढ़ने पर सुई से तरल को बाहर निकलते हुए देखेगा। कुछ माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल कैंची से नोक काटकर सुइयों को तोड़ने की सलाह देते हैं। इस विधि की सलाह नहीं दी जाती है, क्योंकि कैंची सुई की नोक को चकनाचूर कर सकती है। टूटी हुई सुई के साथ भ्रूण को इंजेक्ट करना अत्यधिक हानिकारक होगा।
  6. सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर पर माउंट करें

4. भ्रूण का इंजेक्शन

  1. सिंसाइटियल चरण से माइक्रोइंजेक्शन के लिए भ्रूण का चयन करें: विकास के दौरान वह समय जिसमें नाभिक साइटोकिनेसिस के बिना विभाजित होते हैं।
    नोट: यह माइक्रोइंजेक्शन द्वारा जीनोम संपादन के लिए विकास के दौरान आदर्श समय है, जैसा कि ड्रोसोफिला21 में पहले खोजा गया था। एच साल्टेटर भ्रूण सिंकेटियल चरण से गुजरते हैं और अंडे के जमाव के 10 के बाद लगभग 36 घंटे के आसपास सेलुलराइजेशन तकपहुंचते हैं। इंजेक्शन के लिए छोटे भ्रूण का उपयोग करने पर उच्च दक्षता प्राप्त की जाती है।
  2. ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड से चिपके डबल-साइडेड टेप के एक टुकड़े पर लाइन भ्रूण। सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन के दौरान आंदोलन को रोकने के लिए भ्रूण टेप में अच्छी तरह से सुरक्षित हैं। भ्रूण को एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में रखें, जैसे कि भ्रूण का पार्श्व पक्ष टेप के किनारे पर है (चित्रा 3)। स्लाइड और पंक्तिबद्ध भ्रूण को एक निर्दिष्ट माइक्रोइंजेक्शन वर्कस्टेशन पर माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें।
    नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि भ्रूण को इस तरह से व्यवस्थित किया जाए कि प्रत्येक इंजेक्शन के साथ सुई की स्थिति को समायोजित करने के बजाय मंच पर स्लाइड को स्थानांतरित करके क्रमिक इंजेक्शन किए जा सकें। यह क्रमिक इंजेक्शन को अधिक कुशलता से करने की अनुमति देता है।
  3. सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 4ए) का उपयोग करके इंजेक्ट किए जाने वाले पहले भ्रूण के साथ संरेखित करें।
  4. सूक्ष्मदर्शी के तहत सुई को उसके पृष्ठीय/उदर अक्ष के साथ पहले भ्रूण में पंचर करें।
  5. माइक्रोइंजेक्शन मिश्रण इंजेक्ट करें। भ्रूण की मामूली गति की तलाश करें, इंजेक्शन तरल के कारण आंतरिक दबाव में वृद्धि का संकेत देता है। इसके अतिरिक्त, भ्रूण की बाहरी झिल्ली पर ऊतक और / या लिपिड के दृश्यमान निशान वाली एक छोटी बूंद के गठन के लिए देखें (चित्रा 4बी)।
    नोट: बूंद में ऊतक और / या लिपिड के निशान की उपस्थिति इंगित करती है कि सुई ने भ्रूण के कोरियन और विटेलिन झिल्ली दोनों को सफलतापूर्वक पंचर कर दिया है। यदि इन सामग्रियों के निशान मौजूद नहीं हैं, तो इंजेक्शन सफलतापूर्वक नहीं किया गया था और इसे दोहराया जाना चाहिए। कुछ सेकंड के बाद, बूंद भ्रूण द्वारा पुन: अवशोषित हो जाएगी और अब दिखाई नहीं देगी।
  6. धीरे से भ्रूण से सुई को तुरंत हटा दें, और माइक्रोस्कोप स्लाइड की स्थिति को समायोजित करके अगले पर आगे बढ़ें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी भ्रूण ों को इंजेक्शन न दिया जाए।
  7. एक बार स्लाइड पर सभी भ्रूण सफलतापूर्वक इंजेक्ट हो जाने के बाद, स्लाइड को 1 घंटे के लिए आर्द्र बॉक्स में स्थानांतरित करें ताकि भ्रूण को स्लाइड से हटाने से पहले इंजेक्शन प्रक्रिया से उबरने का समय मिल सके।

