Summary
Mange karakteristika ved insekt eusocialitet er afhængige af kommunikation inden for kolonien og arbejdsdeling. Genetisk manipulation af vigtige regulatoriske gener i myreembryoner via mikroinjektion og CRISPR-medieret mutagenese giver indsigt i arten af altruistisk adfærd hos eusociale insekter.
Abstract
De unikke træk ved eusociale insekter, såsom social adfærd og reproduktiv arbejdsdeling, styres af deres genetiske system. For at adressere, hvordan gener regulerer sociale træk, har vi udviklet mutante myrer via levering af CRISPR-kompleks til unge embryoner i deres synkroniale fase. Her leverer vi en protokol af CRISPR-medieret mutagenese i Harpegnathos saltator, en ponerinmyreart, der viser slående fænotypisk plasticitet. H. saltatormyrer opdrættes let i en laboratorieindstilling. Embryoner opsamles til mikroinjektion med Cas9-proteiner og in vitro-syntetiserede små guide-RNA'er (sgRNA'er) ved hjælp af hjemmelavede kvartsnåle. Fostre efter injektion opdrættes uden for kolonien. Efter fremkomsten af den første larve transporteres alle embryoner og larver til en redekasse med et par plejearbejdere til videre udvikling. Denne protokol er egnet til at inducere mutagenese til analyse af kastespecifik fysiologi og social adfærd hos myrer, men kan også anvendes på et bredere spektrum af hymenopteraner og andre insekter.
Introduction
Udviklingen af eusocialitet hos insekter, nemlig ordenerne Hymenoptera og Blattodea (tidligere Isoptera), har resulteret i unikke og ofte sofistikerede adfærdstræk, der manifesterer sig på både individ- og koloniniveau. Reproduktiv arbejdsdeling, et træk, der karakteriserer de mest avancerede grupper af sociale insekter, involverer ofte kastesystemer sammensat af flere adfærdsmæssige og ofte morfologisk karakteristiske grupper. En sådan adfærdsmæssig og morfologisk mangfoldighed mellem kaster styres ikke kun af deres genetiske system, men også ofte af miljøet 1,2,3,4, hvilket gør eusociale insekter attraktive emner for genetisk og epigenetisk forskning.
Evnen til at manipulere det genetiske system af eusociale insekter har vist sig at være udfordrende, da mange arter ikke parrer sig og reproducerer i laboratoriemiljøer. De fleste eusociale insekter har også meget få reproduktive individer i en koloni, hvilket begrænser antallet af afkom, der kan produceres, og dermed begrænser prøvestørrelsen for genetisk manipulation5. Derudover har mange eusociale insekter lange generationstider sammenlignet med insekter, der almindeligvis anvendes til genetiske undersøgelser (såsom Drosophila), hvilket øger vanskeligheden ved at etablere genetiske linjer5. Nogle eusociale arter kan imidlertid generere en stor andel af reproduktivt aktive individer i en koloni, hvilket lindrer udfordringerne og giver mulighed for at etablere mutante eller transgene linjer.
I tilfælde af ponerinmyrearten, Harpegnathos saltator, kan alle kvindelige arbejdere blive reproduktivt aktive ved en dronnings død eller social isolation. Disse arbejdere kaldes "gamergates" og kan bruges til at generere nye kolonier6. Desuden kan der være mere end en gamergate til stede i en koloni, hvilket øger afkomsproduktionen 5,7,8. Indtil videre er der udviklet mutante og/eller transgene linjer i den europæiske honningbi, Apis mellifera, og i myrearterne H. saltator, Ooceraea biroi og Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetiske analyser hos sociale bier og myrer har banet vejen for en bedre forståelse af eusocialitet, hvilket giver en række muligheder for at studere gener og deres indvirkning på eusocial insektadfærd og kastespecifik fysiologi.
Her leverer vi en protokol for genetisk modifikation via CRISPR/Cas9-systemet i H. saltator. Specifikt blev denne teknik brugt til at generere en kimlinjemutation i orco, genet, der koder for den obligatoriske co-receptor af alle lugtreceptorer (OR'er)10. OR-gener er blevet bemærkelsesværdigt udvidet i hymenopteran eusociale insekter16, og orco spiller en væsentlig rolle i insektolfaction; i mangel heraf samles eller fungerer regionerne i den yderste periferi ikke normalt. Mutationer af orco-genet forstyrrer derfor olfaktorisk fornemmelse, neural udvikling og tilhørende social adfærd 9,10.