5. इंजेक्शन भ्रूण का पालन

  1. एक आर्द्र बॉक्स में इनक्यूबेशन के 1 घंटे के बाद, धीरे से फेदरवेट फोर्सप्स का उपयोग करके टेप से इंजेक्शन भ्रूण को हटा दें, और उन्हें 70% इथेनॉल की थोड़ी मात्रा से भरी ट्यूब में स्थानांतरित करें। भ्रूण को ट्यूब के तल में स्थानांतरित करने के लिए ट्यूब को कई बार उलटा करें। इथेनॉल धोने को एक बार दोहराएं, इसके बाद आटोक्लेव वाले पानी से तीन बार धोएं।
  2. एक छोटे और नरम पेंटब्रश का उपयोग करके, सभी इंजेक्शन वाले भ्रूण को 2% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के साथ 1% आगर प्लेटों में स्थानांतरित करें। सेल स्प्रेडर का उपयोग करके प्लेट की सतह पर फैलकर एगर प्लेटों को ठंडा करने के बाद एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक लागू करें। एगर निर्जलीकरण को रोकने के लिए पैराफिल्म के साथ आगर प्लेट को सील करें।
    नोट: इंजेक्शन के बाद एक कॉलोनी में इंजेक्शन भ्रूण वापस करने का प्रयास न करें क्योंकि श्रमिक अधिकांश इंजेक्शन भ्रूण को नष्ट कर सकते हैं। इसलिए जीवित रहने को सामान्य कॉलोनी वातावरण के बाहर आगर प्लेटों पर भ्रूण विकसित करने की अनुमति देकर अनुकूलित किया जाता है।
  3. लगभग 4 सप्ताह के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। सेने के लिए नियमित रूप से जांच करें।
  4. एक बार जब पहला भ्रूण लार्वा में निकल जाता है, तो सभी भ्रूण और लार्वा को कुछ युवा नर्स श्रमिकों के साथ एक घोंसले के बॉक्स में वापस कर दें ताकि हैचलिंग की देखभाल की जा सके। एक बड़ी जंगली-प्रकार की कॉलोनी द्वारा पूर्व-डंक का उपयोग करके फ़ीड करें, अपशिष्ट उत्पादों को हटा दें, और धारा 1 में चर्चा किए गए उसी प्रोटोकॉल का पालन करते हुए पानी जोड़ें।
    नोट: छोटे बक्से (9.5 x 9.5 सेमी2) ऐसी कॉलोनियों के लिए आदर्श हैं। एच साल्टेटर कैद में अच्छी तरह से प्रजनन करता है। इसलिए, उत्परिवर्ती भ्रूण को वयस्कता तक पाला जा सकता है। उत्परिवर्ती वयस्क (ओं) का अलगाव प्रजनन युग्मक चरण में संक्रमण को प्रेरित करता है। नियंत्रित क्रॉस का उपयोग विषमयुग्मी या होमोजीगस व्यक्तियों के साथ उत्परिवर्ती उपनिवेशों को स्थापित करने के लिए किया जाता है (चित्रा 5)।

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Representative Results

यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हार्पेग्नाथोस साल्टेटर भ्रूण में जीनोम संपादन सफलतापूर्वक किया गया था। इन परिणामों को पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन और इंजेक्शन भ्रूण से निकाले गए डीएनए की पीजीईएम क्लोनिंग के माध्यम से मान्य किया गया था, जिसके बाद डीएनए अनुक्रमण किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके दैहिक म्यूटेनेसिस की दक्षता लगभग 40% तक पहुंच गई। एफ 1 उत्परिवर्ती पुरुषों को जंगली प्रकार की मादाओं के साथ जोड़ा गया था ताकि विषम एफ 2 मादाओं का उत्पादन किया जा सके, जो यदि जुड़े नहीं हैं, तो एफ 3 नर का उत्पादन करते हैं। उत्परिवर्ती एफ 3 पुरुषों को एफ 4 होमोजीगस उत्परिवर्ती मादाओं का उत्पादन करने के लिए विषमयुग्मी महिलाओं के साथ जोड़ा गया था। लक्ष्य पेप्टाइड की अनुपस्थिति को इन एफ 4 होमोजीगस महिला व्यक्तियों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से आगे पुष्टि की गई थी। माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके पुरुषों से पंखों को काट दिया गया और जीनोटाइपिंग उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया गया। चूंकि श्रमिकों के पास पंख नहीं होते हैं, इसलिए उन्हें सामान्य रूप से प्रयोगों के बाद बलिदान और जीनोटाइप किया जाता है। सफल म्यूटेनेसिस के परिणामस्वरूप, असामान्य व्यवहार देखे गए, जो लक्ष्य जीन के नुकसान के साथ सहसंबद्ध थे। ऑर्को के नुकसान के परिणामस्वरूप फेरोमोन सेंसिंग के नुकसान, शिकार का पता लगाने में असमर्थता, बिगड़ा हुआ मल और कॉलोनी से भटकने से संबंधित असामान्य व्यवहार हुए। इसके अलावा, ऑर्को उत्परिवर्ती चींटियों ने ओडोरेंट रिसेप्टर न्यूरॉन्स और एंटीनल लोब ग्लोमेरुली की कम संख्या का प्रदर्शन किया, यह सुझाव देते हुए कि चींटियों में न्यूरोएनाटॉमी गंध रिसेप्टर कार्यक्षमता10 पर निर्भर है।