I denne protokol indføres Cas9-proteiner og små guide-RNA'er (sgRNA'er) i myrembryoner ved hjælp af mikroinjektion med det formål at inducere mutagenese af et målgen. Her vil vi beskrive mikroinjektionsproceduren i detaljer sammen med anvisninger vedrørende pleje af kolonier og injicerede embryoner. Disse metoder er egnede til at inducere mutagenese i en række forskellige gener i H. saltatormyrer og kan anvendes på et bredere spektrum af hymenopteranske insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Regelmæssig vedligeholdelse af Harpegnathos saltatorkolonier
- Oprethold vildtypekolonier af H. saltator i gennemsigtige plastkasser i et myreopdrætsrum ved 22-25 ° C og en fotoperiode på 12 timers lys: 12 timers mørk (12L: 12D) belysningsplan.
- Brug små kasser (9,5 x 9,5 cm2) til at opdrætte individuelle arbejdere eller små kolonier. Brug mellemstore kasser (19 x 13,5 cm 2) eller store kasser (27 x 19 cm2) til at opdrætte større kolonier (figur 1).
- For at oprette redekasser skal du bruge gips til at lave gulve til kasserne. Da det våde gips tørrer i mellemrummet og de store kasser, skal du trykke en skumblok ind i gipsen et par centimeter dybt og et par centimeter fra bagsiden af kassen for at udpege et lavere redeområde. Når gipset er tørret, skal du dække det udpegede redeområde med et firkantet stykke glas.
BEMÆRK: I små kasser er det ikke nødvendigt at udpege et lavere redeområde. Hvis myrer forsømmer at bruge det udpegede nedre redeområde, kan det hjælpe at dække glasset med et firkantet stykke rød cellofan. Dette giver indtryk af et mørkt underjordisk rum, der ligner reder, som H. saltator bruger i naturen og kan tilskynde dem til at flytte deres brød til det udpegede område.
- Foder kolonier med levende crickets to gange om ugen.
BEMÆRK: Kolonier skal fodres nok til, at de spiser alle fårekyllinger inden deres næste fodring. Foder eventuelle isolerede myrer og mutante myrekolonier med fårekyllinger, der er stukket af arbejdere i en almindelig koloni 2-3 gange hver uge. - Påfør vand regelmæssigt på gipsboksens gulv ved hjælp af en vaskeflaske.
BEMÆRK: Gipsen skal være fugtig nok til, at den ikke føles støvet at røre ved, men den skal være tør nok til, at alt tilsat vand absorberes af gipsen. Det er vigtigt, at redenerne ikke vandes for meget. I gennemsnit skal redekasser have en lille mængde vand tilsat en gang om ugen. - Når fodring finder sted, skal du fjerne affald og døde individer. Frys alt affald og døde myrer natten over ved -30 ° C, inden disse materialer bortskaffes som almindeligt affald.
- Tilsæt en knivspids tørret savsmuld til kolonier med jævne mellemrum; Dette hjælper larver, da de gennemgår hvalp og hjælper arbejdere med at holde redekassen ren.
2. Fremstilling af kvartsglas mikroinjektionsnåle
- Brug en micropipette puller til at trække glas mikroinjektionsnåle.
- Vælg det glas, der skal trækkes. Sørg for, at det anvendte glas er blevet opbevaret i et støvfrit og rent miljø.
BEMÆRK: Her er tyndvægget trådformet kvartsglas med en ydre diameter på 1,0 mm, indvendig diameter på 0,5 mm og længde på 7,5 cm blevet brugt til fremstilling af mikroinjektionsnåle. Hvis du injicerer et blødt embryo, kan borosilikatnåle også være anvendelige, men borosilikatnåle er ikke i stand til at trænge ind i hård chorion. - Indstil parameterindstillingerne for trækkeren. Brug en to-trins proces til at trække mikroinjektionsnåle til H. saltatorembryoner : parametre for det første trin inkluderer varme på 575, filament på 3, hastighed på 35, forsinkelse på 145 og et træk på 75; parametre for det andet trin inkluderer varme på 425, filament på 0, hastighed på 15, forsinkelse på 128 og et træk på 200. Efter det andet trin skal du sikre dig, at den resulterende nål har en 2 mm konus og en spids på 0,5 μm (figur 2).