Figure 1
चित्र 1: हार्पेग्नाथोस साल्टेटर घोंसले। (ए) एच साल्टेटर कॉलोनी वाले 19 x 13.5 सेमी2 घोंसले के बॉक्स की बाहरी विशेषताएं। (बी) एच साल्टेटर कॉलोनी वाले 19 x 13.5 सेमी2 घोंसले के बॉक्स की आंतरिक विशेषताएं। कांच के एक वर्गाकार टुकड़े के नीचे एक निचले घोंसले के क्षेत्र की उपस्थिति पर ध्यान दें। (C) एक 9.5 x 9.5 सेमी2 घोंसले के बॉक्स की बाहरी विशेषताएं जिसमें एक छोटा एच. साल्टेटर कॉलोनी होता है। इस तरह का घोंसला बॉक्स पृथक श्रमिकों और उत्परिवर्ती कॉलोनियों के लिए भी उपयुक्त है। (डी) एक 9.5 x 9.5 सेमी2 घोंसले के बॉक्स की आंतरिक विशेषताएं जिसमें एक छोटा एच साल्टेटर कॉलोनी होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: हार्पेग्नाथोस साल्टेटर भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुई। सुई के पतले टेपर (तीर से चिह्नित) पर ध्यान दें। नोक को थोड़ा तोड़कर सुई खोली जा सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: डबल-साइडेड टेप पर भ्रूण का संरेखण। भ्रूण को संरेखित किया जाना चाहिए ताकि उनकी लंबाई टेप के लंबे किनारे के समानांतर हो। यह मंच पर स्लाइड को स्थानांतरित करके क्रमिक इंजेक्शन को आसानी से करने में सक्षम बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: भ्रूण और सुई जैसा कि माइक्रोइंजेक्शन के दौरान देखा जाता है। (ए) इंजेक्शन से पहले भ्रूण के साथ सुई का उचित संरेखण। सुई भ्रूण के पक्ष के मध्य बिंदु के लंबवत रहती है, जो इंजेक्शन की विशिष्ट साइट है। (बी) एक सफल इंजेक्शन के बाद भ्रूण और सुई। भ्रूण की तरफ से एक छोटी बूंद निकलती है (एक तीर के साथ चिह्नित)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: मूल उत्परिवर्ती क्रॉस का आरेख। सीआरआईएसपीआर एफ 0 महिलाओं में लक्ष्य जीन पर उत्परिवर्तन को प्रेरित कर सकता है, जो बाद में वयस्कता पर गेमरगेट संक्रमण को प्रेरित करने के लिए अलग हो जाते हैं। यदि जर्मलाइन कोशिकाओं में उत्परिवर्तन होते हैं, तो अनमेटेड गैमेरगेट उत्परिवर्ती नर अंडे दे सकते हैं। एफ 1 उत्परिवर्ती वयस्क पुरुषों को विषम संतान उत्पन्न करने के लिए जंगली प्रकार की महिलाओं के साथ जोड़ा जा सकता है, या उन्हें होमोजीगस या विषमयुग्मी संतान उत्पन्न करने के लिए विषमयुग्मी मादाओं के साथ जोड़ा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चींटियों, मधुमक्खियों, ततैया और दीमकों सहित कीड़ों के बीच यूसोशलिटी के विकास के परिणामस्वरूप नए व्यवहार और रूपात्मक लक्षण दिखाई दिए हैं, जिनमें से कई को पर्यावरणीय और आनुवंशिक कारकों 1,2,3,4 के संयोजन से प्रभावित माना जाता है। दुर्भाग्य से, आनुवंशिकी के क्षेत्र में अनुसंधान मॉडल के रूप में यूसोशल कीड़ों का आकर्षण और उपयोगिता इस समूह में म्यूटेनेसिस से जुड़ी कठिनाइयों से बाधित हुई है। यह बाधा श्रम के प्रजनन विभाजन के कारण होती है, जो यूसोशल कीड़ों का एक प्रमुख लक्षण है जिसमें एक कॉलोनी के केवल कुछ सदस्य प्रजनन कर सकते हैं। यह विशेषता उत्परिवर्ती संतानों की संख्या पर सीमाएं लगाती है और आनुवंशिक लाइनों के विकास को चुनौतीपूर्ण बनाती है। पोनेरिन चींटी प्रजाति, हार्पेग्नाथोस साल्टेटर, इस दुविधा का समाधान प्रदान करता है, क्योंकि सभी मादाएंपृथक होने पर प्रजनन युग्मक बनने में सक्षम होती हैं। यहां, हम सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली का उपयोग करके एच साल्टेटर में म्यूटेनेसिस के लिए तरीके प्रदान करते हैं, जो भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से वितरित किया जाता है।

माइक्रोइंजेक्शन के लिए उचित विकास चरण में भ्रूण का उचित कॉलोनी रखरखाव और चयन महत्वपूर्ण है। पिछले काम ने स्थापित किया कि कीट विकास में समकालिक चरण जीनोम संपादन21 के लिए आदर्श चरण है, लेकिन एच साल्टेटर भ्रूण के विकास में इस चरण का समय पहले अज्ञात था। प्रारंभिक भ्रूण वर्गों के परमाणु धुंधलापन के माध्यम से, हम यह निर्धारित करने में सक्षम थे कि एच साल्टेटर भ्रूण में सिंकिटियल चरण अंडे के जमाव के 36 घंटे बाद तक रहता है, जिससे हमें यह निर्धारित करने की अनुमति मिलती है कि माइक्रोइंजेक्शन10 के लिए नए भ्रूण का चयन कब करना है।

सुई खींचने और माइक्रोइंजेक्शन के लिए मापदंडों का चयन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। सुई खींचने के लिए मापदंडों का चयन करते समय विचार करने वाले कारकों में (1) उपयोग किए गए कांच का प्रकार, (2) सुई का वांछित उद्देश्य, (3) वांछित टिप आकार, (4) इंजेक्शन के दौरान सुई के प्रतिरोध की मात्रा, (5) वांछित टेपर लंबाई, और (6) कोशिका या जीव का प्रकार शामिल है जिसे इंजेक्शन दिया जाएगा। विभिन्न सुई प्रकारों को खींचने के लिए सुझाव और दिशानिर्देश विभिन्न ऑपरेशन मैनुअल17 में पाए जा सकते हैं। इसी तरह, माइक्रोइंजेक्शन के लिए मापदंडों का चयन करते समय विचार करने के लिए कारक हैं जिनमें (1) उपयोग की जा रही सुई का आकार और (2) इंजेक्शन लगाए जाने वाले भ्रूणशामिल हैं। जबकि यह प्रोटोकॉल एच साल्टेटर भ्रूण में माइक्रोइंजेक्शन पर केंद्रित है, इन मापदंडों में संशोधन के साथ अन्य कीड़ों में तकनीक भिन्न हो सकती है। विशेष रूप से, सुई खींचने और इंजेक्शन के पैरामीटर अलग-अलग होंगे यदि विचाराधीन भ्रूण नरम या विकृत है। साल्टेटर भ्रूण में एक कठिन कोरियन होता है, और इंजेक्शन के परिणाम सबसे अच्छे होते हैं जब एक छोटी टेपर वाली सुई का उपयोग किया जाता है (लगभग 2 मिमी)। जिन भ्रूणों में कम दृढ़ कोरियन होता है, उन्हें लंबे समय तक टेपर (लगभग 10 मिमी) वाली सुइयों के साथ इंजेक्ट किया जा सकता है।

एच साल्टेटर में, इंजेक्शन वाले भ्रूण को तुरंत एक कॉलोनी में वापस नहीं किया जा सकता है, क्योंकि ऐसा करने से नर्सिंग श्रमिकों द्वारा उनके विनाश का खतरा होगा। यदि इस प्रोटोकॉल को अन्य सामाजिक कीट प्रजातियों पर लागू किया जाता है, तो यह मामला नहीं हो सकता है। अन्य प्रजातियों में सर्वोत्तम पोस्ट-माइक्रोइंजेक्शन पालन विधियों का निर्धारण करने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता हो सकती है। एच साल्टेटर के मामले में, भ्रूण को अंडे सेने तक आगर प्लेटों पर पालने की आवश्यकता होती है। एक बार हैच किए जाने के बाद, उन्हें इंजेक्शन ब्रूड10 की देखभाल के लिए कुछ श्रमिकों के साथ एक छोटी कॉलोनी में सुरक्षित रूप से लौटाया जा सकता है। भ्रूण देखभाल की एक समान विधि का उपयोग आग चींटियों (सोलेनोसिस इनविक्टा) और क्लोनल रेडर चींटियों (ऊसेरिया बिरोई) में किया जाता है ताकि इंजेक्शन भ्रूण की जीवित रहने की दर 9,15 को बढ़ाया जा सके। वयस्क प्रजनन पर, परिपक्व उत्परिवर्ती मादाओं को उनके प्रजनन चक्र को शुरू करने के लिए व्यक्तिगत रूप से या छोटी कॉलोनियों में रखा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में एच साल्टेटर म्यूटेंट की देखभाल के लिए निर्देश प्रदान किए गए हैं, लेकिन यदि एक अलग प्रजाति का उपयोग किया जाता है, तो प्रजातियों की जरूरतों को पूरा करने के लिए इंजेक्शन भ्रूण और उत्परिवर्ती वयस्कों की देखभाल के लिए दिशाओं को संशोधित किया जाना चाहिए।

यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल को म्यूटेनेसिस के लिए अनुकूलित किया गया है, जिसमें विशेष रूप से गैर-आवश्यक जीन को लक्षित किया जाता है। इस मामले में, ऑर्को जीन को लक्षित किया गया था, और ऑर्को में उत्परिवर्तन ने वयस्कता तक चींटी के अस्तित्व को प्रभावित नहीं किया था। इसी तरह, इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य गैर-आवश्यक जीनों को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें अन्य संवेदी रिसेप्टर्स से जुड़े लोग भी शामिल हैं। यदि लक्ष्य जीन आवश्यक है, तो ट्रांसजेनिक चींटियों को इसके बजाय उत्पन्न करना होगा, या तो सीआरआईएसपीआर या ट्रांसपोसन के माध्यम से। ट्रांसपोसन-मध्यस्थता ट्रांसजेनेसिस का उपयोग मधुमक्खियों13 में किया गया है और चींटियों पर लागू हो सकता है। यदि वांछित परिणाम ट्रांसजेनिक जीव हैं, तो इंजेक्शन सामग्री को अलग करना होगा। हालांकि, इंजेक्शन के बाद की प्रक्रियाएं समान होंगी, और इसलिए वांछित परिणाम में अंतर के बावजूद इस प्रोटोकॉल के कुछ पहलू फायदेमंद होंगे।

कुल मिलाकर, एच साल्टेटर एक मॉडल जीव के रूप में उपयोग के लिए और इसकी प्लास्टिक प्रजनन प्रणाली के कारण आनुवंशिक क्रॉस के प्रदर्शन के लिए आदर्श है जिसमें श्रमिक अलगाव10 के बाद प्रजनन शुरू करते हैं। यह इस चींटी प्रजाति को अन्य चींटियों से अलग करता है जिसमें CRISPR / Cas9 तकनीक स्थापित की गई है, उदाहरण के लिए, O. biroi, एक प्रजाति जिसमें सभी मादाएं क्लोनल रूप से प्रजनन करती हैं। एच साल्टेटर अपनी तरह के जीवों के बीच अद्वितीय अनुसंधान के अवसर प्रस्तुत करता है क्योंकि आनुवंशिक वंश स्थापित किए जा सकते हैं और इस प्रजाति में पीढ़ियों में उत्परिवर्तन बनाए रखा जा सकता है। इस प्रणाली की नवीनता शोधकर्ताओं को न केवल उत्परिवर्ती चींटियों को उत्पन्न करने की अनुमति देती है, बल्कि भविष्य में ट्रांसजेनिक लाइनों को विकसित करने की भी अनुमति देती है। यह उन्नत सामाजिकता के आनुवंशिक नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए नवीन अनुसंधान के अवसर प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय में डैनी रेनबर्ग और क्लाउड डेसप्लान की प्रयोगशालाओं और एरिजोना स्टेट यूनिवर्सिटी में जुरगेन लिबिग की प्रयोगशाला को चींटी आनुवंशिकी पर उनके समर्थन के लिए धन्यवाद दिया। हुआ यान ने अनुदान संख्या आईआईपी -1821914 के तहत नेशनल साइंस फाउंडेशन आई / यूसीआरसी, आर्थ्रोपोड मैनेजमेंट टेक्नोलॉजीज सेंटर और उद्योग भागीदारों से समर्थन स्वीकार किया। माया सार को संयुक्त राज्य अमेरिका - इज़राइल द्विराष्ट्रीय कृषि अनुसंधान और विकास कोष, वाडिया-बार्ड पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप नंबर एफआई -595-19 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher 15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration PNA Bio CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet Hypogloss Products B00254CNJA The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope  Nikon Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip BioQuip 4748
FemtoJet ll microinjector Eppendorf 920010504 This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
NCBI database National Center for Biotechnology Information Gene ID: 105183395 
P-2000 Micropipette Puller Sutter Instruments P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) Pioneer Plastics 079C 
Plastic boxes (27 X 19 cm2) Pioneer Plastics 195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) Pioneer Plastics 028C 
Quartz glass without filament Sutter Instruments Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm World Precision Instruments 500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 Winsor and Newton 5301030

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References

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आनुवंशिकी अंक 168 सामाजिक कीट चींटी सीआरआईएसपीआर म्यूटेनेसिस माइक्रोइंजेक्शन
एंट <em>हार्पेग्नाथोस साल्टेटर </em> में सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस के लिए भ्रूण इंजेक्शन
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Sieber, K., Saar, M., Opachaloemphan, C., Gallitto, M., Yang, H., Yan, H. Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator . J. Vis. Exp. (168), e61930, doi:10.3791/61930 (2021).

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