BEMÆRK: Dette sæt parametre sammen med parametre for andre nåletyper findes i betjeningsvejledning17. Manualer til pipettetrækkere giver ofte anbefalede parametre til en række forskellige teknikker. Nogle forsøg og fejl kan være nødvendige for at bestemme, hvilke parametre der genererer de bedste nåle til specifikke behov. En kort konus er ideel til H. saltatorinjektioner, da den kan trænge ind i den hårde chorion af H. saltatorembryoner. Hvis du injicerer et blødt embryo, såsom et, der er blevet dechorioneret (f.eks. Drosophila), kan en længere nedtrapning omkring 10 mm give bedre resultater. Betjeningsvejledninger til pipettetrækkere giver normalt specifikke parametre til at trække nåle, der passer til forskellige behov. Det er vigtigt, at der bæres handsker under håndtering af glasfilamenter og træknåle. Olier fra bare hænder kan overføres til glasset, hvis handsker ikke bæres. - Når parametrene er indstillet, skal du bruge en mikropipettetrækker til at trække nåle til mikroinjektion. Sørg for, at nåle opbevares i et støvfrit og rent miljø, indtil de bruges.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge frisktrukne mikroinjektionsnåle. Hvis der anvendes fortrukne nåle, skal de opbevares korrekt i en kasse for at forhindre beskadigelse af nålespidser og potentiel forurening. Nåle, der har gennemgået langtidsopbevaring, anbefales ikke til embryoinjektioner.
3. Fremstilling af mikroinjektor
- Brug en mikroinjektor til at injicere ønskede materialer i myrembryoner.
- Forbered mikroinjektionsblandingen af Cas9-proteiner og in vitro-syntetiserede små guide-RNA'er (sgRNA'er)10. Hold blandingen på is, indtil det er tid til at indlæse en mikroinjektionsnål. Når mikroinjektionsblandingen ikke er i brug, opbevares den ved -80 °C.
BEMÆRK: Koncentrationerne varierer i forskellige arter. Høj koncentration kan forårsage høj dødelighed, mens lav koncentration kan reducere effektiviteten. Vi bruger 0,2 μg/μL Cas9-proteiner og 0,2 μg/μL sgRNA'er til H. saltator-embryoinjektion. Design af vores sgRNA'er fulgte en tidligere etableret protokol18. Gensekvenser blev opnået fra DNA-databaser. Genomsekvensen af H. saltator blev også tidligere rapporteret19,20. - Juster injektionsparametrene for H. saltatorembryoner : et injektionstryk på 140 hektopascal (hPa), et konstant tryk på 70 hPa og en tid på 0,4 sekunder. Juster konstant tryk, så materialet kun strømmer i en retning. Juster kun injektionstrykket og tiden, hvis der ikke strømmer noget materiale fra nålen ind i embryoet.
BEMÆRK: Hvis du injicerer en anden type embryo, er den primære parameter, der kan ændre sig, konstant tryk, som er ansvarlig for at sikre, at væske fra embryoet ikke strømmer tilbage i nålen. Volumen kontrolleres ikke for i denne protokol. Indstilling af parametrene for mikroinjektoren er tilstrækkelig til at opnå konsistente injektioner. - Læg en mikroinjektionsnål med 2 μL af blandingen ved hjælp af mikroloaderpipettespidser. Gør dette langsomt for at sikre, at der ikke dannes bobler i blandingen.
BEMÆRK: Hvis der dannes bobler, kan det være svært at opretholde ensartede mikroinjektioner. - Bryd kun spidsen af nålen ved at bryde langs kanten af båndet, så en smal konus stadig opretholdes. Sørg for, at nålen er brudt lige nok til, at spidsen åbnes, men ikke så meget, at konusen er brudt af.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at hvis åbningen af nålen er for bred efter brud, vil brugeren se væske løbe tør for nålen, når den monteres på mikroinjektoren under tryk inden påføring af injektionstryk. Nogle mikroinjektionsprotokoller anbefaler at bryde nåle ved at skære spidsen med en saks. Denne metode anbefales ikke, da saks kan få nålens spids til at knuse. Injektion af embryoner med en knust nål vil være meget skadelig. - Monter nålen på mikromanipulatoren
4. Injektion af embryoner
- Vælg embryoner til mikroinjektion fra syncytialstadiet: tiden under udviklingen, hvor kerner deler sig uden cytokinese.
BEMÆRK: Dette er det ideelle tidspunkt under udviklingen til genomredigering ved mikroinjektion, som tidligere opdaget i Drosophila21. H. saltatorembryoner passerer syncytialstadiet og når cellularisering omkring 36 timer efter ægaflejring10. Højere effektivitet opnås, hvis yngre embryoner anvendes til injektioner. - Linjeembryoner på et stykke dobbeltsidet tape fastgjort til et glasmikroskopglas. Sørg for, at embryoner er fastgjort godt til båndet for at forhindre bevægelse under injektion. Læg embryonerne i lodret retning, således at embryonets sideside er ved kanten af båndet (figur 3). Placer diaset og foret embryoner på mikroskopets stadium ved en udpeget mikroinjektionsarbejdsstation.
BEMÆRK: Det anbefales, at embryonerne er arrangeret således, at successive injektioner kan udføres ved at flytte diaset på scenen i stedet for at justere nålepositionen ved hver injektion. Dette gør det muligt at udføre successive injektioner mere effektivt. - Nålen justeres med det første embryo, der skal injiceres ved hjælp af mikromanipulatoren (figur 4a).
- Sideværts punktering af nålen i det første embryo langs dets dorsale / ventrale akse under et mikroskop.
- Injicer mikroinjektionsblandingen. Se efter let bevægelse af embryoet, hvilket indikerer en stigning i det indre tryk på grund af den injicerede væske. Derudover skal du holde øje med dannelsen af en lille dråbe indeholdende synlige spor af væv og / eller lipid på embryoets ydre membran (figur 4b).
BEMÆRK: Tilstedeværelse af spor af væv og / eller lipid i dråben indikerer, at nålen med succes har punkteret både chorion og vitellinmembran i embryoet. Hvis spor af disse materialer ikke er til stede, blev injektionen ikke udført med succes og skal gentages. Efter et par sekunder vil dråben blive reabsorberet af embryoet og vil ikke længere være synlig. - Fjern forsigtigt nålen fra embryoet med det samme, og fortsæt til det næste ved at justere mikroskopets placering. Gentag, indtil alle embryoner er blevet injiceret.
- Når alle embryoner på diaset er blevet injiceret med succes, skal du overføre diaset til en fugtig kasse i 1 time for at give embryonerne tid til at komme sig efter injektionsprocessen, inden de fjernes fra diaset.
5. Opdræt af injicerede embryoner
- Efter 1 times inkubation i en fugtig kasse fjernes forsigtigt de injicerede embryoner fra båndet ved hjælp af fjervægtstang og overføres til et rør fyldt med en lille mængde 70% ethanol. Vend røret flere gange for at overføre embryonerne til bunden af røret. Gentag ethanolvasken en gang efterfulgt af tre vaske med autoklaveret vand.
- Ved hjælp af en lille og blød pensel overføres alle injicerede embryoner til 1% agarplader med 2% antibiotika-antimykotisk. Påfør antibiotika-antimykotisk middel, efter at hældte agarplader er afkølet ved at sprede sig over overfladen af pladen ved hjælp af en cellespreder. Forsegl agarpladen med parafilm for at forhindre agarudtørring.
BEMÆRK: Forsøg ikke at returnere injicerede embryoner til en koloni efter injektioner, da arbejdere kan ødelægge de fleste injicerede embryoner. Overlevelse optimeres derfor ved at lade embryoner udvikle sig på agarplader uden for et normalt kolonimiljø. - Agarpladerne inkuberes ved 25 °C i ca. 4 uger. Kontroller regelmæssigt for udklækning.
- Når det første embryo er klækket til en larve, skal du returnere alle embryoner og larver til en redekasse med et par unge sygeplejerskearbejdere til at passe ungerne. Foder ved hjælp af fårekyllinger, der er stukket af en større vildtypekoloni, fjern affaldsprodukter, og tilsæt vand efter den samme protokol, der er diskuteret i afsnit 1.
BEMÆRK: Små kasser (9,5 x 9,5 cm2) er ideelle til sådanne kolonier. H. saltator reproducerer godt i fangenskab. Derfor kan mutante embryoner opdrættes til voksenalderen. Isolering af mutant(e) voksen(e) inducerer overgang til reproduktiv gamergate-fase. Kontrollerede kryds bruges til at etablere mutante kolonier med heterozygote eller homozygote individer (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af protokollen, der er angivet her, blev genomredigering i Harpegnathos saltatorembryoner udført med succes. Disse resultater blev valideret via polymerasekædereaktion og pGEM-kloning af DNA ekstraheret fra injicerede embryoner efterfulgt af DNA-sekventering. Effektiviteten af somatisk mutagenese ved hjælp af denne protokol nåede ca. 40%. F1-mutanthanner blev parret med vildtypehunner for at producere heterozygote F2-hunner, som, hvis de ikke blev parret, producerede F3-hanner. Mutante F3-hanner blev parret med heterozygote hunner for at producere F4 homozygote mutanthunner. Fravær af målpeptidet blev yderligere bekræftet via massespektrometri af disse F4 homozygote kvindelige individer. Vingerne blev klippet fra mænd ved hjælp af mikrodissektionssaks og brugt til genotypebestemmelsesformål. Da arbejdere ikke har vinger, ofres de normalt og genotypes efter eksperimenter. Som et resultat af vellykket mutagenese blev der observeret usædvanlige adfærd, som korrelerede med tab af målgenet. Tabet af orco resulterede i unormal adfærd relateret til tab af feromonføling, manglende evne til at opdage bytte, nedsat fecundity og vandre fra kolonien. Desuden udviste orcomutantmyrer et nedsat antal lugtreceptorneuroner og antennal lobe glomeruli, hvilket tyder på, at neuroanatomi hos myrer er afhængig af lugtreceptorfunktionalitet10.
Figur 1: Harpegnathos saltator reder. (A) Udvendige træk ved en 19 x 13,5 cm2 redekasse, der indeholder en H. saltatorkoloni. (B) Indvendige træk ved en 19 x 13,5 cm2 redekasse, der indeholder en H. saltatorkoloni. Bemærk tilstedeværelsen af en nedre rederegion under et firkantet stykke glas. (C) Udvendige træk ved en 9,5 x 9,5 cm2 redekasse, der indeholder en lille H. saltatorkoloni. En sådan redekasse er også velegnet til isolerede arbejdere og mutante kolonier. (D) Indvendige træk ved en 9,5 x 9,5 cm2 redekasse, der indeholder en lille H. saltatorkoloni. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nål til Harpegnathos saltator embryo mikroinjektion. Bemærk nålens tynde konus (markeret med en pil). Nålen kan åbnes ved at bryde spidsen lidt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Justering af embryoner på dobbeltsidet tape. Embryoner skal justeres, så deres længde er parallel med båndets lange kant. Dette gør det muligt at udføre successive injektioner med lethed ved at flytte diaset på scenen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Embryo og nål som set under mikroinjektion . (A) Korrekt justering af nålen med embryoet før injektion. Nålen hviler vinkelret på midten af embryoets side, det typiske injektionssted. (B) embryoet og nålen efter en vellykket injektion. En lille dråbe stikker ud fra embryoets side (markeret med en pil). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Diagram over grundlæggende mutantkryds. CRISPR kan inducere mutationer på målgenet hos F0-hunner, som efterfølgende isoleres efter voksenalderen for at inducere gamergate-overgangen. Hvis mutationer forekommer i kimlinjeceller, kan umated gamergates lægge mutante mandlige æg. De F1 mutante voksne hanner kan parres med vildtypehunner for at generere heterozygote afkom, eller de kan parres med heterozygote hunner for at generere homozygote eller heterozygote afkom. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Udviklingen af eusocialitet blandt insekter, herunder myrer, bier, hvepse og termitter, har resulteret i fremkomsten af nye adfærdsmæssige og morfologiske træk, hvoraf mange forstås at være påvirket af en kombination af miljømæssige og genetiske faktorer 1,2,3,4. Desværre er eusociale insekters tiltrækningskraft og anvendelighed som forskningsmodeller inden for genetik blevet hindret af de vanskeligheder, der er forbundet med mutagenese i denne gruppe. Denne hindring opstår på grund af reproduktiv arbejdsdeling, et nøgletræk ved eusociale insekter, hvor kun få medlemmer af en koloni kan reproducere. Dette træk sætter begrænsninger på antallet af mutante afkom og gør udviklingen af genetiske linjer udfordrende5. Ponerinmyrearten, Harpegnathos saltator, giver en løsning på dette dilemma, da alle hunner er i stand til at blive reproduktive gamergates, når de isoleres5. Her leverer vi metoder til mutagenese i H. saltator ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet, leveret via embryomikroinjektion.
Korrekt kolonivedligeholdelse og udvælgelse af embryoner på det passende udviklingsstadium til mikroinjektion er kritiske. Tidligere arbejde fastslog, at syncytialfasen i insektudvikling er det ideelle stadium til genomredigering21, men tidspunktet for dette stadium i H. saltator embryonal udvikling var tidligere ukendt. Via nuklear farvning af tidlige embryosektioner var vi i stand til at bestemme, at syncytialstadiet i H. saltatorembryoner varer indtil 36 timer efter ægaflejring, så vi kan bestemme, hvornår vi skal vælge nye embryoner til mikroinjektion10.
Valg af parametre til nåletræk og til mikroinjektion kan være udfordrende. Faktorer, der skal overvejes, når der vælges parametre til nåletrækning, omfatter (1) den anvendte glastype, (2) det ønskede formål med nålen, (3) den ønskede spidsstørrelse, (4) mængden af modstand, nålen vil opleve under injektionen, (5) den ønskede tilspidsningslængde og (6) den type celle eller organisme, der vil blive injiceret. Forslag og retningslinjer for træk af forskellige nåletyper findes i forskellige betjeningsvejledninger17. På samme måde er der faktorer, der skal tages i betragtning ved valg af parametre for mikroinjektion, herunder (1) størrelsen på den nål, der anvendes, og (2) de embryoner, der skal injiceres22. Mens denne protokol fokuserer på mikroinjektion i H. saltatorembryoner , kan teknikkerne variere i andre insekter med ændring af disse parametre. Især vil parametrene for nåletrækning og injektion variere, hvis det pågældende embryo er blødt eller dechorioneret. H. saltatorembryoner har en hård chorion, og injektionsresultater er bedst, når der anvendes en nål med en kort konus (ca. 2 mm). Embryoner, der har mindre fast chorion, kan injiceres med nåle med længere tilspidsninger (ca. 10 mm).
I H. saltator kan injicerede embryoner ikke straks returneres til en koloni, da dette vil risikere deres ødelæggelse af plejepersonale. Hvis denne protokol anvendes på andre sociale insektarter, er dette muligvis ikke tilfældet. Bestemmelse af de bedste opdrætsmetoder efter mikroinjektion i andre arter kan kræve en vis forsøg og fejl. I tilfælde af H. saltator skal embryoner opdrættes på agarplader indtil udklækning. Når de er klækket, kan de returneres sikkert til en lille koloni med et par arbejdere til at passe den injicerede brød10. En lignende metode til embryopleje anvendes i brandmyrer (Solenopsis invicta) og klonale raidermyrer (Ooceraea biroi) for at øge overlevelsesraten for injicerede embryoner 9,15. Ved voksen eclosion kan modne mutante hunner holdes individuelt eller i små kolonier for at begynde deres reproduktive cyklus. Anvisninger til pleje af H. saltator mutanter er angivet i denne protokol, men hvis der anvendes en anden art, bør anvisninger til pleje af injicerede embryoner og mutante voksne ændres, så de passer til artens behov.
Protokollen, der leveres her, er optimeret til mutagenese, hvor specifikt ikke-essentielle gener er målrettet. I dette tilfælde blev orco-genet målrettet, og mutationer i orco påvirkede ikke myrens overlevelse til voksenalderen. På samme måde kan denne protokol bruges til at målrette mod andre ikke-essentielle gener, herunder dem, der er forbundet med andre sensoriske receptorer. Hvis målgenet er essentielt, skal transgene myrer genereres i stedet, enten via CRISPR eller transposon. Transposonmedieret transgenese er blevet anvendt i honningbier13 og kan gælde for myrer. Hvis det ønskede resultat er transgene organismer, skal de injicerede materialer være forskellige. Imidlertid vil postinjektionsprocesser være ens, og derfor vil nogle aspekter af denne protokol være gavnlige på trods af forskellen i det ønskede resultat.
Samlet set er H. saltator ideel til brug som modelorganisme og til udførelse af genetiske kryds på grund af dets plastiske reproduktive system, hvor arbejdere begynder at reproducere efter isolering10. Dette adskiller denne myreart fra andre myrer, hvor CRISPR/Cas9-teknologien er etableret, for eksempel O. biroi, en art, hvor alle hunner reproducerer klonalsk. H. saltator præsenterer unikke forskningsmuligheder blandt organismer af sin art, da genetiske slægter kan etableres, og mutationer kan opretholdes på tværs af generationer i denne art. Nyheden i dette system gør det muligt for forskere ikke kun at generere mutantmyrer, men også at udvikle transgene linjer i fremtiden. Dette giver mulighed for ny forskning til at studere genetisk kontrol af avanceret eusocialitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Danny Reinbergs og Claude Desplans laboratorier ved New York University og Jürgen Liebigs laboratorium ved Arizona State University for deres støtte til myregenetik. Hua Yan anerkender støtte fra National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies under Grant No. IIP-1821914 og af industripartnere. Maya Saar blev støttet af United States - Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. Drosophila Cytogenetics Protocols. , Humana Press. (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
